JP2024024014A - 受容体 - Google Patents
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Abstract
【課題】受容体の提供。【解決手段】本発明者らは、サイトカイン受容体エンドドメインと細胞内T細胞シグナル伝達構成要素の両方を含む組み合わせエンドドメインに、例えば抗体の、結合特異性を移植した、新しいタイプのキメラ受容体(CR)を開発した。受容体のライゲーションは、サイトカイン型とT細胞受容体型の両方の活性化シグナルおよび増殖シグナルを細胞に提供して、従来のCARよりも大きな活性化および増殖を引き起こす。本発明は、リガンド結合エキソドメイン;ならびに(i)サイトカイン受容体エンドドメイン;および(ii)細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ受容体を提供する。【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、キメラ受容体(CR)およびかかるキメラ受容体を発現する細胞に関する。
本発明は、キメラ受容体(CR)およびかかるキメラ受容体を発現する細胞に関する。
発明の背景
キメラ抗原受容体(CAR)
若干の免疫治療剤が、治療用モノクローナル抗体(mAb)、二重特異性T細胞エンゲージャーおよびキメラ抗原受容体(CAR)を含め、がん処置での使用について記載されている。
キメラ抗原受容体(CAR)
若干の免疫治療剤が、治療用モノクローナル抗体(mAb)、二重特異性T細胞エンゲージャーおよびキメラ抗原受容体(CAR)を含め、がん処置での使用について記載されている。
キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体(mAb)の特異性をT細胞のエフェクター機能に結び付けるタンパク質である。キメラ抗原受容体の通常形態は、抗原認識性アミノ末端、スペーサー、T細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて連結された膜貫通ドメインを有するI型膜貫通ドメインタンパク質の形態である。
これらの分子の最も一般的な形態は、シグナル伝達エンドドメインにスペーサーおよび膜貫通ドメインを介して融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から誘導された1本鎖可変フラグメント(scFv)の融合体である。上記分子は、その標的のscFvによる認識に応答してT細胞の活性化をもたらす。T細胞がかかるCARを発現すると、T細胞はその標的抗原を発現する標的細胞を認識し、殺す。いくつかのCARが腫瘍関連抗原に対して開発されており、かかるCAR発現T細胞を用いる養子移入手法は、現在様々ながんの処置についての臨床試験にかけられている。
白血病およびリンパ腫などの液性腫瘍の処置においてCAR T細胞を適用することについて、現在までにいくらか成功している。しかしながら、T細胞に適さない免疫抑制性の微小環境が原因で、固形腫瘍を処置するためにCAR T細胞を使用することは、よりいっそう難易度が高い。
CAR T細胞の持続および活性は、サイトカインの投与によって、またはサイトカインを恒常的に産生するCAR T細胞によって、高めることができる。しかしながら、これらのアプローチにも限界がある:サイトカインの全身投与は、毒性であり得る;サイトカインの恒常的な産生は、制御されない増殖および癌化に至るおそれがある(Nagarkattiら(1994)PNAS 91:7638-7642;Hassunehら(1997)Blood 89:610-620)。
ゆえに、上で述べた欠点を伴わない、T細胞の生着および拡大を促進する代替的なCAR T細胞アプローチが必要とされている。
ゆえに、上で述べた欠点を伴わない、T細胞の生着および拡大を促進する代替的なCAR T細胞アプローチが必要とされている。
Nagarkattiら(1994)PNAS 91:7638-7642
Hassunehら(1997)Blood 89:610-620
本発明の態様の要旨
本発明者らは、サイトカイン受容体エンドドメインと細胞内T細胞シグナル伝達構成要素の両方を含む組み合わせエンドドメインに、例えば抗体の、結合特異性を移植した、新しいタイプのキメラ受容体(CR)を開発した。受容体のライゲーションは、サイトカイン型とT細胞受容体型の両方の活性化シグナルおよび増殖シグナルを細胞に提供して、従来のCARよりも大きな活性化および増殖を引き起こす。
本発明者らは、サイトカイン受容体エンドドメインと細胞内T細胞シグナル伝達構成要素の両方を含む組み合わせエンドドメインに、例えば抗体の、結合特異性を移植した、新しいタイプのキメラ受容体(CR)を開発した。受容体のライゲーションは、サイトカイン型とT細胞受容体型の両方の活性化シグナルおよび増殖シグナルを細胞に提供して、従来のCARよりも大きな活性化および増殖を引き起こす。
生着、増殖および生存の増強は、CR発現細胞が、不適な腫瘍微小環境に生着してそこで拡大することを可能にするので、それは、固形腫瘍の処置において特に有用である。
したがって、第1の態様において、本発明は、
リガンド結合エキソドメイン;ならびに
(i)サイトカイン受容体エンドドメイン;および
(ii)細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
を含むエンドドメイン
を含むキメラ受容体を提供する。
リガンド結合エキソドメイン;ならびに
(i)サイトカイン受容体エンドドメイン;および
(ii)細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
を含むエンドドメイン
を含むキメラ受容体を提供する。
リガンド結合エキソドメインは、重鎖可変ドメイン(VH)および/または軽鎖可変ドメイン(VL)を含み得る。
サイトカイン受容体エンドドメインは、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖を含み得るか、またはI型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖からなり得る。例えば、サイトカイン受容体エンドドメインは、
(i)IL-2受容体β鎖エンドドメイン
(ii)IL-7受容体α鎖エンドドメイン;もしくは
(iii)共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含み得るか、または
(i)IL-2受容体β鎖エンドドメイン
(ii)IL-7受容体α鎖エンドドメイン;もしくは
(iii)共通γ鎖受容体エンドドメイン
からなり得る。
(i)IL-2受容体β鎖エンドドメイン
(ii)IL-7受容体α鎖エンドドメイン;もしくは
(iii)共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含み得るか、または
(i)IL-2受容体β鎖エンドドメイン
(ii)IL-7受容体α鎖エンドドメイン;もしくは
(iii)共通γ鎖受容体エンドドメイン
からなり得る。
細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、以下のうちの1つまたはそれより多くを含み得る:CD3ゼータエンドドメイン、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメイン、4-1BBエンドドメイン、CD2エンドドメイン、CD27エンドドメイン、ICOSエンドドメイン、CD40エンドドメイン。
細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン(複数可)およびサイトカイン受容体エンドドメインの配置(複数可)は、その受容体が、細胞の表面に発現されたとき、細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン(複数可)が、膜の遠位に位置し、サイトカイン受容体エンドドメイン(複数可)が、細胞内の細胞表面上の膜の近位に位置するような配置であり得る。
第2の態様において、本発明は、キメラ受容体システムを提供する。
本発明の第2の態様の第1の実施形態において、キメラ受容体システムは、本発明の第1の態様に記載の少なくとも2つのキメラ受容体を含む。
この第1の実施形態において、キメラ受容体システムは、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含む第1のキメラ受容体および第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含む第2のキメラ受容体を含む。第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、第2のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である。
第1のキメラ受容体および第2のキメラ受容体は、同じ抗原の異なるエピトープに結合し得る。
あるいは、第1のキメラ受容体および第2のキメラ受容体は、同じ抗原の同じエピトープに結合し得る。
あるいは、第1のキメラ受容体のリガンド結合ドメインおよび第2のキメラ受容体のリガンド結合ドメインが、一体となってリガンド結合ができるように、それらは、相補的なリガンド結合ドメインを有し得る。
用語「相補的」は、第1および第2のサイトカインエンドドメインが会合して、細胞シグナル伝達をもたらすことを示す。
第1のキメラ受容体および第2のキメラ受容体が、抗原に結合したとき、α/β鎖およびγ鎖を介してサイトカインシグナル伝達が生じるように、第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、1型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖もしくはβ鎖であり得るかまたは1型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖もしくはβ鎖を含み得、第2のサイトカイン受容体エンドドメインは、1型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖であり得るかまたはそれを含み得る。
第1のキメラ受容体は、CD3ゼータエンドドメインを含み得、第2のキメラ受容体は、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメインおよび4-1BBエンドドメインから選択される1つまたはそれより多い共刺激ドメインを含み得る。
あるいは、第1のキメラ受容体と第2のキメラ受容体の両方が、CD3ゼータエンドドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
本発明の第2の態様の第2の実施形態において、キメラ受容体システムは、本発明の第1の態様に記載のキメラ受容体および細胞内融合タンパク質を含む。
この第2の実施形態において、キメラ受容体は、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、細胞内融合タンパク質は、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含む。
第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、第2のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である。
上記キメラ受容体は、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み得、細胞内融合タンパク質は、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み得るか、またはその逆である。
上記キメラ受容体は、CD3ゼータエンドドメインを含み得、上記細胞内融合タンパク質は、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメインおよび4-1BBエンドドメインから選択される1つまたはそれより多い共刺激ドメインを含み得るか、またはその逆である。
上記キメラ受容体は、CD3ゼータエンドドメインを含み得、上記細胞内融合タンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き得る。
上記細胞内融合タンパク質は、リン酸化されたCD3ゼータエンドドメインに結合するドメイン、例えば、ZAP70 SH2ドメインを含み得る。キメラ受容体が標的抗原に結合すると、これにより、CD3ゼータエンドドメインがリン酸化する。そのリン酸化されたCD3ゼータエンドドメインに細胞内融合タンパク質のZAP70 SH2ドメインが結合して、第1および第2のサイトカイン受容体エンドドメインが一体となる。
本発明の第2の態様の第3の実施形態において、キメラ受容体システムは、本発明の第1の態様に記載のキメラ受容体および膜貫通タンパク質を含む。
上記キメラ受容体は、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、上記膜貫通タンパク質は、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含む。第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、第2のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である。
上記膜貫通タンパク質は、リガンド結合エキソドメインを欠き得る。上記膜貫通タンパク質は、例えば、膜貫通ドメインまたはミリストイル化基を介して、細胞膜に繋がれ得る。
上記キメラ受容体は、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み得、上記膜貫通タンパク質は、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み得るか、またはその逆である。
上記キメラ受容体は、CD3ゼータエンドドメインを含み得、上記膜貫通タンパク質は、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメインおよび4-1BBエンドドメインから選択される1つまたはそれより多い共刺激ドメインを含み得る。
上記キメラ受容体は、CD3ゼータエンドドメインを含み得、上記膜貫通タンパク質は、細胞内シグナル伝達ドメインおよび/または共刺激ドメインを欠き得る。
上記膜貫通タンパク質は、リン酸化されたCD3ゼータエンドドメインに結合するドメイン、例えば、ZAP70 SH2ドメインを含み得る。上記キメラ受容体が、標的抗原に結合すると、これにより、CD3ゼータエンドドメインがリン酸化される。そのリン酸化されたCD3ゼータエンドドメインに膜貫通タンパク質のZAP70 SH2ドメインが結合して、第1および第2のサイトカイン受容体エンドドメインが一体となる。
第3の態様において、本発明は、本発明の第1の態様に記載のキメラ受容体または本発明の第2の態様に記載のキメラ受容体システムを含む細胞を提供する。
本発明の第3の態様の第1の実施形態において、細胞は、第1のキメラ受容体および第2のキメラ受容体を含む細胞受容体システムを含む。
上記細胞は、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する第1のキメラ受容体および第2のキメラ受容体を含み得る。
あるいは、上記細胞は、同じ抗原上の同じエピトープに結合する第1のキメラ受容体および第2のキメラ受容体を含み得る。
あるいは、第1のキメラ受容体のリガンド結合ドメインと第2のキメラ受容体のリガンド結合ドメインとが一体となって、リガンド結合ができるように、上記細胞は、相補的なリガンド結合ドメインを有する第1のキメラ受容体および第2のキメラ受容体を含む。
第1のキメラ受容体は、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み得、第2のキメラ受容体は、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含み得、その第1および第2のサイトカイン受容体エンドドメインは、会合して、細胞シグナル伝達をもたらすことができる。
例えば、第1のキメラ受容体および第2のキメラ受容体が、抗原に結合したとき、α/β鎖およびγ鎖を介して、組み合わさったシグナル伝達が生じるように、第1のキメラ受容体は、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み得、第2のキメラ受容体は、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み得る。
