CN113396215A - 表达嵌合抗原受体(car)的骨髓浸润淋巴细胞(mil)、其制造方法及在疗法中使用的方法 - Google Patents

Abstract

提供了包含嵌合抗原受体(“CAR”)的骨髓浸润淋巴细胞(“MIL”)。在一些方面，所述实施方案涉及用于制备重组MIL的方法，其包括获得包含MIL的骨髓；并用编码嵌合抗原受体的核酸转染、转化或转导MIL，导致产生CAR‑MIL。在一些方面，所述实施方案涉及用于治疗受试者中的病况的方法，所述方法包括向受试者施用包含CAR的MIL。

Description

表达嵌合抗原受体(CAR)的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)、其制造 方法及在疗法中使用的方法

背景

绝大多数恶性肿瘤患者将死于其疾病。一种治疗这些患者的方法是遗传修饰MIL以通过嵌合抗原受体(“CAR”)的表达来靶向肿瘤细胞上表达的抗原。CAR为抗原受体，其被设计为以不依赖于人白细胞抗原的方式识别细胞表面抗原。除了以CD19靶向方法取得的成功以外，使用表达CAR的遗传修饰细胞治疗其他恶性肿瘤的尝试仅取得有限的成功。

概述

在一些实施方案中，提供了具有嵌合抗原受体(“CAR”)的骨髓浸润淋巴细胞(“MIL”或“MIL™”)，在本公开全文中标示为“CAR-MIL”或“CAR-MIL™”。在一些实施方案中，CAR包含可结合配体的细胞外结构域。在一些实施方案中，CAR包含可起始细胞内信号传导级联(例如在MIL中)的细胞内结构域。

在一些实施方案中，提供了用于治疗受试者中的病况的方法，其包括向受试者施用包含CAR的MIL。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用包含MIL群体的组合物，其中MIL群体中的每种MIL都包含CAR。

在一些实施方案中，提供了用于制备重组MIL的方法，其包括获得包含MIL的骨髓；和用编码嵌合抗原受体的核酸转染、转化或转导MIL。骨髓可获得自受试者，诸如具有赘生物(neoplasm)的受试者。受试者可以是人或小鼠。

附图简述

图1显示GFP和CAR表面表达之间的相关性。

图2显示MIL可以被有效地转导以表达CAR，特别是CD38、BCMA和PSMA CAR。

图3显示，与未转导的MIL相比，CAR-MIL具有相似的记忆表型。

图4显示CD38 CAR-MIL和PBL的肿瘤-特异性门控策略。

图5显示CD38 CAR-MIL保留其固有的肿瘤-特异性和功能性。

图6显示在与表达CD38的8226肿瘤细胞共培养并刺激后，CD38 CAR-MIL保留其固有的肿瘤-特异性和功能性。

图7显示BCMA和PSMA CAR-MIL和PBL的肿瘤-特异性门控策略。

图8显示BCMA CAR-MIL保留其固有的肿瘤-特异性和功能性。

图9显示在与表达PSMA的LNCAP肿瘤细胞共培养和刺激后，PSMA CAR-MIL保留其固有的肿瘤-特异性和功能性。

图10显示用于测量CD38 CAR (CAR38)-介导的抗原-特异性杀伤的基于FACS的体外共培养测定。

图11显示在初级48小时共培养杀伤测定中，CD38 CAR-MIL优于CAR-PBL。

图12显示在初级48小时杀伤测定中，在低E:T比率下，与CAR-PBL相比，CD38 CAR-MIL具有优异的体外杀伤。

图13显示在初级和次级再攻击杀伤测定中，CD38 CAR-MIL优于CAR-PBL。

图14显示在次级再攻击杀伤测定中，在低E:T比率下，与CAR-PBL相比，CAR38 CAR-MIL具有优异的体外杀伤。

图15显示在重复攻击(每48小时)中，与CAR-PBL相比，CD38 CAR-MIL具有优异的杀伤。

图16显示，在延迟的次级再攻击杀伤测定中(初级攻击后7天)，与CAR-PBL相比，CD38 CAR-MIL具有优异的杀伤。

图17显示用于实时测量BCMA CAR抗原-特异性杀伤的ACEA体外共培养测定。

图18显示在ACEA实时杀伤测定中，在低E:T比率下，与CAR-PBL相比，BCMA CAR-MIL具有优异的体外杀伤。

图19显示在ACEA杀伤测定中，在低E:T比率下，与CAR-PBL相比，BCMA CAR-MIL具有优异的体外杀伤。

图20显示用于检测BCMA CAR-介导的抗原-特异性杀伤的基于FACS的体外共培养测定。

图21显示在重复攻击后，与CAR-PBL相比，BCMA CAR-MIL具有优异的杀伤。

图22显示四种人前列腺癌细胞系和SW780膀胱癌细胞系上的PSMA染色。

图23显示用于实时测量PSMA CAR抗原-特异性杀伤的ACEA体外共培养测定。

图24显示，甚至当初级攻击有利于CAR-PBL时，PSMA CAR-MIL在次级攻击中也优于CAR-PBL。

图25显示通过细胞内细胞因子-染色来测量CAR抗原刺激-特异性细胞因子产生。

图26显示，与CAR-PBL相比，BCMA CAR-MIL具有增加的IFNγ和TNFα细胞因子产生。

图27显示，与CAR-PBL相比，CD38 CAR-MIL显示增加的IFNγ和TNFα细胞因子产生。

图28显示在单细胞水平上测量在BCMA抗原-刺激后32种细胞因子的产生的程序。

图29显示BCMA抗原-刺激在CAR-MIL和CAR-PBL两者中诱导分泌多功能细胞因子的CD4和CD8 CART细胞。

图30显示由于效应子、刺激性和趋化性细胞因子增加，在BCMA抗原-刺激后多功能性增加。

图31显示颗粒酶B、IFNγ、IL-8、MIP-1a和MIP-1b是在BCMA刺激后由CAR-MIL和CAR-PBL产生的主要细胞因子。

图32显示，在BCMA刺激后，与CAR-PBL相比，CAR-MIL具有更强的PSI的上调并且产生更多的效应子和趋化性细胞因子。

图33显示，与CAR-PBL相比，在BCMA刺激后，CAR-MIL显示多功能细胞亚群的更多增加。

图34显示在抗原-刺激后，CAR-MIL维持CD27，而CAR-PBL失去CD27表达。

图35显示在抗原-刺激后，与CAR-PBL相比，CAR-MIL表达更少的PD1和TIM-3。

图36显示所有67只治疗的小鼠的T细胞输注之前的基线血清人IgE水平，相比于选择用于分析的具有更相似的基线U266肿瘤负荷的46只小鼠。

图37显示46只小鼠中每只的血清人IgE动力学(U266体内肿瘤负荷的标志物)。

图38显示BCMA CAR-MIL在体内比匹配的CAR-PBL更有效。

图39显示通过流式细胞术(FACS)的来自对照和治疗小鼠的骨髓中人CD3+ T细胞和CD138+ U266肿瘤细胞的水平的测量值。

图40显示通过流式细胞术(FACS)的来自对照和治疗小鼠的脾脏中人CD3+ T细胞和CD138+肿瘤细胞的水平的测量值。

图41显示与PBL相比，在用MIL治疗的小鼠的骨髓中检测到较高的人CD3 T细胞百分比和较低的U266肿瘤细胞百分比。

图42显示与PBL相比，在用MIL治疗的小鼠的脾脏中检测到较高的人CD3 T细胞百分比和较低的U266肿瘤细胞百分比。

详述

本公开提供了用于治疗癌症以及其他疾病(包括但不限于血液恶性肿瘤和实体肿瘤)的组合物和方法。癌症可以是血液恶性肿瘤，诸如慢性淋巴细胞白血病(“CLL”)。可使用本文描述和提供的组合物和方法治疗的其他疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫性疾病。

