ES2926805T3

ES2926805T3 - Linfocitos T reguladores redirigidos y modificados por ingeniería genética y su uso en la supresión de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias

Info

Publication number: ES2926805T3
Application number: ES16177278T
Authority: ES
Inventors: Zelig Eshhar; Eran Elinav
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2007-01-31
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2028-01-31
Also published as: US20200056152A1; IL200104A0; CY1118124T1; US11326147B2; WO2008095141A3; EP3097923A1; SI2126054T1; US20100135974A1; LT2126054T; EP2126054A2; HUE030386T2; PT2126054T; EP2126054B1; HRP20161191T1; WO2008095141A2; PL2126054T3; EP3097923B1; ES2595307T3; DK2126054T3

Abstract

Una célula Treg redirigida está dotada de especificidad hacia un antígeno o ligando diana seleccionado. La célula contiene un polipéptido receptor quimérico que se expresa en una sola cadena continua, con una región de reconocimiento extracelular que se muestra en la superficie de la célula, una región transmembrana y una región de señalización intracelular. La región de reconocimiento extracelular es específica para el antígeno o ligando diana seleccionado. La región de señalización intracelular incluye una combinación de fracciones polipeptídicas de señalización de células T, cuya combinación, tras la unión de la región de reconocimiento extracelular al antígeno o ligando diana seleccionado, desencadena la activación de las células Treg redirigidas para provocar la supresión de la inmunidad mediada por células T. Tales células Treg redirigidas pueden usarse para suprimir la actividad no deseada de las células T efectoras, mediando así una respuesta inmunitaria o inflamatoria. Son particularmente útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por células T efectoras, tales como enfermedad inflamatoria intestinal, rechazo de trasplantes y enfermedad de GVH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Linfocitos T reguladores redirigidos y modificados por ingeniería genética y su uso en la supresión de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias

Campo de la invención

La invención, perteneciente al campo de la inmunología y la medicina, se refiere a la modificación genética de los linfocitos T reguladores con receptores quiméricos con especificidad de tipo anticuerpo, en particular a una composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso en un método de tratamiento de enfermedades y afecciones inmunitarias o inflamatorias mediadas por linfocitos T efectores, principalmente enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, como las enteropatías inflamatorias (EI), enfermedades autoinmunitarias en órganos específicos, rechazo de aloinjertos y enfermedad de injerto contra hospedador.

Descripción de la técnica anterior

Linfocitos T reguladores (Treg)

Una línea de investigación que condujo al descubrimiento de las células Treg fue la observación de que la timectomía de ratones de ciertas cepas susceptibles en el día postnatal 3 da lugar a un espectro de efectos autoinmunes específicos de los órganos, que eran evitables mediante la "reconstitución" de estos animales a principios de su vida con linfocitos adultos normales (Asano M et al., JExp Med 1996; 184:387-96). Los efectores y supresores de la autoinmunidad en este modelo de autoinmunidad multiorgánica fueron los linfocitos T CD4+. Posteriormente se demostró que las Treg CD4+ reguladoras que previenen la enfermedad coexpresaban CD25. Las Treg CD4+CD25+ representan el 5-10% del total de células ^cD4+ periféricas en ratones y el 3-6% del total de linfocitos T CD4+ de sangre periférica en humanos (Jonuleit H et al, J Exp Med 2001; 193:1285-94).

A lo largo de la última década, se ha estudiado la función de las Treg CD4+CD25+ en las enfermedades autoinmunitarias. Las Treg CD4+CD25+ suprimieron la enfermedad inducida por linfocitos T efectores clonados con especificidad autoantigénica (Suri-Payer, E et al., J. Immunol., 1998; 160:1212-18). Las células Treg CD4+CD25+ parecen ser miembros de un linaje único de linfocitos T reguladores. Estos autores señalaron que, aunque el antígeno o antígenos diana y el mecanismo de acción de los linfocitos T CD4+CD25+ estaban aún por determinar, es probable que desempeñen un papel importante en la modulación de otras enfermedades autoinmunitarias que están mediadas por la activación de linfocitos T autorreactivos. Las Treg previenen enfermedades autoinmunitarias de órganos específicos, incluida la tiroiditis autoinmunitaria, la gastritis autoinmunitaria, la insulitis y la artritis.

Más recientemente, se descubrió que las Treg expresan intracelularmente un factor de transcripción conocido como Foxp3. Se sabía que la ausencia del factor de transcripción llamado Scurfin (también caja de forkhead P3) y codificado por el gen Foxp3 causaba una enfermedad linfoproliferativa rápidamente mortal, similar a la observada en los ratones que carecen del antígeno 4 asociado a los linfocitos T citolíticos (CTLA-4). Khattri R et al. (Nat Immunol.

2003; 4:337-42) demostró que Foxp3 se expresaba en gran medida en las células Treg y se asociaba a su actividad y fenotipo. Los ratones con deficiencia de Foxp3 carecen de células Treg, mientras que los ratones que sobreexpresan Foxp3 poseen más células Treg. Las Treg expresan de forma constitutiva el factor de transcripción Foxp3 y la molécula coestimuladora inhibidora CTLA-4 (Chen W et al., JExp Med 1998; 188:1849-57).

Se cree que Foxp3 actúa a través de la regulación transcripcional negativa de los genes de las citocinas, entre las que se incluyen IL2, IL4 e IFN-^y(Kasprowicz DJ et al., J Immunol. 2003; 171:1216-23, 2003), aunque muchos aspectos de la actividad de Foxp3 y la regulación de su expresión siguen siendo desconocidos.

Loser K et al., Gene Ther 2005; 12:1294-304, generó Treg in vitro infectando linfocitos T CD4+CD25- vírgenes con un retrovirus que codifica Foxp3. Los linfocitos T infectados con Foxp3 eran similares a las células Treg naturales, según se desprende de la expresión de los marcadores de superficie y la función. Estos autores investigaron los efectos de los linfocitos T infectados con Foxp3 en las respuestas de hipersensibilidad de contacto mediadas por los linfocitos T efectores, inyectando en ratones sensibilizados linfocitos T infectados con Foxp3 o con el virus de control. Solo la inyección de linfocitos T infectados con Foxp3 inhibió significativamente el CHS en comparación con los controles, indicando que los linfocitos T infectados con Foxp3 son supresores in vivo. A continuación, los autores utilizaron linfocitos T infectados con Foxp3 para tratar a ratones transgénicos (Tg) CD40L propensos a la autoinmunidad, que desarrollan una enfermedad autoinmunitaria sistémica grave que incluye linfocitos T autorreactivos y autoanticuerpos. La inyección de linfocitos T infectados con Foxp3 en estos ratones inhibió el desarrollo continuo de la dermatitis autoinmunitaria y la activación de los linfocitos T CD8+ citotóxicos. Este tratamiento también redujo las concentraciones séricas de anticuerpos antinucleares, que fue paralela a la reducción de los depósitos de inmunoglobulina renal y al aumento de la función renal. Los autores concluyeron que los nuevos linfocitos T reguladores generados in vitro pueden utilizarse para tratar con éxito los trastornos inflamatorios y autoinmunitarios en curso.

Smith et al. (2006) Immunology 119(2), páginas 203-211, describe variantes de empalme de FOXP3 humano como inhibidores funcionales de la activación de linfocitos T CD4(+) humanos.

Nguyen et al. (2006) Gene Therapy 10(7), páginas 594-604, hacen referencia al direccionamiento con especificidad antigénica de los linfocitos T CD8+ con linfocitos T con receptores modificados.

Suri-Payer E y Fritzsching B (Springer Semin Immunopathol. 2006; 28:3-16) resumieron recientemente las pruebas de la función de las Treg en la supresión de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas en modelos experimentales de autoinmunidad, entre los que se incluyen artritis, colitis, diabetes, encefalomielitis autoinmunitaria, lupus, gastritis, ooforitis, prostatitis y tiroiditis. Una observación común de estos estudios es que las Treg se activan de una manera específica de antígeno, pero ejercen su función supresora de forma independiente del antígeno, principalmente mediante la producción y secreción de citocinas supresoras, tales como IL-10 y TGF-p. Las Treg pueden suprimir los linfocitos T "convencionales" in vitro por contacto celular directo. Sin embargo, se aprecia que la regulación a la baja de la función de las células presentadoras de antígenos (APC), tal como la de las células dendríticas, y la atenuación de la secreción de citocinas inhibidoras, tales como IL-10 y TGF-p podrían ser importantes para la función de las Treg in vivo. El resultado final de la autoinmunidad frente a la tolerancia depende del equilibrio entre las señales estimuladoras de los linfocitos T efectores y las señales inhibidoras de las Treg. Mientras que estudios anteriores analizaron la capacidad de las Treg para prevenir la aparición de enfermedades autoinmunitarias, los informes más recientes indican un tratamiento exitoso de la enfermedad en curso.

Friedman-Morvinski et al. (2006) Update on Cancer Therapeutics 1(1), páginas 25 a 32, investigan la inmunoterapia adoptiva del cáncer utilizando linfocitos efectores redirigidos con especificidad de anticuerpos. Abken et al. (2003) Current Pharmaceutical Design 9(24), páginas 1992-2001, discuten que los inmunorreceptores recombinantes dotan a los linfocitos T de una especificidad predefinida.

En "ESGCT 2007 Invited presentations" (2007) Human Gene Therapy 18(10), páginas 941-954, en particular en Inv.

27 en la página 951, se indica que la colitis aguda podría curarse con linfocitos T reguladores redirigidos con receptores quiméricos.

M. Divya Jyothi et al. (2002) Nature Biotechnology 20(12), páginas 1215-1220 describen el direccionamiento de los linfocitos T con especificidad autoantigénica y la supresión de la encefalomielitis autoinmunitaria con linfocitos T con receptores modificados.

El documento US 2003/147865 A1 se refiere a métodos y composiciones para tratar diversas enfermedades utilizando poblaciones o composiciones de linfocitos T inmunorreguladores.

In vivo, la transferencia adoptiva de Treg logró los siguientes efectos:

(1) supresión del desarrollo de la autoinmunidad;

(2) supresión del rechazo agudo de las vísceras macizas trasplantadas; y

(3) supresión de la inmunidad antitumoral,

Una revisión de Sakaguchi S et al., Immunol Rev. 2006;212: 8-27, indicó a que las células Treg CD25+ CD4+ que surgen de forma natural desempeñan un papel clave en el mantenimiento de la autotolerancia inmunológica y el control negativo de una serie de respuestas inmunitarias fisiológicas y patológicas. La mayoría de estas células son producidas por el timo normal como una subpoblación de linfocitos T funcionalmente maduros. Las Treg naturales expresan específicamente Foxp3, un factor de transcripción que desempeña un papel fundamental en su desarrollo y función. La citorreducción completa de las Treg naturales que expresan Foxp3 (ya sean CD25+ o CD25-) activó incluso clones de linfocitos T efectores débiles o raros y poco reactivos, lo que induce enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias graves y generalizadas. Las Treg naturales dependen en gran medida de la interleucina (IL)-2 suministrada exógenamente para su supervivencia en la periferia. Además de Foxp3 e IL-2/receptor de IL-2, una deficiencia o una alteración funcional de otras moléculas (expresadas por los linfocitos T o no T), puede afectar al desarrollo o la función de las Treg, los linfocitos T efectores autorreactivos o ambos e inclinar así la balanza entre las dos poblaciones en la periferia hacia la autoinmunidad. Por tanto, las Treg suprimen la actividad de los linfocitos T efectores, que son una de las principales causas de los trastornos inflamatorios autoinmunitarios con especificidad antigénica. Las Treg inducen anergia y promueven la supresión mediante un proceso que implica tanto el contacto célula-célula como, probablemente y de manera más importante, por su secreción de TGF-p e IL-10.

Sakaguchi et al., citado anteriormente, afirmaron que el esclarecimiento de las bases moleculares y celulares del mantenimiento activo de la autotolerancia mediado por las Treg facilitará (1) nuestra comprensión de la patogénesis de las enfermedades autoinmunitarias y (2) el desarrollo de nuevos métodos de prevención y tratamiento de las mismas.

La presente invención se dirige a uno de dichas estrategias novedosas para proporcionar una composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso en un método para tratar enfermedades autoinmunitarias y afecciones inmunitarias/inflamatorias relacionadas, imponiendo un control mediado por las Treg sobre los linfocitos T efectores.

Adición por ingeniería genética de receptores quiméricos con especificidad de anticuerpo en linfocitos T

Los esfuerzos por conferir a los linfocitos T una especificidad similar a la de los anticuerpos surgieron como respuesta a ciertos descubrimientos básicos y a la incapacidad de convertirlos en éxitos terapéuticos. Se ha demostrado que los antígenos asociados a los tumores humanos existen como péptidos asociados a las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). La falta de éxito en la vacunación de pacientes con tumores con una gran variedad de vacunas de antígenos asociados a tumores fue, por tanto, frustrante (Rosenberg SA et al., Nat Med 2004; 10:909-15). La vacunación pasiva con anticuerpos antitumorales (Ac), linfocitos infiltrantes en tumores (TIL) o linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) mostraron una eficacia muy limitada (principalmente para los tumores vasculares). Los éxitos más recientes con la transferencia adoptiva de TIL en pacientes con melanoma en estadio IV ((Dudley ME, et al., J Immunother 2001;24:363-73; Dudley ME, et al., Science 2002; 298:850-4) seguían lastrados por el hecho de que los resultados se limitaban a unos pocos cánceres y a individuos de los que es posible obtener TIL específicos.

Para superar estas limitaciones en la inmunoterapia celular adoptiva del cáncer, y con el fin de desarrollar una estrategia que no estuviera restringida a pacientes individuales o limitada a una forma específica de cáncer, uno de los actuales inventores y sus colaboradores desarrollaron la estrategia "T-cuerpo" (Gross G et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86:10024-8; Gross G y Eshhar, Z, FASEB J 1992; 6:3370-8), Véanse también las siguientes publicaciones de patentes presentadas por Eshhar y sus colaboradores: Publicación de patente de los Estados Unidos 2002-0137697, Patente de los Estados Unidos 5.912.172, Patente de los Estados Unidos 5.906.936, Publicaciones internacionales de patente WO00/31239, WO97/15669, WO95/14710 y WO93/19163. En estas estrategias, se preparó un receptor quimérico (CR), por ejemplo, fusionando la porción variable de un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal (AcM) antitumoral, a un dominio de activación intracelular de los linfocitos, para ser expresado por el linfocito T en el que se ha transfectado el gen como dominio extracelular de esa molécula activadora de linfocitos T. Tras la expresión de dichos genes de CR en las células efectoras inmunitarias (linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales (NK)), las células modificadas resultantes (apodadas "T-cuerpos") reconocieron sus dianas tumorales y los eliminaron con eficacia. Por tanto, el receptor inmunitario quimérico confiere una especificidad antigénica redirigida acoplada a la activación celular directa e independiente del CMH en respuesta a la unión del antígeno diana predefinido.

Originalmente, la configuración heterodimérica del CR comprendía las dos cadenas a y p del receptor de linfocitos T (TCR) en las que cada par de dominios variables del TCR (Va y Vp) se sustituía por un par de dominios Vh y Vl procedentes de un anticuerpo seleccionado. Estas dos secuencias codificantes procedentes de Ac se cotransfectaron en líneas de linfocitos T y se descubrió que conferían especificidad de anticuerpo (Gross et al., 1989, citado anteriormente). Por tanto, Los linfocitos T podrían activarse para realizar funciones efectoras, como la eliminación de células o la actividad citotóxica contra una diana inmunológicamente específica, de forma independiente del CMH (y, por tanto, no restringida) (Gross et al., 1992, citado anteriormente).

En los CR de "segunda generación", se manipuló adicionalmente la configuración monocatenaria del CR para obtener una configuración que particularmente útil para el tratamiento del cáncer o como antivírico. En este caso, se ligó un Fv monocatenario (scFv) de un anticuerpo a los dominios transmembranarios y citoplasmáticos de restos activadores de linfocitos, tales como la cadena asociada al complejo de TCR/CD3 o la cadena y del receptor de Fc (Eshhar Z et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90:720-4). Esta configuración monocatenaria, que combinaba el reconocimiento de anticuerpos y la señalización de linfocitos T en una única proteína continua, era una estructura modular con dominios funcionales fáciles de manipular y que podía expresarse fácilmente en linfocitos humanos mediante vectores basados en retrovirus (Eshhar Z et al.,. J Imm Meth 2001; 248:67-76). Otros receptores de este tipo diseñados por algunos de los presentes inventores y colaboradores, y que se comentan con más detalle a continuación, se denominan receptores quiméricos tripartitos (TpCR) que también incluyen uno o varios dominios coestimuladores (por ejemplo, CD28, 4-1BB).

Con el tiempo, ha surgido que la reorientación de la especificidad de los linfocitos T efectores mediante el uso de CR monocatenario se ha convertido en una opción terapéutica válida para el cáncer. Muchos investigadores han adaptado esta estrategia de "T-cuerpo" para dotar a los linfocitos T de diversas especificidades y funciones (Gross y Eshhar, citado anteriormente; Willemsen RA et al., Hum Immunol 2003; 64:56-68; Baxevanis CN et al., Cancer Immunol Immunother 2004;53:893-903). Para una revisión reciente, véanse: Eshhar, Z. "The T-Body Approach: Redirecting T Cells with Antibody Specificity", en Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology 181, Chernajovsky y Nissim (eds.), Springer-Verlag, 2008, págs. 329-342.

Dinorah Friedmann-Morvinski et al. (2005) Blood 105(8), páginas 3087-3093, informan de que los linfocitos T primarios redirigidos que albergan un receptor quimérico requieren una coestimulación para la activación con especificidad antigénica.

En la presente invención, los inventores han concebido usos ampliados de dichos CR en una composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso en un método para el tratamiento de afecciones inmunitarias/inflamatorias no deseadas, como las enfermedades autoinmunitarias (con un énfasis inicial particular en la enteropatía inflamatoria, EI) y el rechazo de injertos.

Enfermedad inflamatoria crónica y modelos animales

Las afecciones inflamatorias, especialmente las enfermedades inflamatorias crónicas, son de especial importancia en la medicina clínica. Estas enfermedades, causadas por acciones del sistema inmunitario, implican una activación inapropiada o excesiva de ciertos linfocitos T, expresión de citocinas y quimiocinas reguladoras, pérdida de tolerancia inmunológica y similares. Algunos ejemplos de enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias crónicas son la esclerosis múltiple, enteropatías inflamatorias (EI), artropatías, tales como la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico. Algunas de estas enfermedades son más bien específicas de un órgano o un tejido, como las siguientes: intestino (enfermedad de Crohn), piel (psoriasis), nervios mielinizados (esclerosis múltiple o EM), islotes pancreáticos o células p (diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) o diabetes de tipo I), glándulas salivales (enfermedad de Sjogren), músculo esquelético (miastenia grave), tiroides (tiroiditis de Hashimoto; enfermedad de Graves), la cámara anterior del ojo (uveítis), tejido articular (artritis reumatoide), y diversas enfermedades cardiovasculares.

Enteropatía inflamatoria (EI) es un término colectivo que se utiliza para describir dos trastornos intestinales cuya etiología no se conoce por completo: enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. La EI está presente en todo el mundo y afecta a varios millones de personas (el 0,3 % de los habitantes de los países occidentales), y su incidencia va en aumento (Tsironi E, et al., Am J Gastroenterol. 2004; 99:1749-55). La evolución y el pronóstico de la EI son muy variables. El inicio de la EI predomina al comienzo de la edad adulta y se presenta normalmente con diarrea, dolor abdominal y fiebre; la anemia y la pérdida de peso son también signos comunes. Entre el 10 % y el 15 % de las personas con EI requieren una intervención quirúrgica en un periodo de diez años. Los pacientes con EI también tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer intestinal. Estas enfermedades van acompañadas de una alta frecuencia de síntomas psicológicos, entre los que se incluyen ansiedad y depresión.

Aunque la patogénesis de este trastorno común mediado por linfocitos T sigue siendo incierta, se cree que es el resultado de la pérdida de tolerancia en el sistema inmunitario intestinal debido a la presencia de una estimulación antigénica constante proporcionada por el gran número de bacterias residentes (Podolsky DK, N Engl J Med 2002; 347:417-29). Desafortunadamente, las nuevas terapias para la EI son escasas, y tanto el diagnóstico como el tratamiento se han visto obstaculizados por la falta de un conocimiento detallado de la etiología. Una combinación de factores genéticos, desencadenantes exógenos y la microflora endógena pueden contribuir al daño inmunológico de la mucosa intestinal. Se ha implicado a las bacterias en el inicio y la progresión de la enfermedad de Crohn, ya que la inflamación intestinal suele responder a los antibióticos. Se han implicado colonizadores intestinales comunes y nuevos patógenos, ya sea por detección directa o por respuestas inmunitarias antimicrobianas asociadas a la enfermedad. En muchos modelos animales de colitis crónica genéticamente susceptibles, los microorganismos luminales parecen ser un cofactor necesario para la enfermedad.

La etapa iniciadora en la patología de las enfermedades autoinmunitarias suele pasar desapercibida en seres humanos, donde las enfermedades son en gran medida esporádicas, y los síntomas pueden aparecer años después de que se active el primer linfocito T patógeno. Por lo tanto, ha sido difícil diseñar tratamientos eficaces para bloquear la inducción de la enfermedad. En cambio, hay características comunes en muchas de las últimas etapas de estas enfermedades. Suele haber inflamación en el lugar de la enfermedad/órgano diana, causada por la liberación de citocinas inflamatorias, también denominadas "proinflamatorias" (por ejemplo, TNF-a e interferones) por parte de los linfocitos T y de otras células que contribuyen a los pasos de activación y a las vías efectoras de los procesos inmunitarios/inflamatorios. Estas células incluyen (entre otras) macrófagos, células dendríticas y sus precursores, linfocitos B y células plasmáticas y células NK (incluidas las células NKT). Estas reacciones suelen implicar la destrucción de las células "diana" y el daño de los tejidos.

Los estudios que utilizan modelos murinos de inflamación crónica experimental están ayudando a definir la naturaleza de la desregulación inmunológica que inicia la inflamación y conduce a la destrucción de órganos finales específicos, así como para probar terapias. Véanse, por ejemplo, Mombaerts et al. Cell, 1993; 75:274-82; Tarrant et al., 2998; J Immunol, 161:122-7; Powrie et al., Immunity, 1994; 1:553-62; Hong et al., J Immunol, 1999; 162:7480-91; Horak, Clin Immunol Immunopathol, 1995, 76(3 Pt 2):S172-173; Ehrhardt et al. J Immunol, 1997; 158:566-73; Davidson et al., J Immunol, 1998; 161:3143-9; Kuhn et al. Cell, 1993. 75:263-74; Neurath et al., J Exp Med, 1995.

182:1281-90. W. Strober, 2002; Annu. Rev. Immunol. 20:495-54 revisa los modelos de inflamación de las mucosas. Uno de los rasgos distintivos de los mejores modelos es que la histopatología y la fisiopatología se asemejan a las afecciones humanas paralelas, lo que aumenta la utilidad de los modelos para probar nuevas estrategias de tratamiento. En el caso de la EI esta evolución no ha sido uniforme. Se ha hecho hincapié en la modulación de los mecanismos inmunitarios (Blumberg RS et al, Curr Opin Immunol. 1999; 11:648-56; Strober et al., citado anteriormente) y recientemente de la flora entérica (Sartor RB, Curr Opin Gastroenterol. 2001; 4:324-330). Bhan AK et al., 1999 Immunol Rev 169:195-207 revisó los estudios de colitis en modelos animales transgénicos (Tg) y con supresión génica (KO) para la inflamación de la mucosa en la EI. La genética y el medio ambiente, especialmente la flora entérica normal, fueron factores en el desarrollo de la inflamación de la mucosa, como se ha indicado anteriormente. La homeostasia normal de la mucosa se vio alterada por el desequilibrio de citocinas, la supresión de la tolerancia oral, la ruptura de las barreras epiteliales y la pérdida de células inmunorreguladoras. Algunas inmunodeficiencias, pero no todas, en el entorno adecuado, provocaron colitis. Se ha identificado a los linfocitos T CD4+ efectores como los linfocitos patógenos en la colitis y pueden mediar la inflamación por la vía de Th1 o la de Th2. La vía de Th1 domina en la mayoría de los modelos de colitis (y en la enfermedad de Crohn humana). En cambio, en la colitis observada en los ratones, los ratones con supresión génica de la cadena a del receptor de linfocitos T (ratones TCRa KO) compartían muchas características de la colitis ulcerosa, incluido el predominio de la vía Th2 en la inflamación del colon. Estos modelos son importantes para el desarrollo de estrategias terapéuticas para tratar la EI. En una revisión posterior, el mismo grupo (Mizoguchi A et al., 2003, Inflamm Bowel Dis. 9:246-259) señaló que las respuestas inmunitarias exageradas a la microflora entérica normal están implicadas en el inicio y la perpetuación de la inflamación intestinal crónica. Una de las principales vías implica el desarrollo de respuestas inmunitarias "adquiridas" mediante las interacciones de los linfocitos T CD4+ TCRap+ con las células presentadoras de antígenos (APC), en particular las células dendríticas. Las células Treg CD4+CD25+ atenuaron las respuestas de los linfocitos T activados.