第1のキメラ受容体は、CD3ゼータエンドドメインを含み得;第2のキメラ受容体は、例えば、CD3ゼータエンドドメイン、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメイン、4-1BBエンドドメイン、CD2エンドドメイン、CD27エンドドメイン、ICOSエンドドメインおよびCD40エンドドメインから選択される1つまたはそれより多い共刺激ドメインを含み得る。
本発明の第2の態様に記載の細胞は、
リガンド結合エキソドメイン;および
キメラ受容体のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的なサイトカイン受容体エンドドメインを含むエンドドメイン
を含む第2の受容体も含み得、その第2の受容体は、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを欠く。
リガンド結合エキソドメイン;および
キメラ受容体のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的なサイトカイン受容体エンドドメインを含むエンドドメイン
を含む第2の受容体も含み得、その第2の受容体は、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを欠く。
本発明の第3の態様の第2の実施形態において、細胞は、本発明の第1の態様に記載のキメラ受容体および上で定義されたような細胞内融合タンパク質を含む。
上記細胞内融合タンパク質は、ZAP70 SH2ドメインを含み得る。
本発明の第3の態様の第3の実施形態において、細胞は、本発明の第1の態様に記載のキメラ受容体および上で定義されたような膜貫通タンパク質を含む。
第4の態様において、本願は、本発明の第1の態様に記載のキメラ受容体をコードすることができる核酸配列を提供する。
第5の態様において、本発明の第2の態様に記載のキメラ受容体システムをコードする核酸構築物が提供される。
本発明の第5の態様の第1の実施形態において、核酸構築物は、第1のキメラ受容体をコードする第1の核酸配列および第2のキメラ受容体をコードする第2の核酸配列を含む。
核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-AbB2-スペーサー2-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、第1のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、第1のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、第1のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、第1のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、両キメラ受容体の共発現を可能にする核酸配列であり、
AgB2は、第2のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー2は、第2のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM2は、第2のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、第2のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-AbB2-スペーサー2-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、第1のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、第1のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、第1のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、第1のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、両キメラ受容体の共発現を可能にする核酸配列であり、
AgB2は、第2のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー2は、第2のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM2は、第2のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、第2のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
本発明の第5の態様の核酸構築物において、エンド1は、サイトカイン受容体エンドドメインの第1の鎖をコードする核酸配列および第1の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み得;エンド2は、サイトカイン受容体エンドドメインの第2の鎖をコードする核酸配列および第2の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み得る。
「coexpr」は、自己切断性ペプチドを含む配列をコードし得る。
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で使用され得る。
本発明の第5の態様の第2の実施形態において、本発明の第1の態様に記載のキメラ受容体をコードする第1の核酸配列および細胞内融合タンパク質をコードする第2の核酸配列を含む核酸構築物が提供される。
その核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-ドメイン2-エンド2
(ここで、
AgB1は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、キメラ受容体と細胞内融合タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ドメイン2は、細胞内融合タンパク質の第2のドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、細胞内融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-ドメイン2-エンド2
(ここで、
AgB1は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、キメラ受容体と細胞内融合タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ドメイン2は、細胞内融合タンパク質の第2のドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、細胞内融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
第2のドメインである「ドメイン2」は、リン酸化されたCD3ゼータドメインに結合することができる配列をコードし得る。この点において、「ドメイン2」は、ZAP70
SH2ドメインをコードする核酸配列である「ZAP70」であり得る。
SH2ドメインをコードする核酸配列である「ZAP70」であり得る。
本発明の第5の態様の第3の実施形態において、キメラ受容体をコードする第1の核酸配列および膜貫通タンパク質をコードする第2の核酸配列を含む核酸構築物が提供される。
その核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、キメラ受容体と膜貫通タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
TM2は、膜貫通ドメインの膜貫通局在化配列をコードする核酸配列であり、
エンド2は、膜貫通タンパク質(tranmembrane protein)のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、キメラ受容体と膜貫通タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
TM2は、膜貫通ドメインの膜貫通局在化配列をコードする核酸配列であり、
エンド2は、膜貫通タンパク質(tranmembrane protein)のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
第6の態様において、本発明は、本発明の第4の態様に記載の核酸配列または本発明の第5の態様に記載の核酸構築物を含むベクターを提供する。
そのベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンであり得る。
第7の態様において、
i)本発明の第1の態様において定義されたような第1のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)本発明の第1の態様において定義されたような第2のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットが提供される。
i)本発明の第1の態様において定義されたような第1のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)本発明の第1の態様において定義されたような第2のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットが提供される。
i)本発明の第1の態様において定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)第2の受容体または上で定義されたような細胞内融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットも提供される。
ii)第2の受容体または上で定義されたような細胞内融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットも提供される。
i)本発明の第1の態様において定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)上で定義されたような膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットも提供される。
ii)上で定義されたような膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含むキットも提供される。
第8の態様において、本発明の第3の態様に記載の細胞を作製するための方法が提供され、その方法は、本発明の第4の態様に記載の核酸配列;本発明の第5の態様に記載の核酸構築物;本発明の第6の態様に記載のベクター;または本発明の第7の態様に記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む。
その細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。
第9の態様において、本発明の第3の態様に記載の複数の細胞を含む薬学的組成物が提供される。
第10の態様において、疾患を処置および/または予防するための方法が提供され、その方法は、本発明の第9の態様に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む。
その方法は、以下の工程:
(i)被験体からの細胞含有試料の単離;
(ii)本発明の第4の態様に記載の核酸配列;本発明の第5の態様に記載の核酸構築物;本発明の第6の態様に記載のベクター;または本発明の第7の態様に記載のベクターのキットでのその細胞の形質導入またはトランスフェクション;および
(iii)被験体に(ii)からの細胞を投与すること
を含み得る。
(i)被験体からの細胞含有試料の単離;
(ii)本発明の第4の態様に記載の核酸配列;本発明の第5の態様に記載の核酸構築物;本発明の第6の態様に記載のベクター;または本発明の第7の態様に記載のベクターのキットでのその細胞の形質導入またはトランスフェクション;および
(iii)被験体に(ii)からの細胞を投与すること
を含み得る。
上記試料は、T細胞含有試料であり得る。
上記疾患は、がんであり得る。
疾患の処置および/または予防において使用するための、本発明の第9の態様に記載の薬学的組成物も提供される。
疾患を処置および/または予防するための医薬の製造における本発明の第3の態様に記載の細胞の使用も提供される。
詳細な説明
キメラ受容体(CR)
キメラ受容体(CR)は、サイトカイン受容体エンドドメインおよび異種リガンド結合エキソドメインを含む分子である。キメラ受容体のエンドドメインは、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインも含み得る。
キメラ受容体(CR)
キメラ受容体(CR)は、サイトカイン受容体エンドドメインおよび異種リガンド結合エキソドメインを含む分子である。キメラ受容体のエンドドメインは、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインも含み得る。
ゆえに、キメラ受容体は、
(i)リガンド結合エキソドメイン;
(ii)任意選択のスペーサー;
(iii)膜貫通ドメイン;
(iv)サイトカイン受容体エンドドメイン;および
(v)細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
を含み得る。
サイトカイン受容体およびシグナル伝達
(i)リガンド結合エキソドメイン;
(ii)任意選択のスペーサー;
(iii)膜貫通ドメイン;
(iv)サイトカイン受容体エンドドメイン;および
(v)細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
を含み得る。
サイトカイン受容体およびシグナル伝達
多くの細胞の機能は、サイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーによって制御されている。これらの受容体によるシグナル伝達は、それらとJanusキナーゼ(JAK)との会合に依存し、このJanusキナーゼは、リガンドの結合を、受容体複合体にリクルートされたシグナル伝達タンパク質のチロシンリン酸化と結び付ける。これらには、シグナル伝達物質、およびサイトカイン応答の多様性に寄与する転写因子のファミリーである転写活性化因子(STAT)が含まれる。
本発明のキメラ受容体が、そのリガンドに結合すると、以下の細胞内シグナル伝達経路のうちの1つまたはそれより多くが、惹起され得る:
(i)JAK-STAT経路
(ii)MAPキナーゼ経路;および
(iii)ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)経路。
(i)JAK-STAT経路
(ii)MAPキナーゼ経路;および
(iii)ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)経路。
JAK-STAT系は、3つの主要な構成要素:(1)受容体(2)Janusキナーゼ(JAK)および(3)シグナル伝達物質および転写の活性化因子(Signal Transducer and Activator of Transcription)(STAT)からなる。
JAKは、チロシンキナーゼ活性を有し、細胞表面のサイトカイン受容体に結合する。このリガンドと受容体との結合によって、JAKの活性化が引き起こされる。キナーゼ活性が高まると、それらは、受容体上のチロシン残基をリン酸化し、ホスホチロシンに結合するSH2ドメインを含むタンパク質と相互作用するための部位を形成する。これらのホスホチロシン残基に結合することができるSH2ドメインを有するSTATは、その受容体にリクルートされ、それ自体が、JAKによってチロシンがリン酸化される。次いで、これらのホスホチロシンは、他のSTATのSH2ドメインに対する結合部位として働き、それらの二量体化を媒介する。種々のSTATが、ヘテロ二量体またはホモ二量体を形成する。活性化されたSTAT二量体は、細胞核の中に蓄積し、それらの標的遺伝子の転写を活性化する。
サイトカイン受容体エンドドメイン
サイトカイン受容体エンドドメイン
本発明のキメラ受容体は、エキソドメインがそのリガンドに結合したとき、「サイトカイン型」細胞シグナル伝達を引き起こす(単独で、または別のキメラ受容体の存在下において)エンドドメインを含む。