各方面涉及但不限于经转导以表达嵌合抗原受体(CAR)的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的过继细胞转移策略。CAR是将基于抗体的针对期望的抗原(例如肿瘤抗原)的特异性与活化MIL受体的细胞内结构域组合以生成表现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。

在一些实施方案中，提供被工程改造以表达CAR的细胞(即，MIL)，其中CAR-MIL表现出抗肿瘤特性。表达CAR的MIL本文称为CAR-MIL或CAR-修饰的MIL。在一些实施方案中，可对细胞进行遗传修饰以在其表面上稳定表达抗体结合结构域，赋予独立于MHC的新型抗原特异性。在一些实施方案中，对MIL进行遗传修饰以稳定表达将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3ζ链或FcγRI蛋白的细胞内结构域组合成单一嵌合蛋白的CAR。CAR可例如被工程改造以包含具有与MIL抗原受体复合物ζ链(例如CD3ζ)的细胞内信号传导结构域融合的抗原结合结构域的细胞外结构域。CAR例如当在MIL中表达时能够基于抗原结合特异性重定向抗原识别。在一些实施方案中，抗原是CD19，因为该抗原在恶性B细胞上表达。在一些实施方案中，抗原是CD38、前列腺特异性膜抗原(“PSMA”)或B细胞成熟抗原(“BCMA”)。然而，实施方案不限于靶向这些结构域。更确切地，实施方案包括任何抗原结合部分，其当结合其同源抗原时影响肿瘤细胞，使得肿瘤细胞不能生长、被促使死亡或者以其他方式受到影响，使得减少或消除患者中的肿瘤负担。抗原结合部分可以与细胞内结构域融合，所述细胞内结构域来自共刺激分子和ζ链中的一种或多种。在一些实施方案中，抗原结合部分与选自CD137 (4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域及其任何组合的一种或多种细胞内结构域融合。抗原结合部分也可以与细胞内结构域、诸如CD134 (OX40)融合。在一些实施方案中，CAR包含CD137 (4-1BB)信号传导结构域。不受任何特定理论的束缚，这是因为实施方案部分地基于以下发现：CAR介导的T细胞应答可由添加共刺激结构域而进一步增强。

在一些实施方案中，CAR包括具有抗原识别结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。在一些实施方案中，使用天然与CAR中的结构域之一缔合的跨膜结构域。在一些实施方案中，可选择或通过氨基酸取代来修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域结合相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。例如，跨膜结构域可以是CD8α铰链结构域。

在一些实施方案中，CAR包含结合CD19的细胞外配体结合结构域；跨膜结构域；4-1BB共刺激信号传导结构域；和细胞内CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含结合PSMA的细胞外配体结合结构域；跨膜结构域；4-1BB共刺激信号传导结构域；和细胞内CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含结合BCMA的细胞外配体结合结构域；跨膜结构域；4-1BB共刺激信号传导结构域；和细胞内CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含结合CD38的细胞外配体结合结构域；跨膜结构域；4-1BB共刺激信号传导结构域；和细胞内CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是CD3ζ、CD4、CD8或CD28的跨膜结构域。

就细胞质结构域而言，CAR例如可以被设计为包含CD28和/或4-1BB信号传导结构域本身，或者与在CAR的背景下有用的任何其他期望的细胞质结构域组合。在一些实施方案中，CAR的细胞质结构域可被设计为进一步包含CD3ζ的信号传导结构域。例如，CAR的细胞质结构域可包括但不限于CD3ζ、4-1BB和CD28信号传导模块，及其组合。因此，实施方案提供了CAR-MIL及其用于过继疗法的方法。

在一些实施方案中，CAR-MIL可通过将包含期望的CAR (例如包含抗CD19、跨膜结构域和人4-1BB的CAR)的慢病毒载体引入细胞中而生成。例如，CAR-MIL能够在体内复制，导致长期持续存在，这可导致持续的肿瘤控制。

在一些实施方案中，提供使用CAR-MIL输注施用表达CAR的遗传修饰的MIL用于治疗具有赘生物的患者。在一些实施方案中，在治疗中使用自体输注。自体MIL收集自需要治疗的患者，并使用本文描述的和本领域中已知的方法活化并扩增，且然后输注回患者。

在一些实施方案中，使用表达包括CD3ζ和4-1BB共刺激结构域的抗CD19、抗CD38、抗PSMA或抗BCMA CAR的MIL。在一些情况下，输注至患者中的CAR MIL可消除患者体内的白血病细胞。然而，实施方案不限于靶向CD19、CD38、BSMA或PSMA或通过CD3ζ和/或4-1BB介导的途径传导信号的MIL。例如，实施方案包括与一种或多种细胞内结构域(诸如CD137 (4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域及其任何组合)融合的任何抗原结合部分。

定义

冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”在本文用于指冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。举例来说，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。

如本文件中所使用，本文使用的术语“包含”、“具有(have)”、“具有(has)”和“包括”及其词形变式意指“包括但不限于”。尽管各种组合物和方法就“包含”各种组分或步骤而言进行描述(解释为意指“包括但不限于”)，但组合物、方法和装置也可“基本上由所述各种组分和步骤组成”或“由所述各种组分和步骤组成”，并且这样的术语应该解释为定义基本上封闭式成员组。

本文使用的“活化”是指已充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的MIL的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的MIL”尤其是指正在经历细胞分裂的MIL。

本文使用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体。

术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本文使用的术语“抗原”定义为引发免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解，任何大分子(包括几乎所有的蛋白或肽)都可充当抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如该术语在本文中使用的“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，实施方案包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可被合成生成或者可源自生物样品。这样的生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

本文使用的术语“抗肿瘤作用”是指可通过肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加或与癌性病况相关的各种生理症状的改善而表现的生物效应。“抗肿瘤作用”也可首先通过肽、多核苷酸、细胞和抗体预防肿瘤发生的能力而表现。

术语“自体抗原(auto-antigen)”意指任何被免疫系统误认为是外源的自身抗原(self-antigen)。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

本文使用的术语“自身免疫性疾病”定义为由自身免疫应答引起的病症。自身免疫性疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫性疾病的实例包括但不限于艾迪生氏病、斑秃(alopecia greata)、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩氏病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。

