BR112020007319A2

BR112020007319A2 - célula

Info

Publication number: BR112020007319A2
Application number: BR112020007319-9A
Authority: BR
Inventors: Martin Pulé; James Sillibourne; Lukas Stanczuk
Original assignee: Autolus Limited
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2020-09-29
Also published as: CL2020000951A1; GB201716728D0; CA3078161A1; EP3694542A1; MX2020007108A; RU2020109577A; KR20200066347A; IL273915A; US20200255494A1; CN111201033A; US11643453B2; AU2018347778A1; SG11202002045RA; WO2019073248A1; JP2020537521A

Abstract

A presente invenção fornece uma célula que compreende; (i) um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um receptor de células T transgênico (TCR); e (ii) um polipeptídeo capaz de co-localizar um componente da microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular dentro da célula.

Description

CÉLULA CAMPO DE INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a uma célula que expressa um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um receptor de célula T (TCR); e, em particular, abordagens para controlar a rejeição imune de tais células em um receptor.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Após a infusão, as células T CAR enxertam dentro do receptor e proliferam após encontrar as células portadoras do alvo. As células T CAR, então, persistem e sua população se contrai lentamente ao longo do tempo. A persistência das células T CAR pode ser determinada em estudos clínicos por PCR em tempo real para o transgene em amostras de sangue ou por citometria de fluxo para o CAR em amostras de sangue e pesquisadores clínicos descobriram uma correlação entre persistência e respostas sustentadas. Essa correlação é particularmente pronunciada na terapia com CAR CD19 da leucemia linfoblástica B-aguda (LLA). Muitas vezes nesse cenário, a perda do enxerto de células T CAR anuncia a reincidência da leucemia.

[003] As células T CAR podem resultar na ativação de uma resposta imune mediada por células que pode desencadear a rejeição das células T CAR. Isto é devido à imunogenicidade dos componentes manipulados na célula através de proteínas não próprias ou através de sequências não próprias formadas a partir de junções entre as próprias proteínas usadas para produzir receptores e outros componentes de engenharia.

[004] CARS são proteínas artificiais que são tipicamente compostas por um domínio de direcionamento, um domínio espaçador, um domínio transmembranar e um domínio de sinalização. O domínio de direcionamento é tipicamente derivado de um scFv que pode ser murino. Embora esse scFv possa ser humano ou humanizado e outros componentes individualmente sejam derivados de auto-proteínas, as junções entre eles ainda podem ser imunogênicas. Por exemplo, dentro do scFv existem junções entre a cadeia pesada e o ligante e o ligante e a cadeia leve. Existe então uma junção entre o scFv e o domínio espaçador. Se o domínio transmembranar não for contínuo com o espaçador, existe uma junção adicional. Da mesma forma, se o domínio transmembranar não for contínuo com a porção amino-terminal do endodomínio, haverá uma junção adicional. Finalmente, a maioria dos endodomínios possui pelo menos dois componentes e, às vezes mais junções subsequentes entre cada componente.

[005] Além disso, as células T CAR são frequentemente projetadas com outros componentes. Esses componentes incluem genes suicidas (por exemplo, a enzima HSV-TK). Verificou-se que esta enzima é altamente imunogênica e causou uma depleção imune celular de células T CAR fora do contexto da profunda imunossupressão do transplante de células-tronco hematopoiéticas haploidenticais. Outros genes suicidas menos imunogênicos ainda podem fornecer alguma imunogenicidade, pois quase todos os tipo de componente manipulado que envolve uma fusão entre duas proteínas ou o uso de uma proteína xenogênica pode ser imunogênico.

[006] Em muitas situações, as células T CAR são geradas a partir de células T autólogas. Nesse cenário, as respostas allo não ocorrem. Em algumas circunstâncias células T de um doador alogênico são usadas. Isso pode ocorrer se, por exemplo, o paciente foi submetido a um transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas. Nesse caso, as células T colhidas serão alogênicas. Caso contrário, um paciente pode ter células T insuficientes para gerar um produto de células T CAR devido a linfopenia induzida por quimioterapia.

[007] A rejeição de células alogênicas pode ser devido a uma incompatibilidade menor ou maior. Ocorre uma incompatibilidade menor no cenário em que as células T alogênicas são antígeno leucocitário humano (HLA) correspondente ao receptor. Neste caso, a rejeição ocorre devido a antígenos de histocompatibilidade menores, que são diferenças não-HLA entre indivíduos, o que resulta na apresentação de epítopos não auto (doadores) / peptídeos imunogênicos no HLA. No caso em que doador e destinatário são incompatíveis ou são apenas parcialmente compatíveis. Os receptores de células T (TCR) nas células T endógenas de um receptor podem interagir de maneira inespecífica com um HLA incompatível e causar rejeição consequentemente. As formas menores e maiores de rejeição alogênica são causadas pelo HLA interagindo com o TCR.

[008] Um método para prevenir a rejeição por respostas imunes celulares é por ferramentas de edição genômica, como nucleases de dedo de zinco, TALENs, CrispR / Caspº9, MegaTALs e meganucleases. Usando essas ferramentas,

elementos da apresentação de peptídeo / HLA podem ser interrompidos. A maneira mais direta de fazer isso é interromper a expressão do HLA. Isto pode ser conseguido através da ruptura do locus HLA ou, alternativamente, pela interrupção do locus beta-2 microglobulina (B2M) (que então interrompe a expressão do MHC classe I). Outras abordagens incluem a interrupção dos componentes da apresentação peptídica.

[009] Outro método para prevenir a rejeição imune mediada por células baseia-se em abordagens baseadas em proteínas para interromper a expressão de HLA. Por exemplo, um fragmento variável de cadeia única de anticorpo que reconhece B2M e que possui um sinal de retenção de Golgi / ER no seu terminal carboxi pode resultar na regulação negativa do HLA, uma vez que o B2M é retido no complexo ER / Golgi. Outras abordagens incluem o uso de proteínas virais que evoluíram para perturbar a expressão e a função do HLA.

[0010] A principal limitação de todas essas abordagens é que elas dependem ou resultam em regulação da superfície da classe I, que por sua vez desencadeia a rejeição pelas células NK. Portanto, essas abordagens resolvem um problema de rejeição celular mediada por células T alfa / beta, mas causam outro tipo de rejeição imune celular, a saber pelas células NK.

[0011] Um outro método foi descrito - o de tornar as células T manipuladas resistentes a um potente agente imunossupressor e administrar o referido agente imunossupressor após a administração de células T manipuladas. Essa abordagem é limitada, pois causa imunossupressão profunda no receptor, pois todas as células T normais são suprimidas, e não apenas aquelas que podem rejeitar o produto celular manipulado.

[0012] Existe, portanto, a necessidade de abordagens alternativas para reduzir a rejeição imune mediada por células de células manipuladas, em particular células imunes manipuladas que expressam um CAR ou um TCR manipulado.

SUMÁRIO DOS ASPECTOS DA INVENÇÃO

[0013] Os presentes inventores descobriram que é possível acoplar a ligação de um MHC de classe I em uma primeira célula a um TCR em uma segunda célula para induzir - direta ou indiretamente - sinalização na primeira célula. Notavelmente, os presentes sistemas de sinalização de MHC de classe I são capazes de apresentar a mesma faixa de peptídeos que uma molécula de MHC de classe I endógena correspondente. Como tal, qualquer peptídeo que é apresentado naturalmente pelo MHC classe I é apresentado pelo MHC classe I da presente invenção. Isso inclui qualquer peptídeo xenogênico ou juncional que possa ser imunogênico. Em um cenário alogênico, isso também pode incluir antígenos menores de histocompatibilidade. Assim, um MHC de classe I como aqui definido irá interagir com quaisquer células T reativas endógenas presentes no receptor de uma célula manipulada da presente invenção através do reconhecimento de complexos peptídeo / MHC. A célula T reativa pode assim ser esgotada pela ativação da morte celular mediada por citotóxicos pela célula da presente invenção. Portanto, uma resposta imune celular contra a célula da presente invenção pode ser reduzida.

[0014] Assim, num primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma célula que compreende; (i) um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um receptor de células T transgênico (TCR); e (ii) um polipeptídeo capaz de co-localizar um componente da microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular dentro da célula.

[0015] O polipeptídeo capaz de co-localizar o componente de microglobulina beta-2 da molécula de MHC classe I com o domínio de sinalização intracelular pode ser uma microglobulina beta-2 manipulada compreendendo ainda um endodomínio compreendendo —“um domínio de sinalização intracelular.

[0016] A microglobulina beta-2 manipulada pode ainda compreender um domínio transmembranar entre a microglobulina beta-2 e o endodomínio compreendendo um domínio de sinalização intracelular.

[0017] O polipeptídeo capaz de co-localizar o componente de microglobulina beta-2 da molécula de MHC classe I com o domínio de sinalização intracelular pode ser um polipeptídeo de microglobulina beta-2 ligado a um componente do complexo TCR, adequadamente o polipeptídeo de microglobulina beta-2 pode ser ligado a um componente do complexo CD3.

[0018] O componente do complexo CD3 pode ser selecionado a partir de CD3-zeta, CD3-epsilon, CD3-gama ou CD3-delta. O polipeptídeo beta-2 da microglobulina pode fundir-se ao componente do complexo CD3 por um peptídeo ligante. O polipeptídeo beta-2 da microglobulina pode estar ligado ao ectodomínio de um componente do complexo CD3.

[0019] O polipeptídeo capaz de co-localizar o componente da microglobulina beta-2 da molécula de MHC classe I com o domínio de sinalização intracelular pode ser um polipeptídeo biespecífico que compreende; (i) um primeiro domínio de ligação que é capaz de se ligar ao polipeptídeo de microglobulina beta-2 e (ii) um segundo domínio de ligação que é capaz de se ligar a um polipeptídeo compreendendo um domínio de sinalização intracelular ou um componente do complexo CD3.

[0020] A molécula biespecífica pode ser ligada à membrana.

[0021] O domínio de sinalização intracelular pode compreender um motivo de ativação baseada em tirosina imunorreceptora (ITAM).

[0022] O domínio de sinalização intracelular pode ser um domínio de sinalização de células T intracelular que compreende um ou mais dos seguintes itens: endodomínio zeta CD3, endodomínio CD28, endodomínio OX40, endodomínio 4-1 BB, endodomínio CD2, endodomínio CD27, endodomínio ICOS, endodomínio CD40.

[0023] O domínio de sinalização intracelular de células T pode compreender o endodomínio CD3 zeta.

[0024] A célula pode ser uma célula T alfa-beta, uma célula NK, uma célula T gama-delta ou uma célula assassina induzida por citocinas.

[0025] Num aspecto adicional, a presente invenção fornece uma construção de ácido nucleico que compreende:

(i) uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um TCR transgênico; e (ii) uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de co-localizar um componente de microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular de acordo com a presente invenção.

[0026] A primeira e a segunda sequências de ácidos nucleicos podem ser separadas por um local de co-expressão.

[0027] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de sequências de ácidos nucleicos compreendendo: (i) uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um TCR transgênico; e (ii) uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de co-localizar um componente de microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular de acordo com a presente invenção.

[0028] Num aspecto adicional, a presente invenção fornece um vetor que compreende uma construção de ácido nucleico da presente invenção.

[0029] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de vetores que compreende: (i) um primeiro vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um TCR transgênico; e (ii) um segundo vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de co- localizar um componente de microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular de acordo com a presente invenção.

[0030] A presente invenção fornece ainda uma composição farmacêutica que compreende uma pluralidade de células; uma construção de ácido nucleico; uma primeira sequência de ácido nucleico e uma segunda sequência de ácido nucleico; um vetor ou um primeiro e um segundo vetor da presente invenção.

[0031] A presente invenção também fornece às células uma construção de ácido nucleico; uma primeira sequência de ácido nucleico e uma segunda sequência de ácido nucleico; um vetor; um primeiro e um segundo vetor; ou uma composição farmacêutica da invenção para uso no tratamento e / ou prevenção de uma doença.

[0032] A invenção fornece ainda um método para o tratamento e / ou prevenção de uma doença, que compreende a etapa de administração de uma composição farmacêutica da presente invenção a um sujeito em necessidade.