サイトカイン受容体エンドドメインは、I型サイトカイン受容体に由来し得る。I型サイトカイン受容体は、細胞膜に隣接した細胞外の部分に、共通アミノ酸モチーフ(WSXWS)を共有する。
サイトカイン受容体エンドドメインは、II型サイトカイン受容体に由来し得る。II型サイトカイン受容体には、I型およびII型のインターフェロンに結合するもの、ならびにインターロイキン-10ファミリーのメンバー(インターロイキン-10、インターロイキン-20およびインターロイキン-22)に結合するものが含まれる。
I型サイトカイン受容体は、
(i)インターロイキン受容体(例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL13、IL-15、IL-21、IL-23およびIL-27に対する受容体);
(ii)コロニー刺激因子受容体(例えば、エリトロポイエチン、GM-CSFおよびG-CSFに対する受容体);ならびに
(iii)ホルモン受容体/神経ペプチド受容体(例えば、ホルモン受容体およびプロラクチン受容体)
を含む。
(i)インターロイキン受容体(例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL13、IL-15、IL-21、IL-23およびIL-27に対する受容体);
(ii)コロニー刺激因子受容体(例えば、エリトロポイエチン、GM-CSFおよびG-CSFに対する受容体);ならびに
(iii)ホルモン受容体/神経ペプチド受容体(例えば、ホルモン受容体およびプロラクチン受容体)
を含む。
I型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、異なる鎖を含み、それらのうちのいくつかが、リガンド/サイトカイン相互作用に関わり、他のものが、シグナル伝達に関わる。例えば、IL-2受容体は、α鎖、β鎖およびγ鎖を含む。
IL-2受容体共通ガンマ鎖(CD132としても知られる)は、IL-2受容体、IL-4受容体、IL-7受容体、IL-9受容体、IL-13受容体およびIL-15受容体の間で共有されている。
IL-2
IL-2
IL-2は、3つの形態を有するIL-2受容体に結合し、その受容体は、α、βおよびγ「鎖」と称されることが多い3つの異なるタンパク質の異なる組み合わせによって生成される;これらのサブユニットは、他のサイトカインに対する受容体の一部でもある。IL-2Rのβ鎖およびγ鎖は、I型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。
それらの3つの受容体鎖は、様々な細胞型上で別々にかつ異なって発現され、異なる組み合わせおよび順序で組み立てられて、低親和性、中親和性および高親和性のIL-2受容体が生成され得る。
α鎖は、IL-2に低親和性で結合し、βとγとの組み合わせは一体となって、主にメモリーT細胞上およびNK細胞上のIL-2に中親和性で結合する複合体を形成し;3つすべての受容体鎖は、活性化T細胞上および制御性T細胞上のIL-2に高親和性(Kd約10-11M)で結合する複合体を形成する。
これらの3つのIL-2受容体鎖は、細胞膜にまたがり、細胞内に伸びることによって、生化学的シグナルを細胞内部に伝える。アルファ鎖は、シグナル伝達に参加しないが、ベータ鎖が、チロシンホスファターゼJAK1と複合体を形成する。同様に、ガンマ鎖も、JAK3と呼ばれる別のチロシンキナーゼと複合体を形成する。これらの酵素は、IL-2Rの外部ドメインにIL-2が結合することによって活性化される。
初期のT細胞が、抗原によって刺激されたときも、IL-2シグナル伝達は、T細胞からエフェクターT細胞およびメモリーT細胞への分化を促進する。IL-2受容体鎖は、抗原によって選択されたT細胞クローンの数および機能の拡大に依存するT細胞の免疫学的記憶の発生におけるその役割を通じて、長期間の細胞性免疫においても重要な役割を果たす。
本発明のキメラ受容体は、IL-2受容体β鎖および/またはIL-2受容体(すなわち、共通)γ鎖を含み得る。
IL-2β鎖および共通γ鎖のエンドドメインに対するアミノ酸配列を配列番号1および2として示す。
配列番号1:ヒト共通ガンマ鎖由来のエンドドメイン:
配列番号2:ヒトIL-2Rβ由来のエンドドメイン:
配列番号1:ヒト共通ガンマ鎖由来のエンドドメイン:
用語「~由来の」は、本発明のキメラ受容体のエンドドメインが、内在性分子の野生型配列、またはJAK-1もしくはJAK-3と複合体を形成する能力および上で述べたシグナル伝達経路のうちの1つを活性化する能力を保持するその変異型と同じ配列を有することを意味する。
「変異型」配列は、野生型配列(例えば、配列番号1または2)と少なくとも80、85、90、95、98または99%の配列同一性を有するが、但し、その変異型配列は、野生型配列の機能、すなわち、JAK-1またはJAK-3と複合体を形成し、例えば、JAK-STATシグナル伝達経路を活性化する能力を保持する。
2つのポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性は、http://blast.ncbi.nlm.nih.govで自由に利用可能なBLASTなどのプログラムによって容易に測定され得る。
IL-7
IL-7
インターロイキン-7受容体は、2本の鎖:インターロイキン-7受容体-α鎖(CD127)および共通γ鎖受容体(CD132)から構成される。共通γ鎖受容体は、インターロイキン-2、-4、-9および-15をはじめとした様々なサイトカインと共有される。インターロイキン-7受容体は、ナイーブT細胞およびメモリーT細胞をはじめとした様々な細胞型上に発現される。
インターロイキン-7受容体は、リンパ球の発達、特に、V(D)J組換えにおいて重要な役割を果たす。IL-7Rは、STAT5による、T細胞受容体ガンマ遺伝子を含むゲノムの領域の接近可能性およびヒストンアセチル化も制御する。マウスでのノックアウト研究から、アポトーシスの阻止が、Tリンパ球の分化および活性化における、このタンパク質の必須の機能であることが示唆されている。
本発明のキメラ受容体は、IL-7受容体α鎖および/もしくはIL-7受容体(すなわち、共通)γ鎖またはその変異型を含み得る。
IL-7α鎖のエンドドメインに対するアミノ酸配列を配列番号3として示す。
配列番号3-ヒトIL-7Rα由来のエンドドメイン:
単量体キメラ受容体システム
配列番号3-ヒトIL-7Rα由来のエンドドメイン:
キメラ抗原受容体は、通常、同一の2本の鎖のホモ二量体である。
本発明のキメラ受容体は、ホモ二量体、またはリガンドの存在下において別のキメラ受容体単量体と会合される単量体であり得る。
特に、本キメラ受容体は、
(i)エキソドメイン;
(ii)膜貫通ドメイン;
(iii)サイトカイン受容体エンドドメイン;および
(v)細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
を含む単量体であり得る。
(i)エキソドメイン;
(ii)膜貫通ドメイン;
(iii)サイトカイン受容体エンドドメイン;および
(v)細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
を含む単量体であり得る。
エキソドメインは、scFvなどのリガンド結合ドメインを含み得る。ある細胞は、第1のCRのリガンド結合ドメインおよび第2のCRのリガンド結合ドメインが、同じリガンド上の異なるエピトープに結合する、2つの単量体CRを含み得る。
あるいは、エキソドメインは、別のキメラ受容体のエキソドメインと一体となったとき、機能的なリガンド結合ドメインを生成するドメインを含み得る。例えば、一方の単量体キメラ受容体が、VHを含み得、第2のキメラ受容体が、抗体のVLを含む。
単量体サイトカイン受容体は、1つまたはそれより多い細胞内T細胞シグナル伝達ドメインも含み得る。例えば、その受容体は、以下のうちの1つまたはそれより多くを含み得る:CD3ゼータエンドドメイン、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメイン、4-1BBエンドドメイン、CD2エンドドメイン、CD27エンドドメイン、ICOSエンドドメイン、CD40エンドドメイン。
二重キメラ受容体システム
二重キメラ受容体システム
細胞が、2つのホモ二量体キメラ受容体または単量体キメラ受容体を含む場合、それらは、「相補的な」サイトカイン受容体エンドドメインを有し得る。相補的なサイトカイン受容体エンドドメインは、互いと会合して、サイトカイン型のシグナル伝達を誘導することができる。
相補的なサイトカイン受容体エンドドメインの例を下記の表に示す。本発明の二重CRシステムにおいて、一方のCRが、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み得、他方のCRが、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含み得る。
本発明の二重キメラ受容体システムは、1つまたはそれより多い細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。その細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、2つのホモ二量体キメラ受容体または単量体キメラ受容体の間で共有され得るか、または一方の受容体が、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含み得、他方は、含まない。可能性のあるいくつかの組み合わせを以下の表に要約する:
例えば、一方の受容体が、CD3ゼータエンドドメインを含み得、他方の受容体が、1つまたはそれより多い共刺激ドメイン(例えば、CD3ゼータエンドドメイン、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメイン、4-1BBエンドドメイン、CD2エンドドメイン、CD27エンドドメイン、ICOSエンドドメインおよび/またはCD40エンドドメイン)を含み得る。
ZAP70キメラ受容体システム
ZAP70キメラ受容体システム
本発明の1つの実施形態において、キメラ受容体は、細胞内融合タンパク質とともに細胞の中で発現される。その細胞内融合タンパク質は、サイトカイン受容体エンドドメインを含む。その細胞内融合タンパク質は、リン酸化されたCD3ゼータエンドドメインに結合するドメイン、例えば、ZAP70 SH2ドメインを含み得る。この実施形態は、図4に模式的に図示されている。
ZAP70は、T細胞およびナチュラルキラー細胞の表面膜の近くに通常発現されるタンパク質である。ZAP70は、T細胞受容体(TCR)の一部であり、T細胞シグナル伝達において重要な役割を果たす。その分子量は、70kDaであり、2つのN末端SH2ドメインおよび1つのC末端キナーゼドメインから構成される。ZAP70は、タンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。
T細胞の活性化における最も早い工程は、TCRによる標的細胞上のペプチドMHC-複合体の認識である。この最初の事象は、TCR複合体におけるCD3-ゼータの細胞質テイルとLckキナーゼとの近接会合を引き起こす。次いで、Lckは、CD3-ゼータの細胞質テイルにおけるチロシン残基をリン酸化し、それにより、ZAP70のリクルートが可能になる。ZAP70は、TCRの会合の後のT細胞の活性化において中心的役割を果たすSH2含有キナーゼである。ZAP70におけるタンデムなSH2ドメインは、リン酸化されたCD3に結合することにより、ZAP70がリン酸化され、Lckによってまたはトランスで他のZAP70分子によって活性化される。次いで、活性なZAP70は、下流の膜タンパク質をリン酸化することができる。それらの膜タンパク質の中でも重要なのは、活性化T細胞のリンカー(LAT)タンパク質である。LATは、足場タンパク質であり、複数の残基上でそれがリン酸化されると、それは、他のいくつかのSH2ドメイン含有タンパク質と相互作用することが可能になる。それらのSH2ドメイン含有タンパク質には、LATの中のリン酸化されたペプチドを認識して、T細胞の活性化シグナルを下流に伝達し、最終的に、一連のT細胞応答をもたらすGrb2、PLC-gおよびGrapが含まれる。
ZAP70タンパク質の一例は、UniProtKBアクセッション番号P43403を有するヒトZAP70タンパク質である。この例証の配列は、619アミノ酸長であり、配列番号22として示される。
ZAP70アミノ酸配列(配列番号22)
ZAP70アミノ酸配列(配列番号22)
配列番号22として示されるZAP70配列は、タンデムなSH2ドメインを含む。SH2 1は、アミノ酸番号10~102を含み、SH2 2は、この配列のアミノ酸番号163~254を含む。ZAP70 SH2ドメインは、SH2 1、SH2 2または両方のSH2ドメインを含み得る。
上記融合タンパク質は、タンデムなZAP70 SH2ドメインを含み得る。例えば、融合タンパク質は、配列番号23として示される配列を含み得る。
ZAP70 SH2ドメイン(配列番号23)
ZAP70 SH2ドメイン(配列番号23)
上記融合タンパク質は、少なくとも80、85、90、95、98または99%の配列同一性を有する配列番号23の変異型を含み得るが、但し、その変異型の配列は、必要とされる特性を有するSH2ドメイン配列である。換言すれば、変異型の配列は、ZAP70のリクルートを可能にする、CD3-ゼータの細胞質テイルにおけるリン酸化されたチロシン残基に結合することができなければならない。
ある特定の実施形態において、上記融合タンパク質は、ZAP70 SH2ドメインおよびZAP70キナーゼドメインを含み得る。例えば、上記融合タンパク質は、配列番号22として示される配列、または少なくとも80、85、90、95、98もしくは99%の配列同一性を有するその変異型を含み得る。
上記融合タンパク質は、サイトカイン受容体エンドドメインも含む。上記融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインは、上で定義されたようなキメラ受容体のサイトカイン受容体エンドドメインに「相補的」であり得る。相補的なサイトカイン受容体エンドドメインは、互いと会合して、サイトカイン型のシグナル伝達を誘導することができる。
膜貫通タンパク質
膜貫通タンパク質
本発明の別の実施形態において、キメラ受容体は、膜貫通タンパク質とともに細胞の中で発現される。そのキメラ受容体および膜貫通タンパク質は、相補的なサイトカイン受容体エンドドメインを含む。
膜貫通タンパク質は、細胞膜に繋がれ得るかまたは細胞膜と会合し得る。例えば、膜貫通タンパク質は、細胞の膜に当該タンパク質を繋ぎ留める膜貫通ドメインを含み得る。あるいは、膜貫通タンパク質は、ミリストイル基を含み得る。
ミリストイル化は、ミリスチン酸に由来するミリストイル基が、N末端のグリシン残基のアルファ-アミノ基にアミド結合によって共有結合的に付着される、脂質化修飾である。
膜貫通タンパク質は、1つまたはそれより多い共刺激ドメインも含み得る。
膜貫通タンパク質は、リガンド結合エキソドメインを欠き得る。
スペーサー
スペーサー
本発明のキメラ受容体は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインと空間的に分離する、スペーサーを含み得る。フレキシブルスペーサーは、抗原結合ドメインが、抗原結合を可能にする種々の方向に向くことを可能にする。
本発明の細胞が、2つまたはそれを超えるキメラ受容体を含む場合、スペーサーは、同じであっても異なってもよい。
スペーサー配列は、例えば、IgG1 Fc領域、IgG1ヒンジまたはCD8ストークを含み得る。リンカーは、IgG1 Fc領域、IgG1ヒンジまたはCD8ストークと類似の長さおよび/またはドメインスペーシング特性を有する代替的リンカー配列を二者択一的に含み得る。
ヒトIgG1スペーサーは、Fc結合モチーフを除去するように変更され得る。
これらのスペーサーに対するアミノ酸配列の例を下記に示す:
配列番号4(ヒトIgG1のヒンジ-CH2CH3)
配列番号5(ヒトCD8ストーク):
配列番号6(ヒトIgG1ヒンジ):
配列番号4(ヒトIgG1のヒンジ-CH2CH3)
スペーサーは、単量体であり得る。単量体のスペーサーは、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基(複数可)の変異によって作製され得る(Bridgemanら(2010)J.Immunol.184:6938-6949)。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがるCRの配列である。膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、CD28に由来し得、良好な受容体安定性をもたらす。