本文使用的术语“自体的”意指任何源自相同个体的材料，其后来被重新引入到该个体中。

“同种异体的”是指源自相同物种的不同动物的移植物。

“异种异体的”是指源自不同物种的动物的移植物。

本文使用的术语“癌症”定义为特征为异常细胞的快速和不受控制的生长的疾病。癌细胞可局部传播或通过血流和淋巴系统传播到身体其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。可治疗的癌症包括没有血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体肿瘤(诸如血液肿瘤，例如骨髓瘤、白血病和淋巴瘤)或者可包括实体肿瘤。待用如本文所述的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

如本文中使用的术语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如aAPC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合MIL上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子的结合提供的初级信号以外的介导MIL应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的信号。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS- L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其包括与存在于MIL上的共刺激分子特异性结合的抗体，所述共刺激分子诸如但不限于 CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及与CD83特异性结合的配体。

“共刺激分子”是指在MIL上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导MIL的共刺激应答诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。

本文使用的“共刺激信号”是指与初级信号(诸如TCR/CD3连接)组合，导致MIL增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

“疾病”是受试者的健康的状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有得到改善则动物的健康继续恶化。相比之下，受试者中的“病症”是健康的状态，其中受试者能够维持体内平衡，但其中受试者的健康状态不如在不存在病症的情况下那样有利。如果不进行治疗，病症不一定引起受试者的健康状态进一步下降。

本文使用的“有效量”意指提供治疗或预防益处的量。

“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列充当用于在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列及由此生成的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码蛋白。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列一致，并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)两者可称为编码蛋白或者该基因或cDNA的其他产物。

本文使用的“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统的或者在其内部产生的任何材料。

本文使用的术语“外源性”是指自生物体、细胞、组织或系统的外部引入的或者产生的任何材料。

本文使用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列一致性。当两个比较序列两者中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子中每一个中的一个位置都被腺嘌呤占据，则分子在该位置为同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置的数目除以比较位置的数目×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个匹配或同源，则这两个序列为60%同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50%同源性。通常，在两个序列比对给出最大同源性时进行比较。

本文使用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”定义为一类起抗体作用的蛋白。由B细胞表达的抗体有时称为BCR (B细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白中的5个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。

“分离的”意指从天然状态改变或除去。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以基本上纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境诸如宿主细胞中。

如本文所使用，对于通常存在的核酸碱基使用以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷且“U”是指尿苷。

本文使用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中，慢病毒的独特之处在于能够感染非分裂细胞；它们可将大量的遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV全部为慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供实现显著水平的体内基因转移的手段。

本文使用的术语“骨髓浸润淋巴细胞”(“MIL”)是指源自骨髓的淋巴细胞。骨髓浸润淋巴细胞(“MIL”)与外周血淋巴细胞(“PBL”)以及肿瘤浸润淋巴细胞(“TIL”)具有许多可区分的差异。由于抗原呈递细胞(“APC”)的丰富性，骨髓(“BM”)微环境是一种特殊的免疫小生境。这些抗原呈递细胞的存在允许处理和呈递抗原以维持在骨髓隔室中发现的较高水平的中央型记忆细胞。(Li JM等人 J Immunol. 2009 Dec 15; 183(12):7799-809)。这些MIL表达记忆标志物诸如CD45RO+和CD62L+，并且存在比PBL中发现的记忆细胞更多的记忆MIL(Noonan K等人 Clin Cancer Res. 2012 Mar 1; 18(5):1426-34)。此外，由于其连续针对抗原引发记忆细胞的能力，MIL不仅仅是血液恶性肿瘤的“TIL”(Beckhove P等人 J ClinInvest. 2004 Jul 1; 114(1): 67-76; Castiglioni P等人 6 J Immunol 2008; 180:4956-4964)。由于在骨髓基质中大量表达的同源抗原基质衍生的1型因子(“SDF1”)，MIL也比其PBL对应物表达更多的CXCR4 (Noonan K等人 Cancer Res. 2005 Mar 1; 65(5):2026-34)。与PBL相比，MIL中41BB的表达也增加，这可能是由于BM微环境的低氧性质。进一步，与TIL形成对比，MIL可以从所有患者收获和扩增(Noonan, K等人 Sci Transl Med.2015 May 20; 7(288): 288ra78)。TIL仅在约50%的患者中发现，且仅约25%的患者具有可扩增的TIL。与外周血淋巴细胞(PBL)形成对比，MIL具有广泛的内源性抗原库，这解释了其内在肿瘤特异性——一种PBL中完全不存在的特征(Noonan等人 Clin Cancer Res)。

除非另外规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

术语“可操作连接”是指调节序列与异源核酸序列之间导致后者表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列置于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作连接至编码序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中连接两个蛋白编码区。

术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲表明相对于来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自疾病区域，如患者的特定组织或器官内的实体肿瘤的细胞中的肿瘤抗原的异常表达水平。可通过本领域已知的标准测定确定具有特征为肿瘤抗原的过表达的实体肿瘤或血液恶性肿瘤的患者。

免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文可互换使用，并且是指任何动物或其细胞，无论是体外还是原位，均适合于本文描述的方法。在某些非限制性的实施方案中，患者、受试者或个体是人。

本文使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且是指由经肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目没有设置限制。多肽包括包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸的任何肽或蛋白。本文使用的该术语是指短链(其在本领域中通常也例如称为肽、寡肽和寡聚物)和较长的链(其在本领域中通常称为蛋白)，其存在许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异型二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

本文使用的术语“启动子”定义为起始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机构或引入的合成机构识别的DNA序列。

本文使用的术语“启动子/调节序列”意指可操作连接至启动子/调节序列的基因产物表达需要的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列也可包括基因产物表达需要的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可例如是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。

“组成型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作连接时，引起基因产物在细胞的大多数或全部生理条件下在细胞中产生的核苷酸序列。

“诱导型”启动子是当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作连接时，引起基因产物基本上仅在细胞中存在对应于启动子的诱导物时才在细胞中产生的核苷酸序列。

“组织特异性的”启动子是当与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作连接时，引起基因产物基本上仅在细胞为对应于启动子的组织类型的细胞时才在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“刺激”意指通过刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合，从而介导信号转导事件诸如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导而诱导的初级应答。刺激可介导某些分子的表达改变，诸如TGF-β下调和/或细胞骨架结构的重组等。

如同该术语在本文中使用的那样，“刺激分子”意指与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的MIL上的分子。

本文使用的“刺激配体”意指当存在于抗原呈递细胞(例如aAPC、树突状细胞、B细胞等)上时，可与MIL上的同源结合配偶体(本文称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导MIL的初级应答(包括但不限于活化、免疫应答的启动、增殖等)的配体。刺激配体是本领域众所周知的，并且尤其包括负载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超级激动剂(superagonist)抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体。

术语“受试者”意欲包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

本文使用的术语“治疗的”意指治疗和/或预防。治疗作用通过抑制、缓解或根除疾病状态来获得。

术语“治疗有效量”是指将引发研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在探寻的组织、系统或受试者的生物或医学应答的受试化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展或在某种程度上减轻的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物、待治疗的受试者的疾病及其严重程度和年龄、重量等而变化。