[0033] O método pode compreender as seguintes etapas: (i) isolamento de uma célula contendo amostra; (ii) transdução ou transfecção da célula com uma construção de ácido nucleico, um vetor ou um primeiro e um segundo vetor da presente invenção; e (iii) administrar as células de (ii) a um sujeito.

[0034] A célula isolada na parte (i) do método pode ser autóloga. A célula isolada na parte (i) do método pode ser alogênica.

[0035] Num aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de uma composição farmacêutica da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento e / ou prevenção de uma doença.

[0036] A doença pode ser rejeição imune da célula que compreende (i) um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um TCR transgênico; e (ii) um polipeptídeo capaz de co- localizar um componente da microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular.

[0037] A presente invenção fornece ainda um método para fabricar uma célula, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, que compreende a etapa de introdução: uma construção de ácido nucleico, uma primeira sequência de ácido nucleico e uma segunda sequência de ácido nucleico; um vetor ou um primeiro e um segundo vetor da presente invenção na célula.

[0038] A célula pode ser de uma amostra isolada de um sujeito.

[0039] Num aspecto adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo manipulado compreendendo um componente de microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I ligada a um componente do complexo CD3.

[0040] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo biespecífico que compreende; (1) um primeiro domínio de ligação que é capaz de se ligar ao polipeptídeo beta-2 da microglobulina; e (ii) um segundo domínio de ligação que é capaz de se ligar a um polipeptídeo compreendendo um domínio de sinalização intracelular ou um componente do complexo CD3.

[0041] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para excluir ou eliminar células T in vivo que reconhecem um peptídeo apresentado pela molécula de MHC classe I de uma célula de acordo com o primeiro aspecto da invenção, que compreende a etapa de administração de uma célula de acordo com o primeiro aspecto da invenção para um sujeito, de modo que as células T no sujeito que reconhecem esse peptídeo / MHC sejam excluídas por seleção negativa.

[0042] O método pode excluir células T que reconhecem um peptídeo derivado de uma proteína exógena expressa pela célula da invenção. Uma proteína "exógena" é uma proteína que a célula foi projetada para expressar, por exemplo, por meios recombinantes. É uma proteína normalmente não expressa pela célula.

[0043] O método pode excluir células T que reconhecem um peptídeo derivado de um receptor quimérico de antígeno (CAR), um receptor de células T transgênico (TCR), um gene suicida, um receptor de citocinas quimérico ou uma proteína modificadora de transdução de sinal expressa pela célula da invenção.

[0044] O método pode excluir células T que reconhecem um peptídeo derivado de um receptor quimérico de antígeno (CAR) expresso pela célula da invenção.

[0045] Em um aspecto adicional, é fornecido um método para impedir a rejeição imune de uma célula do primeiro aspecto da invenção, que compreende a etapa de excluir células T in vivo que reconhecem um peptídeo apresentado pela molécula de MHC classe I da célula por um método descrito acima.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0046] A Figura 1 mostra (a) complexo molecular de MHC classe I que é composto por MHC e B2M; b) O complexo TCR, composto por cadeias TCR alpha / beta rodeadas por elementos CD3

[0047] A Figura 2 mostra (a) Construção B2M-Z: A construção B2M é fundida em estrutura a um domínio transmembranar e endodomínio CD3-zeta; (b) Construção biespecífica de B2M-TCR: um scFv que reconhece B2M é fundido com um ligante a um segundo scFv que reconhece o complexo CD3 / TCR. Este é então ancorado à membrana através de um domínio transmembranar; (c) Fusão entre B2M e CD3 / TCR: Como exemplo, é mostrada uma fusão entre B2M por meio de um vinculador flexível ao CD3 Epsilon.

[0048] A Figura 3 mostra a) Diagrama esquemático que ilustra um CAR clássico. (b) a (d): Diferentes gerações e permutações de endodomínios CAR: (b) projetos iniciais transmitiram sinais ITAM sozinhos através do endodomínio FceRl-y ou CD36, enquanto projetos futuros transmitiram adicional (c) um ou (d) dois co-estímulos sinais no mesmo endodomínio composto.

[0049] Figura 4 mostra um Diagrama esquemático que ilustra o CAR da Classe I do MHC. O CAR de Classe I do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é um heterodímero composto por duas cadeias polipeptídicas não covalentemente ligadas, a e B2-microglobulina (B2m). As subunidades al e a2, juntamente com um peptídeo carregado,

se ligam a um receptor de células T (TCR) expresso na superfície das células T. A B2-microglobulina está ligada a um domínio transmembranar que ancora a molécula na membrana celular e é ainda ligada a um endodomínio que atua para transmitir sinais intracelulares para a célula. o endodomínio pode ser composto de um ou mais domínios de sinalização.

[0050] A Figura 5 mostra um Diagrama esquemático que ilustra três possíveis projetos de CAR baseados em B2m. No primeiro CAR (A), a B2-microglobulina está ligada através de uma ponte ao domínio transmembranar CD376 que é então ligado ao endodomínio CD3C. Dois outros projetos de CAR (B e C) adicionaram domínios co-estimuladores, 41 BB ou CD28, respectivamente.

[0051] A Figura 6 mostra Células MHC I CAR-T podem matar células T alvo por meio da interação MHC 1 / TCR. Três construções de B2m (B2m-CD3z, B2m-41BBz e B2m-CD28z) foram usadas para transduzir PBMCs de dois doadores saudáveis do haplótipo HLA-AO2. O peptídeo HAlIH recombinante que se liga naturalmente ao HLA-AO2 foi usado para pulsar as células CAR-T em uma faixa de concentrações (concentração máxima = puM). As células CAR-T pulsadas foram co-cultivadas com células SupT1 que expressam TCR anti-HAlH na proporção efetor / alvo 2: l1. Após uma incubação de 48 horas, o número de células alvo SupTl viáveis foi avaliado por citometria de fluxo e normalizado para controle não transduzido (NT). Todas as três construções de 2m foram eficazes na morte de células alvo. O EC5S0 para o peptídeo HAlIlH variou de - 0,5uM (B2m- CD3z) a - 0,1 uM (B2m-41BBz).

[0052] A Figura 7 mostra Oo envolvimento de células MHC I CAR-T com células alvo resulta na produção de citocinas Concentração relativa de citocinas nos meios a partir de uma co-cultura de 48 horas de células MHC I CAR-T (B2m-CD3z n = 1; B2m-41BBz e B2m-CD28z n = 2) e células alvo SupT1.HAlH- TCR na proporção 2: l efetor para alvo. As células CAR-T foram pulsadas com um peptídeo recombinante HAlIH em uma faixa de concentrações antes da semeadura com os alvos. O controle de NT foi utilizado para normalizar as concentrações de citocinas. A linha vermelha indica o nível de citocinas produzidas pelo controle do NT.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO CO-LOCALIZANDO B2M COM UM DOMÍNIO DE SINALIZAÇÃO

INTRACELULAR

[0053] A presente invenção fornece uma célula que compreende; (i) um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um receptor de células T transgênico (TCR); e (ii) um polipeptídeo capaz de co-localizar um componente da microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular dentro da célula.

[0054] Neo-epítopos ou alo-antígenos são apresentados em moléculas de classe I do MHC. O MHC classe I é formado pela montagem de beta-2-microglobulina (B2M) com uma proteína MHC classe I que foi carregada com um peptídeo. Enquanto as proteínas do MHC classe I são altamente polimórficas, o B2M é conservado.

[0055] A molécula de MHC de classe I é composta por 4 alças do tipo imunoglobulina. A proteína MHC fornece três voltas (al, àa2 e a3). Uma proteína separada, B2M, fornece o quarto loop (veja a Figura 1 (a)). B2M fica ao lado da cadeia a3 do MHC classe I na superfície celular. Ao contrário de a3,B2M endógeno não possui região transmembranar. Diretamente acima de B2M (ou seja, mais distante da célula) fica a cadeia al, que fica ao lado da a2.

[0056] Uma sequência de aminoácidos B2M ilustrativa é mostrada como SEQ ID NO: 1:

[0057] SEQ ID NO: 1

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNF LNCYVSGFHPSD IEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLS QPKIVKWDRDM

[0058] Uma sequência polipeptídica B2M para utilização na presente invenção pode compreender a sequência mostrada como SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante com pelo menos 80% de identidade de sequência. A variante mantém a capacidade de se reunir com uma proteína MHC classe I e facilita a apresentação produtiva de peptídeos pelo complexo MHC classe I.

[0059] A variante da SEQ ID NO: 1 pode ter pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência, desde que a sequência variante retenha a capacidade de se reunir com uma proteína MHC classe I e facilite a apresentação produtiva de peptídeos pelo MHC classe I complexo.

[0060] O percentual de identidade 1 entre duas sequências polipeptídicas pode ser facilmente determinada por programas como o BLAST, que está disponível gratuitamente em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Adequadamente, fe) percentual de identidade é determinado em toda a referência e / ou na sequência de referência.

[0061] Como aqui utilizado, "capaz de co-localizar um componente B2M de uma molécula de classe I do MHC com um domínio de sinalização intracelular dentro da célula" significa que, quando um TCR em uma célula T reativa se liga a um complexo peptídeo / MHC em uma célula da presente invenção, o polipeptídeo co-localiza o componente B2M com o domínio de sinalização intracelular, de modo que o domínio de sinalização intracelular transmita um sinal de ativação na célula da presente invenção.

[0062] Adequadamente, o sinal de ativação que é induzido estimula a célula da presente invenção a esgotar a célula T reativa que reconhece o complexo peptídeo / MHC. Tal depleção é tipicamente alcançada por mecanismos de morte citotóxicos mediados por células.

[0063] Métodos adequados para determinar a ativação dos mecanismos de morte citotóxicos em uma célula incluem, mas não estão limitados a, ensaios de liberação de cromo, ensaios de morte baseados em citometria de fluxo, medindo a liberação de citocinas após encontro de efetor e alvo (por exemplo, ELISA ou matriz de esferas de citocinas), demonstração de des-granulação ou ativação em células efetoras após encontro de células efetoras-alvo por citometria de fluxo.

B2M concebido

[0064] Em algumas concretizações, o polipeptídeo capaz de co-localizar o componente B2M da molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular é um B2M manipulado compreendendo ainda um endodomínio compreendendo um domínio de sinalização intracelular.

[0065] Um tal componente B2M concebido compreende um polipeptídeo B2M e é capaz de montar com uma proteína MHC classe I para facilitar a apresentação produtiva de peptídeos pelo complexo MHC classe I. Além disso, o B2M manipulado compreende ainda um domínio de sinalização intracelular que é capaz de transmitir um sinal de ativação após a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC que compreende o B2M manipulado. O domínio de sinalização intracelular pode ser um domínio de sinalização intracelular como aqui descrito.

[0066] Os polipeptídeos B2M concebidos são descritos em Margalit et al. (Int. Immunol. 15, 1379-1387 (2003)) Esses polipeptídeos de MHC / B2M concebidos incluem um peptídeo ligado ao B2M manipulado, de modo que o MHC classe I apresente exclusivamente o peptídeo ligado. Uma célula T que expressa tal construção esgotará seletivamente qualquer célula T reativa que reconheça o complexo peptídeo / MHC selecionado. Deste modo, a imunossupressão seletiva contra um antígeno conhecido pode ser executada pela depleção de células T cognatas.

[0067] Em contraste, qualquer peptídeo que é naturalmente apresentado pelo MHC classe I será apresentado pelos presentes complexos do MHC classe I. Isto vantajosamente permite que uma célula que expresse os presentes complexos de MHC de classe I esgote as células T reativas endógenas que reconhecem qualquer complexo de peptídeo / MHC que é apresentado pela célula da presente invenção.

[0068] O complexo MHC classe I da presente invenção pode apresentar um peptídeo derivado do receptor quimérico de antígeno (CAR) ou de um receptor transgênico de células T (TCR) expresso pela célula. Alternativamente, pode apresentar um peptídeo derivado de outra proteína não endógena que a célula é manipulada para expressar, como um gene suicida, receptor quimérico de citocina ou proteína modificadora de transdução de sinal.

[0069] Um gene suicida é um mecanismo geneticamente codificado que permite a destruição seletiva de células T adotivamente transferidas diante de toxicidade inaceitável. Dois genes suicidas foram testados em estudos clínicos: o vírus do herpes simples timidina quinase (HSV-TK) e caspase 9 induzível (iCasp9). A célula da invenção pode, por exemplo, expressar um desses genes suicidas ou um sistema alternativo, como um dos descritos nos documentos W02013 / 153391, WO2016 / 135470 ou WO2016 / 166521.