あるいは、膜貫通ドメインは、サイトカイン受容体、例えば、エンドドメインが由来する同じサイトカインに由来し得る。
膜貫通ドメインは、例えば、IL-2R、IL-7RまたはIL-15Rに由来し得る。
配列番号7-ヒト共通ガンマ鎖に由来する膜貫通:
配列番号8-ヒトIL-2Rβに由来する膜貫通:
配列番号9-ヒトIL-7Rαに由来する膜貫通:
配列番号10-ヒトIL-15Rαに由来する膜貫通:
リガンド結合エキソドメイン
配列番号7-ヒト共通ガンマ鎖に由来する膜貫通:
用語「リガンド結合ドメイン」とは、リガンド結合に関わるCRの細胞外の部分のことを指す。単一のキメラ受容体のリガンド結合ドメインは、それ自体がリガンドに結合することができ得る(例えば、それがscFvに基づく場合)。あるいは、リガンド結合ドメインは、別のキメラ受容体と会合しているとき(例えば、一方のCRがVHを含み、もう一方のCRが抗体のVLを含む場合)、リガンド結合が可能であり得る。
用語「リガンド」は、CRの抗原結合ドメインまたは相補的なCRリガンド結合ドメインの組み合わせによって特異的に認識および結合される実体を意味する「抗原」の同意語として使用される。
数多くの抗原結合ドメインが、当該分野で公知であり、それらとしては、抗体、抗体模倣物およびT細胞受容体の抗原結合部位に基づくものが挙げられる。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント(scFv);標的抗原に対しての天然受容体由来の結合ドメイン;標的リガンドに対して十分な親和性を有するペプチド;単一ドメインバインダー(例えば、ラクダ科動物のもの);人工単一バインダー(artificial binder single)(例えば、Darpin);またはT細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。
図5に示されているアミノ酸配列は、各々がCD22に結合するリガンド結合ドメインを有する2つのCARを含む。一方は、scFv LT22に基づき、もう一方は、scFv RFB4に基づく。
リガンド
リガンド
本発明のCRまたはCRシステムは、リガンドに結合する。
リガンドは、腫瘍分泌因子またはケモカインなどの可溶性リガンドであり得る。
あるいは、リガンドは、細胞表面抗原などの膜結合型リガンドであり得る。
用語「可溶性リガンド」は、細胞の一部ではないかまたは細胞に付着しておらず、細胞外空間で、例えば、目的の組織の体液中で自由に動く、リガンドまたは抗原を表すために使用される。可溶性リガンドは、個体の血清、血漿または他の体液中において無細胞の状態で存在し得る。
可溶性リガンドは、がんなどの特定の疾患の存在または病理に関連し得る。
可溶性リガンドは、がんセクレトーム(cancer secretome)、すなわち腫瘍によって分泌される因子のコレクションの一部であり得、がん幹細胞、非幹細胞または周囲のストローマ由来であり得る。可溶性リガンドは、腫瘍細胞によって分泌され得るか、または腫瘍により脱落させられ得る。
可溶性リガンドは、疾患または罹患組織に特徴的であり得る。可溶性リガンドは、疾患を有する被験体にもっぱら見られ得るか、または健康な被験体と比べて疾患を有する被験体において;もしくは健康な組織と比べて罹患組織においてより高いレベルで見られ得る。可溶性リガンドは、健康な被験体と比べて疾患を有する被験体において;または健康な組織と比べて罹患組織において、少なくとも2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍または100,000倍高いレベルで発現され得る。
用語「細胞表面抗原」および「細胞表面リガンド」は、細胞の表面に付着されたまたは細胞の表面上に発現されたリガンドを意味する「膜結合型抗原」および「膜結合型リガンド」の同意語として使用される。細胞表面リガンドは、例えば、膜貫通タンパク質であり得る。
細胞表面リガンドが見られる細胞は、がん細胞などの標的細胞であり得る。
細胞表面リガンドは、がんなどの特定の疾患の存在または病理に関連し得る。あるいは、細胞表面リガンドは、必ずしも病的状態に関連せずに、標的細胞(例えば、B細胞)の細胞型に特徴的であり得る。
細胞表面リガンドは、疾患または罹患組織に特徴的である場合、その疾患を有する被験体の関連する細胞上にもっぱら見られ得るか、または健康な被験体と比べてその疾患を有する被験体の関連する細胞上において;もしくは健康な組織と比べて罹患組織においてより高いレベルで見られ得る。細胞表面リガンドは、健康な被験体と比べて疾患を有する被験体の細胞上において;または健康な組織と比べて罹患組織において、少なくとも2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍または100,000倍高いレベルで発現され得る。
腫瘍分泌因子
腫瘍分泌因子
上記CRによって認識されるリガンドは、腫瘍によって分泌されるまたは腫瘍から脱落した可溶性リガンドであり得る。
この「腫瘍分泌因子」は、例えば、前立腺特異的抗原(PSA)、癌胎児抗原(CEA)、血管(vascylar)内皮増殖因子(VEGF)またはがん抗原-125(CA-125)であり得る。
細胞表面抗原
細胞表面抗原
上記CRまたはCRシステムは、細胞表面抗原、すなわち、腫瘍細胞などの標的細胞の表面上に発現される膜貫通タンパク質などの実体を認識し得る。
上記CRまたはCRシステムは、腫瘍関連細胞表面抗原に特異的に結合し得る。
様々な腫瘍関連抗原(TAA)が知られており、それらのうちのいくつかを表1に示す。本発明において使用される抗原結合ドメインは、その中に示されているようなTAAに結合することができるドメインであり得る。
前立腺がん関連抗原
上記CRは、前立腺がんに関連する細胞表面抗原(例えば、前立腺幹細胞抗原(PSCA)または前立腺特異的膜抗原(PSMA))に特異的に結合し得る。
PSCAは、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型の細胞膜糖タンパク質である。PSCAは、前立腺がんの大部分においてアップレギュレートされ、膀胱および膵臓のがんにおいても検出される。
7F5(Morgenrothら(Prostate(2007)67:1121-1131);1G8(Hillerdalら(2014)BMC Cancer 14:30);およびHa1-4.117(Abate-Dagaら(2014)25:1003-1012)などの様々な抗PSCA抗体が知られている。
本発明のCR発現細胞は、これらの抗体のうちの1つに基づく抗原結合ドメインを含み得る。
PSMAは、膜に存在する亜鉛金属酵素である。PSMAは、ヒト前立腺において強く発現され、他のほとんどの組織での発現よりも100倍高い。がんにおいて、PSMAは、発現がアップレギュレートされ、前立腺がんにおいて2番目に多くアップレギュレートされる遺伝子と呼ばれており、その増加は、非がん性前立腺よりも8~12倍高い。ヒト前立腺および前立腺がんにおける発現に加えて、PSMAは、腫瘍の血管新生においても高度に発現されると見出されているが、腎臓、乳房、結腸などのようなすべてのタイプの固形腫瘍の正常な脈管構造では高度に発現されないと見出されている。
7E11、J591、J415ならびにHybritech PEQ226.5およびPM2J004.5などの様々な抗PSMA抗体が知られており、それらの各々が、PSMAの異なるエピトープに結合する(Changら(1999)Cancer Res 15:3192-8)。
本発明のCRは、これらの抗体のうちの1つに基づく抗原結合ドメインを含み得る。
例えば、本CRは、配列番号11として示されている配列を有する、J591に基づくscFvを含み得る。
配列番号11(J591 scFv)
シグナルペプチド
配列番号11(J591 scFv)
本明細書中に記載されるCRまたは膜貫通タンパク質は、それがT細胞などの細胞において発現されるとき、新生タンパク質が小胞体に向けられ、続いて細胞表面(このCRまたは膜貫通タンパク質は細胞表面で発現される)に向けられるようにシグナルペプチドを含み得る。
シグナルペプチドのコアは、単一アルファ-へリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、アミノ酸の短い正に荷電したストレッチから始まり得、これが転位中におけるポリペプチドの適切なトポロジーを強化する助けとなる。シグナルペプチドの末端に、典型的にはシグナルペプチダーゼにより認識され、切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位中または転位完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成させ得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端に位置し得る。本発明におけるCRとともに使用するのに適した数多くのシグナルペプチドが当該分野で公知である。
CRエンドドメイン
CRエンドドメイン
エンドドメインは、膜の細胞内の側に位置する、キメラ受容体または膜貫通タンパク質の一部である。
エンドドメインは、古典的CARのシグナル伝達部分である。抗原結合ドメインによる抗原認識の後、個々のCAR分子クラスター、天然のCD45およびCD148がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。同じ原理が、本発明のキメラ受容体にも当てはまる。動力学的隔離によるキメラ受容体のクラスター化は、細胞シグナル伝達が細胞内(intrcellular)T細胞シグナル伝達ドメインを介して生じることを可能にする。
最も一般的に使用されるシグナル伝達成分は、3つのITAMを含むCD3-ゼータエンドドメインのエンドドメイン成分である。これは、抗原が結合された後、活性化シグナルをT細胞に伝達する。CD3-ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない可能性があるので、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラCD28およびOX40は、CD3-ゼータと併用されて、増殖/生存シグナルを伝達し得るか、または3つ全部が一緒に使用され得る。
CRは、CD3-ゼータエンドドメインのみを含み得るか、CD28もしくはOX40のエンドドメインとともにCD3-ゼータエンドドメインを含み得るか、またはCD28エンドドメインならびにOX40およびCD3-ゼータエンドドメインを含み得る。
上記細胞が、2つまたはそれを超えるキメラ受容体を含む場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、それらのCR分子の間で「共有」され得る。例えば、一方のCRが、CD3ゼータエンドドメインを含み得、もう一方のCRが、1つまたはそれより多い共刺激ドメイン、例えば、CD28、OX40または4-1BBに由来するものを含み得る。
上記細胞が、キメラ受容体および膜貫通タンパク質を含む場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、そのCRと膜貫通タンパク質との間で「共有」され得る。例えば、そのCRは、CD3ゼータエンドドメインを含み得、膜貫通タンパク質は、1つまたはそれより多い共刺激ドメイン、例えば、CD28、OX40または4-1BBに由来するものを含み得る。
上記CRまたは膜貫通タンパク質エンドドメインは、以下のうちの1つまたはそれより多くを含み得る:ICOSエンドドメイン、CD27エンドドメイン、BTLAエンドドメイン、CD30エンドドメイン、GITRエンドドメインおよびHVEMエンドドメイン。
上記エンドドメイン(endomain)は、配列番号12~20として示される配列または少なくとも80%の配列同一性を有するそれらの変異型のうちの1つまたはそれより多くを含み得る。
配列番号12-CD3 Zエンドドメイン
配列番号13-CD28およびCD3ゼータエンドドメイン
配列番号14-CD28、OX40およびCD3ゼータエンドドメイン
配列番号15-ICOSエンドドメイン
配列番号16-CD27エンドドメイン
配列番号17-BTLAエンドドメイン
配列番号19-GITRエンドドメイン
配列番号20-HVEMエンドドメイン
配列番号12-CD3 Zエンドドメイン
変異型の配列は、配列番号12~20と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有し得るが、但し、その配列は、効果的な細胞内シグナル伝達ドメインを提供する。
核酸
核酸
本発明は、本発明のCRをコードする核酸も提供する。
その核酸は、以下の構造:
AgB-スペーサー-TM-エンド
(ここで、
AgB1は、CRの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、CRのスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、CRの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、CRのエンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
核酸構築物
AgB-スペーサー-TM-エンド
(ここで、
AgB1は、CRの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、CRのスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、CRの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、CRのエンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
核酸構築物
本発明はさらに、本発明のキメラ受容体システムをコードする核酸構築物を提供する。
その核酸構築物は、本発明の第1の態様に関連して定義されたような第1のCRをコードする第1の核酸配列;および本発明の第1の態様に関連して定義されたような第2のCRをコードする第2の核酸配列を含み得る。
その核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-AbB2-スペーサー2-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、第1のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、第1のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、第1のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、第1のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、両キメラ受容体の共発現を可能にする核酸配列であり、
AgB2は、第2のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー2は、第2のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM2は、第2のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、第2のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-AbB2-スペーサー2-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、第1のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、第1のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、第1のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、第1のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、両キメラ受容体の共発現を可能にする核酸配列であり、
AgB2は、第2のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー2は、第2のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM2は、第2のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、第2のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