La progresión de la fase aguda a la crónica de la EI no ha sido bien caracterizada en modelos animales y no puede evaluarse fácilmente en los pacientes. Spencer DM et al. Gastroenterol. 2002; 122:94-105 informaron de cambios en la respuesta inmunitaria de la mucosa a lo largo del tiempo en la colitis experimental. Se examinó la gravedad de la colitis, la masa corporal, la consistencia de las heces y el contenido de sangre, el amiloide A en suero y la histología de los tejidos en ratones con deficiencia de interleucina 10 (IL-10) durante 35 semanas. Se midió la producción correspondiente de IL-12, IL-18, IFNy, TNFa, IL-4 e IL-13 por parte de las células mononucleares de la lámina propia del intestino inflamado. La administración de un anticuerpo monoclonal (AcM) neutralizante anti-IL-12 en distintos momentos de la progresión de la enfermedad permitió evaluar el potencial terapéutico de este agente. Las células mononucleares de la lámina propia de los ratones con enfermedad temprana sintetizaron progresivamente más IL-12 e IFNy, mientras que la producción de ambas citocinas disminuyó drásticamente y volvió a los niveles anteriores a la enfermedad en la fase tardía. En consonancia con este patrón, el neutralizante anti-IL-12 revirtió la enfermedad temprana, pero no la tardía. En cambio, la producción de IL-4 e IL-13 aumentó progresivamente desde la fase previa a la enfermedad hasta la fase tardía. Se concluyó que la colitis que se desarrolla en los ratones con deficiencia de IL-10 evoluciona en dos fases distintas. La IL-12 desempeña un papel fundamental en la colitis temprana, mientras que otros mecanismos inmunitarios, presumiblemente mediados por IL-4 e IL-13, predominan en la enfermedad tardía para mantener la inflamación crónica.

E. Elinav et al. (2008) Gastroenterology 134(7), páginas 2014-2024, se refieren al redireccionamiento de linfocitos T reguladores con una especificidad predeterminada para el tratamiento de la colitis experimental en ratones.

IL-10 y enfermedad inflamatoria crónica

Desde hace algunos años se sabe que la IL-10 afecta al crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células hematopoyéticas in vitro y es un supresor especialmente potente de las funciones de los macrófagos y los linfocitos T. Esta observación se basó en parte en el uso de ratones mutantes con deficiencia de IL-10 (supresión génica, KO) mediante la selección de genes (Kuhn R et al., Cell 1993; 75:263-74). En estos ratones, el desarrollo de los linfocitos y las respuestas de los anticuerpos son normales, pero la mayoría de los animales tienen un retraso en el crecimiento, anemia y padecen enterocolitis crónica. Las alteraciones en el intestino incluyen una extensa hiperplasia de la mucosa, inflamación y expresión epitelial aberrante de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase II. En cambio, los mutantes KO de IL-10 mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos, desarrollan solo una inflamación localizada (limitada al colon proximal). Se concluyó que (1) la inflamación intestinal en estos mutantes se originaba en respuestas inmunitarias incontroladas estimuladas por antígenos entéricos y (2) la IL-10 es un regulador esencial (negativo) en el tubo digestivo.

En un estudio que valida este modelo de colitis en ratones IL-10 KO, T. Scheinin, T et al. (Clin Exp Immunol 2003; 133:38-43) subrayaron que un modelo animal valioso debe responder a la terapia existente de una manera que se asemeje a la respuesta de la enfermedad humana. Dado que la enfermedad de Crohn refractaria respondía bien al tratamiento con anticuerpos anti-TNFa, los investigadores examinaron las respuestas de los ratones IL-10 KO a la terapia anti-TNFa, utilizando un nuevo sistema de puntuación similar al "índice de actividad" de la enfermedad de Crohn en seres humanos. Se analizaron muestras de heces para detectar citocinas y se compararon los resultados con la histología. Los resultados mostraron que el tratamiento con anticuerpos anti-TNF a partir de las 4 semanas mejoraba notablemente la enfermedad (según la puntuación clínica o la histología intestinal). Se observó una marcada disminución de las citocinas inflamatorias en las muestras de heces, añadiendo una medida más precisa de la mejoría clínica. Los autores concluyeron que este modelo es útil para evaluar otras modalidades terapéuticas relevantes para la enfermedad de Crohn.

Mekala et al. (2005) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102(33), páginas 11817-11822, investigan la tolerancia infecciosa dependiente de la IL-10 tras el tratamiento de la encefalomielitis alérgica experimental con linfocitos T CD4(+) CD25(+) redirigidos.

Células Treg y enteropatía inflamatoria

Uno de los modelos animales de EI más utilizados es la transferencia adoptiva de linfocitos T CD4+ CD45RBhi a ratones SCID, lo que lleva al desarrollo de infiltrados masivos de células mononucleares en el colon, hiperplasia de células epiteliales y ulceración (Thornton AM, et al., J Immunol 2000; 164(1):183-90). La cotransferencia de un gran número de Treg CD4+CD25+ impidió el desarrollo de colitis o curó la colitis establecida, un efecto que requería la señalización a través de CTLA-4 (Read S, et al., JExp Med 2000; 192:295-302; 2000; Morrissey PJ, et al, JExp Med 1993; 178:237-44). Incluso después del desarrollo de la colitis inmunomediada, la transferencia adoptiva de 106 células CD4+CD25+ provocó una mejoría significativa de la inflamación intestinal (Fantini MC et al, Gut 2006; 55:671-80; Mottet C, et al., J Immunol 2003; 170(8):3939-43; Uraushihara K, et al., J Immunol 2003; 171:708-16). En los seres humanos que padecen EI, las células reguladoras periféricas CD4+CD25+ conservan la actividad supresora. Sin embargo, a diferencia de otras enteropatías inflamatorias, el número de estas células reguladoras disminuye en la sangre periférica durante la inflamación activa y solo aumenta ligeramente en las lesiones intestinales (Maul J, et al., Gastroenterology 2005; 128(7):1868-78). Esta aberración sugiere que los defectos de asentamiento de las Treg, así como la activación desregulada in situ contribuyen a la patogénesis de la EI.

Por lo tanto, existe una necesidad reconocida en la técnica de encontrar modalidades para suprimir las reacciones y enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias, entre las que se incluyen la EI, así como para suprimir el rechazo de los injertos de órganos y tejidos y prevenir la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH). La presente invención proporciona una composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad y afección inmunitaria o inflamatoria mediada por linfocitos T basada en una estrategia novedosa, la de redirigir las células Treg, como medio para reclutar Treg en los sitios de inflamación y activarlos para suprimir dichas reacciones inmunitarias/inflamatorias y proteger frente a, aliviar e incluso curar enfermedades tales como la EI.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la concepción de los inventores de que la redirección y la activación de las células Treg mediadas por CR en los sitios de inflamación da como resultado la supresión de las afecciones inflamatorias, comúnmente parte de la enfermedad autoinmunitaria específica de un órgano y ejemplificada en el presente documento como inflamación en el colon en la EI experimental. Los inventores han concebido además el uso de estas células para superar el rechazo de las células y tejidos no compatibles por parte de los linfocitos T efectores que surgen en los receptores de trasplantes o para inhibir la acción patógena de las células inmunocompetentes trasplantadas en el caso de la EICH.

La invención se basa la estrategia de T-cuerpo de los inventores que hasta ahora ha demostrado ser útil para la inmunoterapia del cáncer (y que actualmente se encuentra en ensayos clínicos de fase I/II). La invención proporciona una composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso en un método para tratar una enfermedad o afección inmunitaria o inflamatoria mediada por linfocitos T, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

De acuerdo con la presente invención, se dota a las células Treg de CR que son específicos para un antígeno diana seleccionado. Dicha modificación provoca la activación de las Treg redirigidas en los sitios de inflamación para suprimir las respuestas inmunitarias proinflamatorias de tipo efector. Basándose en los resultados de los presentes inventores (y sus colaboradores) con la reorientación de los linfocitos efectores antitumorales, se espera que las Treg, dotadas de una especificidad predefinida, migrarán o se asentarán y acumularán en un sitio diana, tal como el colon inflamado, donde suprimirán los linfocitos T efectores mediadores de la enfermedad. Para evitar la necesidad de migrar o asentarse en el sitio diana, siempre que sea posible, las Treg pueden administrarse directamente en dicho sitio, donde se activarán y suprimirán los linfocitos T efectores mediadores de enfermedades.

Estas células Treg redirigidas, también denominados "T-cuerpos", son células Treg que han sido modificadas genéticamente para que expresen un receptor quimérico tripartito (T pCR) formado por una unidad de reconocimiento extracelular monocatenaria, una región transmembrana y una región de señalización intracelular. La región de reconocimiento extracelular es específica para un antígeno diana seleccionado y consiste en una región variable de anticuerpo monocatenaria (scFv) que es capaz de unirse al antígeno diana. Los Treg redirigidos de la presente invención se denominan en ocasiones en el presente documento "T-cuerpos". Una región espaciadora extracelular puede estar presente entre la región de reconocimiento extracelular y la región transmembrana. Dicho espaciador es preferentemente una bisagra similar a la inmunoglobulina (Ig), tal como cualquier región bisagra procedente de la superfamilia de Ig.

La región intracelular incluye una combinación de restos de polipéptidos de señalización de linfocitos T, cuya combinación de restos comprende uno o más dominios citoplásmicos de una molécula coestimuladora y un dominio citoplásmico estimulador de linfocitos T, y cuya combinación de restos, tras la unión de la región de reconocimiento extracelular al antígeno diana seleccionado, desencadena la activación de las células Treg para provocar la supresión de la inmunidad mediada por linfocitos T. Las moléculas de señalización de linfocitos T incluyen uno o más dominios citoplásmicos de una molécula coestimuladora (por ejemplo, CD28) y un dominio citoplásmico estimulador de linfocitos T, por ejemplo, de FcRy o una cadena CD3-Z. Las células Treg redirigidas se activan específicamente, tras la unión de la región de reconocimiento extracelular del CR a su antígeno diana, de una manera que preferentemente (1) no esté restringida por, o dependa de, la unión del antígeno diana a un CMH, ni dependa en modo alguno del haplotipo del CMH (HL-A) del receptor, y (2) sea independiente de la participación del ligando o ligandos coestimuladores en una célula diana.

Una enfermedad diana preferida de la presente invención es una EI, tal como la colitis ulcerosa, en la que los presentes métodos, como se han usado con éxito en un modelo animal, permitirán que las células Treg lleguen a las lesiones intestinales de los pacientes con EI y se activen eficazmente en el lugar de la inflamación. La presente invención da lugar a la acumulación de Treg en sitios específicos, dando como resultado en última instancia la activación mediada por CR con especificidad antigénica que da como resultado la producción de citocinas supresoras que a su vez, suprimen los linfocitos T efectores autoinmunitarios de una manera no específica de antígeno, lo que permite aliviar los síntomas y, por tanto, tratar la enfermedad.

La presente invención tiene varias ventajas únicas. Los T-cuerpos redirigidos con un TpCR, que combina el reconocimiento de anticuerpos/antígenos con motivos estimuladores y coestimuladores puede activarse completamente de una manera que no está restringida por el CMH y es independiente de un requisito de coestimulación. La segunda ventaja de la presente invención se deriva del hecho de que, aunque la activación de las Treg es dependiente del antígeno, la acción supresora de estas células es independiente del antígeno, del TCR y del CMH. Aprovechando esta propiedad, se puede construir un receptor quimérico que sea específico para uno o más antígenos asociados a los tejidos en lugar de requerir especificidad para un número desconocido de antígenos específicos de enfermedades autoinmunitarias aún no definidos. La expresión de dichos receptores quiméricos en las Treg redirige estas células y su activación al tejido diana adecuado (en una realización preferida, el colon) para que se activen de forma específica de antígeno, donde sus potentes efectos supresores tienen lugar sin necesidad de un mayor reconocimiento de los antígenos asociados a la enfermedad (el "efecto espectador"). Utilizando Treg específicamente activadas, se necesitan muchas menos células para tratar las afecciones inflamatorias autoinmunes; tales como la EI o las reacciones asociadas a los aloinjertos en los pacientes de lo que habría sido posible antes de esta invención, cuando se habría necesitado un número mucho mayor de Treg no específicas.

Los presentes inventores han construido cepas de ratones transgénicos (Tg) cuyos linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales (NK) expresan un TpCR con especificidad antigénica. Para ilustrar la invención, los inventores seleccionaron el hapteno trinitrofenilo (TNP) como diana específica de las TpCR. Las Treg específicas para TNP aisladas de estos ratones Tg suprimieron los linfocitos T efectores específicos para TNP in vitro e in vivo y fueron capaces de suprimir la colitis inducida por el ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en ratones. En esta realización, el antígeno diana de las Treg y el antígeno patógeno (el hapteno TNP son el mismo). En otro ejemplo, las Treg específicas para TNP suprimieron la colitis inducida por oxazolona en ratones en los que se introdujo una dosis baja de TNP en el colon junto con la exposición a oxazolona. Sin embargo, las Treg específicas para TNP no tuvieron ningún efecto sobre la colitis inducida por oxazolona en ausencia de la introducción por t Np . Esto establece el efecto "espectador" de la presente invención, es decir, que el antígeno diana no tiene por qué ser el antígeno patógeno, siempre que las Treg redirigidas se activen en las proximidades de la respuesta inmunitaria patógena o no deseada.

Las células y los métodos permiten la activación con especificidad antigénica y la acción sin especificidad antigénica de las células Treg utilizadas para suprimir las respuestas de los linfocitos T efectores (y tratar las patologías consiguientes) de una manera que no requiere la identidad entre el ligando (por ejemplo, el antígeno) reconocido por el TpCR (por ejemplo, por su porción de reconocimiento de la diana) y el ligando/antígeno que desempeña un papel patógeno en el proceso patológico. Por tanto, el antígeno que es patógeno no tiene que ser reconocido por los linfocitos T efectores que se suprimen, y, de hecho, puede no estar relacionado con la enfermedad o afección que se está tratando. Por tanto, la invención se beneficia del efecto "espectador". Siempre y cuando las Treg estén en la vecindad correcta donde se encuentran los linfocitos T efectores y medien sus efectos no deseados, los Treg redirigidos de la presente invención pueden provocarse o activarse en esa localización para liberar citocinas supresoras (por ejemplo, IL-10 y TGF-p), lo que resultará en la supresión de cualquier linfocito T efector "espectador", y mediante este mecanismo, se sofocaría una respuesta inflamatoria/autoinmunitaria en curso.

Las características únicas del sistema Tg utilizado en los presentes ejemplos permiten evaluar el efecto supresor de las Treg con especificidad antigénica en la EI tanto in vitro como in vivo. Se utilizan diferentes medios para inducir las Treg, permitiendo a los expertos en la materia seleccionar el método óptimo para generar un número eficiente de Treg redirigidas con especificidad antigénica para un antígeno o enfermedad/afección deseada. De acuerdo con la presente invención, las Treg humanas redirigidas constituyen una modalidad terapéutica eficaz basada en células para la EI o la colitis ulcerosa y, de manera más amplia, para cualquier enfermedad o afección mediada por linfocitos T efectores.

Para superar la escasez de Treg con especificidad antigénica, la presente invención incluye métodos para inducir estas células utilizando citocinas (por ejemplo, TGF-p) o mediante la expresión de transgenes (por ejemplo, codificando el factor de transcripción Foxp3) que, junto con TpCR, permiten la expansión de las Treg con especificada antigénica.

De acuerdo con la presente invención, las células Treg humanas, procedentes del sujeto con la enfermedad o afección autoinmunitaria/inflamatoria a tratar o de un donante sano con HLA compatible (o una célula universal que no sea reconocida por el sistema inmunitario del receptor), quedan dotadas de especificidad antigénica, mediante la transducción con el TpCR con especificidad antigénica, tal como se describe en el presente documento. Como alternativa, las células que están dotadas de especificidad antigénica son toda la población de linfocitos T y la construcción de ácido nucleico que incluye la secuencia que codifica TpCR incluye además un transgén de Foxp3 que está presente como un cistrón transcrito independientemente. En otra de esas alternativas, se transfecta por separado un transgén de Foxp3 en la población de linfocitos T, para convertir los linfocitos T en células Treg. Algunos ejemplos proporcionados a continuación incluyen estudios que utilizan colonoscopia murina, obtención de imágenes in vivo e inmunofluorescencia, y proporcionan la base para una nueva modalidad terapéutica basada en células para la EI, y, por extensión, para otras respuestas inmunitarias patológicas y no deseadas mediadas por linfocitos T efectores con especificidad antigénica.

A continuación se describen más específicamente diversas realizaciones de la invención.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección inmunitaria/inflamatoria mediada por linfocitos T, que comprende un linfocito T regulador redirigido (célula Treg) dotado de especificidad hacia un antígeno diana seleccionado, siendo dicho antígeno seleccionado uno que está presente o se expresa en un sitio o tejido diana de una respuesta autoinmunitaria o inflamatoria mediada por linfocitos T efectores, comprendiendo dicha célula un ácido nucleico quimérico que codifica un polipéptido receptor quimérico (CR) que comprende, expresado en una cadena única y continua, una región de reconocimiento extracelular, una región transmembrana y una región de señalización intracelular, y se expresa en la célula Treg de forma que muestra la región extracelular en la superficie celular, en donde

(a) la región de reconocimiento extracelular del receptor quimérico es específica para el antígeno diana seleccionado y consiste en un dominio scFv derivado de anticuerpo; y

(b) la región intracelular comprende una combinación de restos polipeptídicos de señalización de linfocitos T, cuya combinación de elementos comprende uno o más dominios citoplásmicos de una molécula coestimuladora y un dominio citoplásmico estimulador de linfocitos T, y cuya combinación de restos, tras la unión de la región de reconocimiento extracelular al antígeno diana seleccionado, desencadena la activación de las células Treg para provocar la supresión de la inmunidad mediada por linfocitos T;

y un vehículo, un excipiente o un diluyente farmacéutica e inmunológicamente aceptables.

Preferentemente, la región de reconocimiento extracelular está unida a la región transmembrana a través de un espaciador extracelular, que, más preferentemente, es una bisagra de una molécula de la familia de las inmunoglobulinas.

La región de señalización intracelular incluye preferentemente un resto de señalización de una cadena polipeptídica seleccionada entre el grupo que consiste en una cadena del complejo TCR/CD3, una cadena a, p, ^yo 8 de TCR y la cadena ^yde un receptor Fc de Ig (FcRy). La cadena de un receptor de linfocitos T con especificidad antigénica es preferentemente la cadena CD3/Z o una subunidad FcRy.

La región de señalización intracelular incluye además un resto de señalización de una proteína coestimuladorareceptora de un linfocito T. La proteína coestimuladora-receptora se selecciona preferentemente entre CD28, OX40, CD40L (gp39), 4-1BB y PD-1 (o preferentemente la forma humana u homóloga de estas moléculas coestimuladoras). La más preferida entre ellas es CD28 o 4-1BB. En otra realización preferida, la región de señalización intracelular incluye más de una de las moléculas de señalización de la proteína coestimuladorareceptora. Por ejemplo, la combinación de las moléculas de polipéptidos de señalización de los linfocitos T en la región de señalización intracelular puede incluir tanto CD28 como 4-1BB. En una realización particularmente preferida, las regiones extracelulares de bisagra y transmembrana de CD28 se utilizan como regiones extracelulares bisagra y transmembrana del receptor quimérico.

La región de señalización intracelular también puede incluir un resto de señalización de un receptor de citocina de un linfocito T, tal como el receptor de IL-2 o el receptor de TGF-p. Esto último puede ayudar a inducir al linfocito T que contiene el receptor quimérico a adoptar las características de una célula Treg.

La región intracelular también puede incluir una enzima transductora de señales que (a) sea una enzima de la vía de transducción de señales de un receptor de linfocitos T con especificidad antigénica o (b) sea una enzima con una especificidad y actividad correspondientes a la enzima de (a), derivada de un linfocito no T. Dicha enzima es preferentemente una cinasa, tal como la cinasa Syk.

El ácido nucleico quimérico que codifica el CR puede incluir también una secuencia de nucleótidos que codifica Foxp3 dispuesta de forma que Foxp3 se exprese por la célula Treg independientemente del receptor quimérico. En otras palabras, el ácido nucleico quimérico puede ser bicistrónico, de manera que el transgén Foxp3 está presente como un cistrón transcrito independientemente.

El antígeno diana es aquel que está presente o se expresa en un lugar o tejido diana de una respuesta inmunitaria o inflamatoria mediada por linfocitos T efectores. La respuesta autoinmunitaria o inflamatoria puede comprender una respuesta o enfermedad autoinmunitaria, una respuesta o rechazo de aloinjerto o xenoinjerto, o una enfermedad de injerto contra hospedador (EICH).

El antígeno no es necesariamente un autoantígeno, pero puede ser, por ejemplo, un antígeno que forma parte de la flora bacteriana, tal como el LPS derivado de las bacterias nativas del colon.

La enfermedad autoinmunitaria o la respuesta del injerto y el antígeno o antígenos contra los que las Treg son específicas se seleccionan preferentemente entre el siguiente grupo:

(a) enteropatía inflamatoria (EI), en donde el antígeno es uno que se expresa en el colon o el íleon enfermos; (b) artritis reumatoide, en donde el antígeno es un epítopo del colágeno o un antígeno presente en las articulaciones;

(c) diabetes mellitus de tipo I o insulitis autoinmunitaria, en donde el antígeno es un antígeno de células p pancreáticas;

(d) esclerosis múltiple, en donde el antígeno es, por ejemplo, un antígeno de la proteína básica de la mielina (MBP) o MOG-1 o MOG2-2, o un antígeno neuronal.

(e) tiroiditis autoinmunitaria, en donde el antígeno es un antígeno tiroideo;

(f) gastritis autoinmunitaria, en donde el antígeno es un antígeno gástrico;

(g) uveítis o uveorretinitis autoinmunitaria, en donde el antígeno es el antígeno S u otro antígeno uveal o retiniano (h) orquitis autoinmunitaria, en donde el antígeno es un antígeno testicular;

(i) ooforitis autoinmunitaria, en donde el antígeno es un antígeno ovárico;

(j) psoriasis, en donde el antígeno es un antígeno de queratinocitos u otro antígeno presente en la dermis o la epidermis;

(k) vitíligo, en donde el antígeno es un antígeno melanocítico como la melanina o la tirosinasa;

(l) prostatitis autoinmunitaria, en donde el antígeno es un antígeno de próstata;

(m) cualquier respuesta inmunitaria no deseada, en donde el antígeno es un antígeno de activación u otro antígeno expresado en los linfocitos T efectores presentes en el lugar de la respuesta no deseada;

(n) rechazo de tejidos, en donde el antígeno es el CMH específico del tejido trasplantado; y

(o) una afección inflamatoria, en donde el antígeno es uno que se expresa en las células no linfoides del linaje hematopoyético que participan en la inflamación.

Lo más preferido es una célula Treg capaz de actuar y suprimir la EI o la colitis ulcerosa, y puede ser específica para un antígeno asociado a la EI, tal como el antígeno carcinoembrionario (CEA) o un antígeno de la flora bacteriana intestinal como el lipopolisacárido bacteriano (LPS) o un componente del mismo, preferentemente un componente de lípido A.