如同该术语在本文中使用的那样，“治疗”疾病意指减少受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源性核酸借以转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。

本文使用的短语“在转录控制下”或“可操作连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

“载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子性或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如，如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

I. 嵌合抗原受体

本文提供了包括细胞外和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。所述细胞外结构域包括另外称为抗原结合部分的靶标特异性结合元件。细胞内结构域或者细胞质结构域可包括共刺激信号传导区和/或ζ链的一部分。共刺激信号传导区是指包括共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体以外的淋巴细胞对抗原有效应答需要的细胞表面分子。

可以在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间或在CAR的细胞质结构域和跨膜结构域之间并入间隔结构域。本文使用的术语“间隔结构域”通常意指起将跨膜结构域连接至多肽链中的细胞外结构域或细胞质结构域的作用的一段氨基酸。间隔结构域可包括多达300个氨基酸，或2-100个氨基酸，诸如25-50个氨基酸。

II. 细胞外结构域

在一些实施方案中，CAR包括另外称为抗原结合部分的靶标特异性结合元件。部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域来识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物的配体。因此，可充当CAR中抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌细胞相关的那些。例如，配体可以是细菌、病毒或寄生虫的蛋白。类似地，配体可以是在癌细胞表面上调的蛋白。

在一些实施方案中，可通过工程改造特异性结合肿瘤细胞上的抗原的期望的抗原结合部分的方式来工程改造CAR以靶向目标肿瘤抗原。本文使用的“肿瘤抗原”或“过度增殖性病症抗原”或“与过度增殖性病症相关的抗原”是指对特定过度增殖性病症、诸如癌症共同的抗原。本文讨论的抗原仅作为实例被包括。列表不意欲为排他性的，并且进一步的实例对本领域技术人员是显而易见的。

肿瘤抗原是由引发免疫应答(特别是T细胞介导的免疫应答)的肿瘤细胞产生的蛋白。抗原结合部分的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域众所周知的，并且包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、突变hsp70-2、M-CSF、prostase、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA，Her2/neu、存活素、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-1受体和间皮素。

在一些实施方案中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一种或多种抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可充当免疫攻击的靶抗原的蛋白。这些分子包括但不限于组织特异性抗原诸如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子组，诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。又另一组靶抗原是瘤胎抗原，诸如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成对个体肿瘤独特的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(例如CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)已被用作单克隆抗体被动免疫疗法的靶标，但成功有限。

所提及的肿瘤抗原的类型也可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对肿瘤细胞是独特的，并且不发生在体内的其他细胞上。TAA相关抗原对肿瘤细胞不是独特的，而是在不能诱导对抗原免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可发生在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下。当免疫系统不成熟并且不能应答时，TAA可以是在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者其可以是通常以极低水平存在于正常细胞上但是以高得多的水平在肿瘤细胞上表达的抗原。

TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原诸如MART-1/MelanA (MART-1)、gp100 (Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原诸如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因诸如p53、Ras、HER-2/neu；自染色体易位生成的独特的肿瘤抗原诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原诸如EB病毒抗原EBVA和人乳头状瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-901\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、YLP和TPS。

在一些实施方案中，CAR的抗原结合部分靶向抗原，所述抗原包括但不限于 CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3 TCR等。

取决于期望的待靶向的抗原，CAR可被工程改造为包括对期望的抗原靶标特异性的合适的抗原结合部分。例如，如果CD19是期望的待靶向的抗原，则针对CD19的抗体可用作抗原结合部分用于并入CAR中。因此，在一些实施方案中，CAR的抗原结合部分靶向CD19。

CAR的细胞外结构域可包含例如结合本文描述的靶标中的任一种的单链可变片段(“scFv”)。

细胞外结构域可以是任何抗原结合多肽，其广泛种类是本领域已知的。在一些情况下，抗原结合结构域是单链Fv (“scFv”)。其他基于抗体的识别结构域(cAb VHH (骆驼抗体可变结构域)和人源化版本、IgNAR VH (鲨鱼抗体可变结构域)和人源化版本、sdAb VH(单结构域抗体可变结构域)和“骆驼化”抗体可变结构域适合于使用。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域诸如单链TCR (scTv，含有ν νβ的单链双结构域TCR)也适合于使用。

本领域已知的其他细胞外结构域也可用于实施方案中(参见例如PCT专利申请公开号WO 2014/127261、美国专利号8975071，其在此通过引用并入)。

III. 跨膜结构域

就跨膜结构域而言，CAR可被设计为包含与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些实施方案中，使用天然与CAR中的结构域之一缔合的跨膜结构域。在一些情况下，可选择或通过氨基酸取代来修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。

跨膜结构域可源自天然来源或者跨膜结构域可被设计(例如来自形成α-螺旋的一段18-30个疏水性氨基酸，诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)。在来源是天然的的情况下，结构域可源自任何膜结合的蛋白或跨膜蛋白。特定用途的跨膜区可源自(即至少包含其跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。或者，跨膜结构域可被设计，在这种情况下，其将主要包括疏水性残基、诸如亮氨酸和缬氨酸。对于设计的跨膜结构域，可在膜/水界面附近找到苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸。任选地，长度在2-10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可连接CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域。甘氨酸-丝氨酸间隔子提供特别合适的接头。

IV. 细胞内结构域

CAR的细胞质结构域或者细胞内信号传导结构域负责活化MIL的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。MIL的效应子功能例如可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并引导细胞实施特化功能的蛋白部分。尽管可采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下没有必要使用整个细胞内结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，可使用这样的截短部分代替完整的链，只要其转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此意指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

用于CAR中的细胞内信号传导结构域的一些非限制性实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和共同起作用以在抗原受体接合后起始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何合成序列。

仅通过TCR生成的信号不足以完全活化淋巴细胞，还需要次级或共刺激信号。因此，MIL活化通过两种不同种类的细胞质信号传导介导：通过TCR起始抗原依赖性初级活化的那些(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。

初级细胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。

可使用的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方案中，CAR的细胞质信号传导分子包含源自CD3ζ的细胞质信号传导序列。

在一些实施方案中，CAR的细胞质结构域可被设计为包含CD3ζ信号传导结构域本身或与在CAR的情况下有用的任何其他期望的细胞质结构域组合。例如，CAR的细胞质结构域可包含CD3ζ链的一部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。在一些实施方案中，共刺激分子是除了抗原受体或其配体以外的淋巴细胞对抗原有效应答所需的细胞表面分子。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3等。因此，尽管可例举一些以4-1BB作为共刺激信号传导元件的实施方案，但是也可使用其他共刺激元件。

CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选地长度在2-10个氨基酸之间)可形成连接。甘氨酸-丝氨酸间隔子提供特别合适的接头。

在一些实施方案中，细胞质结构域被设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞质结构域被设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞质结构域被设计为包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28与4-1BB的信号传导结构域。