[0070] os receptores de citocinas quiméricos fornecem um sinal de citocinas para a célula. Eles podem ser constitutivamente ativos ou induzidos por uma molécula, como um fator secretado por tumor, proteína da membrana celular ou uma quimiocina. Ambos os tipos de receptores de citocinas quiméricos são descritos em mais detalhes no documento WO2017 / 029512.

[0071] Uma proteína modificadora de transdução de sinal pode, por exemplo, ser uma molécula SHP-l ou SHP-2 truncada que compreende ou ambos os domínios SH2, mas não possui um domínio fosfatase. Tais moléculas SHP-1 e SHP-2 negativas dominantes competem com SHP-l e / ou SHP-2 endógenas pela ligação a pITIMs em moléculas inibidoras de receptores imunes, como PDl. Isso reduz a desfosforilação dos domínios ITAM pelo SHP-1 / SHP-2, bloqueando ou reduzindo a inibição da ativação imune mediada por essas moléculas. Estas e outras proteínas modificadoras da transdução de sinal são descritas nos documentos WO2016 / 193696 e WO2018 /

096361.

[0072] Os polipeptídeos endógenos de B2M não compreendem um domínio transmembranar. Adequadamente, oO presente B2M manipulado compreende ainda um domínio transmembranar localizado entre o polipeptídeo B2M e o endodomínio compreendendo um domínio de sinalização intracelular.

[0073] O domínio transmembranar pode ser qualquer domínio peptídico que seja capaz de inserir e estender a membrana celular. Um domínio transmembranar pode ser qualquer estrutura proteica que seja termodinamicamente estável em uma membrana. Esta é tipicamente uma hélice alfa que compreende vários resíduos hidrofóbicos. O domínio transmembranar de qualquer proteína transmembranar pode ser usado para fornecer a porção transmembranar da invenção. A presença e extensão de um domínio transmembranar de uma proteína podem ser determinadas pelos especialistas na técnica usando o algoritmo TMHMM (http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Além disso, dado que o domínio transmembranar de uma proteína é uma estrutura relativamente simples, isto é, uma sequência polipeptídica prevista para formar uma hélice alfa hidrofóbica de comprimento suficiente para abranger a membrana, um domínio TM projetado artificialmente também pode ser usado (US 7052906 Bl descreve componentes transmembranares). Por exemplo, o domínio transmembranar pode compreender uma hélice alfa hidrofóbica. O domínio transmembranar pode ser derivado de CD8alpha ou CD28.

[0074] A título de exemplo, os domínios transmembranares de CD8alpha e CD28 são mostrados como SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

[0075] SEQ ID NO: 28 (domínio transmembranar alfa CD8)

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY

[0076] SEQ ID NO: 2

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVR

[0077] Um B2M concebido ilustrativo para uso na presente invenção é mostrado como SEQ ID NO: 3. Esta sequência polipeptídica compreende um domínio B2M, um domínio transmembranar e um endodomínio CD3-7 intracelular.

[0078] SEQ ID NO: 3

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNF LNCYVSGFHPSDIEVDL LKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRD MIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYSRSADAPAYQQGONQLYNELNLGRREEYDVLDKRR GRDPEMGGKPORRKNPOEGLYNELQOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQOGLSTAT

KDTYDALHMOALPPR Negrito - domínio B2M Itálico - Domínio transmembranar Padrão - endodomínio CD37Z

[0079] Uma sequência polipeptídica B2M manipulada para uso na presente invenção pode compreender a sequência mostrada como SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma com pelo menos 80% de identidade de sequência. A variante mantém a capacidade de se reunir com uma proteína MHC classe [I,

facilitar a apresentação produtiva de peptídeos pelo complexo MHC classe I e transmitir um sinal de ativação após a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC que compreende o B2M manipulado.

[0080] A variante da SEQ ID NO: 3 pode ter pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência, desde que a sequência variante retenha a capacidade de montar com uma proteína MHC classe I, facilite a apresentação produtiva de peptídeos pelo O complexo MHC classe I e transmite um sinal de ativação após a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC compreendendo o B2M manipulado.

Polipeptídeo ligado a B2M / CD3

[0081] Em outras concretizações da presente invenção, o polipeptídeo capaz de co-localizar o componente B2M da molécula MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular é um polipeptídeo B2M ligado a um componente do complexo TCR.

[0082] O CD3 é um co-receptor de células T envolvido na ativação de células T citotóxicas e células T-auxiliares. É formado por um complexo proteico composto por quatro cadeias distintas. Como usado aqui, o termo "complexo CD3" também inclui a cadeia CD3 7. Nos mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3y, uma cadeia CD35 e duas cadeias CD3re. Essas cadeias se associam ao TCR para gerar um complexo de TCR capaz de produzir um sinal de ativação nos linfócitos T.

[0083] As cadeias CD36C, CD3y, CD3ô e CD3e são proteínas de superfície celular altamente relacionadas da superfamília de imunoglobulinas contendo um único domínio de imunoglobulina extracelular. A região transmembranar das cadeias CD3 contém um número de resíduos de aspartato com carga negativa, uma característica que permite que essas cadeias se associem às cadeias de TCR carregadas positivamente. As caudas intracelulares das moléculas CD3 contêm um único motivo conservado conhecido como motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM), que está envolvido na sinalização do TCR.

[0084] O polipeptídeo B2M ligado a um componente do complexo TCR é capaz de se reunir com o complexo MHC classe I e facilitar a apresentação produtiva de peptídeos pelo complexo MHC classe I. Além disso, o componente TCR / CD3 é capaz de montar com o complexo TCR / CD3. Portanto, a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC compreendendo o B2M vinculado a um componente do complexo TCR acionará a sinalização através do complexo CD3 / TCR compreendendo o componente CD3 que está vinculado ao B2M (consulte a Figura 2 (c)).

[0085] O polipeptídeo B2M pode ser ligado ao TCR ou a um componente do complexo CD3. Adequadamente, o polipeptídeo B2M pode ser ligado a um polipeptídeo TCR manipulado que não possui um domínio variável. A título de exemplo, o polipeptídeo B2M pode ser ligado a uma cadeia pré-T-alfa manipulada. A cadeia pré-T-alfa é expressa no desenvolvimento de células T durante a seleção tímica e não possui um domínio variável.

[0086] Uma sequência ilustrativa de uma cadeia pré- T-alfa manipulada é mostrada como SEQ ID NO: 30.

[0087] SEQ ID NO: 30

MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQOMVVVCLVLDVAPPGLDS PIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWINLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSR STOPMHLSGEASTARTCPOEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAG PLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPOPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGE

GSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLOAGAA Negrito - domínio do sinal Itálico - Domínio transmembranar

[0088] A cadeia pré-T-alfa pode não ter uma sequência de sinal como mostrado na SEQ ID NO: 30.

[0089] O domínio TM nativo da cadeia pré-T-alfa pode ser retido ou substituído pelo de uma âncora polar sem sinalização, o endodomínio do CD3-Z e / ou um sinal coestimulador, como CD28 e / ou 41BB. Endodomínios de sinalização adequados e combinações dos mesmos são aqui descritos.

[0090] Os polipeptídeos B2M ilustrativos ligados a uma cadeia TCR que são adequados para uso na presente invenção são mostrados como SEQ ID NO: 31 e 32. Essas sequências polipeptídicas compreendem um domínio B2M ligado ao terminal N de uma cadeia pré-T-alfa e compreendem um domínio transmembranar pré-T-alfa nativo ou um endodomínio de sinalização 41 BB-CD3zeta, respectivamente.

[0091] SEQ ID NO: 31 (B2M-L-PreTalpha)

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQORTPKIQVYSRHPAENGKSNF LNCYVSGFHPSDIEVDL LKNGERIEKVEHSDLSF SKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSOQPKIVKWDRD MSGGGGSGGGGSGGGGSTPFPSLAPPIMLLVDGKOQOMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSA GNGSALDAFTYGPSPATDGTWINLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTOPMH LSGEASTARTCPOEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPA TTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPOPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSS YPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLOAGAA

Negrito - domínio B2M Itálico - domínio do ligante Padrão - PreTalpha

[0092] SEQ ID NO: 32 (B2M-L-PreTalpha-41BB-2Z)

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNF LNCYVSGFHPSDIEVDL LKNGERIEKVEHSDLSF SKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSOQPKIVKWDRD MSGGGGSGGGGSGGGGSTPFPSLAPPIMLLVDGKOQOMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSA GNGSALDAFTYGPSPATDGTWINLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTOPMH LSGEASTARTCPOEPLRGTPGGIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYI FKQPFMRPVOTTOEEDGCSCRFPEEEERVKFESRSADAPAYQOQOGONQOLYNELNLGRREEY DVLDKRRGRDPEMGGKPORRKNPQOQEGL YNELQKDKMAEAY SE IGMKGERRRGKGHDGLY

OGLSTATKDTYDALHMOALPPR Negrito - domínio B2M Itálico - domínio do vinculador Padrão - PreTalpha Sublinhado - 41BB-CD3z endodomínio

[0093] Um polipeptídeo B2M ligado a um componente do complexo TCR e adequado para uso na presente invenção pode compreender a sequência mostrada como SEQ ID NO: 31 ou 32, ou uma variante do mesmo com pelo menos 80% de identidade de sequência. A variante possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência mantém a capacidade de se reunir com uma proteína MHC classe I e facilita a apresentação produtiva de peptídeos pelo complexo MHC classe IT. Também permite que um sinal de ativação seja transmitido após a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC compreendendo o B2M manipulado.

[0094] A sequência variante da SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32 pode ter pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência, desde que a sequência variante retenha a capacidade de montar com uma proteína MHC classe I, facilite a apresentação produtiva de peptídeos pelo complexo MHC classe I e transmita um sinal de ativação após a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC compreendendo o B2M manipulado.

[0095] Adequadamente, o polipeptídeo B2M está ligado a um componente do complexo CD3. O componente do complexo CD3 ao qual um polipeptídeo B2M está ligado pode ser selecionado a partir de CD3-zeta, CD3-epsilon, CD3-gama e CD3-delta.

[0096] Adequadamente, o componente do complexo CD3 ao qual um polipeptídeo B2M está ligado é CD3-zeta.

[0097] Adequadamente, o componente do complexo CD3 ao qual um polipeptídeo B2M está ligado é o CD3-epsilon.

[0098] Adequadamente, o componente do complexo CD3 ao qual um polipeptídeo B2M está ligado é CD3-gama.

[0099] Adequadamente, o componente do complexo CD3 ao qual um polipeptídeo B2M está ligado é o delta do CD3.

[00100] Exemplos de sequências de aminoácidos CD3C, CD3y, CD35 e CD3e humanas são mostrados como SEQ ID NO: 4- 7, respectivamente. A sequência polipeptídica CD3 para uso na presente invenção pode compreender a sequência mostrada como uma das SEQ ID NO: 4-7 ou uma variante da mesma com pelo menos 80% de identidade de sequência. Por exemplo, a variante pode ter pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com uma das SEQ ID NO: 4-7.

[00101] SEQ ID NO: 4 (CD36 - aminoácidos 1-21 fornecem um peptídeo sinal que pode ser excluído)

MKWKALF TAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILF IYGVILTALFLRVKFSRSA DAPAYQQGONQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPORRKNPOEGL YNELQOKDK MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YOGLSTATKDTYDALHMOALPPR

[00102] SEQ ID NO: 5 (CD3y - aminoácidos 1-21 fornecem um peptídeo sinal que pode ser excluído)

MEQGKGLAVLILAIILLOGTLAQSIKGNHLVKVYDYOQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDG KMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQONKSKPLQVYYRMCONCIELNAATISGF LFAEIVSIFVLAVGVYFIAGODGVROSRASDKOTLLPNDOLYQOPLKDREDDOYSHLOGN QLRRN

[00103] SEQ ID NO: 6 (CD35 - aminoácidos 1-21 fornecem um peptídeo sinal que pode ser excluído)

MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVEVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLD LGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVOQVHYRMCOSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLL ALGVFCFAGHETGRLSGAADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK

[00104] SEQ ID NO: 7 (CD3e - aminoácidos 1-21 fornecem um peptídeo sinal que pode ser excluído)

MOSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITOTPYKVSISGTTVILTCPOYPGSEILW QHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARV CENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRORGONK ERPPPVPNPDYEPIRKGORDLYSGLNQORRI

[00105] O polipeptídeo B2M pode ser ligado ao componente CD3 por qualquer meio adequado. Por exemplo, oO polipeptídeo B2M pode ser fundido ao componente do complexo CD3 por um peptídeo ligante.