Las Treg pueden ser específicas para un antígeno de activación expresado en los linfocitos T efectores, tal como CD69 o CD107a. Las Treg pueden ser específicas para un antígeno expresado en una célula dendrítica, macrófago/monocito, granulocito o eosinófilo presente en el lugar de la inflamación.

En una realización preferida, la célula Treg anterior es específica para un antígeno que se introduce exógenamente a un sujeto en el lugar o tejido diana de la respuesta inmunitaria o inflamatoria, bien antes, concomitantemente o después de la administración de la célula Treg.

La célula Treg anterior es preferentemente una que expresa CD4 o CD8, junto con CD25 en su superficie y expresa el factor de transcripción Foxp3 intracelularmente. El factor de transcripción Foxp3 puede expresarse en la célula de forma endógena (es decir, a partir del propio gen Foxp3 de las células); esta expresión se ve potenciada por la exposición de las células a TGF-p o a otra citocina que induce la expresión de Foxp3 e induce un fenotipo Treg en los linfocitos T. En otra realización de la célula Treg anterior, Foxp3 se expresa a partir de un ácido nucleico que ha sido introducido en la célula de forma exógena (es decir, transducido) como una construcción de expresión de ácido nucleico recombinante que codifica Foxp3 y regula su expresión. Las Treg anteriores pueden obtenerse de un sujeto mamífero antes de la introducción del ácido nucleico quimérico y antes de la estimulación que induce la expresión de Foxp3 o antes de transducir la construcción exógena que codifica Foxp3. El ácido nucleico quimérico que codifica el receptor quimérico y la construcción de ácido nucleico que codifica Foxp3 pueden transducirse de manera conjunta en la célula. En una realización, la cotransducción se consigue utilizando un vector bicistrónico que incluye, en un solo vector, una secuencia de (i) el ácido nucleico quimérico que codifica el receptor quimérico y (ii) la construcción de ácido nucleico que codifica Foxp3, bajo el control de un promotor común (o separado) y de secuencias reguladoras.

Las células Treg anteriores pueden enriquecerse o purificarse a partir de una población mixta de linfocitos o linfocitos T en función de la expresión de CD4 (o CD8) y c D25 y/o Foxp3 de las células Treg. La célula puede someterse al siguiente tratamiento:

(a) exposición ex vivo de:

(i) células monomorfonucleares de sangre periférica,

(ii) linfocitos de sangre periférica,

(iii) linfocitos T enriquecidos o purificados a partir de (i) o (ii), o

(iv) un subconjunto de linfocitos T enriquecido o purificado a partir de (iii);

hasta una cantidad de TGF-p u otra citocina o agente inductor de Treg que sea eficaz para convertir los linfocitos T en un fenotipo Treg e inducir la expresión de Foxp3; y

(b) opcionalmente, cultivar y expandir las células expuestas de la etapa (a).

Las células Treg preferidas comprenden la célula anterior que ha sido transducida con un vector de expresión que codifica Foxp3.

Además, en el presente documento se describe un método para producir las Treg redirigidas anteriores que expresan un receptor quimérico como el descrito. Este método comprende preferentemente:

(a) obtener de un sujeto y, opcionalmente, enriquecer o aislar y propagar, una población de linfocitos o linfocitos T;

(b) inducir el fenotipo Treg en estos linfocitos estimulando o activando adecuadamente las células mediante la exposición a TGF-p u otra citocina o agente que induzca la expresión de Foxp3 y un fenotipo Treg;

(c) antes o después de la etapa (b), transducir las células ex vivo con un vector de expresión que codifica el receptor quimérico que se expresará en las Treg; y

(d) opcionalmente, cultivar o expandir in vitro las células obtenidas como se ha indicado anteriormente.

Otro método de la presente divulgación comprende:

(b) transducir las células ex vivo con un vector que codifica el receptor quimérico;

(c) antes, después o simultáneamente con la etapa (b), transducir las células ex vivo con una construcción de expresión de ácido nucleico recombinante que codifica Foxp3; y

Además, en el presente documento se describe un método para suprimir la actividad no deseada de los linfocitos T efectores en la mediación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria, que comprende suministrar a una población de linfocitos T efectores que deben ser suprimidas (o a un sitio en el que están presentes dichos linfocitos T efectores) una cantidad/número de Treg redirigidas como se ha indicado anteriormente, eficaz para suprimir la actividad de los linfocitos T efectores.

Además, se describe en el presente documento un método para suprimir la actividad no deseada de los linfocitos T efectores, como se ha indicado anteriormente, comprendiendo dicho método suministrar a una población de linfocitos T efectores que deben suprimirse (o a un sitio en el que están presentes dichas linfocitos T efectores) una cantidad/número de Treg redirigidas producidas según los métodos anteriores que son eficaces para suprimir la actividad de los linfocitos T efectores.

Este suministro es preferentemente in vivo. Las células Treg redirigidas se administran mediante inyección o infusión a un sujeto en el que se quiere suprimir la actividad de los linfocitos T efectores, preferentemente por una vía seleccionada entre la intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraarticular, intratecal, intraluminal, intracerebroventricular, rectal y tópica. Las células Treg se administran regional o localmente en un lugar de inflamación.

El método anterior está destinado a utilizarse en situaciones en las que los linfocitos T efectores median una respuesta inflamatoria o un trastorno autoinmunitario, rechazo de un trasplante o EICH.

El método para tratar o mejorar los síntomas de una enfermedad o afección en un sujeto que está mediada por una actividad no deseada de los linfocitos T efectores comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición farmacéutica descrita anteriormente, en donde el dominio de reconocimiento de la diana de las células Treg redirigidas es específico para un antígeno presente en el sujeto en la proximidad de los linfocitos T efectores, de modo que, al reconocer y unirse al antígeno, estas células Treg redirigidas se activan para secretar citocinas supresoras que suprimen los linfocitos T efectores de forma no específica para el antígeno. Como se ha señalado anteriormente, la activación de las células Treg se produce de una manera que no está restringida por el CMH y no requiere la coestimulación por un ligando de la proteína de señalización coestimuladora.

También se describe en el presente documento un método para tratar o mejorar los síntomas de una enfermedad o afección en un sujeto que está mediada por la actividad no deseada de los linfocitos T efectores, comprendiendo el método: (a) producir células Treg redirigidas utilizando los métodos de producción descritos anteriormente; (b) administrar al sujeto que lo necesita una cantidad/número eficaz de estas células Treg, tratando o mejorando de este modo los síntomas de la enfermedad o afección.

Además, en el presente documento se describe un método para suprimir un proceso inmunitario/inflamatorio mediado por linfocitos T en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración al sujeto de una cantidad/número eficaz de células Treg redirigidas que expresan en su superficie un receptor quimérico con especificidad antigénica que incluye porciones que activan las células Treg al entrar en contacto con el antígeno para el que el receptor es específico, siendo el antígeno uno que está presente en la proximidad de la actividad inmunitaria/inflamatoria. Preferentemente, la enfermedad o afección que se va a tratar o mejorar es: (a) EI; (b) artritis reumatoide; (c) diabetes mellitus de tipo I o insulitis autoinmunitaria; (d) esclerosis múltiple; (e) tiroiditis; (f) gastritis; (g) uveítis o uveorretinitis; (h) orquitis; (i)) ooforitis; (j) psoriasis; (k) prostatitis; (I) encefalomielitis; (m) vitíligo; (n) rechazo de un injerto de células, tejidos u órganos no compatibles; o (o) EICH.

El método descrito se utiliza para inhibir el rechazo de células, tejidos u órganos trasplantados (aloinjerto o xenoinjerto) que, por ejemplo, no son compatibles con un antígeno mayor y/o uno o más antígenos menores de histocompatibilidad. En el caso de la EICH, el receptor ha recibido generalmente un trasplante de células de la médula ósea alogénicas, semialogénicas o no coincidentes con el CMH, o de células madre hematopoyéticas enriquecidas o aisladas que son responsables de mediar los efectos patógenos.

En el presente documento se describe además un ADN quimérico que puede utilizarse para producir los linfocitos T redirigidos descritos anteriormente, así como la proteína de receptor quimérico codificada por este. Dicho ADN quimérico comprende:

un primer segmento de ADN que codifica una región de reconocimiento extracelular específica para un antígeno diana seleccionado, que no comprende un dominio extracelular de la proteína del c Mh , el antígeno o ligando objetivo seleccionado es uno que está presente o se expresa en un lugar o tejido diana de una respuesta inmunitaria patógena o no deseada mediada por linfocitos T efectores;

un segundo segmento de ADN que codifica una región transmembrana; y

un tercer segmento de ADN que codifica una región de señalización intracelular que comprende una combinación de moléculas de polipéptidos de señalización de linfocitos T, cuya combinación de motivos, tras la transfección del ADN quimérico en un linfocito T regulador (célula Treg) y la unión de la región de reconocimiento extracelular al antígeno diana seleccionado o a su ligando, desencadena la activación de las células Treg para provocar la supresión de la inmunidad mediada por linfocitos T,

cuyo ADN quimérico, tras la transfección en una célula Treg, expresa la región de reconocimiento extracelular, la región transmembrana y la región de señalización intracelular en una sola, cadena continua en la superficie de la célula transfectada, de manera que las Treg transfectadas se activan y provocan la supresión de la inmunidad mediada por linfocitos T cuando la región de reconocimiento extracelular expresada se une a su antígeno o ligando diana seleccionado.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Diagrama esquemático de la estructura del TPCR específico para TNP. (A) Presentación esquemática de los receptores quiméricos específicos para TNP. El CR específico para TNP comprende un scFv derivado del AcM anti-TNP, Sp6. En la configuración tripartita, el scFv se une en tándem a una porción corta de CD28 (que carece del sitio de unión al ligando) de los dominios extracelulares y que incluyen los dominios transmembrana y citoplasmáticos fusionados al dominio ITAM de FcRy. (B) Construcciones transgénicas de receptores quiméricos. Las construcciones utilizadas para generar los ratones transgénicos se colocaron bajo el control del promotor/potenciador CD2 humano que dirige la expresión solo en los linfocitos T y NK. CYT indica dominio citoplasmático; H, dominio bisagra; L, líder de la inmunoglobulina; LCR, región de control del locus; P, promotor; pL, secuencia del plásmido; D, dominio transmembrana; VH y VL, dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, respectivamente; ACD28, CD28 truncado que contiene parte del dominio extracelular y transmembrana, y carece del resto de señalización citoplásmico.

Figura 2: Resultados de citometría de flujo de la tinción de Foxp3 de las Treg específicas para TNP. Los esplenocitos aislados de ratones TS y TNP-Tg se tiñeron para Foxp3 intracelular y para el receptor quimérico específico de TNP utilizando el anticuerpo antiidiotípico para el scFv Sp6. Se muestran análisis de citometría de flujo representativos de un ratón individual de los cinco que se han analizado. Los porcentajes indican las células con doble tinción.

Figura 3: Gráfica que muestra la relación entre las células CD4+CD25+ y las células CD4+ en los esplenocitos de ratones de tipo silvestre y Tg. Los grupos son: ratones de tipo silvestre, ratones Tg para un receptor quimérico específico para un antígeno "irrelevante", ErbB2 (también denominados ratones ErbB2-Tg), Ratones TNP-Tg que han sido transfectados con un vector que carece del dominio transgénico coestimulador CD28 (también denominados ratones TNPACD28-Tg), y TNP-Tg. Las Treg TNP-Tg expresan completamente el TpCR específico para TNP

Figura 4: Gráfica (izquierda) que muestra la proporción de células Foxp3+/CD4 en ratones de tipo silvestre, ErbB2-Tg, TNPACD28-Tg y TNP-Tg. Citogramas de flujo (derecha) que muestran la expresión esplénica de Foxp3. Los resultados comparan los ratones de tipo silvestre, ErbB2-Tg, TNP-Tg y TNPACD28-Tg.

Figura 5: Citogramas de flujo que muestran la tinción de Foxp3 en linfocitos T CD4+CD25+ efectores seleccionados de tipo silvestre, ErbB2-Tg, TNP-Tg y TNP-ACD28-Tg.

Figura 6: Gráfica (izquierda) que muestra la relación entre células Foxp3+ y CD25+/Foxp3+. Citograma de flujo (derecha) que muestra la cotinción de Foxp3 y CD25. Los resultados comparan los esplenocitos de tipo silvestre, ErbB2-Tg, TNP-Tg y TNP-ACD28-Tg.

Figura 7: Gráfica que muestra el porcentaje de esplenocitos Foxp3+ en la población total de linfocitos T CD3+ tras la inducción de la colitis por TNBS. Se aislaron linfocitos esplénicos de ratones TS y TNP-Tg antes o 48 horas después de la inducción de la colitis por TNP, y se tiñeron por partida doble con anticuerpos anti-Foxp3 y anti-CD3.

Figura 8: Gráfica que muestra el porcentaje de linfocitos Foxp3+ extraídos de la lámina propia del colon tras la inducción de la colitis por TNBS. Se aislaron linfocitos de ratones TS y TNP-Tg antes y 48 horas después de la inducción de la colitis por TNP, y se tiñeron dos veces como en la Fig. 7. El porcentaje de linfocitos Foxp3+ en la población CD3+ se presenta como la media de la relación Foxp3/CD3 ± d.t. de cada grupo de cinco ratones. Los datos mostrados son las medias de dos experimentos independientes realizados. Las diferencias en las proporciones entre los ratones TNP-Tg no tratados previamente y con colitis inducida fueron significativas (P < 0,05).

Figura 9: Serie de 6 gráficas que muestran la estimulación de la proliferación de las Treg redirigidas (izquierda) y de los linfocitos T efectores (derecha) mediante un estímulo no específico de antígeno (AcM anti CD3 y anti CD28) y un estímulo específico de antígeno (TNP).

Figura 10: Gráfica que muestra la activación policlonal con concanavalina A (Con A) de cocultivos de células Treg y linfocitos T efectores (y cultivos de control de poblaciones celulares individuales)

Figura 11: Gráficas que muestran que la activación específica de las Treg TNP-Tg y su supresión de los linfocitos T efectores requiere la coestimulación con TNP y CD28. En el panel de la izquierda, se muestra la activación específica (TNP) de las Treg. Las Treg TS o TNP-Tg (5 * 104) se cocultivaron con Teff TS o TNP-Tg (5 * 104) en presencia de APC esplénicas irradiadas, sin linfocitos T y con TNP (1,5 * 105). La proliferación de Teff se midió después de 48 horas mediante la incorporación de 3H-timidina. Panel derecho: APC cargadas con TNP como estímulo.

Figura 12: Gráfica que muestra la dosis-respuesta de la estimulación específica de TNP de los cocultivos de células Treg linfocitos T efectores. Las APC eran células de mastocitoma P815 modificadas con TNP, que no expresan B7 (P815-TNP) o células P815 modificadas con TNP en las que se transfectó de forma estable el gen B7 (B7-TNP).

Figura 13: Gráfica que muestra que la activación específica de las Treg TNP-Tg y su supresión de los linfocitos T efectores requiere la coestimulación con TNP y CD28. Para establecer si la señalización coestimuladora es necesaria para la activación de las Treg TNP-Tg, los experimentos de cocultivo se repitieron utilizando como APC células de mastocitoma P815 irradiadas (1,5 * 105) que estaban transfectadas de forma estable (o no) con ADNc de B7. La proliferación de las células Teff se midió después de 48 horas mediante la incorporación de 3H-timidina. Cada grupo se cultivó por triplicado y el experimento se repitió tres veces. Los datos mostrados representan la media (+ d.t.) de cultivos por triplicado de un experimento representativo. Las diferencias en el índice de estimulación entre las Treg Teff+TS y las Treg Teff+TNP-Tg fueron significativas (P < 0,01).

Figura 14: Fotografía del colon de ratones de tipo silvestre (izquierda) y de ratones TNP-Tg (derecha) cuatro días después de la inducción de la colitis por altas dosis de TNBS mediante la instilación intrarrectal de TNBS en el día 0.

Figura 15: Curva de mortalidad de los ratones de tipo silvestre (TS), TNP-Tg, ErbB2-Tg y TNP-ACD28-Tg tras la inducción de colitis por TNBS mediante instilación intrarrectal de TNBS en el día 0.

Figura 16: Fotomicrografía de tejido teñido (H&E, 40x) de los colones de la Fig. 14.

Figura 17: Curva de mortalidad de los ratones TS, TNP-Tg, ErbB2-Tg y TNP-ACD28-Tg tras la inducción de colitis con oxazolona (OXA; un hapteno/antígeno distinto de TNP). Estos resultados sirven como control de la especificidad de las Treg en el experimento cuyos resultados se muestran en las Fig. 14-16. La colitis se indujo utilizando el hapteno no relacionado, oxazolona, que se instiló por vía intrarrectal en estirpes de ratones similares (n = 10).

Figura 18: Citogramas de flujo de la tinción de Foxp3 de linfocitos T efectores de tipo silvestre, ErbB2-Tg, TNP-ACD28-Tg y TNP-Tg tras una semana de cultivo en presencia de los siguientes "estímulos" (en la parte superior): anti-CD3, TGF-p, anti-CD3+TGF-p, TNP o TNP TGF-p.

Figura 19: Gráficas que muestran la tasa de mortalidad o supervivencia de los ratones de tipo silvestre sometidos a la inducción de colitis por TNBS moderada (panel izquierdo) y grave (panel derecho) tras la transferencia adoptiva de las siguientes poblaciones de Treg: T^s, ErbB2-Tg, TNP-Tg y TNP-ACD28-Tg.

Figura 20: Gráfica que muestra la puntuación de gravedad de la colitis de Wallach en ratones de tipo silvestre sometidos a la inducción de colitis por TNBS tras la transferencia adoptiva de células de donantes TS, ErbB2-Tg o TNP-Tg. La colitis por TNBS se indujo en ratones TS (n = 8) el día 0. Después de 16 horas, las Treg (1 * 105) de ratones TNP-Tg, ErbB2-Tg o TS se transfirieron adoptivamente a los ratones receptores. Cada experimento se repitió tres veces. Los datos mostrados representan la media de un experimento representativo.

Figura 21: Fotografía de colones extirpados de ratones de tipo silvestre en los que se indujo colitis por TNBS, tras la transferencia adoptiva en ratones de tipo silvestre, ErbB2-Tg y TNP-Tg en el experimento descrito en la Fig. 20.

Figura 22: Fotomicrografía de secciones de tejido de colon teñidas (H&E, 40x) de ratones de tipo silvestre con colitis por TNBS tras la transferencia adoptiva de Treg de los siguientes donantes: (A) tipo silvestre (B) ErbB2-Tg y (C) TNP-Tg. El panel D muestra el colon de control normal.

Figura 23: Localización de Treg en el colon. Citogramas de flujo de la tinción fluorescente de las Treg marcadas con el colorante intracelular éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) en la lámina propia del colon de ratones no tratados previamente o de ratones con colitis por TNBS. Las Treg marcadas se inyectaron por vía intraperitoneal 24 horas después de la inducción de la colitis por TNBS. Los linfocitos de la lámina propia se obtuvieron 16 horas después de la transferencia adoptiva de 106 Treg de tipo silvestre o TNP-Tg a los receptores indicados. Las Treg marcadas con CFSE eran 9 veces más abundantes en los colones enfermos.

Los datos mostrados representan los porcentajes de células positivas a CFSE en las puertas lógicas correspondientes de un ratón representativo de cada grupo de cuatro ratones. Cada experimento se repitió dos veces.

Figura 24: Localización de Treg en el colon. Imágenes in vivo de ratones TS que reciben Treg marcadas con DiR de tipo silvestre y TNP-Tg (1 * 106) 16 horas después de la inducción de la colitis por TNP (n = 3). Los ratones fueron sometidos a una toma de imágenes de cuerpo entero (IVIS® 100 Series Imaging System) a intervalos de 12 horas. Se muestra un solo ratón representativo de tres en cada grupo en todos los puntos temporales. Se realizaron dos experimentos independientes, con resultados similares. (

Figura 25: Localización de Treg en el colon. Evaluación microendoscópica fluorescente in situ (Cell Vizio) de las Treg marcadas con CFSE que se acumulan en la capa mucosa preluminal del colon. El diseño experimental es idéntico al descrito en la Fig. 23. La figura muestra fotogramas representativos tomados 48 horas después de la transferencia adoptiva. Cada grupo estaba formado por cuatro ratones y cada experimento se repitió dos veces. Figura 26: La administración intrarrectal de TNBS da lugar a un efecto protector mediado por las Treg TNP-Tg frente a la colitis por oxazolona. (a) Tasas de mortalidad de ratones de tipo silvestre y TNP-Tg a los que se les administró oxazolona ± dosis bajas de TNBS, 1 semana después de la presensibilización solo con oxazolona. (b) Imágenes de colonoscopia murina de ratones TS y TNP-Tg representativos. (c) Aspecto macroscópico de colones representativos de varios grupos de ratones. (d) Aspecto microscópico de los colones mostrados en c. (e) Transferencia adoptiva de Treg (Tr) a ratones presensibilizados con oxazolona (O) inducidos una semana después con colitis por oxazolona (O) en presencia de una dosis baja de TNBS (T). Se administraron Treg TS o TNP-Tg a ratones (n = 8) 16 horas después de la inducción de la colitis.

La Figura 27 muestra 8 dibujos esquemáticos de linfocitos T transducidos con un vector retrovírico portador de una de las 8 construcciones de CR que incluyen la proteína fluorescente detectable, eGFP. Las representadas en la mitad inferior de la figura son construcciones bicistrónicas que codifican una fusión de GFP y el factor de transcripción Foxp3. Se utilizó microscopía óptica y de fluorescencia para seguir la expresión de la GFP en el citoplasma del núcleo de las células transducidas. Las construcciones están etiquetadas de la siguiente manera (donde "TPCR" se refiere a "receptor quimérico tripartito" aunque, algunos de estos CR estaban "más" que tripartitos).

a. TNP-TPCR: región de reconocimiento extracelular compuesta por un scFv de un AcM específico para TNP. b. MD2-TPCR: región de reconocimiento extracelular compuesta por un fragmento o motivo de unión a LPS de la proteína humana MD2, un correceptor de LPS (que interactúa con los receptores TLR4). El fragmento de m D2 corresponde a los restos 120-132 de la SEQ ID NO: 5. Las secuencias de dichos ácidos nucleicos quiméricos utilizadas en el presente documento son las SEQ ID NO: 8 y 9.

c. CD14-TPCR: la región de reconocimiento extracelular comprendía un fragmento de unión a LPS de la proteína CD 14 humana, un conocido receptor de LPS. El fragmento de CD 14 corresponde a los restos 100 119 de la SEQ ID NO: 4. Las secuencias de dichos ácidos nucleicos quiméricos utilizadas en el presente documento son las SEQ ID NO: 6 y 7.

d. MD2-CD14-TPCR: la región de reconocimiento extracelular comprendía tanto el fragmento MD2 como los fragmentos de CD 14 descritos anteriormente. Las secuencias de dichos ácidos nucleicos quiméricos utilizadas en el presente documento son las SEQ ID NO: 10 y 11.

Cada una de las construcciones codificó como motivos estimuladores y coestimuladores, secuencias unidas en tándem que codifican CD28 y FcRy. Los resultados se muestran en forma de micrografías ópticas y de fluorescencia paralelas.

Figura 28. Una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 1) y una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de un CR tripartito específico para TNP tal como se utiliza en el presente documento. Las anotaciones incluyen el origen de las regiones (scFv, en este caso el AcM "Sp6"), la región "CD28", y las regiones de FcRy (indicadas como "GAMMA"), así como sitios de restricción, secuencia líder, etc. La proteína madura comienza en el resto de aminoácido 23.

Figura 29. Una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 3) de un plásmido pBullet que incluye una construcción codificante de CR que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el scFv del AcM HB 9081 (es decir, producido por un hibridoma con el número de referencia ATCC HB9081) fusionado a C28/FcRy. Este AcM y, por ende, el scFv, es específico para LPS. Las anotaciones muestran varios sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, la secuencia líder y las secuencias del plásmido.