核酸構築物が、T細胞などの細胞において発現されるとき、それは、第1および第2のCRが細胞表面で共発現されるように切断部位で切断されるポリペプチドをコードする。
第1および第2のCRは、同じ抗原上の異なるエピトープに結合し得る。あるいは、第1および第2のCRは、一体となって抗原結合が可能である相補的なリガンド結合ドメインを含み得る。
第1および第2のCRは、相補的なサイトカイン受容体エンドドメイン、例えば、サイトカイン受容体のαまたはβ鎖に由来するものおよび同じサイトカイン受容体のγ鎖に由来するものを有し得る。
あるいは、上記核酸構築物は、本発明の第1の態様に記載のキメラ受容体をコードする第1の核酸配列および細胞内融合タンパク質をコードする第2の核酸配列を含み得る。
その核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-ドメイン2-エンド2
(ここで、
AgB1は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、キメラ受容体と細胞内融合タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ドメイン2は、細胞内融合タンパク質の第2のドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、細胞内融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-ドメイン2-エンド2
(ここで、
AgB1は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、キメラ受容体と細胞内融合タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
ドメイン2は、細胞内融合タンパク質の第2のドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、細胞内融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
第2のドメインである「ドメイン2」は、ZAP70 SH2ドメインをコードする核酸配列である「ZAP70」であり得る。
あるいは、上記核酸構築物は、キメラ受容体をコードする第1の核酸配列および膜貫通タンパク質をコードする第2の核酸配列を含み得る。
その核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、キメラ受容体と膜貫通タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
TM2は、膜貫通ドメインの膜局在化ドメインをコードする核酸配列であり、
エンド2は、膜貫通タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、キメラ受容体と膜貫通タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
TM2は、膜貫通ドメインの膜局在化ドメインをコードする核酸配列であり、
エンド2は、膜貫通タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有し得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いと同義であると意図されている。
遺伝暗号の縮重の結果として、数多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードできることは、当業者によって理解される。さらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチドが発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、当業者は、日常的な手法を用いて、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチドの置換を行うことがあることが理解されるべきである。
本発明による核酸は、DNAまたはRNAを含み得る。それらは、一本鎖または二本鎖であり得る。それらは、それらの中に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもあり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当該分野で公知である。これらには、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の3’および/または5’末端におけるアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載されるような使用の目的において、それらのポリヌクレオチドは、当該分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解されるべきである。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性を高めるためまたは寿命を延長するために行われ得る。
ヌクレオチド配列に関する用語「変異型」、「ホモログ」または「誘導体」は、その配列からのまたはその配列への1つ(またはそれを超える)核酸の任意の置換、変更、修飾、置換、欠失または付加を含む。
上記の構造において、「coexpr」は、第1のCRと第2のCRの両方の共発現を可能にする核酸配列である。それは、切断部位をコードする配列であり得、その結果、核酸構築物は、切断部位によって連結された2つまたはそれを超えるCRを生成し含む。切断部位は、自己切断性であり得、その結果、ポリペプチドが生成されると、いかなる外部の切断活性も必要とせずに、直ちに個々のペプチドに切断される。
切断部位は、第1および第2のCRが分断されるようになるのを可能にする任意の配列であってよい。
用語「切断」は、便宜上、本明細書中で使用されるが、切断部位は、上記ペプチドを古典的な切断以外の機構によって個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス(FMDV)2A自己切断性ペプチド(下記を参照のこと)の場合、「切断」活性を説明する様々なモデルが提案されている:宿主細胞のプロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク分解または翻訳効果(Donnellyら(2001)J.Gen.Virol.82:1027-1041)。切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列の間に位置するとき、それらのタンパク質を別個の実体として発現させる限り、そのような「切断」の正確な機構は、本発明の目的にとって重要でない。
切断部位は、フューリン切断部位であり得る。
フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質コンバターゼファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をそれらの生物学的に活性な生成物にプロセシングするプロタンパク質コンバターゼである。フューリンは、前駆体タンパク質をそれらの対になった塩基性アミノ酸プロセシング部位で効率的に切断し得るカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリンの基質の例としては、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ1前駆体、プロアルブミン、プロ-ベータ-セクレターゼ、膜1型マトリックスメタロプロテアーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニットおよびフォン・ビルブラント因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列(標準的には、Arg-X-(Arg/Lys)-Arg’)のすぐ下流でタンパク質を切断し、ゴルジ装置において濃縮される。
切断部位は、タバコエッチウイルス(TEV)の切断部位であり得る。
TEVプロテアーゼは、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼである。TEVプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であるので、インビトロとインビボの両方において、融合タンパク質の制御された切断のために使用されることが多い。コンセンサスTEV切断部位は、ENLYFQ\Sである(ここで、「\」は、切断されるペプチド結合を表す)。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、TEVプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がTEV切断部位を含み、哺乳動物細胞において発現される実施形態では、外来性TEVプロテアーゼは、哺乳動物細胞においても発現されなければならない。
切断部位は、自己切断性ペプチドをコードし得る。
「自己切断性ペプチド」とは、そのポリペプチドが当該タンパク質を構成し、かつ自己切断性ペプチドが生成されると、そのポリペプチドは、いかなる外部の切断活性も必要とせずに、直ちに「切断」されるか、または異なる不連続の第1および第2のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドのことを指す。
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の2A自己切断性ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの最初の2A/2B切断は、それ自体のC末端で「切断」する2Aによって媒介される。アフトウイルス(apthoviruses)(例えば、口蹄疫ウイルス(FMDV)およびウマ鼻炎Aウイルス)では、2A領域は、約18アミノ酸という短いセクションであり、それは、タンパク質2BのN末端残基(保存されたプロリン残基)とともに、それ自体のC末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントになる(上記のようなDonellyら(2001))。
「2A様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、C型ロタウイルスおよびTrypanosoma
sppの中の反復配列および細菌の配列(上記のようなDonnellyら(2001))において見られる。切断部位は、これらの2A様配列のうちの1つ、例えば:
sppの中の反復配列および細菌の配列(上記のようなDonnellyら(2001))において見られる。切断部位は、これらの2A様配列のうちの1つ、例えば:
配列番号21:RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
を含み得る。
を含み得る。
本発明は、本発明の第1の態様に記載の第1および第2のCRをコードする1つまたはそれより多い核酸配列を含むキットも提供する。
ベクター
ベクター
本発明は、本発明の第1の態様に記載の1つまたはそれより多いCRをコードする1つまたはそれより多い核酸配列を含むベクターまたはベクターのキットも提供する。そのようなベクターは、そのベクターが本発明の第1の態様に記載のCRを発現するように、その核酸配列(複数可)を宿主細胞に導入するために使用され得る。
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター)またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成mRNAであり得る。
ベクターは、T細胞またはNK細胞をトランスフェクトすることまたは形質転換することができ得る。
細胞
細胞
本発明は、本発明の1つまたはそれより多いCRを含む細胞を提供する。その細胞は、上で定義されたようなCRシステムを含み得る。
その細胞は、本発明の1つまたはそれより多い核酸またはベクターを含み得る。
上記細胞は、T細胞またはNK細胞などの細胞溶解性の免疫細胞であり得る。
T細胞またはTリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプである。それらは、細胞表面におけるT細胞受容体(TCR)の存在により、B細胞およびナチュラルキラー細胞(NK細胞)など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのT細胞がある。
ヘルパーTヘルパー細胞(TH細胞)は、形質細胞および記憶B細胞へのB細胞の成熟、ならびに細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。TH細胞は、それらの表面でCD4を発現する。TH細胞は、抗原提示細胞(APC)の表面でMHCクラスII分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、TH1、TH2、TH3、TH17、Th9、またはTFHを含む、幾つかのサブタイプのうちの1つに分化し得る。
細胞溶解性T細胞(TC細胞またはCTL)は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。CTLは、それらの表面でCD8を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、MHCクラスIに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性T細胞により分泌されるIL-10、アデノシンおよび他の分子を通じて、CD8+細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。
記憶T細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的T細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターT細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶T細胞は、3つのサブタイプ:セントラル記憶T細胞(TCM細胞)および2タイプのエフェクター記憶T細胞(TEM細胞およびTEMRA細胞)を含む。記憶細胞は、CD4+またはCD8+のいずれかであり得る。記憶T細胞は、典型的には細胞表面タンパク質CD45ROを発現する。
以前にはサプレッサーT細胞として知られていた、調節性T細胞(Treg細胞)は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてT細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性T細胞を抑制することである。
CD4+Treg細胞の2つの主なクラス-天然に存在するTreg細胞および適応Treg細胞については記載されている。
天然に存在するTreg細胞(CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞としても知られている)は、胸腺で生じ、TSLPで活性化された骨髄性(CD11c+)樹状細胞および形質細胞様(CD123+)樹状細胞の両方と発達中のT細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するTreg細胞は、FoxP3と呼ばれる細胞内分子の存在により他のT細胞からは区別され得る。FOXP3遺伝子の変異は、調節性T細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患IPEXが引き起こされ得る。
適応Treg細胞(Tr1細胞またはTh3細胞としても知られている)は、正常な免疫応答中に生じ得る。
細胞は、ナチュラルキラー細胞(またはNK細胞)であり得る。NK細胞は、先天性免疫系の一部を形成する。NK細胞は、MHC非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。
NK細胞(自然リンパ球の群に属する)は、大顆粒リンパ球(LGL)として定義され、Bリンパ球およびTリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第3の種類の細胞を構成する。NK細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。