[00106] os peptídeos ligantes adequados são conhecidos na arte. Por exemplo, uma gama de peptídeos ligantes adequados é descrita por Chen et al. (Adv Drug Deliv Rev. 2013, 15 de outubro; 65 (10): 1357-1369 - consulte a Tabela 3 em particular).

[00107] Um ligante adequado é (SGGGG)nNn (SEQ ID NO:

29), o qual que compreende uma ou mais cópias da SEQ ID NO:

29. Por exemplo, um peptídeo ligante adequado é mostrado como SEQ ID NO: 8.

[00108] SEQ ID NO: 8 - SGGGGSGGGGESCEGES

[00109] Adequadamente, o polipeptídeo B2M está ligado ao ectodomínio do componente do complexo CD3. Adequadamente, o polipeptídeo B2M está ligado ao terminal N do componente do complexo CD3.

[00110] Os polipeptídeos B2M ilustrativos ligados a um componente do complexo CD3 que são adequados para uso na presente invenção são mostrados como SEQ ID NO: 9 e 10. Essas sequências polipeptídicas compreendem um domínio B2M ligado ao terminal N de um polipeptídeo CD3e ou a Polipeptídeo CD3, respectivamente.

[00111] SEQ ID NO: 9 (B2M-CD3e£)

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGE RIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMSGGGGSGGG GSGGGGSQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQOQYPGSEILWQOHNDKNIGGDEDDKNIGSD EDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANEF YL YLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITG GLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRORGONKERPPPVPNPDYEPIRKGORDLYSGLNORR

I Negrito - domínio B2M Itálico - domínio do vinculador Padrão - CD3E

[00112] SEQ ID NO: 10 (B2M-CD37)

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNF LNCYVSGFHPSDIEVDL LKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRD MSGGGGSGGGGSGGGGSQSFGLLDPKLCYLLDGILF IYGVILTALFLRVKFSRSADAPA YOEEGEONQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPORRKNPOEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQOGLSTATKDTYDALHMOALPPR

Negrito - domínio B2M Itálico - domínio do vinculador Padrão - CD3E

[00113] Um polipeptídeo B2M ligado a um componente do complexo CD3 e adequado para uso na presente invenção pode compreender a sequência mostrada como SEQ ID NO: 9 ou 10, ou uma variante do mesmo com pelo menos 80% de identidade de sequência. A variante possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência mantém a capacidade de se reunir com uma proteína MHC classe I e facilita a apresentação produtiva de peptídeos pelo complexo MHC classe I. Também permite que um sinal de ativação seja transmitido após a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC compreendendo o B2M manipulado.

[00114] A sequência variante da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 pode ter pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência, desde que a sequência variante retenha a capacidade de montar com uma proteína MHC classe I, facilite a apresentação produtiva de peptídeos pelo complexo MHC classe I e transmita um sinal de ativação após a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC compreendendo o B2M manipulado.

[00115] Em um aspecto independente adicional, a presente invenção fornece um polipeptídeo B2M manipulado que está ligado a um componente do complexo CD3, como aqui descrito.

[00116] A presente invenção fornece ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo B2M manipulado ligado a um componente do complexo CD3, como aqui descrito. A invenção também fornece um vetor compreendendo o referido polinucleotídeo.

[00117] Além disso, a presente invenção fornece uma célula que compreende um polipeptídeo B2M manipulado ligado a um componente do complexo CD3 ou um polinucleotídeo ou um vetor que codifica o referido polipeptídeo B2M manipulado. Molécula biespecífica de ligação B2M / TCR

[00118] Em outras concretizações da presente invenção, o polipeptídeo capaz de co-localizar o componente B2M da molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular pode ser um polipeptídeo biespecífico que compreende; (i) um primeiro domínio de ligação que é capaz de se ligar ao polipeptídeo B2M e (ii) um segundo domínio de ligação que é capaz de se ligar a um polipeptídeo compreendendo um domínio de sinalização intracelular ou um componente do complexo CD3.

[00119] Quando expressa na superfície celular, a presente molécula biespecífica co-localiza o MHC classe I e o TCR e facilita a sinalização do TCR em uma célula da presente invenção após a ligação de um TCR em uma célula T diferente ao complexo peptídeo / MHC ligado por a presente molécula biespecífica.

[00120] Moléculas biespecíficas foram desenvolvidas em vários formatos diferentes. Uma das mais comuns é uma fusão que consiste em dois fragmentos variáveis de cadeia única (scFvs) de diferentes anticorpos.

[00121] O primeiro e / ou o segundo domínios de ligação da presente molécula biespecífica podem ser domínios de ligação baseados em anticorpos ou imunoglobulinas.

[00122] Como aqui utilizado, "anticorpo" significa um polipeptídeo que possui um local de ligação ao antígeno que compreende pelo menos uma região determinante da complementar idade CDR. O anticorpo pode compreender 3 CDRs e ter um local de ligação ao antígeno que é equivalente ao de um anticorpo no domínio (dAb). O anticorpo pode compreender 6 CDRs e ter um local de ligação ao antígeno que é equivalente ao de uma molécula de anticorpo clássica. O restante do polipeptídeo pode ser qualquer sequência que forneça um suporte adequado para o local de ligação ao antígeno e o exiba de uma maneira apropriada para que ele se ligue ao antígeno. O anticorpo pode ser uma molécula de imunoglobulina inteira ou uma parte dela, como um fragmento Fab, F(ab)'2, Fv, Fv de cadeia única (ScFv), nanocorpo ou domínio variável de cadeia única (que pode ser uma cadeia VH ou VL, tendo 3 CDRs). O anticorpo pode ser um anticorpo bifuncional. O anticorpo pode ser não humano, quimérico, humanizado ou totalmente humano.

[00123] Alternativamente, o primeiro e / ou o segundo domínios de ligação da presente molécula biespecífica podem compreender domínios que não são derivados de ou com base em uma imunoglobulina. Um número de proteínas de repetição (DRPs) projetadas por "anticorpos miméticos" foi desenvolvido para explorar as habilidades de ligação de polipeptídeos que não são anticorpos. Tais moléculas incluem proteínas de repetição ricas em ancirina ou leucina, por exemplo, DARPins (Proteínas de Repetição de Ankyrin Projetadas), Anticalinas, Avimeros e Versacorpos.

[00124] O primeiro domínio de ligação da presente molécula biespecífica é capaz de se ligar a um polipeptídeo

B2M.

[00125] Em particular, o primeiro domínio de ligação pode ser capaz de se ligar a B2Mb. Os domínios de ligação a B2Mb adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a sequência polipeptídica mostrada como SEQ ID NO:

11.

[00126] SEQ ID NO: 11

EVOLOQQOSGAELVKPGASVKLSCTPSGENVKDTYIHWVKORPKOGLEWIGRIDPSDGDIK YDPKFOGKATITADTSSNTVSLOLSSLTSEDTAVYYCARWFGDYGAMNYWGOGTSVTVS SGGGGSCGGGGSCGGGGSDILMTOSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQOQOKPGKS POLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSLKIRTLOAEDEVSYYCOQLYSKPYTFGGGT KLEIKR

[00127] Este domínio de ligação a B2Mb pode ser gerado a partir do hibridoma BBM1 descrito por Brodsky et al. (Eur. J. Immunol; 9; 536-545; 1979) e Parham et al. (J. Biol. Chem.; 258; 6179-6186; 1983).

[00128] o primeiro domínio de ligação pode compreender as regiões determinantes da complementaridade (CDRs) da sequência scFv mostrada como SEQ ID NO: 11.

[00129] O primeiro domínio pode compreender uma sequência de scFv, como a mostrada como SEQ ID NO: 11. O segundo domínio pode compreender uma variante de uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11 e liga B2M, em particular, B2Mb.

[00130] o primeiro domínio de ligação pode compreender uma ou mais CDRs da sequência mostrada como SEQ ID NO: 11. O segundo domínio de ligação pode compreender CDR3 da cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e / ou CDR3 da cadeia leve da SEQ ID NO: 11. O segundo domínio de ligação pode compreender todas as 6 CDRs da SEQ ID NO: 11. As sequências das CDRs da SEQ ID NO: 11 são mostradas abaixo.

[00131] Cadeia pesada CDR1: (SEQ ID NO: 33) - GFNVKDT CDR2: (SEQ ID NO: 34) - DPSDGD CDR3: (SEQ ID NO: 35) - WFGDYGAMNY

[00132] Cadeia leve CDR1: (SEQ ID NO: 36) - LASQTIGTWLA CDR2: (SEQ ID NO: 37) - AATSLAD CDR3: (SEQ ID NO: 38) - QQOLYSKPYT

[00133] o primeiro domínio de ligação pode compreender um scFv que compreende as sequências de CDR da SEQ ID NO: 11 (como mostrado na SEQ ID NO: 33-38).

[00134] Apenas a título de exemplo, um outro hibridoma que fornece anticorpos contra B2M é descrito por Mhashilkar ei. (Gene Ther.; 995); 207-319; 2002). O hibridoma BB7.7 descrito por Mhashilkar et al. Verificou-se expressar na sequência variável da cadeia pesada e duas possíveis sequências variáveis da cadeia leve. O primeiro domínio de ligação pode compreender um scEFV gerado a partir do BB7.7 (mostrado como SEQ ID NO: 39-40).

[00135] SEQ ID NO: 39

QVEOLQOESGAELARPGASVKLSCKASGYTF TSHWMOWVRORPGOGLEWIGTIYPGDGDTR YTONFKGKATLTADKSSTTAYLHLSSLSSEDSAVYYCARDEITTVVPRGFAYWGOGTSV TVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTOTPSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYOOKP DGTIKLLIYYTSRLYSGVPPRFSGSGAGTDYSLTISNLEQEDIATYFCOQGNVIPYTFG GGTKLEMKR

[00136] SEQ ID NO: 40

QVOLQOQESGAELTRPGASVKLSCKASGYTF TSHWMOWVRORPGOGLEWIGTIYPGDGDTR YTONFKGKATLTADKSSTTAYLHLSSLSSEDSAVYYCARDEITTVVPRGFAYWGOGTLV TVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVLTOSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQOQOKP GNIPOLLIYKASNLHTGVPSRFSGRGSGTGFTLTISSLOPEDIGTYYCOQOGOSYPLTFG GGTKLEMKR

[00137] o primeiro domínio de ligação pode compreender a sequência scFv mostrada como SEQ ID NO: 11, 39 ou 40 ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência, o que retém a capacidade de se ligar a B2M.

[00138] Uma sequência variante da SEQ ID NO: 11, 39 ou 40 pode ter pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência e ter recursos equivalentes ou aprimorados de ligação ao B2M como uma sequência mostrada como SEQ ID NO: 11, 39 ou 40.

[00139] O segundo domínio da presente molécula biespecífica é capaz de se ligar a um polipeptídeo compreendendo um domínio de sinalização intracelular ou um componente do complexo CD3. Em particular, o segundo domínio pode ser capaz de se ligar a CD3 na superfície da célula T. A este respeito, o segundo domínio pode compreender um anticorpo específico para CD3 ou TCR ou parte dele.

[00140] O segundo domínio pode compreender as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da sequência scFv mostrada como SEQ ID NO: 12.

[00141] O segundo domínio pode compreender uma sequência de scFv, como a mostrada como SEQ ID NO: 12. O segundo domínio pode compreender uma variante dessa sequência que possui pelo menos 80% de identidade de sequência e se liga a CD3.

[00142] o segundo "domínio pode compreender -— um anticorpo ou parte dele que se liga especificamente a CD3, como OKT3, WT32, anti-leu-4, UCHT-l1, SPV-3TA, TR66, SPV-T3B ou variantes afinadas dos mesmos.