Figura 30A - 30B. La Fig. 30A es una secuencia de aminoácidos anotada de CD 14 humano (SEQ ID NO: 4). Véase el n.° de referencia de GenBank P08571. Se observa una secuencia de señal y un motivo de unión a LPS (restos 100-119). Esta proteína sirve como receptor de LPS en las células. La Fig. 30B es una secuencia de aminoácidos anotada de la proteína humana MD-2 (SEQ ID NO: 5). Véase el n.° de referencia de GenBank NP_056179. Se observa una secuencia de señal y un motivo de unión a LPS (restos 120-132). Esta proteína de unión a LPS interactúa con TLR-4 como correceptor.

Figura 31A - 31B. La Fig. 31A es una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 6) que muestra la secuencia de nucleótidos de un receptor quimérico que comprende el motivo CD14 CD28-FcRy. La Fig. 31B es una secuencia de nucleótidos anotada (s Eq ID NO: 7) que muestra la secuencia de nucleótidos de un receptor quimérico bicistrónico: motivo CD14 CD28-FcRy-IRES-GFP-Foxp3. También se muestra la secuencia de aminoácidos (código de una sola letra) del motivo CD14 (restos 110-119 de la SEQ ID NO: 4). Las anotaciones muestran diversos sitios de restricción, inicios y finales de regiones proteicas, región de IRES, etc.

Figura 32A - 32B. La Fig. 32A es una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 8) que muestra la secuencia de nucleótidos de un receptor quimérico que comprende el motivo MD2-CD28-F^cR^y. La Fig. 32B es una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 9) que muestra la secuencia de nucleótidos de un receptor quimérico bicistrónico: motivo MD2 CD28-FcRY-IRES-GFP-Foxp3. También se muestra la secuencia de aminoácidos del motivo MD2 (restos 120-132 de la SEQ ID NO: 4). Las anotaciones muestran diversos sitios de restricción, inicios y finales de regiones proteicas, región de IRES, etc.

Figura 33A y 33B. La Fig. 33A es una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 10) que muestra la secuencia de nucleótidos de un receptor quimérico que comprende el motivo MD2-CD14 motivo CD28-FcRy. La Fig. 33B es una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 11) que muestra la secuencia de nucleótidos de un receptor quimérico bicistrónico: motivo MD2-motivo CD14-CD28-FcRY-IRES-GFP-Foxp3. También se muestra la secuencia de aminoácidos del motivo MD2 (restos 120-132 de la SEQ ID NO: 4) y la secuencia de aminoácidos del motivo CD14 (restos 100-119 de la SEQ ID NO: 3). Los nucleótidos 106-148 de la SEQ ID NO: 11 (doblemente subrayados) codifican un enlazador flexible (14 aminoácidos, SEQ ID NO: 12, también con doble subrayado). Las anotaciones muestran diversos sitios de restricción, inicios y finales de regiones proteicas, región de IRES, etc.

La Figura 34 es una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 13) que muestra la secuencia de nucleótidos de un receptor quimérico que comprende MD2-CD28-FcRy (SEQ ID NO: 13). También se muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína MD2 de longitud completa (SEQ ID NO: 4). La región de unión al LPS de esta secuencia de aminoácidos está subrayada. Las anotaciones muestran diversos sitios de restricción, inicios y finales de regiones proteicas, etc.

La Figura 35 es una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 14) que muestra la secuencia de nucleótidos de un receptor quimérico bicistrónico: MD2-CD28-FcRY-IRES-GFP-Foxp3. También se muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína MD2 de longitud completa (SEQ ID NO: 4). La región de unión al LPS de esta secuencia de aminoácidos está subrayada. Las anotaciones muestran diversos sitios de restricción, inicios y finales de regiones codificantes de proteínas, IRES, secuencia del vector, etc.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Definiciones

"Linfocito T regulador" o "célula Treg" o "Treg" tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, son sinónimos y pretenden tener su definición estándar tal y como se utiliza en la técnica. Las células Treg son una subpoblación especializada de linfocitos T que actúan de forma "reguladora" para suprimir la activación del sistema inmunitario y mantener así la homeostasia del sistema inmunitario y la tolerancia a los autoantígenos. Las Treg se han denominado a veces linfocitos T supresores. Las células Treg se caracterizan por la expresión del factor de transcripción de la familia forkhead Foxp3 (caja de forkhead p3). También pueden expresar proteínas de superficie CD4 o CD8. Normalmente también expresan CD25. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, y a menos que se especifique lo contrario, las Treg incluyen las Treg naturales y las Treg inducidas o adaptativas y las Treg que han sido creadas mediante tecnología de ADN recombinante. Las células Treg de origen natural (CD4+CD25+Foxp3+) surgen como todas los demás linfocitos T en el timo. En cambio, las células Treg adaptativas (también conocidas como células Tr1 o células Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal. La activación con especificidad antigénica de los linfocitos T efectores humanos da lugar a la expresión inducible de Foxp3 en un subgrupo de las células efectoras activadas, y este subgrupo puede desarrollar un fenotipo regulador (Treg). Una forma de inducir las Treg es mediante la exposición prolongada de los linfocitos T efectores a TGF-p. Los linfocitos T también pueden convertirse en células Treg por transfección o transducción del gen Foxp3 en una población mixta de linfocitos T. Un linfocito T al que se le hace expresar Foxp3 adopta el fenotipo Treg y dichas Treg recombinantes también se definen en el presente documento como "Treg".

"Treg redirigida" pretende ser un término global para las Treg portadoras de un receptor quimérico (CR) como el descrito, que confiere a las células la capacidad de unirse a y ser activadas por un antígeno diana (de acuerdo con la invención) o un ligando (no en el ámbito de la invención) que es diferente de aquel para el que una población Treg puede haber sido previamente específica (según lo controlado por su TCR endógeno con especificidad antigénica). Las Treg redirigidas son "independientes del CMH" y "no restringidas al CMH" en su proceso de activación y en sus acciones, ya que no requieren la asociación de un péptido derivado de su antígeno o ligando diana con el CMH para reconocerlo. Sin embargo, para fines especiales, puede ser posible diseñar un Treg redirigido que reconozca un epítopo específico de una molécula de CMH per se, por ejemplo, funcionando como un antígeno de trasplante. En este caso, estas Treg redirigidas siguen estando no restringidas por el CMH.

La expresión "antígeno o ligando diana seleccionado" significa una molécula a la que la Treg redirigida debe unirse a fin de activar dicha Treg. Si la diana seleccionada es un antígeno de acuerdo con la invención, entonces se puede generar un anticuerpo contra él y utilizar las regiones de unión de dicho anticuerpo para construir la región de reconocimiento extracelular de las Treg redirigidas. Si la molécula diana es un miembro de un par de receptor/ligando (definido a continuación), el otro miembro de ese par puede utilizarse como parte de la región de reconocimiento extracelular de las Treg redirigidas. Generalmente, en el diseño de una Treg redirigida para su uso de acuerdo con la presente invención, primero se identifica el tejido diana o el lugar donde se va a emplear la Treg y posteriormente, se identifica un antígeno que está presente en este tejido o lugar diana o cerca de él. A continuación, se identifica un anticuerpo que se une al mismo, o, si fuese necesario, se crea o construye para su uso en la Treg redirigida.

El término "ligando", como se usa en el presente documento y concretamente como parte de la expresión "antígeno o ligando diana" o la expresión "par de receptor/ligando" se refiere a una molécula que tiene la capacidad de unirse a y formar un complejo con otra molécula biológica para desempeñar un papel biológico. A menudo, el compañero de unión de un ligando se llama receptor, de modo que los dos compañeros de unión se denominan "par de receptor/ligando" A efectos de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, el término "receptor", cuando se utiliza en el sentido de "par de receptor/ligando" tiene un significado más amplio que, por ejemplo, una definición típica de "receptor", tal como una proteína en o sobre una célula que se une a un ligando específico. Se trata más bien de cualquier compañero de unión para un ligando. Cualquiera de los miembros de un par de unión puede considerarse el "ligando" mientras que el otro miembro se considera el "receptor". Por tanto, un receptor clásico puede calificarse como "ligando" cuando en el presente documento se utiliza la expresión "antígeno o ligando diana", ya que es un miembro de un par de unión de receptor/ligando. Por ejemplo, la IL-2 puede ser un ligando porque se une y forma un complejo con otra biomolécula, es decir, un receptor de IL-2 (IL-2R), para desempeñar un papel biológico. Sin embargo, IL-2R es también un "ligando" porque es una molécula que se une y forma un complejo con otra biomolécula, es decir, IL-2, para desempeñar un papel biológico. Por tanto, según el uso actual, si IL-2R se considera un ligando en el par de unión de IL2R/IL-2, IL-2 puede considerarse el receptor, y viceversa.

Un "receptor quimérico" tal como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, es un polipéptido recombinante que incluye una región de reconocimiento extracelular derivada de una molécula y al menos un resto de señalización intracelular derivado de una molécula diferente. En ese sentido es quimérico.

Un "ácido nucleico quimérico" es un polinucleótido recombinante que incluye una secuencia que codifica un receptor quimérico.

Los términos "recombinante" o "recombinantemente" cuando se aplican a un polinucleótido, polipéptido o célula significan que la molécula o célula se ha producido mediante técnicas de ingeniería genética y no existiría de no ser por la intervención humana.

La expresión "resto polipeptídico de señalización de linfocitos T" se refiere a la parte de una molécula endógena en un linfocito T que media la señalización. Puede ser una porción de una molécula receptora de linfocitos T que medie en la señalización, o una enzima de transducción de señales posterior o una porción de la misma que media la señalización, es decir, que tiene actividad enzimática.

La expresión "dominio scFv derivado de anticuerpo" significa un anticuerpo monocatenario en el que la V^lde un anticuerpo específico está unida a la V^hdel mismo por un enlazador o espaciador flexible.

La expresión "un dominio extracelular de proteína de CMH" se refiere a la divulgación de Meal DJ et al. (Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:11817-22), que se analiza más adelante, y Jodi MD et al, Nat. Biotechnol., 2002, 20:1215-1220. Estas publicaciones describen las células Treg redirigidas contra linfocitos T en un sistema murino. Utilizaron las cadenas Is a e Is p del CMH de clase II como regiones extracelulares de dos receptores quiméricos separados para su uso en una Treg redirigida. La expresión dominio extracelular de la proteína del CMH se define de manera que abarque lo que se utilizó en las publicaciones de Meal et al. y Jodi et al. y cualquier análogo o fracción de los mismos que hubiera sido obvio para una persona con conocimientos ordinarios en la materia sustituir dichos dominios para el propósito divulgado por Meal et al. y por Jodi et al., es decir, para provocar la unión de las Treg redirigidas a un linfocito T dirigido específicamente a un autoantígeno concreto.

La expresión "espaciador flexible" se refiere a cualquier resto peptídico flexible que facilite la funcionalidad de la región de reconocimiento extracelular. Cuando esta región no está rígidamente unida a la región transmembrana, pero se permite cierto grado de flexibilidad con respecto a la membrana celular, se facilita la capacidad de la región de reconocimiento para reconocer y unirse a su antígeno o ligando diana. Pequeños aminoácidos neutros, tales como la glicina y la serina, confieren dicha flexibilidad. Algunos ejemplos son Gly4Ser y GIy4Ser3.

La "superfamilia de las inmunoglobulinas" (Ig) es el gran grupo de proteínas solubles y de superficie celular que participan en los procesos de reconocimiento, unión o adhesión de las células. Las moléculas se clasifican como miembros de esta superfamilia en función de las características estructurales que comparten con las inmunoglobulinas (también conocidas como anticuerpos); todas ellas poseen un dominio conocido como dominio o pliegue de inmunoglobulina. Los miembros de las Ig incluyen varios receptores de antígenos de la superficie celular, correceptores y moléculas coestimuladoras del sistema inmunitario, moléculas implicadas en la presentación de antígenos a los linfocitos, moléculas de adhesión celular y ciertos receptores de citocinas. Suelen asociarse, aunque no exclusivamente, a funciones del sistema inmunitario.

El término "bisagra" cuando se refiere a una región de una molécula de las Ig significa la región entre los dominios C^h1 y C^h2 que consiste en un pequeño número de aminoácidos. La bisagra es flexible y permite que la región de unión se mueva libremente con respecto al resto de la molécula. En la región bisagra se encuentran los puentes disulfuro que unen los dos dímeros, creando la unidad estructural del tetrámero. Se pueden encontrar ejemplos de dichas secuencias bisagra de inmunoglobulina en la patente de los Estados Unidos 6.165.476.

La expresión "receptor con especificidad antigénica de un linfocito T" se refiere a un receptor que se encuentra en un linfocito T que tiene especificidad antigénica, es decir, naturalmente tiene una región extracelular que se une específicamente a un antígeno particular con preferencia a otro. Algunos ejemplos de estos receptores con especificidad antigénica de un linfocito T son las cadenas a, p, y o 6 del TCR, el dímero TCRap y el dímero TCR. La expresión "complejo TCR/CD3" se denomina a veces "complejo TCR" CD3 es un complejo proteico compuesto por cuatro cadenas en los mamíferos (CD3y, CD36 y dos cadenas CD3e), que se asocian con moléculas conocidas como receptor de linfocitos T (TCR; véase más arriba) y con la cadena Z y la cadena n (como homo o heterodímeros) para generar una señal de activación en los linfocitos T. Las colas intracelulares de estas moléculas de CD3 contienen un único motivo conservado conocido como "motivo de activación basado en la tirosina del inmunorreceptor" o ITAM para abreviar, que es esencial para la capacidad de señalización del TCR. Las cadenas CD3-y, -6 y -£ y las cadenas Z y n, también conocidas como cadenas CD3-Z y CD3-n, junto con el TCR, forman lo que se conoce como el complejo receptor de linfocitos T.

La expresión "proteína coestimuladora-receptora de linfocitos T" significa un receptor del linfocito T que proporciona una señal coestimuladora. Durante la activación de los linfocitos T, la coestimulación suele ser crucial para la generación de una respuesta inmunitaria eficaz. Los linfocitos T requieren dos señales para activarse completamente. Una primera señal, con especificidad antigénica, se proporciona a través del complejo receptor de linfocitos T/CD3. Una segunda señal, la señal coestimuladora, es inespecífica para el antígeno y la proporcionan las moléculas coestimuladoras expresadas en la membrana de los linfocitos T. Algunos ejemplos de proteínas receptoras coestimuladoras de linfocitos T son CD28, OX40, CD40L, 4-1BB y PD-1.

La presente invención se basa en la concepción de que los linfocitos T reguladores (Treg) que han sido modificados para poseer una especificidad antigénica de tipo anticuerpo, pueden aprovecharse para suprimir la función de los linfocitos T efectores in vivo. La acción de estas células Treg está mediada de una manera no específica de antígeno, principalmente por la liberación de citocinas supresoras en la vecindad donde las Treg son activadas o estimuladas por un antígeno reconocido por su TpCR. Una vez activadas, las Treg pueden suprimir las respuestas de los linfocitos T espectadores. Por tanto, la transferencia de estas células que han sido diseñadas para expresar los CR (como se describe en el presente documento) a un sujeto en el que se desea suprimir una respuesta de linfocitos T efectores y su inflamación concomitante o consecuente, y su administración y activación en, el lugar de dicha actividad inflamatoria, da como resultado los efectos terapéuticos.

Por tanto, las enfermedades o afecciones diana preferidas para la presente invención son enfermedades autoinmunitarias, más preferentemente, enfermedades autoinmunitarias mediadas por linfocitos T específicas de un órgano. Otros ejemplos de capacidad de respuesta inmunitaria no deseada a los que se refiere el presente documento son el rechazo de injertos de tejidos y vísceras macizas, así como de injertos de células en suspensión (por ejemplo, trasplantes de médula ósea (M^o) o de células madre hematopoyéticas (HSV)). Otra enfermedad diana es la enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) que es una consecuencia común de un trasplante de MO o HSV no compatible. Otra afección a la que se refiere la presente invención es el rechazo de trasplantes (por ejemplo, de un riñón no compatible), donde las células efectoras inmunitarias del receptor rechazan el injerto.

Dado que el factor de transcripción Foxp3 (un miembro de la familia de forkhead) parece ser esencial para el desarrollo y la función de las Treg, y es un marcador distintivo de estas células (junto con CD4 y CD25), en el presente documento se describen métodos para producir Treg, así como proporcionar las Treg producidas por esos métodos, que se basan en la inducción de Foxp3 en los linfocitos T en un proceso de direccionamiento de las células a lo largo de la vía hacia el estado de Treg.

También es posible que el ADN que codifica Foxp3 se transduzca o transfecte en los linfocitos T utilizando cualquier vector de expresión adecuado como vehículo de administración en un proceso para impulsar estas células a convertirse en Treg. Este concepto se ve respaldado además por informes que apuntan a que la prevención de la expresión de Foxp3 in vivo da como resultados animales con propensión a desarrollar trastornos autoinmunitarios y linfoproliferativos (Sakaguchi S, et al., J Immunol 1995; 155:1151-64; Hori S et al., Science 2003; 299:1057-61; Khattri R, et al., citado anteriormente; Fontenot JD et al., Nat Immunol. 2003; 4:330-6).

La población de partida puede ser PBL totales, linfocitos T que se han enriquecido o aislado a partir de PBL o linfocitos T CD4+ que se han enriquecido o aislado a partir de dichos linfocitos T (que expresan o no CD25). Estas células pueden redirigirse mediante la transducción del TpCR antes, simultáneamente con, o después de transducir el ADN que codifica el ADN de Foxp3, preferentemente en forma de vector de expresión de Foxp3. Walker MR. et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA. 102:4103-8, demostraron que las células Treg humanas CD4+CD25+ con especificidad antigénica pueden generarse de novo a partir de células CD4+CD25-. La ventaja de esta estrategia frente a la descrita por Walker et al. es que los requisitos de especificidad antigénica y de activación de las Treg son independientes del CMH. Esto hace que el aislamiento y la activación de las Treg con especificidad antigénica sean más sencillos y permite métodos terapéuticos (descritos más adelante) en los que el antígeno puede administrarse convenientemente junto con las células Treg transferidas a un sitio deseado, tal como un foco inflamatorio, ilustrado por el colon en la EI.

Treg naturales en comparación con las inducibles

Las Treg "clásicas" de origen natural proceden del timo, expresan altos niveles de Foxp3 y suprimen la activación de los linfocitos efectores. La activación con especificidad antigénica de los linfocitos T efectores humanos da lugar a la expresión inducible de Foxp3 en un subgrupo de las células efectoras activadas, que a su vez puede desarrollarse en un fenotipo regulador (Treg). Estos linfocitos T reguladores inducidos pueden suprimir (independientemente del contacto celular) las células efectoras recién aisladas (Walker MR., et al., 2005, citado anteriormente; Walker MR., et al., 2003, J Clin Invest. 112:1437-43). En ratones, la inducción in vitro e in vivo de las Treg se consigue mediante la exposición prolongada de las células efectoras a TGF-p (Wan YR, et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA. 102:5126-3 1; Mantini Mc , et al., 2004, J Immunol. 72:5149-53; Mantini et al., 2006, citado anteriormente). Se cree que esta pequeña población generada periféricamente de Treg inducibles desempeña un papel central en la regulación y contención de las respuestas inmunitarias en curso, al igual que la falta de inducción de Treg se asocia con una propensión a la autoinmunidad.

Manipulación genética de los linfocitos T reguladores CD4+CD25+

Las estrategias que redirigen específicamente los linfocitos T reguladores para suprimir la actividad de los linfocitos T patológicos son beneficiosos en las afecciones inflamatorias al facilitar la localización de las Treg en los sitios inflamatorios y su activación específica por antígenos asociados a la inflamación. Cuando se activa específicamente en lesiones inflamatorias, se espera que estas Treg atenúen la enfermedad inflamatoria mediante la supresión de los linfocitos T efectores patógenos de una manera no específica para el antígeno y sin restricción del CMH.

La activación independiente del CMH y la acción de las células Treg es una ventaja importante. Esta acción se contrasta con el informe de Meal DJ et al. (Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:11817-22) de un estudio de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) que describió células Treg CD4+25+ redirigidas contra linfocitos T reactivos con el epítopo 89-101 de la proteína básica de mielina (MBP) mediante un CR que incluía el epítopo de MBP unido a la proteína de CMH de clase II. Al forzar la interacción entre una célula Treg y los linfocitos T autorreactivos dirigidos contra el epítopo 89-101 de la MBP, la actividad de las Treg se centra específicamente en el antígeno contra los linfocitos T autorreactivos. Este modelo requiere cierto grado de dependencia del CMH, ya que un único CR solo puede tener dominios de un único CMH y, por tanto, solo puede utilizarse para pacientes con esa característica de HLA.

En cambio, las células Treg utilizadas en la presente invención actúan para suprimir los linfocitos T efectores patógenos de forma independiente del CMH, lo que las hace más ventajosas para el tratamiento de afecciones autoinmunitarias/inflamatorias porque pueden dirigirse a antígenos diana comunes compartidos entre muchos individuos. En el modelo de Meal et al., citado anteriormente, las Treg actuaron mediante acoplamiento restringido al CMH y al antígeno. Como tales, estas Treg, que expresan el ligando que es reconocido por el TCR de los linfocitos T autorreactivos, son estimuladas por dicha interacción y suprimen las células efectoras. Sin embargo, como estrategia clínica adolece de ala desventaja de que podría requerir una compatibilidad de CMH completa entre donante y receptor en la población humana, en la que la diversidad del CMH (HLA) es sustancial. Además, dicha estrategia estaría limitada a la supresión de clones que sean autorreactivos contra un solo epítopo peptídico autorreactivo reconocible en el contexto de un CMH-II (HLA-DR) definido. Una ventaja significativa adicional de la presente invención es que supera el requisito de que el antígeno patógeno sea conocido. De hecho, los antígenos asociados a la enfermedad en un gran número de trastornos autoinmunitarios humanos, incluida la EI humana, aún no se conocen y pueden ser numerosos.

La estrategia de "T-cuerpo" de la presente invención

La estrategia de "T-cuerpo" fue diseñada por uno de los presentes inventores y sus colaboradores como una nueva modalidad para redirigir y activar específicamente los linfocitos T efectores hacia dianas predefinidas, principales las asociadas a procesos neoplásicos (por ejemplo, Pinthus JHU et al., J Clin Invest 2004; 114:1774-81) y enfermedades infecciosas (Bitton N, et al, Curr Top Microbiol Immunol 2001; 260:271-300). La estrategia de los Tcuerpos pretendía superar la relativa inaccesibilidad de los anticuerpos a ciertos lugares (como los tumores sólidos) y la ineficacia general de los linfocitos que se infiltran en tumores para combatirlos, combinando en una sola población de células efectoras las propiedades de las vertientes humoral y celular del sistema inmunitario (Gross G et al., 1989; citado anteriormente, Eshhar Z, et al., Br J Cancer Suppl, 1990; 10:27-9).

Los receptores quiméricos del T-cuerpo comprenden (1) una región variable de anticuerpo monocatenario (scFv) dirigida contra un antígeno asociado a la enfermedad, unida a (2) un espaciador extracelular opcional y una región transmembrana y (3) una o más moléculas intracitoplasmáticas de moléculas coestimuladoras y estimuladoras/señalizadoras de linfocitos T. Dichos CR, tal y como se desarrollaron inicialmente, permiten el reconocimiento, la localización y la penetración de los tejidos neoplásicos por parte de anticuerpos específicos no restringidos al CMH. Dentro de los tejidos diana, la activación con especificidad antigénica de los linfocitos T efectores portadores de receptores quiméricos permitió la destrucción de las células tumorales mediada por linfocitos T, ya sea por citotoxicidad directa o por inducción de una respuesta inflamatoria local.

Mientras que el dominio scFv es la unidad de reconocimiento de acuerdo con la presente invención, en otras realizaciones (no de acuerdo con la invención), puede sustituirse por otra estructura que sirva como ligando de direccionamiento (o compañero de unión de ligando) que facilite llevar las células Treg que expresan el CR a un sitio seleccionado o a un antígeno seleccionado. Capon y sus colaboradores han divulgado varias CR de este tipo, tal como uno en el que un polipéptido asociado a la unión del ligando se fusiona en su extremo C-terminal con el extremo N-terminal de una región constante de inmunoglobulina. Véanse, por ejemplo, Roberts MR. et al., Blood 1994; 84:2878-89; Ashkenazi A et al., Int Rev Immunol. 1993;10:219-27; Chamow SM et al, Int J Cancer Suppl.