本発明のCR細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。
本発明の第1の態様に記載のTまたはNK細胞は、患者自身の末梢血から(第1団)、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において(第2団)、または非関連ドナーからの末梢血(第3団)から生体外で作製され得る。
あるいは、本発明の第1の態様によるTまたはNK細胞は、TまたはNK細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエキソビボでの分化から得られ得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用し得る不死化されたT細胞株が使用され得る。
これらのすべての実施形態において、CR発現細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、DNAまたはRNAによるトランスフェクションを含む多くの手段のうちの1つによって、各CRをコードするDNAまたはRNAを導入することによって作製される。
本発明の細胞は、被験体由来のエキソビボのTまたはNK細胞であり得る。そのTまたはNK細胞は、末梢血単核球(PBMC)試料に由来し得る。TまたはNK細胞は、本発明の第1の態様に記載のCRを提供する分子をコードする核酸を形質導入される前に、例えば、抗CD3モノクローナル抗体での処置によって、活性化および/または拡大され得る。
本発明のTまたはNK細胞は、
(i)被験体または上に列挙された他の起源からのTまたはNK細胞含有試料の単離;および
(ii)CRをコードする1つまたはそれより多い核酸配列によるTまたはNK細胞の形質導入またはトランスフェクション
によって作製され得る。
(i)被験体または上に列挙された他の起源からのTまたはNK細胞含有試料の単離;および
(ii)CRをコードする1つまたはそれより多い核酸配列によるTまたはNK細胞の形質導入またはトランスフェクション
によって作製され得る。
次いで、それらのTまたはNK細胞は、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて精製され得、例えば、選択され得る。
医薬組成物
本発明はまた、本発明による複数の細胞を含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、本発明による複数の細胞を含む医薬組成物に関する。
医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により1種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび/または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
処置方法
本発明は、疾患を処置および/または予防するための方法を提供し、その方法は、本発明の細胞(例えば、上に記載されたような医薬組成物中の本発明の細胞)を被験体に投与する工程を含む。
本発明は、疾患を処置および/または予防するための方法を提供し、その方法は、本発明の細胞(例えば、上に記載されたような医薬組成物中の本発明の細胞)を被験体に投与する工程を含む。
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書中において、それらの細胞は、既存の疾患に関連する少なくとも1つの症候を和らげるか、減少させるか、もしくは改善するため、および/またはその疾患の進行を減速させるか、減少させるか、もしくは阻止するために、その疾患または症状を有する被験体に投与され得る。
疾患を予防するための方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書中において、そのような細胞は、まだ疾患にかかっていないおよび/またはいかなる疾患の症候も示していない被験体に、その疾患を予防するためもしくはその疾患の原因を弱めるため、またはその疾患に関連する少なくとも1つの症候を減少させるためもしくはその発生を予防するために、投与され得る。被験体は、その疾患の素因を有し得るか、またはその疾患を発症するリスクがあると考えられ得る。
上記方法は、
(i)TまたはNK細胞含有試料を単離する工程;
(ii)そのような細胞に、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターを形質導入するか、またはそのような細胞を、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターでトランスフェクトする工程;
(iii)被験体に(ii)からの細胞を投与する工程
を含み得る。
(i)TまたはNK細胞含有試料を単離する工程;
(ii)そのような細胞に、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターを形質導入するか、またはそのような細胞を、本発明によって提供される核酸配列もしくはベクターでトランスフェクトする工程;
(iii)被験体に(ii)からの細胞を投与する工程
を含み得る。
TまたはNK細胞含有試料は、被験体または他の起源、例えば、上に記載されたような起源から単離され得る。TまたはNK細胞は、被験体自身の末梢血(第一者)、またはドナー末梢血由来の造血幹細胞移植の状況(第二者)、または無関係のドナー由来の末梢血(第三者)から単離され得る。
本発明は、疾患の処置および/または予防において使用するための本発明のCR発現またはCRシステム発現細胞を提供する。
本発明は、疾患を処置および/または予防するための医薬の製造における本発明のCR発現またはCRシステム発現細胞の使用にも関する。
本発明の方法によって処置および/または予防される疾患は、がん性疾患(例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮体がん、腎臓がん(腎細胞)、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵がん、前立腺がんおよび甲状腺がん)であり得る。
上記CRによって認識されるリガンドが、PSA、PSMAまたはPSCAである場合、がんは、前立腺がんであり得る。
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺すことができてもよい。標的細胞は、標的細胞の近くに、腫瘍によって分泌されるリガンドまたはケモカインリガンドが存在することを特徴とし得る。標的細胞は、標的細胞表面における腫瘍関連抗原(TAA)の発現とともに、可溶性リガンドが存在することを特徴とし得る。
本発明の細胞および医薬組成物は、上に記載された疾患の処置および/または予防において使用するためであり得る。
本発明の細胞および医薬組成物は、上に記載された任意の方法において使用するためであり得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
リガンド結合エキソドメイン;ならびに
(i)サイトカイン受容体エンドドメイン;および
(ii)細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
を含むエンドドメイン
を含む、キメラ受容体。
(項目2)
前記リガンド結合エキソドメインが、重鎖可変ドメイン(VH)および/または軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、項目1に記載のキメラ受容体。
(項目3)
前記サイトカイン受容体エンドドメインが、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖を含むか、またはI型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖からなる、前述のいずれかの項目に記載のキメラ受容体。
(項目4)
前記サイトカイン受容体エンドドメインが、
(i)IL-2受容体β鎖エンドドメイン
(ii)IL-7受容体α鎖エンドドメイン;もしくは
(iii)共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含むか、または
(i)IL-2受容体β鎖エンドドメイン
(ii)IL-7受容体α鎖エンドドメイン;もしくは
(iii)共通γ鎖受容体エンドドメイン
からなる、項目3に記載のキメラ受容体。
(項目5)
前記細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが、以下:CD3ゼータエンドドメイン、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメイン、4-1BBエンドドメイン、CD2エンドドメイン、CD27エンドドメイン、ICOSエンドドメイン、CD40エンドドメインのうちの1つまたはそれより多くを含む、前述のいずれかの項目に記載のキメラ受容体。
(項目6)
前記細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン(複数可)および前記サイトカイン受容体エンドドメインの配置は、前記受容体が、細胞の表面に発現されるとき、前記細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン(複数可)が、膜の遠位に位置し、前記サイトカイン受容体エンドドメインが、細胞内の細胞表面上の膜の近位に位置するような配置である、前述のいずれかの項目に記載のキメラ受容体。
(項目7)
項目1~6のいずれかに記載の第1および第2のキメラ受容体を含む、キメラ受容体システムであって、
ここで、前記第1のキメラ受容体は、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、前記第2のキメラ受容体は、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、
前記第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、前記第2のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である、キメラ受容体システム。
(項目8)
前記第1のキメラ受容体および前記第2のキメラ受容体が、同じ抗原の異なるエピトープに結合する、項目7に記載のキメラ受容体システム。
(項目9)
前記第1のキメラ受容体および前記第2のキメラ受容体が、同じ抗原の同じエピトープに結合する、項目7に記載のキメラ受容体システム。
(項目10)
前記第1のキメラ受容体のリガンド結合ドメインおよび前記第2のキメラ受容体のリガンド結合ドメインが、一体となってリガンド結合ができるように、それらが、相補的なリガンド結合ドメインを有する、項目7に記載のキメラ受容体システム。
(項目11)
前記第1および第2のサイトカインエンドドメインが会合して、細胞シグナル伝達をもたらす、項目7~10のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
(項目12)
前記第1のキメラ受容体および前記第2のキメラ受容体が、前記抗原に結合したとき、1型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖/β鎖およびγ鎖を介したサイトカインシグナル伝達が生じるように、前記第1のサイトカイン受容体エンドドメインが、1型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖であり、前記第2のサイトカイン受容体エンドドメインが、1型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖である、項目11に記載のキメラ受容体システム。
(項目13)
前記第1のキメラ受容体が、CD3ゼータエンドドメインを含み、前記第2のキメラ受容体が、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメインおよび4-1BBエンドドメインから選択される1つまたはそれより多い共刺激ドメインを含む、項目7~12のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
(項目14)
前記第1のキメラ受容体と前記第2のキメラ受容体の両方が、CD3ゼータエンドドメインを含む、項目7~12のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
(項目15)
項目1~6のいずれかに記載のキメラ受容体および細胞内融合タンパク質を含む、キメラ受容体システムであって、
ここで、前記キメラ受容体は、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、前記細胞内融合タンパク質は、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、
前記第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、前記第2のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である、キメラ受容体システム。
(項目16)
前記キメラ受容体が、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み、前記細胞内融合タンパク質が、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含む、項目15に記載のキメラ受容体システム。
(項目17)
前記キメラ受容体が、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み、前記細胞内融合タンパク質が、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含む、項目15に記載のキメラ受容体システム。
(項目18)
前記キメラ受容体が、CD3ゼータエンドドメインを含み、前記細胞内融合タンパク質が、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く、項目15または16に記載のキメラ受容体システム。
(項目19)
前記細胞内融合タンパク質が、ZAP70 SH2ドメインを含む、項目15~18のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
(項目20)
項目1~6のいずれかに記載のキメラ受容体および膜貫通タンパク質を含む、キメラ受容体システムであって、
ここで、前記キメラ受容体は、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、前記膜貫通タンパク質は、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、
ここで、前記第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、前記第2のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である、キメラ受容体システム。
(項目21)
前記キメラ受容体が、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み、前記膜貫通タンパク質が、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含む、項目20に記載のキメラ受容体システム。
(項目22)
前記キメラ受容体が、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み、前記膜貫通タンパク質が、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含む、項目20に記載のキメラ受容体システム。
(項目23)
前記キメラ受容体が、CD3ゼータエンドドメインを含み、前記膜貫通タンパク質が、細胞内シグナル伝達ドメインおよびリガンド結合エキソドメインを欠く、項目20または21に記載のキメラ受容体システム。
(項目24)
項目1~6のいずれかに記載のキメラ受容体または項目7~23のいずれかに記載のキメラ受容体システムを含む、細胞。
(項目25)
項目1~6のいずれかに記載のキメラ受容体をコードする、核酸配列。
(項目26)
項目7~23のいずれかに記載のキメラ受容体システムをコードする、核酸構築物。
(項目27)