[00143] O segundo domínio da molécula biespecífica da invenção pode compreender todo ou parte do anticorpo monoclonal OKT3, que foi o primeiro anticorpo monoclonal aprovado pelo FDA. O OKT3 está disponível no ATCC CRL 8001. As sequências de anticorpos são publicadas no documento US

7.381.803.

[00144] O segundo domínio pode compreender um ou mais CDRs de OKT3. O segundo domínio de ligação pode compreender CDR3 da cadeia pesada de OKT3 e / ou CDR3 da cadeia leve de OKT3. O segundo domínio de ligação pode compreender todas as 6 CDRs de OKT3, como mostrado abaixo.

[00145] Cadeia pesada CDR1: (SEQ ID NO: 13) KASGYTFTRYTMH CDR2: (SEQ ID NO: 14) INPSRGYTNYNOKFKD CDR3: (SEQ ID NO: 15) YYDDHYCLDY

[00146] Cadeia leve CDR1: (SEQ ID NO: 16) SASSSVSYMN CDR2: (SEQ ID NO: 17) RWIYDTSKLAS CDR3: (SEQ ID NO: 18) QQWSSNPET

[00147] O segundo domínio de ligação pode compreender um scFv que compreende as sequências de CDR de OKT3. O segundo domínio de ligação pode compreender a sequência scFv mostrada abaixo como SEQ ID NO: 12 ou 41 ou uma variante do mesmo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência, que mantém a capacidade de se ligar a CD3.

[00148] SEQ ID NO: 12

QVOLOQESGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKORPGOGLEWIGY INPSRGYTN YNOKFKDKATLTTDKSSSTAYMOLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGOGTTLTVS SSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQOQOKSGTS PKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGT KLEINR

[00149] SEQ ID NO: 41

QIVLTOSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQOQOKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPA HFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCOQWSSNPFTFGSGTKLEINRSSSGGGGSGGG GSGGGGSQVOLOQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKORPGOGLEWIGYIN PSRGYTNYNOKFKDKATLTTDKSSSTAYMOLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGO GTTLTVSS

[00150] As SEQ ID NO: 12 e 41 fornecem arquiteturas alternativas de um scFV adequado para uso na presente invenção. A SEQ ID NO: 12 é fornecida como um arranjo VL-VH. SEQ ID NO: 41 é fornecida como um arranjo VH-VL.

[00151] Uma sequência variante da SEQ ID NO: 12 ou 41 pode ter pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência e ter recursos equivalentes ou aprimorados de ligação a CD3 como a sequência mostrada como SEQ ID NO: 12 ou 41.

[00152] A molécula biespecífica da presente invenção pode compreender uma sequência espaçadora para conectar o primeiro domínio ao segundo domínio e separar espacialmente os dois domínios.

[00153] Por exemplo, o primeiro e o segundo domínios de ligação podem ser conectados via um ligante peptídico de cinco resíduos curtos (GGGGS).

[00154] A sequência espaçadora pode, por exemplo, compreender uma dobradiça laGl ou uma haste CD8. O ligante pode, alternativamente, compreender uma sequência de ligante alternativa que possui propriedades semelhantes de comprimento e / ou espaçamento de domínio como uma dobradiça l1gGl ou uma haste CD8.

[00155] O espaçador pode ser um espaçador curto, por exemplo, um espaçador que compreende menos de 100, menor que 80, menor que 60 ou menor que 45 aminoácidos. O espaçador pode ser ou compreender uma dobradiça l1gGl ou uma haste CD8 ou uma versão modificada da mesma.

[00156] Exemplos de sequências de aminoácidos para esses ligantes são dados abaixo:

[00157] SEQ ID NO: 19 (IgGl hinge):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPKSGGGGS

[00158] SEQ ID NO: 20 (CD8 stalk):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

[00159] O talo CD8 tem uma sequência tal que pode induzir a formação de homodímeros. Se isto não for desejado, um ou mais resíduos de cisteína podem ser substituídos ou removidos da sequência do caule CD8. A molécula biespecífica da invenção pode incluir um espaçador que compreende ou consiste na sequência mostrada como SEQ ID NO: 20 ou uma sua variante com pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência, desde que a variante sequência é uma molécula que causa espaçamento —. aproximadamente equivalente do primeiro e segundo domínios e / ou que a sequência variante causa homodimerização da molécula biespecífica.

[00160] A molécula biespecífica da invenção pode ter a fórmula geral: Primeiro domínio - espaçador - segundo domínio.

[00161] O espaçador também pode compreender um ou mais motivos de ligação para introduzir uma quebra de corrente. Uma quebra de cadeia separa dois domínios distintos, mas permite orientação em ângulos diferentes. Tais sequências incluem a sequência SDP e a sequência SGGGSDP (SEQ ID NO: 21).

[00162] O ligante pode compreender um ligante serina- glicina, tal como SGGGGS (SEQ ID NO: 22).

[00163] O espaçador pode fazer com que a molécula biespecífica forme um homodímero, por exemplo, devido à presença de um ou mais resíduos de cisteína no espaçador, o que pode resultar em uma ligação dissulfeto com outra molécula compreendendo o mesmo espaçador.

[00164] A molécula biespecífica pode ser ligada à membrana. Por outras palavras, a molécula biespecífica pode compreender um domínio transmembranar tal que seja localizado na membrana celular após expressão na célula da presente invenção.

[00165] A título de exemplo, o domínio transmembranar pode um domínio transmembranar como aqui descrito. Por exemplo, o domínio transmembranar pode compreender uma hélice alfa hidrofóbica. O domínio transmembranar pode ser derivado de CD8alpha ou CD28.

[00166] A título de exemplo, os domínios transmembranares de CD8alpha e CD28 são mostrados aqui como SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

[00167] A molécula biespecífica da invenção pode ter a fórmula geral: Primeiro domínio - espaçador - segundo domínio - domínio transmembranar; ou Domínio transmembranar - primeiro domínio - espaçador - segundo domínio.

[00168] Uma molécula biespecífica ilustrativa adequada para uso na presente invenção é mostrada como SEQ ID NO: 23. Estas sequências polipeptídicas compreendem um domínio de ligação a B2M ligado a um domínio de ligação a CD3 e a um transmembranar.

[00169] SEQ ID NO: 23 (aB2M-L-aCD3-TM-A)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGEVOLOOSGAELVKPGASVKLSCTPSGENVKDTYIHWVKO RPKQOGLEWIGRIDPSDGDIKYDPKFOGKATITADTSSNTVSLQOLSSLTSEDTAVYYCAR WFGDYGAMNYWGOGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDILMTOSPASQSASLGESVTITC LASQTIGTWLAWYOQOKPGKSPOLLIYAATSLADGVPSRESGSGSGTKFSLKIRTLOAED EVSYYCOQLYSKPYTFGGGTKLEIKRSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTOSPAIMSASPGE KVTMTCSASSSVSYMNWYQOQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISG MEAEDAATYYCQQWSSNPEFTFGSGTKLEINRSSSGGGGSGGGGSGGGGSEQVELEESGAE LARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKORPGOGLEWIGY INPSRGYTNYNOKFKDKAT LTTDKSSSTAYMOLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGEGTTLTVSSSGGGGSGGG

GSGGGGSIYIWAPLATCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRP Negrito - Sinal Normal - aB2M VH Itálico - Ligante Sublinhado - aB2M VL Negrito / Sublinhado - aCD3 VL Negrito / Itálico / Sublinhado - aCD3 VH Sublinhado - Transmembrana e âncora

[00170] Uma molécula biespecífica adequada para uso na presente invenção pode compreender a sequência mostrada como SEQ ID NO: 23, ou uma variante da mesma com pelo menos 80% de identidade de sequência. A variante possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência mantém a capacidade de se ligar a B2M e um domínio de sinalização intracelular ou um componente do complexo CD3. A presente molécula biespecífica também permite que um sinal de ativação seja transmitido após a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC compreendendo o B2M que é ligado pela molécula biespecífica.

[00171] A sequência variante da SEQ ID NO: 23 pode ter pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência, desde que a sequência variante retenha a capacidade de ligar B2M e um domínio de sinalização intracelular ou um componente do CD3 complexo; e permitir que um sinal de ativação seja transmitido após a ligação de um TCR ao complexo peptídeo / MHC compreendendo o B2M que é ligado pela molécula biespecífica.

[00172] Em um aspecto independente adicional, a presente invenção fornece uma molécula biespecífica que compreende: (i) um primeiro domínio de ligação que é capaz de se ligar ao polipeptídeo B2M e (ii) um segundo domínio de ligação que é capaz de se ligar a um polipeptídeo que compreende um intracelular domínio de sinalização ou um componente do complexo CD3 como aqui descrito.

[00173] A presente invenção fornece ainda uma molécula biespecífica que codifica polinucleotídeo compreendendo: (i) um primeiro domínio de ligação que é capaz de se ligar ao polipeptídeo B2M e (ii) um segundo domínio de ligação que é capaz de se ligar a um polipeptídeo compreendendo um domínio de sinalização intracelular ou um componente do complexo CD3 como aqui descrito. A invenção também fornece um vetor compreendendo o referido polinucleotídeo.

[00174] Além disso, a presente invenção fornece uma célula que compreende uma molécula biespecífica como aqui descrito; ou um polinucleotídeo ou um vetor que codifica o referido polipeptídeo B2M concebido.

DOMÍNIO DE SINALIZAÇÃO INTRACELULAR

[00175] A presente invenção envolve o fornecimento de um polipeptídeo capaz de co-localizar um componente da microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular dentro da célula.

[00176] Um domínio de sinalização intracelular como aqui utilizado refere-se a uma porção de transmissão de sinal de um endodomínio.

[00177] O domínio de sinalização intracelular é capaz de levar à sinalização dentro da célula da presente invenção após a ligação de um TCR presente em uma célula T reativa ao complexo MHC / peptídeo compreendendo o B2M manipulado na célula da presente invenção.

[00178] O domínio de sinalização intracelular pode ser ou compreender um domínio de sinalização de células T.

[00179] O domínio de sinalização intracelular pode compreender um ou mais motivos de ativação à base de tirosina (ITAMS) não imunorreceptores. Um ITAM é uma sequência conservada de quatro aminoácidos que é repetida duas vezes nas caudas citoplasmáticas de certas proteínas da superfície celular do sistema imunológico. O motivo contém uma tirosina separada de uma leucina ou isoleucina por quaisquer outros dois aminoácidos, dando a assinatura YxxL / l. Duas dessas assinaturas são tipicamente separadas por 6 a 8 aminoácidos na cauda da molécula (YxxL / lx (6-8) YxxL / 1).

[00180] ITAMS são importantes para a transdução de sinal nas células imunológicas. Portanto, eles são encontrados nas caudas de moléculas importantes de sinalização celular, como as cadeias CDS e of do complexo receptor de células T, as cadeias alfa e beta CD79 do complexo receptor de células B e alguns receptores Fc. Os resíduos de tirosina dentro destes motivos tornam-se fosforilados após a interação das moléculas receptoras com seus ligantes e formam locais de acoplamento para outras proteínas envolvidas nas vias de sinalização da célula.

[00181] De preferência, o componente do domínio de sinalização intracelular compreende, consiste essencialmente em, ou consiste no endodomínio CD3-,, que contém três ITAMs. Classicamente, o endodomínio CD3-transm transmite um sinal de ativação para a célula T após a ligação do antígeno. No entanto, no contexto da presente invenção, o endodomínio CD3-transm transmite um sinal de ativação para a célula T após o complexo MHC / peptídeo compreendendo o B2M manipulado se ligar a um TCR em uma célula T diferente.

[00182] O domínio de sinalização intracelular pode compreender “sinalização co-estimuladora adicional. Por exemplo, 4-1 BB (também conhecido como CD137) pode ser usado com CD3-6€ ou CD28 e OX40 podem ser usados com CD3-(6( para transmitir um sinal proliferativo / de sobrevivência.

[00183] Por conseguinte, o domínio de sinalização intracelular pode compreender o endodomínio CD3-alone sozinho, o endodomínio CD3-in em combinação com um ou mais domínios co-estimuladores selecionados a partir de 4- 1BB, CD28 ou OX40 endodomínio e / ou uma combinação de alguns ou todos os 4-1BB, CD28 ou OX40.

[00184] O endodomínio pode compreender um ou mais dos seguintes itens: um endodomínio ICOS, um endodomínio CD2, um endodomínio CD27 ou um endodomínio CD40.