1992; 7:69-72. Véanse también las patentes de los Estados Unidos 6.710.169; 6.407.221; 6.406.697; 6.319.494; 6.117.655; 6.103.521; 6.077.947; 5.741.899; 5.714.147; 5.514.582; 5.455.165; 5.428.130; 5.359.046; 5.336.603; 5.225.538; y 5.116.964.

Los CR de los linfocitos T comprenden un primer dominio de unión, que es un fragmento scFv extracelular derivado de un anticuerpo monoclonal (AcM) específico para un antígeno seleccionado. El dominio anterior se fusiona con un dominio espaciador opcional (preferentemente un dominio bisagra de la familia Ig que proporciona espaciamiento y flexibilidad), un dominio transmembrana, una región coestimuladora, por ejemplo, partes de una molécula de CD28, y otro resto de señalización intracelular para los linfocitos T. Entre los ejemplos de estos últimos se incluye una cadena asociada al complejo TCR/CD3 o una cadena n, o una región citoplasmática que contiene ITAM, tal como la cadena y de un receptor de Fc de Ig (FcRy). Un ITAM es un "motivo de activación basado en la tirosina del inmunorreceptor"; para consultar revisiones, véanse Humphrey MB et al., Immunol Rev. 2005 Dec; 208:50-65; Pitcher LA et al., Trends Immunol. 2003; 24:554-60; Isakov N, Receptors Channels. 1998; 5:243-53; Daeron M, Annu Rev Immunol. 1997; 15:203-34; Isakov N, J Leukoc Biol. 1997, 61:6-16; Cambier JC, J Immunol. 1995; 155:3281-5; Flaswinkel H et al., Semin Immunol. 1995; 7:21-7. También es posible utilizar las porciones intracelulares de las moléculas de los receptores TCR a, p, ^yo 8 en el CR para este fin. El resto de señalización de un receptor de citocina también puede estar presente en la cadena de receptores quiméricos para su uso en la presente invención. Por ejemplo, la adición de la porción de señalización del receptor de IL-2 hará que la célula Treg siga actuando como si hubiera sido expuesta a IL-2 externa tras la unión del dominio de orientación extracelular al antígeno diana o ligando seleccionado. Además, la adición del resto de señalización del receptor de TGFp inducirá a un linfocito T efector a convertirse en una célula Treg y, por tanto, esto también puede ser una adición útil a la cadena de receptores quiméricos de la presente invención. Se sabe que estos CR expresados en los linfocitos T son funcionales y, tras la exposición al antígeno, promueven la producción de citocinas (y, cuando se expresan en el tipo de células efectoras apropiadas de la técnica anterior, promovieron la lisis de las células diana portadoras de antígenos (Stancovski I, et al., J Immunol 1993; 151:6577-82)).

Una primera configuración de un CR basado en scFv comprendía un dominio de reconocimiento extracelular y un resto de señalización intracelular. La activación completa de estos T-cuerpos a través del CR requería la estimulación previa del T-cuerpo o la activación de una vía coestimuladora mediante la exposición a células presentadoras de antígenos (APC) CD08/CD86 (B7).

La creación de un receptor quimérico tripartito (TpCR) por uno de los presentes inventores y por otros (Pule MA, et al., Mol Ther. 2005; 12:933-41)), en la que el dominio de señalización de la molécula coestimuladora CD28 se añadió al dominio citoplasmático del CR, permitió la activación mediada por el antígeno de las vías de señalización estimuladora y coestimuladora, independientemente de las interacciones B7-CD28 (Eshhar et al., 2001, citado anteriormente). Esta estrategia facilita la activación completa de los linfocitos que expresan scFv, lo que se traduce en una mejora de los efectos (en el caso de los linfocitos T efectores, mejora antitumoral; Pinthus JHU et al., citado anteriormente).

Otro dominio de señalización intracelular útil para la presente invención es la totalidad o parte del dominio citoplasmático de una fosfotirosina cinasa (por ejemplo, una molécula de la familia Syk) que se fusiona con el CR. Véanse, por ejemplo, Eshhar Z y Fitzer-Attas CJ, Adv Drug Deliv Rev. 1998; 31:171-82; Fitzer-Attas CJ et al., J Immunol. 1998; 160:145-54; y Eshhar Z et al., Springer Semin Immunopathol. 1996; 18(2): 199-209. El uso de dicho resto de señalización evita los eventos de señalización proximal de la membrana que suelen ser defectuosos en los linfocitos T de sujetos con inflamación aguda o crónica o cáncer.

Dominios/regiones coestimuladores y señales en el receptor quimérico tripartito

La expresión de CR mediada por retrovirus en los linfocitos T requiere, en general, la activación de los linfocitos T, activación que suele conseguirse mediante el uso combinado de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Dicha preactivación fue suficiente para preparar a los linfocitos T para responder a una señal mediada por el CR al interactuar con el antígeno para el que el CR es específico, tanto in vitro como in vivo (por ejemplo, Schwartz RH; Annu Rev Immunol 2003; 21:305-34). Una señal coestimuladora es ventajosa para una función óptima y sostenida de los linfocitos T y para la reactivación impulsada por el antígeno, incluso por dianas que a menudo carecen de ligandos para las moléculas coestimuladoras.

La estimulación con antígenos por sí sola de los CR que carecen de una estructura o un mecanismo de señalización coestimuladora suele ser inadecuada para activar los linfocitos en reposo o vírgenes (Brocker T et al., J Exp Med 1995;181:1653-9). Por tanto, en ausencia de señalización coestimuladora por parte de CD28, los linfocitos T en reposo suelen sufrir anergia o apoptosis (Boussiotis VA et al., Immunol Rev 1996;153:5-26). Para más información sobre CD28 y sus interacciones con B7, véase también, L. Chen (ed.) The B7-CD28 Family Molecules, Landes Bioscience, 2003.

Para superar estas limitaciones en los CR utilizados en la presente invención, el primer dominio (de reconocimiento), un dominio scFv, se une a través de un espaciador de bisagra de Ig y segmentos transmembrana al segmento intracelular de una molécula de señalización coestimuladora, preferentemente CD28, y luego a una región de activación intracelular, tal como de la cadena CD3 Z o de la cadena FcR ^y. Se comprobó que la coexpresión de dos CR, cada uno con el mismo scFv, el primero unido a CD3 Z y el segundo a CD28, proporcionaba las señales estimuladoras y coestimuladoras necesarias para la activación de los linfocitos T (Beecham EJ et al, J Immunother 2000; 23:631-42).

Por tanto, en una realización preferida del presente documento, un sitio de reconocimiento basado en el anticuerpo scFv se une a un dominio intracelular CD28 "en serie" y se une además a la región de señalización intracelular de la cadena Z del complejo TCR. Dicha construcción fue 20 veces más potente en la estimulación de la producción de IL-2 tras la exposición al antígeno en fase sólida (en comparación con los transfectantes que expresan CR que carecen del dominio CD28 (Finney HM et al., J Immunol 1998; 161:2791-7)). Intracelularmente, este dominio en el CR se une a la subunidad p85 de la fosfatidilinositol 3'-cinasa.

Uno de los presentes inventores diseñó un novedoso CR tripartito compuesto por un resto de reconocimiento de scFv fusionado a la parte sin unión al ligando del dominio extracelular (ECD) de CD28, los dominios transmembrana e intracelular completos de CD28, y el dominio estimulador intracelular de FcRy ("scFv-CD28-Y") (Eshhar et al., 2001, citado anteriormente). Las PBL humanas transducidas con una construcción de ácido nucleico que codifica este CR fueron estimuladas específicamente para producir IL-2. La activación dependía de la actividad coestimuladora de CD28.

El laboratorio de los actuales inventores ha generado varias líneas de ratones Tg que expresan CR bajo el control de secuencias reguladoras específicas de linfocitos T. Los linfocitos T de ratones no tratados previamente no cebados que son Tg para el TpCR scFv-CD28-Y manifestaron respuestas potentes (proliferación, secreción de IL-2 y rescate de la apoptosis) al ser estimulados únicamente por el antígeno afín en forma inmovilizada (Friedmann-Morvinski D et al., citado anteriormente).

De acuerdo con la presente invención, se aprovechan moléculas distintas o adicionales a CD28 para proporcionar señales coestimuladoras cuando se incluyen en la presente configuración de CR. Algunos ejemplos preferidos de éstos son los miembros de la familia de los "coestimuladores inducibles" (ICOS), entre los que se incluyen OX40 (CD 134), ligando de CD40 (CD40L, CD 154), PD-1 ("receptor de muerte programada-1") y 4-1Bb (CD137). Cada uno de estos pares de ligando/receptor posee funciones distintas que difieren según la naturaleza del estímulo y la "historia antigénica" de los linfocitos T en los que se expresan. Por ejemplo, la señalización de CD28 va acompañada de la inducción de ICOS, que, a su vez, coestimula la activación de los linfocitos T CD4+. El acoplamiento de OX40 (estudiado en el contexto de la inmunoterapia adoptiva específica para el tumor) mejoró la supervivencia y las acciones antimetastásicas de los linfocitos T efectores mediante un mecanismo dependiente de los linfocitos T colaboradores CD4+ (Weinberg AD, Trends Immunol 2002; 23:102-9). La activación de OX40 promueve la expresión de las proteínas antiapoptóticas Bcl-XL y Bcl-2 y, por consiguiente, aumenta la supervivencia y, por tanto, el número de linfocitos T CD4+ con especificidad antigénica, lo que da lugar a una fuerte memoria de los linfocitos T CD4+ con especificidad antigénica. El acoplamiento del receptor coestimulador 4-1BB (CD137) con su ligando, 4-1BBL, aumentó la proliferación inducida por el TCR, la supervivencia y la producción de citocinas en los linfocitos T CD4+ y CD8+ (Cheuk AT et al., Cancer Gene Ther 2004; 11:215-26). La supervivencia de las células se asoció con una mayor expresión de los genes antiapoptóticos bcl-XL y bfl-l. En general, el par ligando/receptor interactivo 4-1 BB/4-1 BBL actúa para amplificar las señales coestimuladoras existentes, en particular las que emanan de CD28 (Guinn BA et al., J Immunol 1999; 162:5003-10). Los linfocitos T CD4+ humanos expresan PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, tras su activación. Los anticuerpos contra el receptor pueden ser agonistas o antagonistas de la vía apoptótica. La participación de PD-1 puede promover la coestimulación mediada por ICOS o CD28. (por ejemplo, Bennett F et al., J Immunol. 2003; 170:711-8.

La actividad de los dominios coestimuladores de CD28, ICOS, OX40 (CD134), y 4-1BB (CD137) en los CR se conoce también en los linfocitos T CD4+ y CD8+ humanos (Finney HM et al, J Immunol 2004; 172:104-13). En dicho estudio, los genes tripartitos se electroporaron en las células para evitar la preactivación de las mismas. Cuando los linfocitos T portadores de CR fueron estimulados por su antígeno específico (CD33), la liberación de citocinas y la actividad citotóxica aumentaron drásticamente en comparación con las células en las que los CR carecían de estructuras de señalización coestimuladoras. La inclusión del dominio de señalización 4-1BB como resto coestimulador en un TpCR de linfocitos T humanos con especificidad contra el antígeno CD 19 (anti-CD 19-1BB-Z) condujo a una potente citotoxicidad contra las células diana de la leucemia linfoblástica aguda portadoras de CD19 in vitro (Imai C, et al., 2004; 18:676-84).

Mientras que la presente invención incluye el uso de un dominio intracelular o parte de cualquiera de estas secuencias coestimuladoras en el CR, no es seguro que la señalización evocada por estas moléculas tenga ventajas prácticas sobre el uso de las secuencias coestimuladoras de CD28 por sí solas. Por tanto, aunque el rendimiento de CD28 parece ser hasta ahora bastante satisfactorio tanto in vitro como in vivo, la presente invención incluye dentro de su alcance el uso de sistemas coestimuladores adicionales o alternativos al CD28 para generar células Treg que actúen de forma óptima en la supresión de los linfocitos T efectores y en el tratamiento de afecciones autoinmunitarias/inflamatorias y otras afecciones como las descritas en el presente documento. 4-1BB se ha utilizado con éxito como alternativa a CD28 en los T-cuerpos. Véase Zhang et al., J. Immunol., 2007; 179:4910-4918. Transferencia de Treg redirigidas a sujetos receptores

El uso de linfocitos T transferidos in vivo en la terapia adoptiva requiere que las células transferidas sobrevivan, superen los mecanismos de control homeostático del hospedador que pueden servir para dificultar la aceptación de estas células, y migren a (se dirijan o transiten a) y se acumulen o localicen en, el lugar o los lugares de destino deseados.

El sistema inmunitario utiliza estímulos internos para regular el tamaño total de los grupos de linfocitos. El número total de linfocitos T periféricos permanece bastante constante, a pesar de la producción de nuevas células, la renovación de las células existentes y la expansión clonal de las células con especificidad antigénica durante una respuesta inmunitaria (Jameson SC. Nat Rev Immunol 2002; 2:547-56). Estos "estímulos internos" incluyen citocinas y ligandos de péptidos propios del CMH para el TCR. Se cree que al menos dos mecanismos generales son responsables de los efectos homeostáticos de los linfocitos T espectadores en la limitación de la proliferación: (1) inhibición por interacciones físicas entre linfocitos T; y/o (2) la competencia por los "recursos" limitados (por ejemplo, la IL-7 y el acceso a las APC con ligandos adecuados del CMH propio). Las citocinas más destacadas en este proceso son las que señalan a través de receptores que contienen una cadena ^ycomún, denominadas colectivamente "citocinas yC". Estas incluyen IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. El control homeostático de la expansión de los linfocitos T vírgenes (examinado in vitro) está respaldado por IL-4, IL-7, IL 15 e IL21 a través de la región transmembrana de CD28, mientras que solo IL-7 parece ser necesaria in vivo (Jameson, citado anteriormente).

La linfocitorreducción o "linfosupresión" se realiza preferentemente para acondicionar a un receptor de las Treg transducidas de la presente invención. Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, irradiación, tratamiento con ciertos antimetabolitos como fludarabina, etc. Estos tratamientos se han utilizado junto con la terapia adoptiva de linfocitos T en otros contextos. Se sabe que la linfocitorreducción in vivo realizada como precursora de la transferencia celular adoptiva potencia la actividad inmunoterapéutica antitumoral en ratones y en seres humanos (como se ha estudiado especialmente con linfocitos T efectores autólogos y reactivos con el tumor); Klebanoff CA et al., Trends Immunol 2005; 26:111-7). En ensayos clínicos, se observaron tasas de respuesta objetiva del 50 % en pacientes con tumores sólidos metastásicos que habían sido sometidos primero a linfocitorreducción. Los mecanismos que se cree que subyacen a estos efectos incluyen: la eliminación de los "sumideros" de citocinas celulares para las citocinas yC homeostásicas (tales como IL-7, IL-15 y posiblemente IL-21 (que sirven para activar y expandir los linfocitos T efectores)), la inducción de la apoptosis y la necrosis de las células tumorales junto con la activación de las APC, y, más importante para la presente invención, el deterioro de las células Treg CD4+CD25+ que suprimen los linfocitos T efectores.

Como se ha indicado, el tratamiento con citocinas homeostáticas puede utilizarse para mantener las poblaciones Treg en el receptor.

El grupo de los actuales inventores descubrió que la activación de los linfocitos T en general y de los T-cuerpos en particular (como la requerida durante las manipulaciones ex vivo para expresar el CR con ciertos vectores) regulaba a la baja la expresión del receptor de quimiocinas CXCR4, lo que impide que los linfocitos T se dirijan a su lugar de origen en respuesta a la quimiocina SDF-1, por ejemplo. SDF-1 es un quimioatrayente para los linfocitos T que expresan CXCR4 (Bleul CC et al., JExp Med 1996; 184:1101-9; Beider K et al., Blood 2003; 102:1951-8). Utilizando T-cuerpos humanos específicos para ErbB2; estos investigadores demostraron que este asentamiento es un paso esencial para que los linfocitos T efectores actúen in vivo, medido como la inhibición de la progresión del cáncer de próstata avanzado e incluso la curación (Pinthus et al., citado anteriormente). Basándose en los conocimientos anteriores, de acuerdo con la presente invención, las células Treg redirigidas deben dirigirse/migrar a los lugares de destino deseados o administrarse en dichos lugares.

Persistencia de las respuestas de los linfocitos T portadores de TpCR

Un factor clave para el éxito de la terapia con linfocitos T transferidos adoptivamente (que hasta ahora se ha examinado más a fondo con los linfocitos T efectores en el cáncer) es el mantenimiento de la función de los linfocitos T transducidos (efectores). Es deseable mantener la función de las Treg que han sido administradas para realizar una función supresora. Es posible que se prefiera que las Treg actúen en "ráfagas" más cortas para reducir una respuesta T efectora más aguda (en lugar de crónica).

Dado que los linfocitos encontrados en pacientes con tumores incluyen células Treg CD4+ CD25+ que suprimen los linfocitos T efectores (Wang HY et al., Immunity 2004; 20:107-18; Curiel TJ, et al., Nat Med 2004; 10:942-9), dicha actividad supresora "endógena" debe ser superada para optimizar la acción de los linfocitos T efectores redirigidos. En la presente invención, el objetivo es el contrario: las células Treg redirigidas se administran a un sujeto que las necesita para sofocar o inhibir de otro modo las respuestas inmunitarias/inflamatorias que caracterizan a las enfermedades autoinmunitarias, el rechazo de trasplantes, etc.

Ejemplos de ensayos clínicos con linfocitos T redirigidos

Aunque todavía no se han llevado a cabo ensayos clínicos con Treg tal y como se describe en este documento, a continuación se describen varios ensayos en los que se utilizan linfocitos T efectores redirigidos portadores de CR. En un ensayo de fase I en sujetos infectados por el VIH, se administraron linfocitos autólogos con un CR de CD4-Z (Mitsuyasu RT, et al., 2000, Blood 96:785-93). De 24 pacientes, 11 también recibieron infusiones simultáneas de IL-2 durante 5 días. El tratamiento se toleró bien. En algunos pacientes, se observó una disminución transitoria de la carga viral en el plasma y la mucosa rectal (el tejido reservorio del VIH). Todos los sujetos dieron negativo en la detección de retrovirus competentes para la replicación (el vector de administración) hasta 1 año después de la infusión.

Cell Genesys, Inc. llevó a cabo ensayos clínicos de fase I en pacientes con cáncer colorrectal utilizando un CR anti-TAG72-Z fabricado a partir del AcM humanizado CC49 (Warren R et al., En: 7.a Conferencia Internacional sobre Terapia Génica del Cáncer; 1998).

El grupo de Junghans probó 24 dosis de linfocitos portadores de CR cuya especificidad antigénica se dirigía al CEA en pacientes con afecciones colorrectales. Se administraron hasta 1011 células/paciente. El tratamiento se toleró adecuadamente (Junghans R et al., Proc Am Assoc Can Res, 2000, 41:543).

Hwu y sus colaboradores del Instituto Nacional del Cáncer llevaron a cabo un ensayo clínico de fase I en pacientes con cáncer de ovario utilizando T-cuerpos que expresaban un CR dirigido contra la proteína de unión antifolato MoV18-murino. Se infundieron grandes dosis de las células modificadas en los pacientes junto con la administración controlada de IL-2. No se han notificado efectos secundarios adversos. En los sueros de varios pacientes se encontraron anticuerpos neutralizantes específicos para los determinantes de AcM de MoV18 murino (Kershaw MH et al, Clin Canc Res, 2006; 12:6106-15.

En un ensayo clínico de fase I sobre el cáncer de células renales (CCR) se emplearon linfocitos T autólogos específicos para G250 modificados genéticamente (Lamers CHJ et al., Daniel den Hoed Cancer News, 2004, 2:8-10). Las infusiones de estas células fueron clínicamente bien toleradas. Después de 4-5 infusiones, los pacientes comenzaron a desarrollar anomalías en las enzimas hepáticas, un hallazgo que se explica por la reactividad de los linfocitos T infundidos con el G250L expresado en el epitelio del conducto biliar, aunque en niveles bajos. Por lo tanto, el tratamiento se limitó a dosis bajas de T-cuerpos que expresan CR. Los resultados mostraron, en cualquier caso, que los linfocitos T redirigidos ejercían funciones dictadas por el CR in vivo.

Se han iniciado otros dos ensayos clínicos de fase I, aunque hasta donde saben los presentes inventores, sus resultados aún no se han comunicado. Un ensayo de fase I trató a pacientes de neuroblastoma con PBL y CTL específicos para el virus de Epstein Barr, ambos expresan receptores quiméricos de linfocitos T específicos para ^gD-2 (Brenner MK. URL de la World Wide Web: clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00085930, 2005). El otro ensayo emplea CTL CD8+ específicos para CD20 genéticamente modificados para el linfoma folicular recidivante (Wang J, et al., Mol Ther 2004; 9: 577-86.

Los presentes inventores reconocen que ciertos eventos pueden interferir con la eficacia de la terapia que utiliza células Treg que expresan CR in vivo en seres humanos, por ejemplo:

(1) la formación de anticuerpos antiidiotípicos neutralizantes dirigidos a un idiotipo de la parte scFv del CR que podría reducir la vida útil o la eficacia de las Treg;

(2) la escasa proporción de células manipuladas que acabaron llegando a los lugares de destino y;

(3) el daño potencial al tejido sano que expresa el antígeno diana.

El uso de Treg como se describe en el presente documento tiene un riesgo mucho menor de (3). Como se describe en el presente documento, la administración directa de Treg a los sitios de inflamación debería superar la limitación de (1)-(3). Se espera que el ajuste de las pautas posológicas (número de células, frecuencia de administración) empleando consideraciones clínicas habituales limite el impacto de los factores limitantes anteriores.

Se administra una cantidad eficaz de células Treg redirigidas a un sujeto. Los vehículos preferidos para las células Treg son tampón fosfato, preferentemente 0,01-0,1 M, más preferentemente 0,05 M o solución salina al 0,8 %. Los diluyentes o vehículos aceptables para diversas vías de administración son bien conocidos.

Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de un tipo celular dado para una enfermedad o afección particular se encuentra dentro de las capacidades de la técnica. La dosis administrada dependerá de la edad, el estado de salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento simultáneo, en caso de haberlo, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. La determinación de las cantidades eficaces puede hacerse fácilmente de forma empírica por aquellos con conocimientos habituales en la materia sin necesidad de experimentación excesiva.

Las dosis típicas se encuentren entre aproximadamente 106 y aproximadamente 1011 células Treg por inyección o infusión, más preferentemente, de aproximadamente 107 a aproximadamente 1010 células. Si se va a administrar un antígeno con las células (o por separado, pero en un lugar donde se pretende activar las células), se prefiere una dosis de aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal y preferentemente, de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg de peso corporal.

Una cantidad eficaz de células Treg es la necesaria para inducir un cambio medible, generalmente una disminución, en la gravedad de cualquier síntoma medible de la enfermedad, preferentemente más de un síntoma, y más preferentemente, se traduciría en el cese de los síntomas y la curación de la enfermedad o afección. Por ejemplo, sin limitar la invención, la disminución anterior puede ser de al menos aproximadamente un 10%, más preferentemente de al menos aproximadamente un 20 %, más preferentemente de al menos aproximadamente un 30 %, aún más preferentemente, de al menos aproximadamente un 40 % y más preferentemente, al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %. Se encuentra dentro de las capacidades de la técnica clínica la determinación de cuándo se han logrado dichos objetivos terapéuticos y el ajuste de la dosis o la frecuencia de la administración en consecuencia o el cese de un tratamiento adicional.

La composición farmacéutica de la invención puede administrarse una vez o en múltiples ocasiones, a través de una o varias rutas. La composición puede administrarse diariamente, o preferentemente en días alternos, preferentemente semanal o quincenalmente. La administración puede abarcar un intervalo de varios días a semanas, o incluso meses o años. La frecuencia y la duración de la administración pueden determinarse empíricamente o basarse en la historia clínica y la experiencia del sujeto.