在一些实施方案中，CAR中的细胞质结构域被设计为包含4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。

在一些实施方案中，CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域、包含共刺激结构域和信号传导结构域的细胞内结构域。细胞外结构域是结合肿瘤抗原的结构域。这样的抗原的实例包括但不限于BCMA、PSMA、CD19和CD38。细胞外结构域可以是抗体，诸如scFV，或如本文所述或本领域技术人员已知的其他类型的抗体。在一些实施方案中，细胞外结构域是衍生自达雷木单抗(daratumumab)的scFv。在一些实施方案中，细胞外结构域是可以结合本文所述的一种或多种抗原的FN3结构域。在一些实施方案中，细胞外结构域是天然结合抗原的蛋白或蛋白的一部分。

在一些实施方案中，跨膜结构域是人CD8的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是CD3ζ、CD4、CD8或CD28的跨膜结构域。

在一些实施方案中，共刺激结构域是4-1BB共刺激结构域(细胞内信号传导结构域)。也可以使用其他共刺激结构域。例如，可以使用CD28的细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，信号传导结构域是来自CD3ζ的信号传导结构域。

在一些实施方案中，CAR包含如下表、表1中所举例说明的构建体：

V. 载体

编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作连接至启动子，并将该构建体并入表达载体中来实现。载体可适合于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节期望的核酸序列表达的启动子。

源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定整合及其在子细胞中繁殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠白血病病毒的载体的额外优点，因为其可转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们也具有免疫原性低的额外优点。

编码期望的分子的核酸序列可使用本领域已知的重组方法获得，诸如例如通过筛选来自表达基因的细胞的文库、通过从已知包含基因的载体衍生基因或通过使用标准技术直接从含有基因的细胞和组织分离。或者，目标基因可合成产生，而不是克隆。

使用标准基因递送方案，表达构建体也可用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5399346、5580859、5589466，其在此通过引用并入)。在一些实施方案中，实施方案提供了基因疗法载体。核酸序列也可使用基因编辑技术(诸如但不限于CRISPR)插入。

核酸可被克隆至许多类型的载体中。例如，核酸可被克隆至包括但不限于以下的载体中：质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于例如Green＆Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual)，(第4版, 2012))和其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起功能的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标志物(例如WO 01/96584、WO 01/29058和美国专利号6326193)。

已经开发了许多基于病毒的系统用于基因转移至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供一种便利的平台。可使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可将重组病毒分离并在体内或离体递送至受试者的细胞。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。

另外的调节元件(例如启动子和增强子)调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-100000 bp，尽管最近已经显示许多启动子在起始位点下游也含有功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件颠倒或相对于彼此移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可增加到相距50 bp。取决于启动子，单个元件可合作或独立地起作用以活化转录。

合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α (EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40 (SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV 启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。启动子不限于组成型启动子。也可使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供一种分子开关，其能够在期望这样的表达时开启可操作连接的多核苷酸序列的表达，或者在不期望表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子和四环素启动子。

为了评价CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体也可含有选择标志物基因或报告基因或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择标志物可携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序中。选择标志物和报告基因两者侧翼可以是适当的调节序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择标志物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。

报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评估调节序列的功能性。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或者由受体生物体或组织表达，并且编码多肽(其表达通过一些可易于检测的特性例如酶活性表现)的基因。在将DNA引入受体细胞后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等人, 2000 FEBSLetters 479: 79-82)。在一些实施方案中，报告基因是mCherry。

将基因引入细胞中和表达的方法是本领域众所周知的。在表达载体的背景下，载体可易于通过本领域的任何方法引入宿主细胞例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移至宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域众所周知的(参见例如Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(第4版, 2012))。

用于将目标多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已经成为用于将基因插入哺乳动物细胞中的广泛使用的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、I型单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒等(参见例如美国专利号5350674和5585362)。

用于将核酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。

在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂用于将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。另一方面，核酸可与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可被包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子连接至脂质体、捕获在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、含有胶束或与胶束复合、或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，作为胶束，或具有“塌陷的”结构。它们也可简单地散布在溶液中、可能形成大小或形状不均匀的聚集体。

VI. 骨髓浸润淋巴细胞

在MIL的扩增和遗传修饰之前，MIL的来源获得自受试者。在具有许多类型癌症(包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤)中的任何一种的患者中，与外周血相比，T细胞可易于获得自骨髓微环境，其具有提高的肿瘤特异性(参见例如美国专利申请公开号US 2011/0223146，其在此通过引用并入)。通过比较获得自具有血液恶性肿瘤的受试者的这两种不同隔室的T细胞，观察到获得自骨髓抽吸物的骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的寡克隆限制。方法(诸如包括抗CD3/CD28抗体缀合的磁珠的那些)可用于体外活化并扩增骨髓细胞以生成活化的MIL。在所有被检查患者中，与外周血淋巴细胞相比，活化的MIL显示更大的扩增和增强的肿瘤活性。这些发现提示：1) 骨髓是肿瘤特异性T细胞的储库；2) 在所研究的所有患者中，MIL可被活化并扩增(与在转移性黑色素瘤中观察到的有限数目相比)；3) 这些细胞在输注后运输至骨髓; 4) 在NOD/SCID小鼠中过继转移后持续长达200天；并且5) 活化的MIL能够根除预先建立的疾病并靶向骨髓瘤干细胞前体，因此意味着广泛的抗原识别。

代表总骨髓细胞群的少数部分的T细胞可以在存在几乎完整骨髓的情况下扩增。为了确保最大的肿瘤-T细胞接触，可以将吸取的骨髓基于淋巴细胞分离培养基密度梯度分级分离，并可以收集细胞，几乎达到红细胞沉淀的水平。这种分离方法基本上仅除去红血细胞和嗜中性粒细胞，提供几乎完整的骨髓，并导致收集T细胞以及肿瘤细胞两者。T细胞可在没有T细胞特异性分离步骤和没有肿瘤细胞分离步骤的情况下扩增。细胞类型特异性分离步骤包括例如使用抗体或其他细胞类型特异性的可检测标记物进行的细胞标记和使用荧光活化细胞分选(FACS)进行分选。在一些实施方案中，所述方法可在没有这样的标记和细胞分选方法的情况下实施。

为了用珠活化，珠-T细胞接触优选地在培养的最初24-48小时期间最大化。因为T细胞仅代表群体中总细胞的少数部分，因此通过使用足够数目的珠:细胞(其范围为约1:1至约5:1的珠:细胞，优选地约2:1-4:1的珠:细胞，更优选地约2.5:1至3.5:1的珠:细胞)来促进T细胞与抗体包被的珠接触。这些比率适用于所公开的珠，并且珠大小和/或珠上抗体密度的变化可改变珠:细胞比率。