[00185] O endodomínio pode compreender a sequência mostrada como SEQ ID NO: 24 a 27 ou uma variante da mesma tendo pelo menos 80% de identidade de sequência. A variante que possui pelo menos identidade de sequência mantém a função de sinalização de uma das SEQ ID NO: 24 a 27.

[00186] A variante de uma da sequência mostrada como SEQ ID NO: 24 a 27 pode ter pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência, desde que a sequência variante retenha a capacidade de transmitir um sinal de ativação para a célula.

[00187] A identidade percentual entre duas sequências polipeptídicas pode ser facilmente determinada por programas como o BLAST, que está disponível gratuitamente em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Adequadamente, a identidade percentual é determinada em toda a referência e / ou na sequência de referência.

[00188] SEQ ID NO: 24 - endodomínio CD3-7

RVKFSRSADAPAYQQOGONOLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPOEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMOALPPR

[00189] SEQ ID NO: 25 - endodomínios 4-1BB e CD3-Ç

MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLODPCSNCPAGTFCDNNRNQOICSPCPPNSFSSAGGO RTCDICROQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQOGOELTKKGCK DCCFGTFNDOKRGICRPWINCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAP AREPGHSPOIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRF SVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVOTTO EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGANQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG RDPEMGGKPORRKNPOEGLYNELQOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK DTYDALHMOALPPR

[00190] SEQ ID NO: 26 - endodomínios CD28 e CD3-€

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQOPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQOOGONE LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQOEGLYNELQOKDKMAEAYSEIGMKG ERRRGKGHDGLYQOGLSTATKDTYDALHMOALPPR

[00191] SEQ ID NO: 27 - endodomínios CD28, OX40 e CD3- [GS

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYOPYAPPRDFAAYRSRDORLPPDAHKPPGGGSFR TPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQOGONQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRD PEMGGKPRRKNPOEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQOQGLSTATKDTY DALHMOALPPR PEPTÍDEO SINAL

[00192] O presente polipeptídeo capaz de co-localizar um componente B2M de uma molécula de MHC de classe I com um domínio de sinalização intracelular dentro da célula pode compreender um peptídeo de sinal de modo que, quando expresso em uma célula, como uma célula T, a proteína nascente é direcionado ao retículo endoplasmático e subsequentemente à superfície celular, onde é expresso.

[00193] O núcleo do peptídeo sinal pode conter um longo trecho de aminoácidos hidrofóbicos que tendem a formar uma única alfa-hélice. O peptídeo sinal pode começar com um pequeno trecho de aminoácidos com carga positiva, o que ajuda a impor a topologia adequada do polipeptídeo durante a translocação. No final do peptídeo sinal, há tipicamente um trecho de aminoácidos que é reconhecido e clivado pela peptidase sinal. A peptidase de sinal pode clivar durante ou após a conclusão da translocação para gerar um peptídeo de sinal livre e uma proteína madura. Os peptídeos de sinal livre são então digeridos por proteases específicas.

CÉLULA

[00194] A célula da presente invenção pode ser uma célula efetora imunológica, como uma célula T, uma célula natural killer (NK) ou uma célula killer induzida por citocina.

[00195] A célula T pode ser uma célula T alfa-beta ou uma célula T gama-delta.

[00196] A célula pode ser derivada do sangue periférico do próprio paciente (primeira parte) ou no cenário de um transplante de células-tronco hematopoiéticas de sangue periférico do doador (segunda parte) ou sangue periférico de um doador não conectado (terceiros). As células T ou NK, por exemplo, podem ser ativadas e / ou expandidas antes de serem transduzidas com moléculas de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos da invenção, por exemplo, por tratamento com um anticorpo monoclonal anti-CD3.

[00197] Alternativamente, a célula pode ser derivada da diferenciação ex vivo de células progenitoras induzíveis ou células progenitoras embrionárias em células TT. Alternativamente, pode ser utilizada uma linha de células T imortalizada que retém sua função lítica.

[00198] A célula pode ser uma célula-tronco hematopoiética (HSC). Os HSCs podem ser obtidos para transplante da medula óssea de um doador adequadamente correspondido, por leucoferese de sangue periférico após mobilização pela administração de doses farmacológicas de citocinas como G-CSF [células-tronco do sangue periférico (PBSCs)] ou do cordão umbilical sangue (UCB) coletado da placenta após o parto. A medula, PBSCs ou UCB podem ser transplantados sem processamento, ou os HSCs podem ser enriquecidos por seleção imune com um anticorpo monoclonal ao antígeno de superfície CD34

RECEPTOR QUIMÉRICO DE ANTÍGENOS

[00199] Os CARs clássicos, mostrados esquematicamente na Figura 3, são proteínas transmembranares quiméricas do tipo I que conectam um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular (ligante) a um domínio de sinalização intracelular (endodomínio). O aglutinante é tipicamente um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo monoclonal (mAb), mas pode ser baseado em outros formatos que compreendem um local de ligação ao antígeno semelhante ao anticorpo ou em um ligante para o antígeno alvo. Pode ser necessário um domínio espaçador para isolar o ligante da membrana e permitir uma orientação adequada. Um domínio espaçador comum usado é o Fc de lgGl. Espaçadores mais compactos podem ser suficientes, por exemplo, O pedúnculo de CD8a e até apenas a dobradiça lgGl, dependendo do antígeno. Um domínio transmembranar ancora a proteína na membrana celular e conecta o espaçador ao endodomínio.

[00200] os desenhos iniciais de CAR tinham endodomínios derivados das partes intracelulares da cadeia y do FceRl ou CD36C. Consequentemente, estes receptores de primeira geração transmitiram o sinal imunológico 1, o que foi suficiente para desencadear a morte de células T das células alvo cognatas, mas não conseguiu ativar completamente a célula T para proliferar e sobreviver. Para superar essa limitação, foram construídos endodomínios compostos: a fusão da parte intracelular de uma molécula co- estimuladora de células T com a de CD37 resulta em receptores de segunda geração que podem transmitir um sinal de ativação e co-estimulação simultaneamente após o reconhecimento do antígeno. O domínio coestimulador mais utilizado é o do CD28. Isso fornece o sinal co-estimulador mais potente - o sinal imunológico 2, que desencadeia a proliferação de células T. Alguns também foram descritos receptores que incluem endodomínioos da família de receptores de TNF, como o OX40 e 41BB estreitamente relacionados, que transmitem sinais de sobrevivência. Ainda foram descritos CARs de terceira geração ainda mais potentes, os quais possuem endodomatos capazes de transmitir sinais de ativação, proliferação e sobrevivência.

[00201] Os ácidos nucleicos que codificam o CAR podem ser transferidos para células T usando, por exemplo, vetores retrovirais. Dessa maneira, um grande número de células T específicas ao antígeno pode ser gerado para transferência celular adotiva. Quando o CAR liga o antígeno-alvo, isso resulta na transmissão de um sinal de ativação para a célula T na qual ele é expresso. Assim, o CAR direciona a especificidade e citotoxicidade da célula T para células que expressam o antígeno alvo.

DOMÍNIO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS

[00202] O domínio de ligação ao antígeno é a porção de um CAR clássico que reconhece o antígeno.

[00203] Numerosos domínios de ligação ao antígeno são conhecidos na técnica, incluindo aqueles baseados no local de ligação ao antígeno de um anticorpo, miméticos de anticorpos e receptores de células T. Por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno pode compreender: um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo monoclonal; um ligando natural do antígeno alvo; um peptídeo com afinidade suficiente para o alvo; um aglutinante de domínio único, como um camelídeo; um aglutinante artificial único como um Darpin; ou uma cadeia simples derivada de um receptor de células T.

[00204] São conhecidos vários antígenos associados a tumores (TAA), como mostrado na Tabela 2. A seguir, o domínio de ligação ao antígeno usado na presente invenção pode ser um domínio que é capaz de se ligar a um TAA, conforme aqui indicado.

[00205] Tabela 1 células B

Folato, CA-125

[00206] O domínio de ligação ao antígeno pode compreender um ligante indutor da proliferação (APRIL) que se liga ao antígeno da membrana das células B (BCMA) e ativador transmembranar e modulador do cálcio e interator do ligante da ciclofilina (TACI). Um CAR compreendendo um domínio de ligação a antígeno baseado em APRIL é descrito no documento WO 2015/052538.

DOMÍNIO TRANSMEMBRANAR

[00207] O domínio transmembranar é a sequência de um CAR clássico que atravessa a membrana. Pode compreender uma hélice alfa hidrofóbica. O domínio transmembranar pode ser derivado de CD28, o que fornece boa estabilidade ao receptor.

PEPTÍDEO DE SINAL

[00208] O CAR pode ainda compreender um peptídeo sinal como aqui descrito.

DOMÍNIO DO ESPAÇADOR

[00209] o CAR pode compreender uma sequência espaçadora para conectar o domínio de ligação ao antígeno ao domínio transmembranar. Um espaçador flexível permite que o domínio de ligação ao antígeno se oriente em diferentes direções para facilitar a ligação.

[00210] A sequência espaçadora pode, por exemplo, compreender uma região IgGl Fc, uma dobradiça IgGl ou uma haste de CD8 humana ou a haste de CD8 de camundongo. O espaçador pode, alternativamente, compreender uma sequência ligante alternativa que tem comprimento e / ou propriedades de espaçamento de domínio semelhantes a uma região Fc de IgGl, uma dobradiça de IgGl ou uma haste de CD8. Um espaçador de IgGl humano pode ser alterado para remover os motivos de ligação a Fc.

DOMÍNIO DE SINALIZAÇÃO INTRACELULAR

[00211] O domínio de sinalização intracelular é a porção de transmissão de sinal de um CAR clássico.

[00212] O componente do domínio de sinalização mais comumente usados é o endodomínio CD3-zeta, que contém 3 ITAMS. Isso transmite um sinal de ativação para a célula T após a ligação do antígeno. CD3-O zeta pode não fornecer um sinal de ativação totalmente competente e pode ser necessária sinalização co-estimulatória adicional. Por exemplo, CD28 quimérico e OX40 podem ser usados com CD3-Zeta para transmitir um sinal proliferativo / de sobrevivência, ou todos os três podem ser usados juntos (ilustrado na Figura 3B).

RECEPTOR TRANSGÊNICO DE CÉLULAS T

[00213] O receptor de células T (TCR) é uma molécula encontrada na superfície das células T responsável pelo reconhecimento de fragmentos de antígeno como peptídeos ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

[00214] O TCR é um heterodímero composto por duas cadeias proteicas diferentes. Em humanos, em 95% das células T, o TCR consiste em uma cadeia alfa (a) e uma cadeia beta (B) (codificadas por TRA e TRB, respectivamente), enquanto que em 5% das células T o TCR consiste em gama e delta cadeias (y / d) (codificadas por TRG e TRD, respectivamente).

[00215] Quando o TCR se envolve com peptídeo antigênico e MHC (peptídeo / MHC), o linfócito T é ativado por meio de transdução de sinal.

[00216] Em contraste com os antígenos alvo direcionados a anticorpos convencionais, os antígenos reconhecidos pelo TCR podem incluir toda a matriz de potenciais proteínas intracelulares, que são processadas e entregues à superfície da célula como um complexo peptídeo / MHC.

[00217] É possível projetar células para expressar moléculas de TCR heterólogas (isto é, não nativas) introduzindo artificialmente os genes TRA e TRB; ou TRG e TRD na célula usando vetor. Por exemplo, os genes para TCRs manipulados podem ser reintroduzidos em células T autólogas e transferidos de volta aos pacientes para terapias adotivas de células T. Tais TCRs 'heterólogos' também podem ser aqui referidos como 'TCRs transgênicos'.

CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO / KIT DE SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO

[00218] A presente invenção fornece uma sequência de ácido nucleico que compreende: (i) uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um TCR transgênico; e (ii) uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de co-

localizar um componente de microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular como aqui definido.

[00219] A presente invenção fornece ainda um kit compreendendo sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Por exemplo, o kit pode compreender (i) uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um TCR transgênico; e (ii) uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo capaz de co-localizar um componente de microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular como aqui definido.

[00220] Como aqui utilizado, os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo" e "ácido nucleico" pretendem ser sinônimos um do outro.