La composición de la presente invención puede administrarse por cualquiera de los medios y vías conocidos en la técnica. La administración es preferentemente parenteral. Las rutas preferidas incluyen, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraarticular, intracerebroventricular, intraluminal (preferentemente en la luz del íleon o del colon), rectal o tópica. También se incluye la vía "intratecal", que pretende abarcar la inyección, infusión o instilación directamente en una cavidad o espacio (teca) que rodea un órgano o región del cuerpo en la que se está produciendo una respuesta inmunitaria/inflamatoria no deseada. Estos espacios incluyen el espacio pleural, peritoneo, el espacio subaracnoideo o dural o el espacio pericárdico. El término genérico para la administración en una vaina que encierra un órgano se denomina "intratecal" (véase, por ejemplo, la definición en Dorland's Medical Dictionary 29.a Edición, WB Saunders (2000) y Stedman's Medical Dictionary, 27.a Edición, Lippincott, Williams & Wilkins (2000)) como "dentro de una vaina" Como se usa en el presente documento, este término pretende ser más amplio que una definición más utilizada que se limita a los espacios intracraneales.

La composición de la presente invención puede aplicarse a usos humanos y veterinarios. El sujeto preferido es un ser humano.

Ratones transgénicos que expresan receptores quiméricos específicos para TNP

En el presente documento se describen varias estirpes de ratones Tg que expresan el TpCR específico para TNP, que fueron producidas recientemente por los presentes inventores y sus colaboradores (Friedmann-Morvinski D, 2005). Estos ratones son la fuente de linfocitos T efectores y T reguladores específicos para TNP y se utilizan como animales de experimentación en los que se evalúa la inducción de colitis mediante el hapteno reactivo "clásico", TNBS. Como control de estas células portadoras de CR, se utilizan células de ratones TpCR Tg específico para erbB-2 que se produjeron en el laboratorio de los presentes inventores, ya que expresan un CR específico para un antígeno irrelevante.

Todos los linfocitos T maduros y las células NK de estos ratones Tg expresan la construcción scFv-CD28-FcRY. Los linfocitos T Tg vírgenes pueden activarse por completo mediante TNP inmovilizado en plástico sin necesidad de presensibilización. (Friedmann-Morvinski D, et al., citado anteriormente). Los resultados de los ejemplos expuestos en el presente documento muestran que las Treg CD4+CD25+ esplénicas aisladas de dichos ratones suprimen específicamente la proliferación y la secreción de citocinas por parte de los linfocitos T efectores específicos para TNP. Además, estas Treg son responsables del retraso en el desarrollo y la atenuación de la colitis inducida por TNBS en estos animales. Es importante el hecho de que el nivel de Treg en la periferia de las cepas que expresan el TpCR específico para TNP es mayor que en los ratones de tipo silvestre (TS) y que los Treg no requieren una activación previa para mostrar su actividad supresora in vivo. Se cree que esto se debe a la reactividad cruzada del AcM SP6, del que se derivó el scFv del TpCR.

Administración del ADN que codifica el CR a linfocitos T

La modificación genética de los linfocitos T periféricos humanos se consigue en una realización utilizando vectores retrovirales (Eshhar Z, et al., 2001, citado anteriormente). Como vector, se utiliza el vector pBullet, en el que se introduce el ADNc que codifica el CR (Weijtens ME, et al., 1998). Se utiliza una construcción de expresión bicistrónica en la que el ADNc de TpCR y eGFP se expresan bajo el control de LTR. Esto sirve para generar una célula de empaquetamiento basada en pG13 que se está utilizando para pseudotipar el vector retroviral con el virus de la leucemia del mono gibón (GALV). La clasificación por citometría de flujo se realiza sobre la base de la expresión de eGFP, y se seleccionan las células de empaquetamiento que producen viriones de alto título para lograr una alta eficacia de transducción.

Para transducir linfocitos humanos de donantes sanos, los linfocitos se activan en cultivo con AcM anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la placa (o utilizando microesferas comerciales recubiertas con estos anticuerpos; por ejemplo, de Invitrogen, Miltenyi Biotec, Inc.) y se transfieren a placas recubiertas de Retronectin™ (fragmento de fibronectina CH-296) junto con sobrenadantes frescos tomados de las células empaquetadoras. Al final del proceso que tarda entre 5 y 8 días, las células se propagan en presencia de IL-2 y después se recolectan y usan. Siguiendo este procedimiento ex vivo, un 45-70 % de las células son positivas para la expresión de CR (y GFP).

Los reactivos adicionales útiles son anticuerpos antiidiotípicos contra los idiotipos del scFv del TpCR. Estos permiten el etiquetado directo y la visualización del TpCR en las membranas celulares. Los presentes inventores han fabricado y utilizado dichos anticuerpos contra el scFv de SP6 (ilustrado a continuación).

En la figura 27 se muestra una secuencia de nucleótidos anotada (SEQ ID NO: 1) y una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) del TpCR específico para TNP utilizado en el presente documento. La proteína madura comienza en el resto de aminoácido 23 de la SEQ ID NO: 2.

Una secuencia preferida que excluye el scFv anterior, y que puede unirse a cualquier otra región de unión al ligando apropiada, preferentemente un scFv diferente específico para otro antígeno, es la definida por las secuencias anteriores a partir de la región de CD28. Por tanto, una secuencia nucleotídica codificante preferida es los nucleótidos 2203 - 2523 de la SEQ ID NO: 1 y los aminoácidos 260-367 de la SEQ ID NO: 2. En una secuencia preferida también pueden incluirse nucleótidos adicionales que comprenden un sitio de restricción 5' y los aminoácidos "inadvertidamente" codificados por el mismo. Puede haber una secuencia de codificación adicional añadida en el extremo 3' de 2203-2523 de la SEQ ID NO: 1 o aminoácidos adicionales codificados por la misma y añadidos en el C-terminal de 260-367 de la SEQ ID NO: 2, siempre que permitan que la secuencia codificada, tal y como se expresa en las Treg redirigidas, funcione como un TpCR en las formas descritas en el presente documento. Los expertos en la materia de la clonación y la tecnología de ADN recombinante entenderán cómo modificar estas secuencias para lograr el objetivo deseado sin necesidad de experimentación indebida.

Los vectores de expresión que comprenden las secuencias anteriores también se utilizan en la presente invención, en la producción de Treg redirigidas que expresan TpCR.

Generación y expresión del gen de fusión TpCR y Foxp3-GFP y su expresión

Los linfocitos T redirigidos se "convierten" en Treg haciendo que expresen tanto el factor de transcripción Foxp3 como el TpCR con especificidad antigénica. Esta manipulación permite la producción de un gran número de Treg para su evaluación y uso terapéutico. El éxito de la cotransducción o la coexpresión se comprueba incluyendo un gen de fusión Foxp3-GFP en la misma construcción que un TpCR para expresar ambos en las mismas células. Esta estrategia es particularmente útil cuando las poblaciones celulares de partida son PBL humanas en las que las Treg constituyen solo alrededor del 3-5 % de los linfocitos T CD4+. Esto evita las complicaciones de otra estrategia, también dentro del ámbito de la invención, en la que se requiere la propagación de Treg a gran escala para la transducción eficaz con vectores retrovirales. Además, simplificará el aislamiento de las Treg y la evaluación de su destino in vivo.

En un ejemplo, se clona ARN mensajero (ARNm) de Foxp3 a partir de Treg purificadas mediante la PCR. El ADNc de Foxp3 se clona en un plásmido de Clontech de eGFP para crear una proteína de fusión Foxp3-GFP. La proteína de fusión se clona en el vector pBullet que contiene TpCR insertado tras un IRES para crear un vector de expresión bicistrónico. Tanto un vector retroviral de un solo gen Foxp3-GFP como un vector retroviral de doble gen TpCR-IRES-Foxp3-GFP bicistrónico se transducen en linfocitos T de sangre periférica humana CD4+CD25 aislados tras su activación con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Las células resultantes se analizan para determinar la expresión de los tres genes mediante FACS utilizando (1) anticuerpos antiidiotípicos específicos para el idiotipo scFv, o anticuerpos contra la región bisagra y (2) GFP y Foxp3 intracelulares mediante la tinción de las células fijadas con anticuerpos primarios específicos para Foxp3 (Alexis Biochemicals, Lausana, Suiza).

En otra realización, se utilizan protocolos de expresión secuencial (primero TpCR y luego genes Foxp3-GFP) o protocolos de coexpresión. Una vez que los genes se expresan, se puede obtener un número relativamente grande de Treg y separarlos utilizando un clasificador celular (clasificación celular activada por fluorescencia FACSaria (Becton Dickinson, Mountain View, CA), clasificando las células que coexpresan GFP y TpCR.

La construcción de Foxp3 puede tener la forma de un vector bicistrónico que incluye ADN que codifica una molécula indicadora, tal como una proteína fluorescente. Las moléculas indicadoras adecuadas son bien conocidas en la técnica e incluyen proteínas fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicas, por ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP) o la proteína amarilla fluorescente mejorada (EYFP) o un homólogo fluorescente de las mismas, la proteína luciferasa de luciérnaga (codificada por el gen Luc), las enzimas cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), o LacZ bacteriana, (p-galactosidasa) o el gen de la timidina cinasa (codificado por el gen TK del HSV1. La GFP y la EYFP se detectan mediante fluorimetría o histoquímica de fluorescencia; las enzimas se detectan mediante el uso de un sustrato cromogénico que se convierte en un producto coloreado que puede utilizarse en la detección colorimétrica histoquímica de la actividad enzimática. La luciferasa se mide mediante la activación de la luciferina que emite luz a una longitud de onda conocida. Las moléculas informadoras pueden detectarse in vivo mediante técnicas de detección no invasivas, como la formación de imágenes ópticas de fluorescencia (FOI), formación de imágenes ópticas de bioluminiscencia (BOI), formación de imágenes ópticas de la cámara de dispositivos acoplados cargados (CCD) refrigerados (CCOI) y la tomografía por emisión de positrones (PET).

Se ha demostrado que la infección de linfocitos T CD4+CD25- humanos con vectores retrovirales portadores del gen Foxp3 convierte estas células en otras con fenotipo Treg (Walker et al., 2005, citado anteriormente; Wan et al., 2005, citado anteriormente).

En la presente invención puede utilizarse cualquier método para introducir ADN en una célula y expresarlo, lo que incluye, vectores, tales como vectores retrovirales o lentivirales, electroporación, lipofección y similares.

La funcionalidad de las Treg redirigidas puede determinarse mediante ensayos de co-cultivo como se describe en los ejemplos. Si se van a utilizar APC en dichas pruebas, una fuente preferida son los monocitos irradiados. El antígeno se carga en APC humanas irradiadas que lo presentarán a los linfocitos T efectores y a las Treg. En el caso de antígenos como el CEA, pueden utilizarse células de carcinoma de colon humano transfectadas de forma estable con el epítopo CEA. En estas pruebas de cocultivo, se puede detectar la activación específica de las Treg portadoras de TpCR a través del TpCR. La activación de las Treg se evalúa examinando la acción de estas células sobre la proliferación de los linfocitos T efectores (1) y el perfil de secreción de citocinas (2), centrándose en la IL2, IL4, IL10, IFN-^yy TGF-p (utilizando kits comerciales de ELISA, por ejemplo, el kit ELISA Ready-Set Go, Ebioscience CA). Se prefiere ensayar TGF-p y/o IL-10 como indicación del fenotipo Treg de las células.

En una realización preferida, la presente invención redirige las Treg a los sitios de inflamación colónica, introduciendo en dichas células CR con especificidad de tipo anticuerpo. En los sitios de inflamación, las Treg redirigidas se activan para suprimir la respuesta inmunitaria asociada a la EI. Las Treg dotadas de una especificidad predefinida migran y se dirigen a los lugares inflamados del colon donde se activan y, como resultado, suprimen a los linfocitos T efectores que medan los procesos patológicos.

Las actuales Treg redirigidas representan los "T-cuerpos" mencionados anteriormente y se emplean como una nueva modalidad terapéutica en la EI. Estos T-cuerpos son linfocitos T que han sido modificados genéticamente para que expresen TpCR, en el que una región variable de anticuerpos es la unidad de reconocimiento vinculada a dominios estimuladores y coestimuladores de linfocitos T que permiten la activación específica de estos linfocitos T, pero de una manera independiente del CMH y no restringida por el CMH. Basándose en estudios anteriores que utilizan modelos tumorales descritos anteriormente, estas Treg redirigidas se prueban en modelos murinos de EI. Un aspecto importante de esta invención es la concepción de los inventores de que, en el contexto del tratamiento de la EI, el antígeno o los antígenos asociados al colon hacia los que se redirigen y dirigen los T-cuerpos no son necesariamente los autoantígenos patógenos reconocidos por los linfocitos T efectores autoagresivos. Por tanto, la presente invención puede aprovechar el fenómeno de la reactividad de los "espectadores", donde la presencia de los antígenos relevantes en los sitios de las reacciones inflamatorias sirven para atraer y "retener" o localizar las Treg redirigidas, permitiendo que se activen y ejerzan sus efectos supresores de forma paracrina, actuando sobre las células efectoras diana en las proximidades, independientemente de las diferencias en la especificidad antigénica de los linfocitos T efectores y de las células Treg.

Antígenos colónicos CEA y LPS como objetivos para las Treg humanas redirigidas en la EI

Se aprovechó un modelo de EI específico para el hapteno que se basa en la especificidad del hapteno TNP para estudiar los efectos supresores de las Treg. En la enfermedad humana, otros antígenos que se expresan en el tejido intestinal o colónico, ya sea normalmente o en el estado de la enfermedad correspondiente, son objetivos preferidos. Entre ellos se encuentran el antígeno carcinoembrionario, CEA, y antígenos de la flora bacteriana, como el lipopolisacárido, LPS.

La EI humana es idiopática en la medida en que se desconocen los antígenos patógenos. El desconocimiento del antígeno parece ser un obstáculo para la aplicación clínica de los T-cuerpos. Aun así, de acuerdo con la presente invención, no es necesario que un antígeno patógeno sea también el antígeno diana para la redirección y activación de las Treg. La activación de las Treg tiene, en efecto, especificidad antigénica y, por lo tanto, depende de los TCR o, en las presentes Treg, de la especificidad de los anticuerpos, asociada a la coestimulación junto con la activación/mediada por las moléculas de señalización intracelular de las presentes construcciones. Sin embargo, una vez que las Treg se activan, su acción supresora es independiente del antígeno y se lleva a cabo mediante la secreción de citocinas supresoras (por ejemplo, TGF-p e IL-10) incluso después de que se haya eliminado el antígeno activador. Por tanto, la inducción de la activación de las Treg colónicas por cualquier antígeno local asociado al colon promoverá una potente activación y proliferación de las Treg, mientras que la acción de estas células en la inhibición de los procesos inflamatorios locales se produce independientemente del antígeno. CEA está significativamente sobreexpresado en el tejido del colon enfermo en pacientes con colitis ulcerosa activa en comparación con los individuos normales y con los pacientes con EI quiescente (Smithson JE et al, J Pathol. 1996; 180:146-51; Pavelic ZP et al., Anticancer Res. 1991; 11:1671-5). Esta mayor expresión tisular de CEA era independiente de los cambios displásicos y es el resultado de la reacción de la mucosa al propio proceso inflamatorio. Por tanto, CEA es un candidato preferido para el direccionamiento de Treg TpCR en la colitis ulcerosa activa.

Un segundo antígeno candidato al que se pueden redirigir las Treg es la endotoxina o LPS, que procede de la membrana externa de las bacterias Gram negativas residentes en el colon. En una realización, la parte similar a un anticuerpo (scFv), la región de reconocimiento extracelular del CR, puede proceder de un anticuerpo anti-LPS, tal como el AcM producido por el hibridoma con el número de referencia ATCC HB9081. La secuencia de nucleótidos de un scFv producido a partir de este AcM se muestra como una anotación en la Figura 29 como parte de la secuencia completa de un plásmido (pBullet) que comprende este scFv - SEQ ID NO: 3. Por tanto, una Treg que exprese un TpCR que muestre este scFv extracelularmente, en un lugar donde haya LPS, como el tejido de colon inflamado (ya sea la luz del intestino, la lámina propia o incluso los ganglios linfáticos regionales y otro tejido linfático asociado al intestino), se unirá al LPS y se activará para provocar la supresión de cualquier linfocito T efector en las proximidades de una manera no específica al antígeno e independiente del MHC.

Se conocen en la técnica varios tipos de receptores de LPS distintos de anticuerpos. CD 14 (SEQ ID NO:4) es una clase de receptor de LPS que es una glicoproteína de 356 aa anclada a GPI. Contiene un péptido señal de 19aa, un dominio extracelular que contiene 11 dominios de repetición ricos en leucina (LRR), 4 sitios de N-glicosilación y un número desconocido de sitios de O-glicosilación. Se han descrito al menos 2 formas solubles de CD 14, una retiene el GPI y se libera de la superficie celular, lo que da lugar a una molécula de aproximadamente 48 kDa y la otra se libera antes de la adición del anclaje a GPI, lo que da lugar a un peso molecular más elevado (>48 kDa).

Mientras que el LPS interactúa con CD 14, CD 14 no es capaz de iniciar una señal de activación transmembrana porque es una proteína anclada al glucosilfosfatidilinositol (GPI). Por tanto, el LPS debe interactuar con uno o varios receptores transmembrana responsables de la transducción de la señal. El LPS es reconocido por los receptores de tipo toll TLR4 y MD-2 (SEQ ID NO: 5; ser humano), una molécula asociada al dominio extracelular de TLR4. CD14 aumenta en gran medida la formación de complejos LPS-TLR4-MD-2, aparentemente por la carga del LPS sobre TLR4-MD-2 pero no en la propia interacción entre LPS y TLR4-MD-2. (Akashi S, et al., J. Exp. Med. 198:1035-42 (2003)).

La interacción de LPS con MD-2 en un complejo TLR4-MD-2 desencadena una cascada de transducción de señales intracelulares que conduce a la producción y liberación de citocinas proinflamatorias, especialmente TNF-a (Dauphinee SM et al., 2006, Lab. Invest. 86, 9-22). Los pacientes con EI muestran un aumento de los niveles de endotoxina en el colon y en el suero, LBP, CD14 y MD-2 (Pastor Rojo O, et al., 2006, Inflamm Bowel Dis., 19 de diciembre (epub); Amati L et al., Curr Pharm Des. 2003; 9:1937-45; Cario E et al., J Immunol. 2006; 176:4258-66). Este cambio se correlaciona con la actividad de la enfermedad, y los niveles de citocinas proinflamatorias vuelven a la normalidad después del tratamiento.

Un motivo de MD-2 humano, por ejemplo, a partir de los aminoácidos 119-132 (14 restos) de SEQ ID NO:_ puede sustituir a MD-2 en la unión del complejo MD-2-TLR4 al resto de lípido A del LPS, que (Mancek M et al., Biochem Biophys Res Comm 2002;292: 880-5; Kobayashi M et al., J Immunol. 2006;176:6211-8).

Por tanto, en un TpCR como se describe en el presente documento, la región de reconocimiento extracelular comprende, en lugar de un scFv de acuerdo con la invención, un receptor que se une a un ligando que no actúa como "antígeno", por ejemplo, LPS. Por tanto, la región de reconocimiento extracelular puede comprender cualquiera de las siguientes estructuras receptoras:

(a) CD14 (SEQ ID NO: 4),

(b) un motivo de unión a LPS de CD 14, tal como los restos 100-119 de SEQ ID NO: 4,

(c) MD-2 de longitud completa (SEQ ID NO: 5),

(d) un motivo de unión a LPS de MD-2 (restos 120-132 de SEQ ID NO: 5),

(e) una combinación de CD 14 y MD-2 o

(f) una combinación de un motivo de CD14 y un motivo de MD-2 (codificado por el segmento correspondiente del ácido nucleico quimérico de la SEQ ID NO: 10).

Cualquiera de estas construcciones, cuando se muestra en una superficie de Treg, permitirá que las Treg redirigidas se unan a las moléculas de LPS y sean activadas por ellas, por ejemplo, en los focos de inflamación del colon y, por lo tanto, ejercen sus actividades supresoras en esa vecindad. De nuevo, este es un ejemplo de unión/reconocimiento de receptor-ligando que no es "similar a un anticuerpo" y, por lo tanto, no está de acuerdo con la invención reivindicada, pero que, sin embargo, permite que el TpCR actúe de acuerdo con la presente invención y active las Treg de una manera no específica de antígeno (e independiente del CMH).

La presente invención incluye una realización en la que las Treg redirigidas que llevan un TpCR están diseñadas para ser específicas para un antígeno, denominado en el presente documento "AgX" que pueden no tener ninguna relación inherente con el tejido al que se dirige o la enfermedad que se trata. En esta realización, las Treg específicas para AgX se activan específicamente en un sitio seleccionado administrándolas junto con AgX en ese sitio. Se trata de un lugar donde los linfocitos T efectores están situados y activos, donde se debe suprimir la inflamación en curso. El receptor de tipo anticuerpo específico de AgX de las Treg reconocerá AgX sin necesidad de presentación de antígeno, CMH, etc. y las moléculas de señalización enlazadas en el TpCR servirán para activar a las Treg para que liberen citocinas inhibidoras en ese sitio. Este proceso conducirá a la supresión inespecífica de la actividad inflamatoria y de los linfocitos T efectores en curso.

Las composiciones descritas en el presente documento son útiles para cualquiera de las enfermedades autoinmunitarias que implican una actividad indeseada de los linfocitos T efectores como causa subyacente o como consecuencia de la fisiopatología. Dichas enfermedades incluyen, pero sin limitación, EI, artritis reumatoide, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, uveorretinitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, insulitis autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, psoriasis, polimiositis autoinmunitaria y similares. Véanse, por ejemplo, Theofilopoulos, A., En: Stites, DP et al., eds., Basic and Clinical Immunology, Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1988)).

Habiéndose descrito en líneas generales la invención, la misma se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo ilustrativo.

EJEMPLO I

Materiales y métodos

Los siguientes materiales y métodos se utilizan en varios de los Ejemplos a continuación, así como en la realización de ciertas realizaciones de la invención.

Fraccionamiento y aislamiento celular

Las Treg CD4+CD25+ se purificaron a partir de linfocitos esplénicos o poblaciones de células mononucleares de sangre periférica utilizando varios métodos. Uno de los métodos utiliza la separación por perlas magnéticas (MACS). Los bazos se trituran suavemente en HB-SS/FCS al 5 % para preparar suspensiones de células individuales.

Los linfocitos T CD4+ se purificaron mediante selección negativa por incubación con perlas CD4 MACS conjugadas con biotina (Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CA). La purificación posterior de las células CD4+CD25+ se realizó mediante la incubación con anticuerpos anti-CD25 conjugados con ficoeritrina (PE) o anti-CD45RBhigh, seguido de la incubación con microesferas anti-PE (Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CA). La separación magnética se realizó utilizando columnas magnéticas según las instrucciones del fabricante. Para la subpoblación de linfocitos T efectores y Treg altamente purificados (>99%), se aplica la clasificación celular de alta velocidad, utilizando el sistema de clasificación celular BD FACSaria (®) (BD Bioscience)

Los linfocitos de la lámina propia del colon se aislaron como se describió anteriormente (Han X et al, Gastroenterology. 2005; 129:185-203). Brevemente, se diseccionó la mucosa colónica, seguido de una incubación con una solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) libre de Ca2+ -Mg2+ que contiene ditiotreitol 1 mM (Sigma-Aldrich, Louis, Mo) durante 30 minutos para eliminar la mucosidad, y luego se incubaron dos veces en serie en medio que contenía EDTA 0,75 mM (Sigma-Aldrich) durante 60 minutos en cada incubación. Los sobrenadantes de estas incubaciones que contienen epitelio y población de linfocitos intraepiteliales se descartan, y los fragmentos residuales se agrupan y se tratan con 2 mg/ml de colagenasa A (Worthington Biomedical, Freehold, NJ) y DNasa al 0,01 % (Worthington) en aire humidificado a 37 °C durante 2 horas. A continuación, las células se sedimentan dos veces en una solución isotónica de Percoll al 40 %, tras lo cual se purifican aún más mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (40 %/75 %).