在一些实施方案中，装置可用于培养细胞，提供光滑、刚性、圆形的底部表面以促进通过重力极接近地收集细胞和珠(参见例如美国专利申请公开号US2011/0223146，其在此通过引用并入)。该装置包括放置在支持物上的封闭的细胞容器。在存在珠的情况下至少第一个3天培养期间，容器优选地静止(即不摇动或旋转)以进一步促进珠和细胞之间的接触。这些步骤和条件对于使用珠使肿瘤特异性MIL的扩增最大化，以允许产生足够的治疗有用的细胞是优选的。进一步，这些培养条件促进T细胞的生长而不促进肿瘤细胞的生长。

MIL的几种属性使其成为免疫疗法的合适候选物。具体地，在本文描述的条件下，它们在刺激后比PBL更快速地扩增，并且在活化后经常维持偏态的T细胞库，可能提示肿瘤特异性增强。尽管未活化的MIL对自体肿瘤显示显著的低应答性，但是活化并扩增T细胞并显著增强其肿瘤反应性的能力否定了缺失耐受性(deletional tolerance)作为这种情况下介导T细胞无应答性的推定机制。此外，活化的MIL显示肿瘤特异性，对非恶性造血元件的交叉反应性小，具有更高的CXCR-4表达，并且对SDF-I具有更大的应答性，提示MIL向骨髓的迁移能力增加。总之，这些研究结果显示活化并扩增具有记忆/效应表型的骨髓浸润T细胞的能力，所述T细胞似乎靶向存在于成熟的终末分化浆细胞及其前体两者上的广泛范围的肿瘤抗原，并且具有趋化因子受体，这似乎促进运输至骨髓隔室——这是使过继免疫疗法的抗肿瘤免疫力最大化所必需的特征。

MIL的活化并扩增基于两个先前报道的现象：肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤特异性增强(Rosenberg等人 Science 1986; 233:1318)，以及证实具有黑色素瘤(Letsch等人Cancer Res 2003; 63:5582-6)、乳腺癌(Feuerer等人 Nat Med 2001; 7:452)和多发性骨髓瘤(一种骨髓也展现肿瘤微环境的疾病)(Dhodapkar等人 Proc Natl Acad Sci U S A2002; 99:13009)的患者的骨髓中存在肿瘤反应性T细胞。

本文提供了活化并扩增MIL的能力，作为克服其无应答性并且与活化的PBL相比显著增加其肿瘤特异性的手段。肿瘤在骨髓微环境中的存在可能在保留活化的MIL的抗原特异性中起关键作用。几种假设可能解释活化的MIL的反应性相比于活化的PBL增加。不受机制的束缚，提示抗原在骨髓中的持续存在可能对维持记忆应答是必要的。抗CD3/CD28抗体包被的珠活化可能逆转骨髓T细胞群体中的耐受性。类似地，平板结合的和/或可溶性CD3和/或CD28可用于活化。然而，活化MIL的手段不是特别限制的，并且任何合适的活化方法可用于各个实施方案中。如本文所证实，活化的MIL的肿瘤特异性取决于T细胞活化期间抗原的存在。进一步，骨髓是一种功能性淋巴器官，其能够在存在危险信号(感染、炎症、自身免疫和癌症)的情况下经由反应性淋巴样滤泡产生初级免疫应答和次级应答两者。

骨髓瘤患者中的T细胞显示VB T细胞受体库的相当的偏态(skewing)。这样的偏态提示具有显著肿瘤特异性的T细胞的选择性生长或由具有显著肿瘤负担的患者的特征性的明显基础性T细胞缺陷导致。在后者情况下，用抗CD3/CD28抗体缀合的磁珠多克隆刺激PBL的益处是恢复正常T细胞库并因此纠正任何基础性T细胞缺陷的能力。相比之下，如果特定VB家族的寡克隆表达反映具有肿瘤特异性的T细胞的存在，则具有维持的抗肿瘤活性和T细胞受体库偏态的该T细胞合并物的活化和扩增可能是优选的。如本文所证实，在用抗CD3/CD28抗体缀合的磁珠活化并扩增后，PBL使其VB T-细胞库正常化，而MIL维持VB限制。考虑到活化的MIL的肿瘤特异性应答增强，其偏态T-细胞库可能提示更大的肿瘤识别。不受机制的束缚，在T细胞扩增期间保持并可能地增加VB偏态的程度可能是重要的。

用抗CD3/CD28抗体缀合的磁珠活化并扩增MIL生成有效的抗肿瘤活性，并且在该扩增期间抗原的持续存在在维持(和增强)肿瘤特异性中是显著重要的。Dhodapkar等人(2002)也已经研究了MIL在骨髓瘤患者中的作用。与我们的发现类似，新鲜分离的MIL或PBL在用自体肿瘤或肿瘤肽刺激后未显示活性。然而，尽管该研究在用肿瘤脉冲的树突状细胞孵育12-16天后的酶联免疫斑点测定中，在从外周血和骨髓隔室获得的T细胞之间没有看到显著差异，但是在我们的系统中，在检查的所有测定中观察到活化的MIL的抗肿瘤应答比活化的PBL大10倍。与MIL的树突状细胞活化相比，这些不一致的结果可能与抗CD3/CD28珠刺激的功效有关。不受机制的束缚，似乎活化并扩增的MIL培养物中肿瘤反应性T细胞的频率增加可能反映耐受性的破坏和肿瘤反应性T细胞功能的恢复。此外，在骨髓微环境内刺激MIL是可解释这些结果的另一个重要因素。

通过负向选择富集MIL群体可通过针对负向选择的细胞独特的表面标志物的抗体组合来完成。一种方法为经由负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。

为了通过正向或负向选择分离期望的细胞群，细胞和表面(例如颗粒诸如珠)的浓度可以变化。在某些实施方案中，可以期望的是显著减少其中珠和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞与珠的最大接触。

在一些实施方案中，可以期望的是使用较低浓度的细胞。通过显著稀释MIL和表面(例如颗粒诸如珠)的混合物，使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。这选择表达大量的待结合至颗粒的期望抗原的细胞。

本文还提供了在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的一定时间段，从受试者收集包含MIL的样品。因此，可在必要的任何时间点收集待扩增的细胞来源，并将期望的细胞(诸如MIL)分离和冷冻用于以后在MIL疗法中用于将得益于MIL疗法的任何数目的疾病或病况，诸如本文描述的那些。在一些实施方案中，包含MIL的样品取自普通健康受试者。在一些实施方案中，包含MIL的样品取自处于发展疾病的风险、但是尚未发展成疾病的普通健康受试者，并将目标细胞分离并冷冻用于以后使用。在一些实施方案中，MIL可被扩增、冷冻并在以后的时间使用。在一些实施方案中，在诊断如本文描述的特定疾病后不久，但在任何治疗之前，从患者收集样品。在一些实施方案中，在任何数目的相关治疗模式之前(包括但不限于用以下药剂治疗)，从来自受试者的包含MIL的样品分离细胞：所述药剂诸如那他珠单抗，依法珠单抗，抗病毒药剂，化学疗法，放射，免疫抑制药物，诸如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫清除药物(immunoablative agent)，诸如CAMPATH，抗CD3抗体，环磷酰胺，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。在一些实施方案中，为患者分离细胞并冷冻用于以后与骨髓或干细胞移植、使用化疗药物诸如氟达拉滨的MIL消除疗法(ablative therapy)、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH，共同(例如在之前、同时或之后)使用。在一些实施方案中，细胞在之前被分离并可被冷冻用于以后在B细胞消除疗法，诸如与CD20反应的药物例如Rituxan之后的治疗。