[00221] Será entendido por um técnico versado no assunto que numerosos polinucleotídeos e ácidos nucleicos diferentes podem codificar o mesmo polipeptídeo como resultado da degeneração do código genético. Além disso, deve ser entendido que pessoas habilitadas podem, utilizando técnicas de rotina, fazer substituições de nucleotídeos que não afetam a sequência polipeptídica codificada pelos polinucleotídeos descritos aqui para refletir o uso de códons de qualquer organismo hospedeiro em particular no qual os polipeptídeos devem ser expressos.

[00222] Os ácidos nucleicos, de acordo com a invenção podem compreender DNA ou RNA. Eles podem ser de fita simples ou dupla. Eles também podem ser polinucleotídeos que incluem neles nucleotídeos sintéticos ou modificados. Um número de diferentes tipos de modificação de oligonucleotídeos é conhecido na técnica. Estes incluem esqueletos de metilfosfonato e fosforotioato, adição de cadeias de acridina ou polilisina nas extremidades 3 'e / ou 5' da molécula. Para os fins do uso como aqui descrito, deve ser entendido que os polinucleotídeos podem ser modificados por qualquer método disponível na técnica. Tais modificações podem ser realizadas a fim de aumentar a atividade in vivo ou a vida útil dos polinucleotídeos de interesse.

[00223] os termos "variante", "homólogo" ou "derivado" em relação a uma sequência de nucleotídeos incluem qualquer substituição, variação de, modificação, modificação, substituição de, exclusão ou exclusão de um (ou mais) ácido nucleico da ou para a sequência.

LOCAL DE CO-EXPRESSÃO

[00224] Um local de co-expressão é aqui utilizado para se referir a uma sequência de ácido nucleico que permite a co-expressão de (i) um CAR ou um TCR; e (ii) um polipeptídeo capaz de co-localizar um componente da microglobulina beta- 2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular dentro da célula. O local de co- expressão pode ser uma sequência que codifica um local de clivagem, de modo que a construção de ácido nucleico produza compreenda os dois polipeptídeos unidos por um (s) local (is) de clivagem. O local de clivagem pode ser auto-clivável de modo que quando o polipeptídeo é produzido, ele é imediatamente clivado em peptídeos individuais sem a necessidade de qualquer atividade de clivagem externa.

[00225] O local de clivagen pode ser qualquer sequência que permita que os dois polipeptídeos se separem.

[00226] O termo "clivagem" é aqui utilizado por conveniência, mas o local de clivagem pode fazer com que os peptídeos se separem em entidades individuais por um mecanismo diferente da clivagem clássica. Por exemplo, para o peptídeo de auto-clivagem do vírus da febre aftosa (FMDV) 2A (veja abaixo), vários modelos foram propostos para explicar a atividade de "clivagem": proteólise por uma proteinase de célula hospedeira, autoproteólise ou um efeito de tradução (Donnelly et al. (2001) J. Gen. Virol. 82: 1027- 1041). O mecanismo exato de tal "clivagem" não é importante para os propósitos da presente invenção, desde que o local de clivagem, quando posicionado entre sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas, faça com que as proteínas sejam expressas como entidades separadas. O local de clivagem pode ser um local de clivagem da furina.

[00227] Furina é uma enzima que pertence à família das pró-proteínas convertase do tipo subtilisina. Os membros desta família são convertidos de proproteínas que processam proteínas precursoras latentes em seus produtos biologicamente ativos. Furina é uma endoprotease de serina dependente de cálcio que pode clivar com eficiência proteínas precursoras em seus locais de processamento de aminoácidos básicos emparelhados. Exemplos de substratos de furina incluem hormônio proparatireoidiano, precursor do fator de crescimento transformador beta 1, proalbumina, pró-beta- secretase, metaloproteinase de matriz tipo 1 de membrana, subunidade beta do fator de crescimento pró-nervo e fator de von Willebrand. A furina cliva proteínas logo a jusante de uma sequência alvo básica de aminoácidos (canonicamente, Arg-X- (Arg / Lys) -Arg ') e é enriquecida no aparelho de Golgi.

[00228] O local de clivagem pode ser um local de clivagem de Tobacco Etch Virus (TEV).

[00229] A protease de TEV é uma protease de cisteína altamente específica de sequência que é proteases do tipo quimotripsina. É muito específico para o seu local de clivagem alvo e, portanto, é frequentemente usado para a clivagem controlada de proteínas de fusão, tanto in vitro quanto in vivo. O local de clivagem por consenso de TEV é ENLYFO VV S (onde 'V denota a ligação peptídica clivada) Células de mamíferos, como células humanas, não expressam a protease de TEV. Assim, em concretizações nas quais a presente construção de ácido nucleico compreende um local de clivagem de TEV e é expressa em uma célula de mamífero - a protease de TEV exógena também deve ser expressa na célula de mamífero.

[00230] O local de clivagem pode codificar um peptídeo de auto-clivagem.

[00231] Um 'peptídeo de auto-clivagem' refere-se a um peptídeo que funciona de tal maneira que quando O polipeptídeo que compreende as proteínas e o peptídeo de auto-clivagem é produzido, ele é imediatamente "clivado" ou separados em primeiro e segundo polipeptídeos distintos e discretos sem a necessidade de qualquer atividade de clivagem externa.

[00232] O peptídeo de auto-clivagem pode ser um peptídeo de auto-clivagem 2A de um aftho ou um cardiovírus.

[00233] A clivagem primária 2A / 2B dos vírus apt e cardio é mediada pela "clivagem" 2A no seu próprio terminal C. Nos aptovírus, como vírus da febre aftosa (FMDV) e vírus da rinite A equina, a região 2A é uma seção curta de cerca de 18 aminoácidos que, juntamente com o resíduo N-terminal da proteína 2B (prolina conservada resíduo) representa um elemento autônomo capaz de mediar a "clivagem" em seu próprio terminal C (Donelly et al (2001), como acima).

[00234] Sequências "tipo 2A" foram encontradas em vírus de picornavírus que não sejam aptho ou cardiovírus, vírus de inseto 'tipo picornavírus', rotavírus de tipo C e sequências repetidas dentro de Trypanosoma spp e uma sequência bacteriana (Donnelly et al., 2001) como acima.

[00235] A sequência de co-expressão pode ser uma sequência interna de entrada de ribossomo (IRES). A sequência de co-expressão pode ser um promotor interno.

VETOR

[00236] A presente invenção também fornece um vetor ou kit de vetores que compreende uma ou mais sequência (Ss) de ácido nucleico ou construto (s) de ácido nucleico da invenção. Um tal vetor pode ser usado para introduzir a (s) sequência (s) de ácido nucleico (s) ou construção (s) em uma célula hospedeira, de modo a expressar um componente CAR ou CAR e, opcionalmente, um agente que modula a atividade do CAR.

[00237] O vetor pode, por exemplo, ser um plasmídeo ou um vetor viral, como um vetor retroviral ou um vetor lentiviral, ou um vetor baseado em transposon ou mRNA sintético.

[00238] O vetor pode ser capaz de transfectar ou transduzir uma célula.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[00239] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica contendo uma pluralidade de células, uma construção de ácido nucleico, uma primeira sequência de ácido nucleico e uma segunda sequência de ácido nucleico; um vetor ou um primeiro e um segundo vetor da presente invenção. Em particular, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica contendo uma pluralidade de células de acordo com a presente invenção.

[00240] A composição farmacêutica pode adicionalmente compreender um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode opcionalmente compreender um ou mais polipeptídeos e / ou compostos farmaceuticamente ativos. Essa formulação pode, por exemplo, estar numa forma adequada para infusão intravenosa.

[00241] MÉTODO DE TRATAMENTO

[00242] A presente invenção fornece um método para o tratamento e / ou prevenção de uma doença que compreende a etapa de administração das células da presente invenção (por exemplo, em uma composição farmacêutica como descrita acima) a um sujeito.

[00243] Um método para o tratamento de uma doença refere-se ao uso terapêutico das células da presente invenção. A este respeito, as células podem ser administradas a um indivíduo com uma doença ou condição existente, a fim de diminuir, reduzir ou melhorar pelo menos um sintoma associado à doença e / ou desacelerar, reduzir ou bloquear a progressão da doença.

[00244] O método para prevenir uma doença refere-se ao uso profilático das células da presente invenção. A esse respeito, as células podem ser administradas a um sujeito que ainda não contraiu a doença e / ou que não está apresentando nenhum sintoma da doença para prevenir ou prejudicar a causa da doença ou reduzir ou impedir o desenvolvimento de pelo menos um sintoma associado à doença. O sujeito pode ter uma predisposição para, ou se pensa estar em risco de desenvolver a doença.

[00245] O método pode envolver as etapas de: (i) isolar uma amostra contendo células; (ii) transdução ou transfecção dessas células com uma sequência ou vetor de ácido nucleico fornecido pela presente invenção; (iii) administrar as células de (ii) a um sujeito.

[00246] A presente invenção fornece uma célula, uma construção de ácido nucleico, uma primeira sequência de ácido nucleico e uma segunda sequência de ácido nucleico, um vetor ou um primeiro e um segundo vetor da presente invenção para uso no tratamento e / ou prevenção de uma doença. Em particular, a presente invenção fornece uma célula da presente invenção para uso no tratamento e / ou prevenção de uma doença.

[00247] A invenção também se refere ao uso de uma célula, uma construção de ácido nucleico, uma primeira sequência de ácido nucleico e uma segunda sequência de ácido nucleico, um vetor ou um primeiro e um segundo vetor da presente invenção da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento e / ou prevenção de uma doença. Em particular, a invenção refere-se ao uso de uma célula na fabricação de um medicamento para o tratamento e / ou prevenção de uma doença.

[00248] A doença a ser tratada e / ou prevenida pelo método da presente invenção pode ser a rejeição imune da célula que compreende (i) um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um TCR transgênico; e (ii) um polipeptídeo capaz de co-localizar um componente da microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular.

[00249] A doença pode ser rejeição imune de células autólogas ou rejeição imune de células alogênicas que codificam um CAR ou TCR transgênico, como aqui descrito.

[00250] A doença a ser tratada e / ou prevenida pelos métodos da presente invenção pode ser uma infecção, como uma infecção viral.

[00251] Os métodos da invenção também podem ser para o controle de respostas imunes patogênicas, por exemplo em doenças auto-imunes, alergias e rejeição de enxerto contra hospedeiro.

[00252] Os métodos podem ser para o tratamento de uma doença cancerígena, como câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cólon, câncer endometrial, câncer de rim (célula renal), leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não Hodgkin, câncer de pâncreas, câncer de próstata e câncer de tireóide.

[00253] As células CAR da presente invenção podem ser capazes de matar células alvo, tais como células cancerígenas. A célula alvo pode ser reconhecível pela expressão de um TAA, por exemplo, a expressão de um TAA fornecida acima na Tabela 1.

MÉTODO DE PRODUZIR UMA CÉLULA

[00254] As células que expressam CAR ou TCR transgênico da presente invenção podem ser geradas através da introdução de DNA ou RNA que codifica para o CAR ou TCR e o polipeptídeo capaz de co-localizar um componente de microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I com um domínio de sinalização intracelular dentro da célula por um dos muitos meios, incluindo transdução com um vetor viral, transfecção com DNA ou RNA.

[00255] A célula da invenção pode ser feita por: (i) isolamento de uma amostra contendo células de um sujeito ou de uma das outras fontes listadas acima; e (ii) transdução ou transfecção das células com uma ou mais sequência (s) de ácido nucleico ou construção de ácido nucleico como definido acima in vitro ou ex vivo.

[00256] As células podem então ser purificadas, por exemplo, selecionadas com base na expressão do domínio de ligação ao antígeno do polipeptídeo de ligação ao antígeno.

[00257] Esta divulgação não é limitada pelos métodos e materiais exemplares divulgados neste documento, e quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos podem ser utilizados na prática ou no teste de concretizações da presente divulgação. Intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. Salvo indicação em contrário, quaisquer sequências de ácidos nucleicos são escritas da esquerda para a direita na orientação 5 'para 3'; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carboxi, respectivamente.