Inducción in vitro de Treg

Las Treg de origen natural proceden del timo, expresan niveles elevados del factor de transcripción de forkhead Foxp3 y suprimen la activación de los linfocitos efectores. Se ha descubierto que la activación con especificidad antigénica de los linfocitos T efectores humanos puede inducir la expresión de Foxp3 en un subgrupo de células efectoras activadas, que a su vez desarrollan un fenotipo regulador. Se demostró que estos linfocitos T reguladores inducidos son capaces de suprimir, en función del contacto celular, las células efectoras recién aisladas (Walker et al., 2003, citado anteriormente). En ratones, la exposición prolongada de las células efectoras al TGF-p induce a las Treg tanto in vitro como in vivo (Fantini et al., J Immunol. 2004 y 2006, citado anteriormente). Esta pequeña población generada periféricamente de Treg inducibles puede ser fundamental en la regulación y contención de la respuesta inmunitaria en curso, mientras que la incapacidad de inducir dichas Treg puede ser responsable de una propensión a desarrollar autoinmunidad.

Para comprobar si dicha inducción se producía tras la estimulación de los linfocitos T efectores a través del TpCR, se aislaron linfocitos T efectores de tipo silvestre, TNP-Tg, Erbb2-Tg y TNP-CD28A-Tg mediante clasificación FACS y se cultivaron durante 7 días en presencia de (1) Ac anti CD3, (2) TGF-p murino, (3) AcM dirigido contra TNP, (4) Ac anti CD3 TGF-p, o (5) Ac anti TNP TGF-p. La inducción de Foxp3 en las células "en desarrollo" de estos linfocitos T efectores se evaluó después de siete días de cultivo utilizando la tinción intracelular de Foxp3.

La activación con especificidad antigénica de los linfocitos T efectores humanos conduce a la expresión inducible de Foxp3 en un subgrupo de células efectoras activadas, que a su vez desarrollan el fenotipo regulador. Estos linfocitos T reguladores inducidos son capaces de suprimir, en función del contacto celular, las células efectoras recién aisladas. En ratones, tanto in vitro como in vivo, la inducción de Treg se puede lograr con la exposición prolongada de las células efectoras a TGF-p (Fantini et al., 2004, 2006, citado anteriormente) los presentes inventores adoptaron esta tecnología para inducir Treg redirigidas murinas a partir de linfocitos T efectores redirigidos (véase la Figura 3).

Animales

En los estudios que se describen a continuación se utilizaron varias cepas de ratones, que también se emplean en otras realizaciones de la invención. Entre ellas se encuentran las líneas de ratones transgénicos que expresan específicamente TpCR anti-TNP o anti-Erb B2 (con cadenas de señalización CD28-FcR^) bajo el control de un promotor de CD2, así como una línea de ratones transgénicos que expresan CEA humano (Saha A et al., Immunology 2006, 118:483-496)

Todos los ratones transgénicos se retrocruzaron con Balb/c. Los ratones de tipo silvestre Balb/c sirven de forma rutinaria como controles y receptores de células transferidas adoptivamente.

Un modelo de colitis por transferencia celular se utiliza en ratones inmunodeficientes Rag_/' y SCID.

Todos los procedimientos invasivos fueron y son llevados a cabo bajo anestesia general con Ketamina y Xilacina (127,5 y 4,5 mg/kg, respectivamente). Las inyecciones subcutáneas (S.C.) se realizan bajo anestesia local con un spray de Xilocaína al 10 %.

Inducción y evaluación de la colitis:

Para inducir la colitis mediada por el hapteno TNP, se sensibilizó a los ratones con 150 pl del agente haptenante ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNB^s, Sigma-Aldrich) a una concentración del 2,5% v/v en etanol al 50% mediante pintura cutánea el día 1. El día 8, se administraron 150 pl de TNBS al 1 % en etanol al 50% por vía intrarrectal a través de un catéter de 3,5 F bajo anestesia general.

La colitis inducida por OXA se indujo sensibilizando a los ratones con oxazolona (4-etoximetilen-2-fenil-2-oxazolin-5-ona; Sigma-Aldrich) a una concentración del 3 % v/v en etanol al 100 % mediante pintura cutánea el día 1, seguido de la administración intrarrectal de 150 pl a una concentración del 1 % v/v en etanol al 50 % el día 8.

En uno de los modelos preferidos de colitis por transferencia celular, los linfocitos T CD45RBhigh (vírgenes) se transfieren a ratones inmunodeficientes de origen singénico (Powrie F et al., J Exp Med. 1994; 179:589-600. Este modelo de inflamación de la mucosa permite separar la función de los linfocitos T efectores y Treg dentro de un sitio inflamatorio.

En todos los modelos, la colitis se evalúa tras la inducción mediante los siguientes parámetros: grado de ulceración del colon, adherencias intestinales y peritoneales, el grosor de la pared y el grado de edema de la mucosa. Cada parámetro se califica en una escala de 0 (completamente normal) a 4 (más grave) por dos observadores experimentados y con ocultación del tratamiento. Para la evaluación histológica de la inflamación, el tejido del colon distal (últimos 10 cm) se extrae y se fija en formaldehído al 10 %. Cinco secciones de parafina de cada ratón se tiñen con hematoxilina-eosina utilizando técnicas estándar. El grado de inflamación se clasifica de forma semicuantitativa en cortes transversales microscópicos del colon de 0 a 4 de la siguiente manera: Grado 0: normal, sin signos de inflamación; Grado 1: un nivel muy bajo de infiltración leucocitaria; Grado 2: bajo nivel de infiltración leucocitaria; y Grado 3: alto nivel de infiltración con alta densidad vascular, y engrosamiento de la pared intestinal; Grado 4: Infiltrados transmurales con pérdida de células caliciformes, alta densidad vascular, engrosamiento de la pared y alteración de la arquitectura normal del intestino.

Colonoscopia murina

Para el seguimiento continuo de la patología de la colitis, se ha utilizado un sistema de videoendoscopia para ratones de alta resolución recientemente desarrollado Becker C et al, Gut. 2005; 54:950-4. El sistema experimental de endoscopia (de Karl Storz, Tuttlingen, Alemania) consiste en un endoscopio en miniatura (1,9 mm de diámetro exterior), una fuente de luz de xenón, una cámara de triple chip, y una bomba de aire. Los parámetros para clasificar la colitis incluyen el engrosamiento de la pared intestinal, la granularidad, la consistencia fecal, la deposición de fibrina y el patrón vascular. Se utiliza la tinción de cromoendoscopia con azul de metileno en todo el colon, cuando sea adecuado, para visualizar el patrón de la cripta. Para la toma de biopsias se emplea una pinza para biopsias flexible 3fr. Las biopsias se colocan en formol para su inclusión en parafina, seccionamiento y posterior inmunohistoquímica, se congelan en nitrógeno líquido para realizar criosecciones o se obtienen y utilizan para el aislamiento de ARN. El rendimiento típico de una muestra de biopsia es de aproximadamente 2 |jg de ARN Imágenes/n vivo:

Para seguir la migración (también denominado el asentamiento o tránsito) de las Treg redirigidas en los ratones, se utilizó una cámara CCD de cuerpo entero (IVIS® 100 Series Imaging System, Xenogen, Alameda CA). Los Treg redirigidos se marcaron con el colorante lipófilo de carbocianina en el infrarrojo cercano (NIR) 1,1'-dioctadecil-3, 3, 3', 3-tetrametilindotricarocianina yoduro (DiR, Invitrogen, EE. UU.). Este colorante tiene máximos de absorción y fluorescencia a 750 y 782 nm, respectivamente, permite el marcado directo y seguro de las membranas de las células linfoides humanas con niveles muy bajos de absorción de luz y autofluorescencia en los tejidos vivos (Miller MJ et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2003; 100:2604-9; Kalchenko V et al., presentado para su publicación, 2007). La visualización adicional in vivo de las Treg marcadas con éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) en la mucosa colónica se realizó mediante la inserción intrarrectal de un microendoscopio confocal de 300 y 650 jm de diámetro (Cell Vizio, MKT, París, Francia). Esta modalidad única, previamente no probada en modelos de colitis, permite la evaluación repetida in vivo de la localización de las Treg redirigidas marcadas con CFSE a las capas más internas del tejido del colon tras la inducción de la inflamación.

Determinación de los niveles de citocinas en el colon

La expresión de ARNm de citocinas específicas en el colon se determina para permitir la evaluación de los efectos de las Treg redirigidas sobre la respuesta inmunitaria intestinal local. Concretamente, niveles de citocinas proinflamatorias (TNFa e IFNy) y antiinflamatorias (TGFp e IL10), así como los niveles del factor de transcripción TH1 Tbet y del factor de transcripción TH2 GATA-3. Los niveles de citocinas del colon se evalúan midiendo la expresión del ARNm y los niveles de proteínas.

Las muestras para el aislamiento del ARNm se extraen del colon de los ratones mediante colonoscopia in vivo o durante el sacrificio. Se aísla y procesa el ARN total y se produce el ADNc mediante RT-PCR. En todos los experimentos, los ratones se dividen en los siguientes grupos: ratones no tratados previamente, ratones con colitis inducida y ratones con colitis inducida con Treg transferidas adoptivamente (de origen natural, inducidas o redirigidas, véanse detalles sobre los experimentos de transferencia adoptiva del presente documento). Se utilizan los siguientes conjuntos de oligonucleótidos y condiciones de amplificación:

continuación

La expresión relativa del ARNm en comparación con el GAPDH constitutivo se evalúa utilizando el software de imagen de los NIH y se promedia a partir de los ratones de cada grupo.

Los niveles de expresión de las proteínas IL-10 e IFN-^yen el tejido del colon se cuantifican mediante un sistema ELISA basado en citofluorimetría. En resumen, las proteínas enteras se aíslan de las muestras de colon en ausencia de detergente. Las proteínas (100 pg) se utilizan inmediatamente para la determinación de citocinas según las instrucciones del fabricante.

Inmunohistoquímica de Foxp3 en muestras de colon:

La inmunofluorescencia de Foxp3 se realiza para estimar in situ el direccionamiento de las Treg en el colon enfermo, utilizando TSA Cy3 y un microscopio de fluorescencia (Olympus). En resumen, las criosecciones se fijan en acetona fría durante 10 minutos, seguido de una incubación secuencial con metanol, avidina/biotina (Vector Laboratories, CA), y reactivo de bloqueo de proteínas para eliminar la tinción de fondo no específica. A continuación, los portaobjetos se incuban durante la noche con anticuerpos primarios específicos para Foxp3 (por ejemplo, de Alexis Biochemicals, Lausana, Suiza). Posteriormente, los portaobjetos se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios biotinilados, y se tratan con estreptavidina-peroxidasa de rábano y se tiñen con tiramida (Cy3 o FITC). Antes del examen, los núcleos se contratiñen con Hoechst 3342 (Molecular Probes, Ohio).

EJEMPLO I

Caracterización fenotípica de las Treg específicas para TNP

Los inventores han producido ratones transgénicos (Tg) que expresan un receptor quimérico tripartito específico para TNP (TpCR) que sirven como fuente de células Treg redirigidas específicas para el hapteno trinitrofenilo (TNP). Este hapteno ha servido como antígeno "clásico" durante años en el estudio tanto de los anticuerpos como de la inmunidad mediada por linfocitos T. Una forma químicamente reactiva de este hapteno, TNBS, es un agente sensibilizador por contacto que induce y evoca respuestas de hipersensibilidad retardada (DTH), además de inducir colitis en animales, como se describe en el presente documento.

La generación de Treg específicas para TNP se logró mediante la creación de ratones Tg que expresan TpCR específicos para TNP que comprenden un scFv del AcM Sp6 específico para TNP unido a una molécula CD28 truncada que se insertó entre el scFv y la parte citoplásmica de la cadena FcR y (abreviada como y en este documento) (véase la Figura 1). Esta construcción incluye la región bisagra, la región transmembrana y la región citoplasmática de CD28, pero carece del sitio de unión a B7 (ligando).

Para la forma truncada de CD28 (TpCR/CD28, Figura 1) que no incluye el dominio de señalización intracelular CD28, los inventores clonaron el vector en el mismo sitio. Como control, se utilizó un ratón Tg que expresaba TpCR específico para otro antígeno irrelevante (Erb-B2).

Para la expresión de TpCR en los linfocitos T de los ratones Tg, se clonó una construcción que comprende un scFv-CD28-y anti-TNP (derivado de Sp6) en un vector basado en el promotor/ potenciador de CD2 humano. Los ratones Tg se generaron en el Departamento de Recursos Veterinarios del Instituto Weizmann mediante microinyección pronuclear de óvulos fertilizados (BALB/c x C57BL/6)F1 derivados de hembras donantes hiperovuladas. Los ratones fundadores se examinaron mediante la PCR del ADN de las muestras de la cola. Se obtuvieron varias cepas fundadoras que expresan un alto nivel del TpCR en su superficie celular. Estos fueron retrocruzados durante más de nueve generaciones con ratones BALB/c o C57BL/6 para obtener ratones con CMH homogéneo.

Los estudios que se presentan a continuación describen la caracterización de varias subpoblaciones de Treg en las diferentes cepas de ratones transgénicos TNP-CR, y la expresión de TpCR en estas Treg.

EJEMPLO II

Aislamiento de Treg en las que los TpCR específicos para TNP están altamente expresados

Las Treg se aislaron mediante la separación con doble perla magnética (Miltenyi Biotech) o mediante la clasificación celular fluorescente en la que las células CD4+CD25+ marcadas con fluorescencia se clasificaron mediante el sistema de clasificación celular FACSARIA.

La expresión de las Treg específicas para TNP se evaluó mediante la tinción de las células para Foxp3 (considerado el marcador "estándar de oro" de las Treg) y AcM marcado con PE específico para el anticuerpo TNP (generado en el laboratorio de los inventores). Los controles incluyeron grupos teñidos con los controles de isotipo apropiados. Como se muestra en la Figura 2, las Treg de ratones TNP-Tg, pero no de ratones de tipo silvestre, expresaron altos niveles de TpCR específicos para TNP.

EJEMPLO III

Los ratones TNP-Tg poseen un mayor número de población de Treg Foxp3+.

Se tiñeron los linfocitos periféricos del bazo y los linfocitos asociados al intestino de la lámina propia del colon. Como se muestra en la Figura 3, una población de células CD4+CD25+ (representada como la proporción de células CD4+CD25+ entre los linfocitos T CD4+) se elevó modestamente en los ratones TNP-Tg en comparación con los ratones de control (tipo silvestre, ErbB2-Tg y TNP-CD28 null-Tg). En cambio, se observó un mayor número de células Foxp3+ en los animales TNP-Tg en comparación con los animales de control en comparación con todos los demás tipos de ratón (Figura 4).

Para resolver lo que podría parecer una inconsistencia entre la población de Treg Foxp3+ altamente elevada en los ratones TNP-Tg y la población de Treg CD4+CD25+ modestamente elevada en estos ratones, las células efectoras CD4+CD25- se aislaron mediante clasificación celular con un nivel de pureza del 99 %. Las células aisladas se tiñeron para Foxp3 (Figura 5). Como se esperaba, no se observó ninguna tinción positiva de Foxp3 en los linfocitos T efectores de ratones de tipo silvestre, ErbB2-Tg y TNP-CD28null-Tg. En cambio, los linfocitos T efectores TNP-Tg presentaban una población significativa de células Foxp3+. Esta observación se validó además en poblaciones de células del bazo completas que presentaban tinción conjunta para Foxp3 y CD25 (Figura 6). La presencia de una población de Treg Foxp3+CD25- significativamente mayor en los ratones TNP-Tg está respaldada por otros resultados recientes del laboratorio de los inventores que muestran que el AcM Sp6 del que se derivó el scFv de TpCR específico para TNP reconoce antígenos tímicos endógenos con reactividad cruzada. Esto da como resultado la eliminación o la liberación temprana del timo a la periferia antes que otros subconjuntos de linfocitos T inmaduros, incluyendo las Treg CD25- inmaduras.

EJEMPLO IV

La inducción de colitis por TNBS en ratones TNP-Tg elevó significativamente el número de células que expresan Foxp3+ en poblaciones de linfocitos periféricos y derivados del colon

La inducción de la colitis por TNBS resulta en una mayor elevación de las Treg Foxp3+ esplénicas (Figura 7) y de colon (Figura 8) en TNP-Tg (Figura 7 y 8, respectivamente). Estos resultados demostraron que la expansión de las Treg específicas para TNP se produjo tras la inducción de colitis en ratones Tg, reflejando la proliferación de Treg tras la activación con especificidad antigénica por TNP.

EJEMPLO V

Caracterización funcional/n vitro de las Treg redirigidas

Un requisito previo clave para la utilidad de las Treg que expresan TpCR específicas para TNP en el tratamiento de la autoinmunidad es la verificación de su actividad reguladora, concretamente la capacidad de suprimir la proliferación de linfocitos T efectores de forma dependiente de la dosis. También se examinó si dicha activación de Treg se produce como resultado de la señalización de TpCR, y si era realmente independiente de la interacción CD28-B7. Una serie de experimentos de cocultivo examinó las Treg de las diferentes cepas Tg, como se indica a continuación.

EJEMPLO VI

Las Treg portadoras del receptor quimérico específico para TNP suprimieron específicamente la actividad de los linfocitos T efectores

Para caracterizar si las Treg TNP-Tg conservaban sus propiedades anérgicas, se purificaron las células Treg CD4+CD25+ y los linfocitos T efectores CD4+CD25- de diferentes fundadores de ratones Tg (anti-TNP, control anti-Erb-b2 y ratones de tipo silvestre (TS)) a partir de esplenocitos en bruto. se incubaron 105 células in vitro durante 24 horas, 48 h o 72 h (Figura 9) y se activaron de forma no específica con Ac anti CD3 y anti-CD28, o de forma específica con TNP modificado con gammaglobulina de aves (FyG-TNP). La proliferación de los linfocitos T se midió utilizando la captación de un colorante (sal de tetrazolio XTT) o timidina radiomarcada. La secreción de IL2 se midió mediante la tinción con XTT de la línea celular CTLL-2 dependiente de IL-2.

Todas las poblaciones de células efectoras mostraron un aumento significativo de la proliferación y la secreción de IL2 tras la estimulación inespecífica con Ac anti-CD3 anti-CD28. La estimulación específica por FyG-TNP dio lugar a la proliferación y la secreción de IL2 por parte de los linfocitos T efectores portadores del receptor quimérico de TNP, pero no por dichos linfocitos T de ratones TS o Tg anti-Erb-b2. En cambio, las Treg de ratones de tipo silvestre, de ratones Tg con receptores quiméricos de TNP y los ratones Tg Erb-b2 conservaron sus propiedades anérgicas: no experimentaron una proliferación medible ni la secreción de IL2 cuando se les sometió al estímulo no específico o al Ag específico.

Para caracterizar si la activación policlonal podría desencadenar la acción supresora de las Treg TNP-Tg, estas Treg se cocultivaron en microplacas de 96 pocillos (0,2 ml) con células presentadoras de antígeno (APC) irradiadas y linfocitos T efectores (CD4+CD25-) en una proporción 1:1. Las células en estos cultivos fueron activadas por (1) un antígeno inmovilizado "mimético" (anti-CD3 anti-CD28) o (2) concanavalina A (ConA) soluble. La proliferación de los linfocitos T se midió como la captación de timidina y la secreción de IL2 se midió como la proliferación de las células de la línea celular CTLL-2 dependiente de IL-2 (tinción de XTT).

La Figura 10 muestra un experimento con ConA. La estimulación no específica (policlonal) de las Treg indujo a estas células a mostrar una potente inhibición de la proliferación de linfocitos T efectores y de la secreción de IL2, independientemente del origen de las Treg o de la presencia del receptor quimérico. Por tanto, la manipulación genética de las Treg del tipo descrito en el presente documento conserva sus propiedades supresoras.

EJEMPLO VII

La estimulación con especificidad antigénica de las células Treg redirigidas con TNP da como resultado la supresión de la proliferación linfocitos T efectores.

Para estudiar la estimulación de las Treg con especificidad antigénica a través de TpCR, se realizaron experimentos de cocultivo en los que las APC cargadas con TNP proporcionaron la presentación del Ag (Figura 11). Se realizaron comparaciones de la estimulación de Treg específicas para TNP, comparando las Treg de tipo silvestre frente a las TNP-Tg (Figura 11, panel izquierdo) o ErbB2-Tg y TNP-Tg Treg (Figura 11, panel derecho). En ausencia de estimulación con TNP, la proliferación de linfocitos T efectores no se produjo (barras de la izquierda en ambas gráficas). En cambio, la incubación con APC modificadas con TNP dio como resultado:

(1) una marcada proliferación de los linfocitos T efectores TNP-Tg pero no de las de tipo silvestre o ErbB2-Tg en ausencia de Treg; y

(2) activación de TNP-Tg, pero no de las Treg TS o Erb-b2-Tg, se manifiesta como una supresión de la proliferación de células efectoras por parte de las Treg específicas para TNP únicamente.

Estos resultados demostraron el modo de activación y la función de las células Treg TpCR específicas para TNP en respuesta al antígeno, TNP.

El cocultivo de proporciones variables de Treg específicas para TNP y linfocitos T efectores específicos para TNP (Figura 12) demostró una inhibición con especificidad antigénica exitosa por parte de las Treg en una proporción de 1 Treg por cada 8 linfocitos T efectores.

Se realizaron estudios que apoyan la existencia de los efectos espectadores. La colitis se indujo en ratones como en el caso anterior utilizando OXA como se describe en el Ejemplo I. La transferencia adoptiva de Treg específicas para TNP por sí sola no protegió a estos animales de la colitis. Sin embargo, en presencia de trazas de TNP aplicadas al colon, los animales estaban protegidos frente a esta colitis inducida por OXA.

EJEMPLO VIII

La actividad supresora de las Treg redirigidas por TpCR es independiente de los receptores coestimuladores Para evaluar el papel de la señalización coestimuladora en el modelo de TpCR-Tg anterior, se realizaron experimentos de cocultivo como los anteriores utilizando como APC (a) células P815 modificadas con TNP, una línea celular que no expresa B7, o (b) células P815 modificadas genéticamente con TNP que expresan de forma estable el gen B7 (Figura 13). La estimulación de los linfocitos T efectores TNP-Tg con células TNP-P815 indujo la proliferación, que fue marcadamente suprimida por las Treg TNP-Tg. La expresión de B7 en estas APC no promovió ninguna supresión adicional mediada por Treg. Se concluyó que la supresión máxima de las Treg ocurría independientemente de B7. También se observó cierta supresión con las Treg de tipo silvestre. Esto se explica por la preactivación de estas células antes de su recolección. Basándose en estos resultados, podría concluirse que la inclusión del dominio de señalización intracitoplasmática de CD28 en el TpCR de las células Treg redirigidas da lugar a la activación completa de su actividad supresora cuando son estimuladas con Ag, independientemente de la presencia de la coestimulación con B7-CD28.

EJEMPLO IX

Caracterización funcional de la actividad de las Treg específicas para TNP in vivo en la colitis murina El TNBS es un potente inductor de las respuestas de los linfocitos T, como la sensibilización por DTH/de contacto. Este hapteno reactivo también induce una colitis autoinmunitaria cuando se aplica al colon de ratones presensibilizados. Para determinar si las Treg portadoras de TpCR podían suprimir la autoinmunidad, se empleó el modelo de colitis aguda mediada por TNBS. La administración intrarrectal de TNBS provoca su unión a las proteínas del colon, haciendo que estas proteínas modificadas sean inmunogénicas para que provoquen una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T. En este modelo se comprobó el efecto supresor de las Treg endógenas o transferidas exógenamente sobre la enfermedad inflamatoria autoinmunitaria. Un hapteno diferente, la oxazolona (OXA), con propiedades sensibilizadoras similares y que induce la colitis experimental, se utilizó como control de especificidad in vivo.