在一些实施方案中，MIL在治疗之后直接获得自患者。在这方面，已经观察到在某些癌症治疗(特别是用损害免疫系统的药物治疗)之后，在治疗后不久，患者会正常从治疗恢复期间，所获得的MIL的质量可能是最佳的或者其离体扩增的能力得以改善。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可处于增强的植入和体内扩增的优选状态。因此，可在该恢复期期间收集MIL。

MIL通常可使用例如在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005(其在此通过引用并入)中描述的方法来活化并扩增。

在一些实施方案中，MIL通过与连接有刺激CD3/TCR复合物相关信号的药剂和刺激MIL的表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。具体地，MIL群体可如本文所述进行刺激，诸如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或者通过接触连同钙离子载体一起的蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)。为了共刺激MIL的表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可在适合于刺激MIL的增殖的条件下使MIL群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+MIL或CD8+MIL的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)，可如本领域通常已知的其他方法那样使用(Berg等人, Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen等人, J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland等人, J.Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。

在某些实施方案中，MIL的初级刺激信号和共刺激信号可由不同的方案提供。例如，提供每种信号的药物可处于溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，药剂可偶联至相同的表面(即以“顺式”形成)或偶联至分开的表面(即以“反式”形成)。或者，可将一种药剂偶联至表面并且另一种药剂在溶液中。在一些实施方案中，提供共刺激信号的药物结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的药剂处于溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种药剂均可处于溶液中。在一些实施方案中，药剂可以呈可溶的形式，且然后交联至表面，诸如表达Fc受体或将结合药剂的抗体或其他结合剂的细胞(通常参见美国专利申请公开号20040101519和20060034810，其在此通过引用并入，尤其是对于考虑用于活化并扩增MIL的人工抗原呈递细胞(aAPC))。

在一些实施方案中，两种药剂固定在珠上，或者在相同的珠上，即“顺式”，或者至分开的珠上，即“反式”。举例来说，提供初级活化信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种药剂以等同的分子的量共固定至相同的珠。在一些实施方案中，使用结合至珠的每种抗体的1:1比率用于CD4+MIL扩增和MIL生长。在一些实施方案中，使用结合至珠的抗CD3:CD28抗体的一定比率，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比观察到MIL扩增的增加。在一些实施方案中，与使用1:1的比率观察到的扩增相比观察到增加约1至约3倍。在一些实施方案中，结合至珠的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1-1:100及其之间的所有整数值。在一些实施方案中，比抗CD3抗体更多的抗CD28抗体结合至颗粒，即CD3:CD28的比率小于1。在一些实施方案中，结合至珠的抗CD28抗体:抗CD3抗体的比率大于2:1。在一些实施方案中，使用结合至珠的抗体的1:100 CD3:CD28比率。在一些实施方案中，使用结合至珠的抗体的1:75 CD3:CD28比率。在一些实施方案中，使用结合至珠的抗体的1:50 CD3:CD28比率。在一些实施方案中，使用结合至珠的抗体的1:30 CD3:CD28比率。在一些实施方案中，使用结合至珠的抗体的1:10CD3:CD28比率。在一些实施方案中，使用结合至珠的抗体的1:3 CD3:CD28比率。在一些实施方案中，使用结合至珠的抗体的3:1 CD3:CD28比率。

1:500-500:1及其之间的任何整数值的颗粒:细胞的比率可用于刺激MIL。如本领域普通技术人员可易于意识到的，颗粒:细胞的比率可取决于相对于靶细胞的粒径。例如，小尺寸珠仅能结合几个细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞:颗粒的比率范围为1:100-100:1及其之间的任何整数值，并且在进一步实施方案中比率包括1:9-9:1及其之间的任何整数值，也可用于刺激MIL。如以上所示，导致MIL刺激的抗CD3和抗CD28偶联的颗粒:细胞的比率可以变化，然而某些数值包括但不限于1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1。在一些实施方案中，比率为每个细胞至少1:1个颗粒。在一些实施方案中，使用1:1或更小的颗粒:细胞的比率。在一些实施方案中，颗粒:细胞比率为1:5。在一些实施方案中，颗粒:细胞的比率可根据刺激日而变化。例如，在一些实施方案中，颗粒:细胞的比率在第一天为1:1-10:1，并且其后每天或每隔一天向细胞添加另外的颗粒长达10天，最终比率为1:1-1:10 (基于添加日的细胞计数)。在一些实施方案中，在刺激的第一天，颗粒:细胞的比率为1:1，并在刺激的第3天和第5天调整为1:5。在一些实施方案中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒至刺激的第1天最终比率为1:1，和在刺激的第3天和第5天最终比率为1:5。在一些实施方案中，在刺激的第1天，颗粒:细胞的比率为2:1，和在刺激的第3天和第5天调整为1:10。在一些实施方案中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒至刺激的第1天最终比率为1:1，和在刺激的第3天和第5天最终比率为1:10。本领域技术人员将理解，还可使用多种其他比率。例如，比率将根据粒径和细胞大小和类型而变化。

在一些实施方案中，将MIL与药剂包被的珠组合，且随后分离珠和细胞，且然后培养细胞。在一些实施方案中，在培养之前，不分离药剂包被的珠和细胞，而是一起培养。在一些实施方案中，珠和细胞首先通过施加力、诸如磁力进行浓缩，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。

举例来说，细胞表面蛋白可通过使抗CD3和抗CD28连接的顺磁珠(3×28珠)接触MIL来连接。在一些实施方案中，将细胞和珠(例如1:1比率的DYNABEADS® M-450 CD3/CD28T顺磁珠)在缓冲液、优选地PBS (不含二价阳离子、诸如钙和镁)中组合。本领域普通技术人员可易于理解，可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可能在样品中非常稀少，并且仅占样品的0.01%，或者整个样品(即100%)可包含目标靶细胞。因此，可使用任何细胞数目。在某些实施方案中，可以期望的是显著减少其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一些实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在一些实施方案中，使用1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0千万个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施方案中，使用7.5、8.0、8.5、9.0、9.5千万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在一些实施方案中，可使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞，诸如CD28阴性细胞。这样的细胞群可具有治疗价值，并且在某些实施方案中将是期望获得的。

在一些实施方案中，可将混合物培养几个小时(约3小时)至约14天或其之间的任何小时整数值。在一些实施方案中，可将混合物培养21天。在一些实施方案中，将珠和MIL一起培养约8天。在一些实施方案中，将珠和MIL一起培养2-3天。也可期望几个循环的刺激，使得MIL的培养时间可以是60天或更长。适合于MIL培养的条件包括可含有增殖和活力必需的因子的适当培养基(例如最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15 (Lonza))，所述因子包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2 (IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。其他用于细胞生长的添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂、诸如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一定量的足以用于MIL生长和扩增的细胞因子。抗生素例如青霉素和链霉素仅包括在实验培养物中，而不包括在待输注入受试者中的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气+5% CO₂)。