第1のキメラ受容体をコードする第1の核酸配列および第2のキメラ受容体をコードする第2の核酸配列を含む、項目26に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-AbB2-スペーサー2-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、前記第1のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;スペーサー1は、前記第1のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、前記第1のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、前記第1のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、両キメラ受容体の共発現を可能にする核酸配列であり、
AgB2は、前記第2のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;スペーサー2は、前記第2のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM2は、前記第2のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、前記第2のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列である)
を有する、核酸構築物。
(項目28)
エンド1が、サイトカイン受容体エンドドメインの第1の鎖をコードする核酸配列および第1の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み;エンド2が、サイトカイン受容体エンドドメインの第2の鎖をコードする核酸配列および第2の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含む、項目27に記載の核酸構築物。
(項目29)
coexprが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、項目27または28に記載の核酸構築物。
(項目30)
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域において使用される、項目27~29のいずれかに記載の核酸構築物。(項目31)
キメラ受容体をコードする第1の核酸配列および細胞内融合タンパク質をコードする第2の核酸配列を含む、項目26に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-ドメイン2-エンド2
(ここで、
AgB1は、前記キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、前記キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、前記キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、前記キメラ受容体と前記細胞内融合タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり;
ドメイン2は、前記細胞内融合タンパク質に対する第2のドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、前記細胞内融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有する、核酸構築物。
(項目32)
ドメイン2が、ZAP70 SH2ドメインをコードする核酸配列である、項目31に記載の核酸構築物。
(項目33)
キメラ受容体をコードする第1の核酸配列および膜貫通タンパク質をコードする第2の核酸配列を含む、項目26に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、前記キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、前記キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、前記キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、前記キメラ受容体と前記膜貫通タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
TM2は、前記膜貫通ドメインの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
エンド2は、前記膜貫通タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有する、核酸構築物。
(項目34)
項目25に記載の核酸配列または項目26~33のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
(項目35)
項目34に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
(項目36)
i)項目1~6のいずれかにおいて定義されたような第1のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)項目1~6のいずれかにおいて定義されたような第2のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
(項目37)
i)項目1~6のいずれかにおいて定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)項目15~19のいずれかにおいて定義されたような細胞内融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
(項目38)
i)項目1~6のいずれかにおいて定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)項目20~23のいずれかにおいて定義されたような膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
(項目39)
項目24に記載の細胞を作製するための方法であって、前記方法は、項目25に記載の核酸配列;項目26~33のいずれかに記載の核酸構築物;項目34もしくは35に記載のベクター;または項目36~38のいずれかに記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む、方法。
(項目40)
前記細胞が、被験体から単離された試料由来である、項目39に記載の方法。
(項目41)
項目24に記載の複数の細胞を含む、薬学的組成物。
(項目42)
項目41に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および/または予防するための方法。
(項目43)
以下の工程:
(i)被験体からの細胞含有試料の単離;
(ii)項目25に記載の核酸配列;項目26~33のいずれかに記載の核酸構築物;項目34もしくは35に記載のベクター;または項目36~38のいずれかに記載のベクターのキットでの前記細胞の形質導入またはトランスフェクション;および
(iii)前記被験体に(ii)からの前記細胞を投与すること
を含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記試料が、T細胞含有試料である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記疾患が、がんである、項目42~44のいずれかに記載の方法。
(項目46)
疾患の処置および/または予防において使用するための、項目41に記載の薬学的組成物。
(項目47)
疾患を処置および/または予防するための医薬の製造における項目24に記載の細胞の使用。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
リガンド結合エキソドメイン;ならびに
(i)サイトカイン受容体エンドドメイン;および
(ii)細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン
を含むエンドドメイン
を含む、キメラ受容体。
(項目2)
前記リガンド結合エキソドメインが、重鎖可変ドメイン(VH)および/または軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、項目1に記載のキメラ受容体。
(項目3)
前記サイトカイン受容体エンドドメインが、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖を含むか、またはI型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖、β鎖もしくはγ鎖からなる、前述のいずれかの項目に記載のキメラ受容体。
(項目4)
前記サイトカイン受容体エンドドメインが、
(i)IL-2受容体β鎖エンドドメイン
(ii)IL-7受容体α鎖エンドドメイン;もしくは
(iii)共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含むか、または
(i)IL-2受容体β鎖エンドドメイン
(ii)IL-7受容体α鎖エンドドメイン;もしくは
(iii)共通γ鎖受容体エンドドメイン
からなる、項目3に記載のキメラ受容体。
(項目5)
前記細胞内T細胞シグナル伝達ドメインが、以下:CD3ゼータエンドドメイン、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメイン、4-1BBエンドドメイン、CD2エンドドメイン、CD27エンドドメイン、ICOSエンドドメイン、CD40エンドドメインのうちの1つまたはそれより多くを含む、前述のいずれかの項目に記載のキメラ受容体。
(項目6)
前記細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン(複数可)および前記サイトカイン受容体エンドドメインの配置は、前記受容体が、細胞の表面に発現されるとき、前記細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン(複数可)が、膜の遠位に位置し、前記サイトカイン受容体エンドドメインが、細胞内の細胞表面上の膜の近位に位置するような配置である、前述のいずれかの項目に記載のキメラ受容体。
(項目7)
項目1~6のいずれかに記載の第1および第2のキメラ受容体を含む、キメラ受容体システムであって、
ここで、前記第1のキメラ受容体は、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、前記第2のキメラ受容体は、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、
前記第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、前記第2のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である、キメラ受容体システム。
(項目8)
前記第1のキメラ受容体および前記第2のキメラ受容体が、同じ抗原の異なるエピトープに結合する、項目7に記載のキメラ受容体システム。
(項目9)
前記第1のキメラ受容体および前記第2のキメラ受容体が、同じ抗原の同じエピトープに結合する、項目7に記載のキメラ受容体システム。
(項目10)
前記第1のキメラ受容体のリガンド結合ドメインおよび前記第2のキメラ受容体のリガンド結合ドメインが、一体となってリガンド結合ができるように、それらが、相補的なリガンド結合ドメインを有する、項目7に記載のキメラ受容体システム。
(項目11)
前記第1および第2のサイトカインエンドドメインが会合して、細胞シグナル伝達をもたらす、項目7~10のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
(項目12)
前記第1のキメラ受容体および前記第2のキメラ受容体が、前記抗原に結合したとき、1型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖/β鎖およびγ鎖を介したサイトカインシグナル伝達が生じるように、前記第1のサイトカイン受容体エンドドメインが、1型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖であり、前記第2のサイトカイン受容体エンドドメインが、1型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖である、項目11に記載のキメラ受容体システム。
(項目13)
前記第1のキメラ受容体が、CD3ゼータエンドドメインを含み、前記第2のキメラ受容体が、CD28エンドドメイン、OX40エンドドメインおよび4-1BBエンドドメインから選択される1つまたはそれより多い共刺激ドメインを含む、項目7~12のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
(項目14)
前記第1のキメラ受容体と前記第2のキメラ受容体の両方が、CD3ゼータエンドドメインを含む、項目7~12のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
(項目15)
項目1~6のいずれかに記載のキメラ受容体および細胞内融合タンパク質を含む、キメラ受容体システムであって、
ここで、前記キメラ受容体は、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、前記細胞内融合タンパク質は、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、
前記第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、前記第2のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である、キメラ受容体システム。
(項目16)
前記キメラ受容体が、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み、前記細胞内融合タンパク質が、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含む、項目15に記載のキメラ受容体システム。
(項目17)
前記キメラ受容体が、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み、前記細胞内融合タンパク質が、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含む、項目15に記載のキメラ受容体システム。
(項目18)
前記キメラ受容体が、CD3ゼータエンドドメインを含み、前記細胞内融合タンパク質が、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く、項目15または16に記載のキメラ受容体システム。
(項目19)
前記細胞内融合タンパク質が、ZAP70 SH2ドメインを含む、項目15~18のいずれかに記載のキメラ受容体システム。
(項目20)
項目1~6のいずれかに記載のキメラ受容体および膜貫通タンパク質を含む、キメラ受容体システムであって、
ここで、前記キメラ受容体は、第1のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、前記膜貫通タンパク質は、第2のサイトカイン受容体エンドドメインを含み、
ここで、前記第1のサイトカイン受容体エンドドメインは、前記第2のサイトカイン受容体エンドドメインに相補的である、キメラ受容体システム。
(項目21)
前記キメラ受容体が、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含み、前記膜貫通タンパク質が、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含む、項目20に記載のキメラ受容体システム。
(項目22)
前記キメラ受容体が、I型サイトカイン受容体エンドドメインγ鎖を含み、前記膜貫通タンパク質が、I型サイトカイン受容体エンドドメインα鎖またはβ鎖を含む、項目20に記載のキメラ受容体システム。
(項目23)
前記キメラ受容体が、CD3ゼータエンドドメインを含み、前記膜貫通タンパク質が、細胞内シグナル伝達ドメインおよびリガンド結合エキソドメインを欠く、項目20または21に記載のキメラ受容体システム。