EJEMPLO X

Los ratones transgénicos cuya población de Treg completa expresa el receptor quimérico anti-TNP son resistentes a la colitis inducida por TNBS

La colitis mediada por el hapteno TNP se indujo en ratones Tg y TS sensibilizando primero a los animales con 150 pl del ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS, Sigma-Aldrich) a una concentración del 2,5% en etanol al 50% pintado en la piel el día 1. El día 8, el antígeno se administró por vía rectal (150 pl de TNBS al 1 % en etanol al 50 %; los ratones TS desarrollaron una colitis grave a los 2-5 días de la administración rectal de TNBS (Figura 14, panel izquierdo). En cambio, el 90 % de los ratones TNP-Tg tenían colones de aspecto normal (Figura 14, derecha). Las puntuaciones de gravedad de la colitis fueron las siguientes:

Para producir curvas de mortalidad, los experimentos anteriores se repitieron con dosis más bajas de TNBS (75 pl de TNBS al 1 % en etanol al 50 %). Se observaron diferencias similares en la gravedad de la colitis y en la mortalidad (Figura 15). Microscópicamente, los colones de los ratones de tipo silvestre, TNP-ACD28-Tg y ErbB2-Tg mostraron una inflamación grave, necrosis, hemorragia y, en algunos casos, perforación, mientras que los de los ratones TNP-Tg parecían normales o casi normales (Figura 16).

Las pruebas de la especificidad antigénica de la protección contra la colitis mediada por haptenos provienen de estudios de colitis inducida por OXA. Como se muestra en la Figura 17, no se observaron diferencias en la mortalidad entre los ratones de tipo silvestre, TNP-Tg, TNP-ACD28-Tg y ErbB2-Tg. Lo mismo ocurrió con las puntuaciones de colitis macroscópica y microscópica. A partir de estos experimentos in vivo, se concluyó que la presencia de una población de células Treg que expresa uniformemente el receptor quimérico anti-TNP da lugar a una protección de alto grado contra la inflamación inducida por TNBS, manifestada como una reducción de la inflamación del colon y una mejora significativa de la supervivencia. Cabe destacar que la inclusión de la señalización coestimuladora de CD28 en la CR aumenta significativamente la función supresora de las Treg TNP-Tg. EJEMPLO XI

La estimulación prolongada con TNP combinada con TGF-B promueve la conversión de los linfocitos T efectores específicos para TNP en Treg específicas para TNP.

Las Treg de origen natural proceden del timo, expresan altos niveles de Foxp3 y suprimen la activación de los linfocitos efectores. La activación con especificidad antigénica de los linfocitos T efectores humanos puede inducir la expresión de Foxp3 en un subgrupo de células efectoras activadas, que a su vez desarrollan un fenotipo regulador. Se demostró que estos linfocitos T reguladores inducidos son capaces de suprimir, en función del contacto celular, las células efectoras recién aisladas (Walker et al., 2003, citado anteriormente). En ratones, se ha demostrado que la exposición prolongada de las células efectoras al TGF-p induce a las Treg tanto in vitro como in vivo (Fantini et al, 2004, 2006, citado anteriormente). Esta pequeña población generada periféricamente de Treg inducibles puede ser fundamental en la regulación y contención de la respuesta inmunitaria en curso, mientras que la incapacidad de inducir dichas Treg puede ser responsable de una propensión a desarrollar autoinmunidad.

Para comprobar si dicha inducción se producía tras la estimulación de los linfocitos T efectores mediante el TpCR, se aislaron linfocitos T efectores de tipo silvestre, TNP-Tg, Erbb2-Tg y TNP-CD28null-Tg mediante clasificación por FACS y se cultivaron durante 7 días en presencia de (1) Ac anti CD3, (2) TGFp murino, (3) AcM para TNP, (4) Ac anti-CD3+TGF-p, o (5) Ac anti-TNP TGF-p. La inducción de Foxp3 en las células "en desarrollo" de estos linfocitos T efectores se evaluó después de siete días de cultivo utilizando la tinción intracelular de Foxp3 (Figura 18).

En el momento 0 hasta el momento de la clasificación de los linfocitos T efectores, no se observó ninguna tinción de Foxp3. Una semana de estimulación con anti-CD3+TGF-p, pero no con TNP+TGF-p, resultó en un aumento de 2 veces en las células Foxp3+ en los linfocitos T efectores de tipo silvestre, ErbB2-tg y TNP-CD28null-Tg. En cambio, se observó un aumento dramático de 30 veces en las células Foxp3+ en las células efectoras TNP-Tg tras la exposición a TNP+TGF-p. De manera interesante, no se observó ninguna inducción de Foxp3 en los linfocitos T efectores TNP-Tg tras la incubación con Ab anti CD3 o con TGF-p, probablemente debido a la atenuación significativa de la expresión de CD3 en los linfocitos T TNP-Tg (Morvinsky-Friedman et al, en prensa).

Los resultados anteriores demostraron que la estimulación con especificidad antigénica a través de TpCR en presencia de TGF-p, condujo a la inducción de Treg específicas de Ag a partir de linfocitos T efectores, contribuyendo aún más a la expansión de las Treg. Este cambio dependía tanto de la especificidad antigénica de la unidad de reconocimiento de Ac de TpCR como del resto de señalización intracitoplasmático de CD28.

De acuerdo con la presente invención, la inducción de Treg de esta manera permite la generación de grandes poblaciones de Treg portadoras de TpCR que pueden utilizarse en la terapia celular contra autoinmunidad.

EJEMPLO XII

La transferencia adoptiva de TNP-Tg Treg a ratones TS con colitis por TNBS mejora los síntomas y la supervivencia.

Se realizaron estudios para establecer que las Treg TNP-Tg son responsables de la resistencia de los ratones TNP-Tg a la colitis por TNB^sy para evaluar su capacidad terapéutica en la autoinmunidad. Se aislaron Treg de tipo silvestre, TNP-Tg y Erb-b2-Tg y se administraron en números variables a ratones de tipo silvestre un día después de la inducción de colitis por TNBS. Como se ha descrito previamente, la transferencia adoptiva de un gran número de Treg de cualquier origen (>2 * 105) causó una atenuación no específica de la colitis por TNBS. Se cree que esto se debe a la presencia de una población suficientemente grande de Treg preactivadas que pueden ejercer su actividad supresora en ausencia de estimulación o especificidad de antígeno. En cambio, la transferencia adoptiva de un número menor (5 * 104) de Treg TNP-Tg pero no de Treg de tipo silvestre o Erbb2-Tg, prolongó la supervivencia (Figura 19) mejoró las puntuaciones de gravedad de la colitis de Wallach (Figura 20) y mejoró significativamente el aspecto macroscópico (Figura 21) y microscópico (Figura 22) del tejido del colon. La figura 21 muestra un marcado acortamiento del intestino, una manifestación de la inflamación del colon (en los ratones TS y ErbB2-Tg, pero no en los TNP-Tg). La figura 22 muestra la grave inflamación transmural, necrosis, sangrado de la mucosa y pérdida de la arquitectura normal en los colones de ratones TS con colitis por TNBS que habían recibido el control (TS y ErbB2-Tg), pero no en los colones TNP-Tg.

EJEMPLO XIII

Migración/tránsito de las Treg redirigidas a los sitios de inflamación: las Treg TNP-Tg transferidas adoptivamente se localizan en el colon en la colitis inducida por TNBS

Se realizaron estudios para obtener más pruebas sobre el papel de las TNP-Tg Treg en la atenuación de la colitis por TNBS, demostrando que estas células se localizan efectivamente en el tejido del colon inflamado. Se aislaron las Treg TS y TNP-Tg y se tiñeron con el colorante intracelular fluorescente, éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE). Después de la tinción, se administraron 106 Treg por vía intraperitoneal (ip) a ratones TS de control o a ratones TS en los que se había inducido colitis por TNBS 12 horas antes. Dieciséis horas después de este tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se aislaron los linfocitos de la lámina propia del colon. El protocolo utilizado fue el descrito anteriormente para aislar los linfocitos de la lámina propia. Posteriormente, las células se examinaron para detectar la presencia de células positivas para CFSE mediante un análisis FACS. Como se muestra en la Figura 23, un número muy pequeño de Treg transferidas adoptivamente por TS o TNP-Tg llegó a los colones de los ratones normales. La inducción de la colitis condujo a un pequeño aumento (0,5 % a 0,8 %) en el número de Treg teñidas con CFSE TS en el tejido del colon. En cambio, la transferencia adoptiva de TNP-Tg Treg marcadas con CFSE a ratones con colitis condujo a un aumento significativo de la población de Treg de colon, en el intervalo del 0,4% al 3,6%. Esto demuestra que las Treg TNP-Tg se localizan en un órgano diana expuesto a TNBS, donde ejercen su función supresora.

EJEMPLO XIV

Acumulación de TNP-Tg Treg transferidas adoptivamente dentro de la capa mucosa del colon de ratones con colitis por TNBS.

Un aspecto importante para entender el papel de las Treg para el tratamiento adoptivo de la inflamación autoinmunitaria de las Treg en los órganos enfermos, donde se espera que ejerzan sus efectos supresores. Para demostrar la localización de TNP-Tg-Treg, las Treg TS y TNP-Tg fueron marcadas con CFSE y se transfirieron a ratones TS 24 horas después de la inducción de la colitis por TNBS. Mientras que se observó un número muy pequeño de Treg TS marcadas con CFSE en las células extraídas de la lámina propia del colon de ratones no tratados previamente o con colitis inducida por TNBS, se observó un aumento de nueve veces en las Treg TNP-Tg (Figura 23).

Para estudiar la cinética de localización de TNP-Tg Treg en el animal vivo, se empleó el sistema de formación de imágenes de la serie IVIS® 100 (Xenogen, Alameda, CA). Los Treg de tipo silvestre y TNP-Tg, 1,5 * 106, marcados con el colorante lipofílico de carbocianina en el infrarrojo cercano yoduro de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotarbocianina (DiR, Invitrogen, EE. UU.), fueron administrados ip a ratones TS con o sin colitis por TNBS, que fueron monitorizados diariamente con la cámara CCCD de cuerpo entero IVIS (Figura 24). Una fuerte señal fluorescente anterior-abdominal, que refleja la mayor parte de las Treg inyectadas, se observó en ratones no tratados previamente 24-48 horas después de la inyección ip de Treg y desapareció después debido a la redistribución de las Treg. En ratones con colitis por TNBS, se observó una débil señal abdominal durante 72 horas, probablemente reflejando la autofluorescencia relacionada con la inflamación. En ratones con colitis por TNBS que recibieron Treg TS marcadas, una señal fluorescente abdominal moderada podría reconocerse hasta 96 horas después de la transferencia de Treg. En cambio, las TNP-Tg Treg administradas a ratones TS con colitis por TNBS presentaron una señal fluorescente abdominal distintiva hasta una semana después de la transferencia celular, sustancialmente más fuerte que la de las Treg de tipo silvestre en todos los puntos temporales. Estos resultados reflejan la localización persistente de TNP-Tg Treg en el interior del colon durante la colitis.

Para determinar si las Treg TNP-Tg alcanzan la capa interna de la mucosa colónica, el lugar donde se produce la mayor parte del daño a la mucosa inducido por TNBS, se empleó el sistema de microendoscopia confocal Cell Vizio (Cell Vizio, MKT, París, Francia). Un microendoscopio confocal de 650 pm de diámetro insertado intrarrectalmente permitió la visualización de las células marcadas con CFSE en un espesor de la pared intestinal de hasta 150 pm (Figura 25). Se pudieron visualizar numerosas Treg TNP-Tg marcadas con CFSE transferidas de manera adoptiva, pero no Treg TS en la capa mucosa interna de los ratones TS con colitis por TNBS, tan pronto como 12 horas después de la transferencia sistémica de Treg. Este resultado indica que las Treg TNP-Tg se localizan en respuesta al TNBS colónico, a las pocas horas de su administración, y que alcanzan las capas más profundas de la mucosa colónica, donde ejercen sus funciones de supresión.

EJEMPLO XV

La administración de TNP-Tg Treg específicas para un antígeno espectador (TNBS) cura la colitis mediada por un antígeno patógeno (oxazolona)

A diferencia de la colitis mediada por haptenos, en la que el antígeno elicitador está predefinido, el antígeno causante de la enfermedad en la enteropatía inflamatoria (EI) es desconocido. Para permitir la aplicación de la estrategia de "T-cuerpo" en la EI, se probaron las Treg vírgenes portadoras de TPCR para determinar si pueden activarse por un antígeno espectador predeterminado asociado al colon o a la colitis, para realizar su acción supresora inespecífica de antígenos. Para este fin, los ratones TS y TNP-Tg fueron presensibilizados solo a la oxazolona. Se introdujo una mezcla de oxazolona y dosis bajas de TNBS por vía intrarrectal. Como se muestra en la Fig. 26a, la exposición concomitante de los ratones TS a TNBS y oxazolona, se asoció con una tasa de mortalidad de una semana del 100 %, en comparación con solo un 15 % de mortalidad a la semana de los ratones TNP-Tg (P < 0,01). De forma similar, la inflamación significativa de la mucosa fue evidente tanto en los ratones TS como en los TNP-Tg con colitis por oxazolona (no se muestra), y fue más grave en los ratones de tipo silvestre a los que se les administró TNBS oxazolona (Fig. 26b, recuadro I), lo que provocó una hemorragia grave, deposición de fibrina y desprendimiento de la mucosa colónica.

En total contraste, los ratones TNP-Tg a los que se les administró TNBS oxazolona presentaban una mucosa colónica de aspecto normal con áreas dispersas de colitis leve (Fig. 26b, cuadro II). Macroscópicamente y microscópicamente, los colones de los ratones TS tratados con TNBS y oxazolona de forma concomitante presentaban una colitis grave, frente a los colones casi normales de los ratones TNP-Tg (Fig. 26c y 26d, respectivamente)

De manera destacable, este efecto protector "espectador" también se produjo cuando las Treg TNP-Tg se transfirieron de manera adoptiva a ratones de tipo silvestre presensibilizados con oxazolona a los que se había reforzado por vía intrarrectal con una mezcla de oxazolona y bajas dosis de TNBS (Fig. 26e, P < 0,01)). En cambio, las Treg TS transferidas adoptivamente no tuvieron este efecto curativo, y las dosis muy bajas de TNBS en ausencia de presensibilización fueron insuficientes por sí mismas para inducir la colitis por TNBS. Estos resultados demuestran que la activación de las Treg por un antígeno espectador (TNBS) causa una mejora en la colitis que ha sido inducida por un antígeno diferente sin reactividad cruzada (oxazolona).

EJEMPLO XVI

Administración de Foxp3 al núcleo celular por medio de vectores que comprenden receptores quiméricos Se realizó un experimento para verificar que Foxp3 puede expresarse tras la transducción de células A273 con construcciones de vectores retrovirales diseñadas para transducir células Treg. Se generó un gen fusionado que incluía secuencias de eGFP que codificaban la proteína verde fluorescente (denominada eGFP o GFP). Esto se diseñó como una construcción bicistrónica con la secuencia de GFP sola o unida a una secuencia codificadora de Foxp3 (después de un IRES) en vectores que comprendían una construcción de receptor quimérico con las siguientes regiones de reconocimiento extracelular: Véase la descripción de la Figura 27 para un análisis de las construcciones de receptores quiméricos utilizadas. 273 células, transducidas con vectores que comprenden los mismos receptores quiméricos pero con un gen eGFP bicistrónico solamente (sin Foxp3), sirvieron como controles para la expresión de Foxp2.

Los resultados se muestran en la Figura 27. La mitad superior de la figura muestra los controles solo con GFP, mientras que la mitad inferior de la figura muestra las construcciones de GFP-Foxp3. Los rectángulos con dos paneles de la figura muestran imágenes de microscopía óptica (mitad izquierda) y de microscopía de fluorescencia (mitad derecha) del mismo material (para visualizar y localizar la GFP).

Todo el grupo de control expresó la eGFP solo en su citoplasma. En cambio, en células transducidas con las construcciones de fusión de eGFP-Foxp3, los núcleos eran fluorescentes (apareciendo como imágenes nucleares brillantes) debido al transporte y la expresión del factor de transcripción Foxp3 en los núcleos.

En otro experimento que no se muestra aquí, la expresión del receptor quimérico formado por la proteína MD2 de longitud completa (SEQ ID NO: 5) o la proteína CD14 (SEQ ID NO: 4) se confirmó por la capacidad de las células transducidas, que expresan la región extracelular del CR en su superficie, para unirse al ligando de MD2 y CD14, el LPS bacteriano, que se proporcionó en forma biotinilada y se reveló mediante la unión secundaria de avidina fluorescente.

EJEMPLO XVII

Vectores que comprenden receptores quiméricos con regiones extracelulares de unión a LPS

Se han realizado construcciones de ácido nucleico y vectores que codifican regiones extracelulares que comprenden un dominio de anticuerpo anti-LPS (por ejemplo, SEQ ID NO: 3 o la porción de codificación de scFv de la misma) y se pueden realizar otras. Dichos vectores expresan dominios polipeptídicos extracelulares que han demostrado unirse al LPS, por ejemplo, en un ensayo que utilice LPS biotinilado y avidina marcada de forma detectable (por ejemplo, marcada con fluorescencia). Véase también el Ejemplo XVI anterior.

Se han preparado construcciones de ácido nucleico y vectores que codifican regiones extracelulares que comprenden un polipéptido no anticuerpo de unión a LPS (por ejemplo, SEQ ID NO: 6-11, 13 y 14). Estas construcciones incluyen las bicistrónicas que también incluyen Foxp3. Otras construcciones de este tipo pueden prepararse utilizando el método descrito anteriormente junto con métodos bien conocidos en la técnica. Dichas construcciones (como la SEQ ID NO: 13 y 14) incluyen las que codifican la proteína CD14 de longitud completa (SEQ ID NO: 4) o MD2 (SEQ ID NO: 5), y construcciones que codifican motivos de unión a LPS de las mismas (como la SEQ ID NO: 6-9) y combinaciones (como la SEQ I^dNO: 10 y 11). Las construcciones que se realizan incluyen las que tienen regiones estimuladoras/coestimuladoras intracelulares CD28-FcRy y las que utilizan otras del tipo divulgado en el presente documento.

Las células Treg se redirigen como se describe en el presente documento utilizando las construcciones anteriores, incluyendo las que se han producid y probado y las que se pueden preparar.

Dichas células Treg se administran a sujetos que padecen EI, tal como colitis ulcerosa. Las células Treg se administran en números de acuerdo con los ejemplos anteriores, o en números que se determinan fácilmente para ser eficaz por los expertos en la técnica utilizando solo la experimentación rutinaria, y a través de las rutas de administración como se ejemplifica anteriormente y se divulga a lo largo del presente documento. Estas células Treg redirigidas que expresan una región de anticuerpos de unión al LPS u otro resto de unión al LPS en su superficie

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o una afección inmunitarias/inflamatorias mediadas por linfocitos T efectores, que comprende linfocitos T reguladores redirigidos (células Treg), en donde dichas células Treg redirigidas están dotadas de especificidad contra un antígeno seleccionado, siendo dicho antígeno seleccionado uno que está presente o se expresa en un sitio o tejido diana de una respuesta autoinmunitaria o inflamatoria mediada por linfocitos T efectores, comprendiendo dichas células un ácido nucleico quimérico que codifica un polipéptido receptor quimérico (CR) que comprende, expresado en una cadena única y continua, una región de reconocimiento extracelular, una región transmembrana y una región de señalización intracelular, y se expresa en las células Treg redirigidas de forma que muestran la región extracelular en la superficie celular, en donde

(a) la región de reconocimiento extracelular del receptor quimérico es específica para el antígeno seleccionado y consiste en un dominio scFv derivado de anticuerpo; y

(b) la región de señalización intracelular comprende una combinación de restos de polipéptidos de señalización de linfocitos T, combinación de restos que comprende uno o más dominios citoplásmicos de una molécula coestimuladora y un dominio citoplásmico estimulador de linfocitos T, y combinación de restos que, tras la unión de la región de reconocimiento extracelular al antígeno seleccionado, desencadena la activación de las células Treg para provocar la supresión de la inmunidad mediada por linfocitos T;

2. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región de reconocimiento extracelular está unida a la región transmembrana a través de un espaciador extracelular, preferentemente una bisagra de una molécula de la superfamilia de las inmunoglobulinas.

3. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la región de señalización intracelular comprende un resto de señalización de una cadena polipeptídica seleccionada entre el grupo que consiste en una cadena del complejo TCR/CD3, y la cadena ^yde un receptor Fc de Ig (FcRy).

4. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la región intracelular comprende un resto de direccionamiento de al menos una proteína seleccionada entre el grupo que consiste en CD28, OX40, CD40L, 4-lBB (CD137) y PD-l.

5. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el factor de transcripción Foxp3 se expresa en las células Treg de manera endógena y cuya expresión se potencia mediante la exposición de las células al factor de crecimiento transformante p (TGF-p) u otra citocina u otro agente que inducen la expresión de Foxp3 y un fenotipo de Treg en los linfocitos T; y/o en donde las células Treg comprenden además una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica Foxp3, que se introduce en las células Treg como una construcción de expresión de ácido nucleico recombinante que codifica Foxp3 y regula su expresión.

6. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido nucleico quimérico comprende una secuencia de ácido nucleico que hará que las células Treg redirigidas expresen Foxp3.

7. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la región de señalización intracelular comprende la totalidad o parte del dominio citoplasmático de una fosfotirosina cinasa, preferentemente de la familia de Syk-cinasa.

8. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el dominio estimulador de linfocitos T citoplasmático procede de FcRy o de una cadena CD3-Z.

9. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la molécula coestimuladora se selecciona entre CD28 y miembros de la familia de "coestimulador inducible" (ICOS), que comprende OX40 (CD134), ligando de CD40 Cd4oL CD154, PD-I ("receptor de muerte programada-1") y 4-1B^b(CD137).

10. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la molécula coestimuladora se selecciona entre CD28, OX40 (CD134), ligando de CD40 (CD40L CD154), PD-I y 4-1BB (CD137).

11. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la molécula coestimuladora es CD28.

12. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha respuesta autoinmunitaria o inflamatoria y dicho antígeno se seleccionan entre el grupo que consiste en:

(a) enteropatía inflamatoria (EI), en donde dichos antígeno o ligando son uno que se expresa en el colon o el íleon enfermos;

(b) artritis reumatoide, en donde dichos antígeno o ligando son un epítopo del colágeno o un antígeno presentes en las articulaciones;

(c) diabetes mellitus de tipo I o insulitis autoinmunitaria, en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno de células [beta] pancreáticas;

(d) esclerosis múltiple, en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno de la proteína básica de la mielina, MOG-I o MOG-2;

(e) tiroiditis autoinmunitaria, en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno tiroideo;

(f) gastritis autoinmunitaria, en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno gástrico;

(g) uveítis o uveorretinitis autoinmunitarias, en donde dichos antígeno o ligando son el antígeno S u otro antígeno uveal o retiniano;

(h) orquitis autoinmunitaria, en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno testicular;

(i) ooforitis autoinmunitaria, en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno ovárico;

(j) psoriasis; en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno de queratinocitos u otro antígeno dérmico o epidérmico;

(k) vitíligo, en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno melanocítico;

(l) prostatitis autoinmunitaria, en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno prostático;

(m) cualquier respuesta inmunitaria no deseada, en donde dichos antígeno o ligando son un antígeno de activación expresado en los linfocitos T efectores presentes en el lugar de la respuesta inmunitaria no deseada; (n) rechazo de tejidos, en donde dichos antígeno o ligando son la molécula del CMH que tiene el haplotipo del tejido trasplantado, o una porción de esa molécula del CMH; y

(o) una afección inflamatoria, en donde dichos antígeno o ligando son uno que se expresa en las células no linfoides del linaje hematopoyético que participan en la inflamación.

13. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la enfermedad o la afección inmunitarias/inflamatorias se seleccionan entre el grupo que comprende EI, artritis reumatoide, diabetes mellitus de tipo I o insulitis autoinmunitaria, esclerosis múltiple, tiroiditis, gastritis, uveítis o uveorretinitis, orquitis, ooforitis, psoriasis, prostatitis, encefalomielitis y vitíligo.

14. La composición farmacéutica inmunorreguladora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la enfermedad o la afección inmunitarias/inflamatorias se seleccionan entre el grupo que comprende rechazo de una célula, tejido u órgano no histocompatible y EICH.