[00258] Quando é fornecido um intervalo de valores, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente o contrário, entre os limites superior e inferior desse intervalo também é especificamente divulgado. Cada faixa menor entre qualquer valor declarado ou valor intermediário em um intervalo declarado e qualquer outro valor declarado ou interveniente nesse intervalo declarado é abrangida nesta divulgação. Os limites superior e inferior desses intervalos menores podem ser incluídos ou excluídos independentemente no intervalo, e cada intervalo em que um ou ambos os limites estão incluídos nos intervalos menores também é abrangido nesta divulgação, sujeito a qualquer limite especificamente excluído no intervalo. faixa declarada. Quando o intervalo declarado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluindo um ou ambos os limites incluídos também são incluídos nesta divulgação.

[00259] Deve-se notar que, conforme usados aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[00260] Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendidos” como aqui utilizados são sinônimos de "incluindo", "inclui" ou "contendo", "contém") e são inclusivos ou abertos e não excluem outros itens não membros recitados, elementos ou etapas do método. Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendidos também incluem o termo "consistindo em”.

[00261] As publicações discutidas neste relatório descritivo são fornecidas apenas para sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada aqui contido deve ser interpretado como uma admissão de que tais publicações constituem arte anterior às reivindicações anexas.

[00262] A invenção será agora descrita adicionalmente por meio de Exemplos, que devem servir para auxiliar um versado na técnica na realização da invenção e não se destinam de forma alguma a limitar o escopo da invenção

EXEMPLOS Exemplo 1 - Demonstração de alo reatividade reduzida em um ensaio misto de resposta linfocitária

[00263] Os ensaios de resposta linfocitária mista (MLR) são ensaios clássicos que são utilizados para determinar a alo-reatividade. As células T dadoras normais são transduzidas com um vetor retroviral que expressa um CAR CD19 co-expresso com construções B2M-CD3 zeta endodomínio (B2M-Z). As células T do mesmo doador também são transduzidas com um vetor retroviral que acabou de expressar o CD19 CAR. Essas células T CAR ou células T CAR / B2M-Z são irradiadas e co-cultivadas repetidamente com células T de outro doador normal com MHC incompatível. As células T incompatíveis são carregadas com trítio, o que permite contar em resposta a aloantígenos. Após co-cultura repetida, as células T CAR terão maior resposta alo em comparação com as células T CAR

/ B2M-Z. Exemplo 2 - Demonstração de imunogenicidade reduzida em um modelo animal imunocompetente

[00264] É gerada um cassete de células T CAR, que é particularmente imunogênica pela co-expressão de um fator imunogênico, como a proteína OVA ou HSV-TK. Numa segunda cassete de células T CAR, o CAR idêntico e a proteína imunogênica são co-expressos juntamente com B2M-Z. Os esplenócitos murinos são transduzidos com as construções acima. Camundongos singênicos são condicionados com baixa dose de irradiação corporal total e infundidos esplenócitos transduzidos. O enxerto e a persistência das células T CAR são determinados por citometria de fluxo. As respostas imunes ao fator imunogênico são determinadas por ELISPOT. Espera- se que a inclusão do componente B2M-Z melhore o enxerto e reduza as respostas imunes. Exemplo 3 - Demonstração de resposta alogênica reduzida em um modelo de transferência haploidêntico

[00265] Os ratos BALB / C BLACK6 são cruzados para resultar em um híbrido Fl. O enxerto de células T de um camundongo híbrido Fl normalmente resultaria em sua rejeição após a administração a um camundongo BalB / C devido ao reconhecimento de moléculas de MHC BalB / C. As células T CAR Fl que expressam CD19 anti-murino e as células T CAR Fl que expressam CAR CD19 anti-murino e B2MZ são administradas a um camundongo BalB / C após irradiação corporal total em baixa dose. O enxerto é estudado em série por imagem de bioluminescência e após término por citometria de fluxo.

Exemplo 4 - Expressão de construções quiméricas B2m nas células T transforma o MHC I em um CAR funcional

[00266] A molécula do MHC Classe I é um heterodímero composto da cadeia a e da B2-microglobulina. No complexo MHC I endógeno, apenas a cadeia a é ancorada na membrana celular, enquanto a B2-microglobulina não está ligada covalentemente ao seu parceiro. Os domínios distais da membrana da cadeia a (al e a2) formam um bosque que se liga a peptídeos curtos que podem ser reconhecidos por receptores de células T específicos para peptídeos (TCRs) nas células T. Ao contrário da molécula endógena, o MHC I CAR é composto de B2- microglobulina ancorada na membrana celular por meio de um domínio transmembranar e ligado a um endodomínio de sinalização (Figura 4). Três possíveis projetos de MHC I CAR são possíveis, dependendo do design das construções quiméricas B21n (Figura 5). Essas construções podem conter apenas o endodomínioo CD3€ (1º geração) ou adicionalmente podem conter domínio co-estimulador, 41 BB ou CD28 (2º geração).

[00267] Para testar a funcionalidade das três construções quiméricas de B2m, foram produzidos retrovírus por transfecção transitória de células 293T com plasmídeos que codificam os CARs, gag / pol e a proteína do envelope RD114. Após 3 dias, os sobrenadantes foram colhidos e utilizados para transduzir PBMCs de dois doadores saudáveis usando placas revestidas com retronectina. Cinco dias após a transdução, a expressão do CAR foi confirmada por citometria de fluxo.

[00268] Ambos os doadores de PBMC utilizados foram previamente haplotipados como HLA-AO2 + por um método de sequenciamento de DNA. Como publicado anteriormente, os doadores de HLA-AO2 + são capazes de ligar o peptídeo HAlH ao seu bosque de ligação ao peptídeo do complexo MHC 1. Assim, uma curta incubação das células CAR-T ou células de controle não transduzidas (NT) obtidas desses doadores com um peptídeo recombinante HAlIlH resulta na apresentação do peptídeo às células T. Os CAR-Ts pulsados com uma gama de concentrações de peptídeo HAIH (0,01-10uM) foram co- cultivados em uma proporção de 2: 1 com células SupT1l projetadas para expressar TCR específico para HAlIH. A morte celular alvo foi testada após dois dias por citometria de fluxo e o peptídeo HAIH EC50 foi calculado para cada CART usando GraphPad Prism (Figura 6). Simultaneamente, os sobrenadantes foram removidos e os níveis de citocinas foram analisados pelo ensaio Luminex Multiplex (Figura 7).

[00269] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da invenção serão evidentes para os especialistas na técnica, sem se afastar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com concretizações preferenciais específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a essas concretizações específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção, que são óbvias para os especialistas em biologia molecular ou campos relacionados, devem estar dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma célula que compreende; (i) um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de células T transgênico (TCR); e (ii) uma microglobulina beta-2 manipulada que compreende um endodomínio compreendendo um domínio de sinalização intracelular caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento e / ou prevenção de uma doença.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a microglobulina beta-2 manipulada compreende ainda um domínio transmembranar entre o polipeptídeo de microglobulina beta-2 e o endodomínio compreendendo um domínio de sinalização intracelular.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização de célula T intracelular compreende o endodomínio CD3 zeta.

4, Construção de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende: (i) uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um TCR transgênico; e (11) uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma microglobulina beta-2 manipulada conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Kit de sequências de ácidos nucleicos caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um TCR transgênico; e (11) uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma microglobulina beta-2 manipulada, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

6. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende uma construção de ácido nucleico conforme definida pela reivindicação 4.

7. Kit de vetores caracterizado pelo fato de que compreende: (1) um primeiro vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um TCR transgênico; e (ii) um segundo vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma microglobulina beta-2 manipulada como definido por qualquer uma das reivindicações 1a33.

8. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de células, em que as células compreendem: (i) um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de células T transgênico (TCR); e (ii) uma microglobulina beta-2 manipulada que compreende um endodomínio compreendendo um domínio de sinalização intracelular.

9. Uso de uma composição farmacêutica conforme definido pela reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para o tratamento e / ou prevenção de uma doença.

10. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definido pela reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença é a rejeição imune da célula que compreende (i) um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um TCR transgênico; e (1i) uma microglobulina beta-2 manipulada.

12. Método para fabricar uma célula conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de introdução: uma construção de ácido nucleico conforme definido pela reivindicação 4, uma primeira sequência de ácido nucleico e uma segunda sequência de ácido nucleico, como definido pela reivindicação 5; um vetor conforme definido pela reivindicação 6 ou um primeiro e um segundo vetor como definido pela reivindicação 7 em uma célula ex vivo.

13. Polipeptídeo manipulado caracterizado pelo fato de que compreendendo um componente de microglobulina beta-2 de uma molécula de MHC classe I ligada ao endodomaina zeta CD3.

14. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definido pela reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para deletar células T in vivo em um sujeito que reconheça um peptídeo apresentado pela molécula de MHC classe I de uma célula, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 3, de modo que as células T no sujeito, as quais reconhecem tal peptídeo / MHC sejam deletadas por seleção negativa.

15. Uso de uma composição farmacêutica, conforme definido pela reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para prevenir a rejeição imune de uma célula, conforme definido por qualquer uma das reivindicações l1 a 3, em um sujeito, em que compreende a etapa de deletar células T in vivo que reconhecem um peptídeo apresentado pelo Molécula de MHC classe I da célula conforme definido pela reivindicação 14.

FIGURA 1 a TCR a CA) = e Ca. 1 CDE

FEM EE

FIGURA 2 a) FA

LOAD BENS <<) Cesio o

IPI

FIGURA 3 (3 , (Db) Primeira geração de endodomínios > “AN Em O ==) 2 Í ÁS : / a É q 2 Ã j | o / — O ) ILS R/ / (c) Segunda geração de endodomínios é ! f O SEO OVO CER ns % 8 É o 3 EEN 3 : x Á X 3 NÃ do RABRAS CAizagoio à í 1 W/ É mm f SERESTA Loro dy Tercei ão de endodomíni = (as 4 ' CAXAK (d) Terceira geração de endodomínios à TX RC COROS OO = e | SEX SST E í 3 ; a SE Na E) = = E - = & | É A o o - Tee

FIGURA 4 MHC Class | CAR Domínio distal-membranar a2 al Domínio proximal-membranar aB Microglobulina-B2 CD3Ç Cauda citoplasmática FIGURA 5

A B C Microglobulina-B2 Ponte Ç OIOOOOO! ente VOTES CO Orr transmembranar à O CD3T 41BB CD28 CD3T CD3T B2m-CD3z —“B2m-41BBz Ba2m-CD28z

FIGURA 6 150 e R2m-CDôz -— R2m-41BBz e 100 - R2m-CD28z

TE 4

ZE ss So -) = v o 3 2 4 o 1 2 Log [DHA1H] (uM) PpHA1H ECSO [uM] B2m-CD3z 0.49 R2m-41BBz 0.11 B2m-282 0.16

FIGURA 7 GM-CSF 2 1 ê [E 0.01uM HA1H $ 0.1UM HAIH : a 1UM HA1H Í à: * 10uM HA1H . 7 8 HD ra 4

VA VÃ À z 561 À à | A ê ——tiGão 84) 2 9 IOMNHM ss O NT B2m-CD3z B2m-41BBz B2m-CD28z TNFa 2 1 Ê EN 0.01uM HA1H À og EJ 0.tuM HAtH a 1uM HAIH | 3 6 10uM HA1H 1 E a zo = Z 1 8 2 À Z1Z LAO 2 ol UMA nAGA (405 (040 NT B2am-CD3z — f2m41BBz — gam-CD28z

TT IFNg 2 30 É [3 0.01uM HA1H 3 0.1uM HA1H 3 1uM HA1IH Z EE EÃ 10uM HA1H A ça ê Ap À 3 [14 VA À ê mv 1 pá 2 1 Ag HÁ : AA NA S 14 VÁ S : A A & o ncooocnos Áoooe iooe ne Dao b dl E esneneeeneenn lo doa En Boo E Soa A nsassnsseenees Íoosdoabbeáé loool é A o EA ooomenoeessseedicea Seo Ê ni Eoad é Ao A NT B2m-CD3z B2m-41BBz =— Bom-CD28z 2 €& 25 É " [] 0.01uM HA1H 8 20 FA 0.1uM HA1H o ui [o ã 1uM HA1H R 10uM HA1IH a ê 18 7 | À o 5 1 x FIT FA Ã VÁ + AA IAN na6A [lag] 2 051 [IM [IRA À | & 00 HA 4 d Á HH VIVA vá NT B2m-CD3z B2am-41BBz =— Bam-CD28z Figura 7 (Continuação)