(項目24)
項目1~6のいずれかに記載のキメラ受容体または項目7~23のいずれかに記載のキメラ受容体システムを含む、細胞。
(項目25)
項目1~6のいずれかに記載のキメラ受容体をコードする、核酸配列。
(項目26)
項目7~23のいずれかに記載のキメラ受容体システムをコードする、核酸構築物。
(項目27)
第1のキメラ受容体をコードする第1の核酸配列および第2のキメラ受容体をコードする第2の核酸配列を含む、項目26に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-AbB2-スペーサー2-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、前記第1のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;スペーサー1は、前記第1のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、前記第1のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、前記第1のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、両キメラ受容体の共発現を可能にする核酸配列であり、
AgB2は、前記第2のキメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;スペーサー2は、前記第2のキメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM2は、前記第2のキメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、前記第2のキメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列である)
を有する、核酸構築物。
(項目28)
エンド1が、サイトカイン受容体エンドドメインの第1の鎖をコードする核酸配列および第1の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み;エンド2が、サイトカイン受容体エンドドメインの第2の鎖をコードする核酸配列および第2の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含む、項目27に記載の核酸構築物。
(項目29)
coexprが、自己切断性ペプチドを含む配列をコードする、項目27または28に記載の核酸構築物。
(項目30)
相同組換えを回避するために、代替的コドンが、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域において使用される、項目27~29のいずれかに記載の核酸構築物。(項目31)
キメラ受容体をコードする第1の核酸配列および細胞内融合タンパク質をコードする第2の核酸配列を含む、項目26に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-ドメイン2-エンド2
(ここで、
AgB1は、前記キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、前記キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、前記キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、前記キメラ受容体と前記細胞内融合タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり;
ドメイン2は、前記細胞内融合タンパク質に対する第2のドメインをコードする核酸配列であり;
エンド2は、前記細胞内融合タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有する、核酸構築物。
(項目32)
ドメイン2が、ZAP70 SH2ドメインをコードする核酸配列である、項目31に記載の核酸構築物。
(項目33)
キメラ受容体をコードする第1の核酸配列および膜貫通タンパク質をコードする第2の核酸配列を含む、項目26に記載の核酸構築物であって、前記核酸構築物は、以下の構造:
AgB1-スペーサー1-TM1-エンド1-coexpr-TM2-エンド2
(ここで、
AgB1は、前記キメラ受容体の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり;
スペーサー1は、前記キメラ受容体のスペーサーをコードする核酸配列であり;
TM1は、前記キメラ受容体の膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり;
エンド1は、前記キメラ受容体のエンドドメインをコードする核酸配列であり;
coexprは、前記キメラ受容体と前記膜貫通タンパク質の両方の共発現を可能にする核酸配列であり、
TM2は、前記膜貫通ドメインの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
エンド2は、前記膜貫通タンパク質のサイトカイン受容体エンドドメインをコードする核酸配列である)
を有する、核酸構築物。
(項目34)
項目25に記載の核酸配列または項目26~33のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
(項目35)
項目34に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
(項目36)
i)項目1~6のいずれかにおいて定義されたような第1のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)項目1~6のいずれかにおいて定義されたような第2のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
(項目37)
i)項目1~6のいずれかにおいて定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)項目15~19のいずれかにおいて定義されたような細胞内融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
(項目38)
i)項目1~6のいずれかにおいて定義されたようなキメラ受容体をコードする核酸配列を含むベクター;および
ii)項目20~23のいずれかにおいて定義されたような膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含む、キット。
(項目39)
項目24に記載の細胞を作製するための方法であって、前記方法は、項目25に記載の核酸配列;項目26~33のいずれかに記載の核酸構築物;項目34もしくは35に記載のベクター;または項目36~38のいずれかに記載のベクターのキットを細胞に導入する工程を含む、方法。
(項目40)
前記細胞が、被験体から単離された試料由来である、項目39に記載の方法。
(項目41)
項目24に記載の複数の細胞を含む、薬学的組成物。
(項目42)
項目41に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程を含む、疾患を処置および/または予防するための方法。
(項目43)
以下の工程:
(i)被験体からの細胞含有試料の単離;
(ii)項目25に記載の核酸配列;項目26~33のいずれかに記載の核酸構築物;項目34もしくは35に記載のベクター;または項目36~38のいずれかに記載のベクターのキットでの前記細胞の形質導入またはトランスフェクション;および
(iii)前記被験体に(ii)からの前記細胞を投与すること
を含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記試料が、T細胞含有試料である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記疾患が、がんである、項目42~44のいずれかに記載の方法。
(項目46)
疾患の処置および/または予防において使用するための、項目41に記載の薬学的組成物。
(項目47)
疾患を処置および/または予防するための医薬の製造における項目24に記載の細胞の使用。
本発明は、実施例によってさらに説明され、この実施例は、本発明を実施する際に当業者を助けるように機能すると意味されており、本発明の範囲を決して限定しないと意図されている。
実施例1-インビトロ試験
T細胞に、標準的なCARまたはサイトカインシグナルを伝達するCARをコードするレトロウイルスベクターを形質導入する。形質導入されていないおよび形質導入されたT細胞を、CR同族標的を発現している標的細胞でチャレンジする。標的抗原に応答したサイトカイン経路の活性化は、細胞内抗体染色およびフローサイトメトリーを利用して、PI3キナーゼ、MAPキナーゼおよびJAK-STAT経路における公知のメディエーターのリン酸化のレベルを計測することによって、直接検出され得る。サイトカインシグナル伝達は、T細胞の増殖、アポトーシスおよび表現型をフローサイトメトリーによって計測することによって、間接的に測定され得る。
実施例2-標的抗原の異なるエピトープに対する抗原結合ドメインを有する「第4世代」CARシステムの作製
T細胞に、標準的なCARまたはサイトカインシグナルを伝達するCARをコードするレトロウイルスベクターを形質導入する。形質導入されていないおよび形質導入されたT細胞を、CR同族標的を発現している標的細胞でチャレンジする。標的抗原に応答したサイトカイン経路の活性化は、細胞内抗体染色およびフローサイトメトリーを利用して、PI3キナーゼ、MAPキナーゼおよびJAK-STAT経路における公知のメディエーターのリン酸化のレベルを計測することによって、直接検出され得る。サイトカインシグナル伝達は、T細胞の増殖、アポトーシスおよび表現型をフローサイトメトリーによって計測することによって、間接的に測定され得る。
実施例2-標的抗原の異なるエピトープに対する抗原結合ドメインを有する「第4世代」CARシステムの作製
抗原ROR1の異なるエピトープに結合するscFvを有する第4世代CARシステムを設計した(図6)。第1のキメラ受容体は、R11 scFvを含む抗原結合ドメイン、ヒトFcスペーサー、IL2受容体βエンドドメインおよびCD3ゼータエンドドメインを有し;第2のキメラ受容体は、R12 scFvを含む抗原結合ドメイン、CD8ストークスペーサー、IL2受容体γエンドドメインおよびCD3ゼータエンドドメインを有した。2つのコントロール受容体システムも設計した:1つは、サイトカイン受容体エンドドメインを欠き(図6);もう1つは、CD3ゼータドメインを欠いた(図9)が、それらは、その他の点では上に記載されたシステムと同一であった。
実施例3-第4世代CARシステムは、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なCARシステムよりも高い増殖/生存を示す
実施例3-第4世代CARシステムは、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なCARシステムよりも高い増殖/生存を示す
サイトカインエンドドメインを含むキメラ受容体システムの存在が増殖/生存シグナルを提供するかを調べるために、成長のためにIL2を必要とするCTLL2マウス細胞傷害性T細胞株(ATCC(登録商標)TIB-214TM)を使用した。CTLL細胞に、図6に示されている2つのキメラ受容体システムの一方または他方を発現するベクターを形質導入した。ROR1でコーティングされたビーズまたはコーティングされていないビーズとともに培養した3および6日後に、細胞増殖を評価した。
結果を図7および8に示す。図7に示されているように、サイトカイン受容体およびCD3ゼータエンドドメインを含む第4世代CARは、リガンドとともに共培養されたとき、3日目と6日目の両方において、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムよりも、形質導入された細胞においてより高い倍率の濃縮を示した。図8に示されているように、リガンドの存在は、第4世代CARを発現する細胞に対して、3日目と6日目の両方において細胞生存/増殖を大幅に高めたのに対して、リガンドの存在は、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムを発現する細胞の増殖/生存に対してほとんど影響を及ぼさなかった。
実施例4-第4世代CARシステムは、CD3ゼータエンドドメインを欠く等価なCARシステムよりも高い標的細胞の死滅およびIFNgの放出を示す
実施例4-第4世代CARシステムは、CD3ゼータエンドドメインを欠く等価なCARシステムよりも高い標的細胞の死滅およびIFNgの放出を示す
次に、サイトカイン受容体エンドドメインおよびCD3ゼータエンドドメインを含む第4世代CARが標的細胞を殺すことができるかを調べた。健常なドナーのPBMCに、図9に示されている2つのキメラ受容体システムの一方または他方を発現するベクターを形質導入した。形質導入された細胞を、SupT1細胞またはROR1を発現するSupT1標的細胞と10:1のE:T比で48時間共培養した。次いで、標的細胞の死滅をFACSによって解析し、ELISAを用いて、IFNγの分泌をアッセイした。
図10に示されているように、サイトカイン受容体エンドドメインおよびCD3ゼータエンドドメインを含む第4世代CARは、ROR1を発現する標的細胞を殺すことができ、CD3ゼータエンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムよりもいっそう効率的に殺した。
CD3ゼータエンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムを発現するPBMCとは異なり、第4世代CARを発現するPBMCを、ROR1を発現する標的細胞と共培養することにより、有意なレベルのIFNγ放出がもたらされる(図11)。
実施例5-標的抗原の同じエピトープに対する抗原結合ドメインを有する第4世代CARシステムの作製
実施例5-標的抗原の同じエピトープに対する抗原結合ドメインを有する第4世代CARシステムの作製
抗原ROR1の同じエピトープに結合するscFvを有する第4世代CARシステムを設計した(図12)。第1のキメラ受容体は、R12 scFvを含む抗原結合ドメイン、ヒトFcスペーサー、IL2受容体βエンドドメインおよびCD3ゼータエンドドメインを有し;第2のキメラ受容体は、R12 scFvを含む抗原結合ドメイン、CD8ストークスペーサー、IL2受容体γエンドドメインおよびCD3ゼータエンドドメインを有した。相同組換えを回避するために、第1のキメラ受容体のR12ScFvのDNA配列をゆらぎにした。サイトカイン受容体エンドドメインを欠くがその他の点では同一であるコントロール受容体システムも設計した(これも図12に示されている)。
実施例6-標的抗原の同じエピトープに対する抗原結合ドメインを有する第4世代CARシステムは、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なCARシステムよりも高い増殖/生存を示す
実施例5において開発された構築物に対して実施例3に記載されたものと等価な生存/増殖アッセイを行い、その結果を図13および14に示す。図13に示されているように、サイトカイン受容体およびCD3ゼータエンドドメインを含む第4世代CARは、リガンドとともに3日間共培養されたとき、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムよりも、形質導入された細胞においてより高い倍率の濃縮を示した。図8に示されているように、リガンドの存在は、第4世代CARを発現する細胞に対して、培養の3日後に細胞生存/増殖を大幅に高めたのに対して、リガンドの存在は、サイトカイン受容体エンドドメインを欠く等価なキメラ受容体システムを発現する細胞の増殖/生存に対してほとんど影響を及ぼさなかった。
ゆえに、標的抗原の同じエピトープに結合する2つの抗原結合ドメインを使用する本発明のキメラ受容体システムを用いて、抗原を標的化することが可能である。これは、キメラ受容体システムの設計を潜在的に単純化し、各標的抗原に対して相互排他的なエピトープを見つける必要を無くす。
上記の明細書で挙げた出版物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
Claims (1)
- 図面に記載の発明。
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