除了CD4和CD8标志物以外，其他表型标志物变化显著，但在很大程度上，在细胞扩增过程期间可重现。因此，这样的重现性实现针对特定目的定制活化的MIL产物的能力。

另外，可使用用于制备肿瘤浸润淋巴细胞的方法来制备MIL。例如，高剂量IL-2生长条件可用于生成“年轻的”TIL，并且这些方法可适用于制备MIL (参见例如美国专利号8383099，其在此通过引用并入)。

在一些实施方案中，MIL也可在低氧条件下被活化和/或扩增。在低氧条件下生长MIL的一个实例可例如在WO2016037054中发现，其在此通过引用以其整体并入。

在一些实施方案中，所述方法可包括：移取来自受试者的骨髓中的细胞、淋巴细胞和/或骨髓浸润淋巴细胞(“MIL”)；在低氧环境中孵育细胞，从而产生活化的MIL；并将活化的MIL施用于受试者。如本文所述，细胞也可以在存在抗CD3/抗CD28抗体和细胞因子的情况下被活化。如本文所述，细胞因子也可用于活化MIL。编码CAR的核酸分子，诸如本文描述的那些核酸分子之一，可在MIL在低氧环境中孵育之前或之后转染或感染至细胞中。

低氧环境可包含少于约7%的氧，诸如少于约7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的氧。例如，低氧环境可包含约0%的氧至约7%的氧，诸如约0%的氧至约6%的氧、约0%的氧至约3%的氧、约0%的氧至约2%的氧、约0%的氧至约1%的氧。在一些实施方案中，低氧环境包含约1%至约7%的氧。在一些实施方案中，低氧环境为约1%至约5%的氧。在一些实施方案中，低氧环境为约0.5%至约1.5%的氧。在一些实施方案中，低氧环境为约0.5%至约2%的氧。低氧环境可包含约7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或约0%的氧或在这些量之间的其所有分数的氧。

在低氧环境中孵育MIL可包括将MIL例如在组织培养基中孵育至少约1小时，诸如至少约12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、60小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者甚至至少约14天。孵育可包括孵育MIL约1小时至约30天，诸如约1天至约20天、约1天至约14天或者约1天至约12天。在一些实施方案中，在低氧环境中孵育MIL包括在低氧环境中孵育MIL约2天至约5天。所述方法可包括在低氧环境中孵育MIL约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，所述方法包括在低氧环境中孵育MIL约3天。在一些实施方案中，所述方法包括在低氧环境中孵育MIL约2天至约4天。在一些实施方案中，所述方法包括在低氧环境中孵育MIL约3天至约4天。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在常氧环境中孵育MIL，例如在低氧环境中孵育MIL之后。

常氧环境可以是至少约7%的氧。常氧环境可以是约8%的氧至约30%的氧，约10%的氧至约30%的氧、约15%的氧至约25%的氧、约18%的氧至约24%的氧、约19%的氧至约23%的氧或者约20%的氧至约22%的氧。在一些实施方案中，常氧环境可以是约21%的氧。

在常氧环境中孵育MIL可包括例如在组织培养基中孵育MIL至少约1小时，诸如至少约12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、60小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者甚至至少约14天。孵育可包括孵育MIL约1小时至约30天，诸如约1天至约20天、约1天至约14天、约1天至约12天或者约2天至约12天。

在某些实施方案中，提供了表达重组嵌合抗原受体(“CAR”)的MIL。可以对MIL进行修饰，以在扩增和活化之前、期间或之后表达CAR。在某些实施方案中，CAR包括BCMA、PSMA、CD19或CD38作为靶受体。在某些方面，实施方案涉及用于制备重组MIL的方法，其包括以下步骤：获得包括MIL的骨髓；和用编码嵌合抗原受体的核酸转染、转化或转导MIL。在另外的方面，实施方案涉及通过向受试者施用有效量的包括CAR的重组MIL来治疗受试者的病况的方法。

在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法分别从患者的骨髓和血液样品中活化和扩增MIL和/或外周血淋巴细胞(PBL)。T细胞表型标志物(CD3、CD4和CD8)将通过流式细胞术在扩增前后进行表征。活化的方法是本领域中已知的，包括在美国公开号20180200367、20180185434、20170266232、20170258838、20160331781、20150320798、20110223146和20140255433(其各自在此以其整体通过引用并入)中描述的那些。

在一些实施方案中，可以使用功能测定法在扩增的MIL和/或PBL中定量肿瘤-特异性T细胞。例如，在一些实施方案中，自体抗原-呈递细胞(APC)可以用来自选择的癌细胞系的裂解物脉冲，并与CFSE-标记的MIL或PBL共培养。用选择的细胞系裂解物或单独的培养基脉冲的APC可用作阴性对照。肿瘤-特异性细胞可以例如定义为产生IFNγ的CFSE-低、CD3+群体。

本文所述的CAR修饰的MIL细胞也可充当用于在哺乳动物中的离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。所述哺乳动物可以是人。

就离体免疫而言，在将细胞施用于哺乳动物之前，体外发生以下中的至少一种：i)细胞的扩增，ii) 将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii) 细胞的冷冻保存。

离体过程是本领域众所周知的，并在以下更充分地讨论。简而言之，从哺乳动物、诸如人分离细胞并用如本文所公开的表达CAR的载体进行遗传修饰(即体外转导或转染)。可将CAR-修饰的细胞施用于哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且CAR-修饰的细胞就受体而言可以是自体的。或者，细胞就受体而言可以是同种异体的、同基因的或异种异体的。

在一些实施方案中，在置于常氧环境中之后或在将其置于常氧环境中之前，细胞用编码本文描述的CAR的核酸分子转染或感染。

在一些实施方案中，从具有不同量的骨髓受累(bone marrow involvement)的选择的癌症患者收集骨髓样品。在骨髓吸取时，还将从一部分患者收集匹配的外周血。在一些实施方案中，将骨髓样品离心以除去红血细胞。在一些实施方案中，骨髓样品不经受单采术(apheresis)或通过单采术获得。在一些实施方案中，骨髓样品不包含外周血淋巴细胞(“PBL”)或者骨髓样品基本上不含PBL。可以通过例如遵循美国公开号20180200367、20180185434、20170266232、20170258838、20160331781、20150320798、20110223146和20140255433(其各自在此以其整体通过引用并入)中所述的程序来分离MIL。这些方法选择的细胞与已变为称为TIL的不同。因此，MIL不是TIL。

在一些实施方案中，然后可将细胞接种于平板、烧瓶或袋中。在一些实施方案中，低氧条件可通过用95%氮气和5% CO₂气体混合物冲洗低氧室或细胞培养袋3分钟来实现。这可导致容器中例如1-2%或者更少的O₂气体。然后，细胞可如本文所述或如在WO2016037054(其在此通过引用并入)的实施例中进行培养。

在一些实施方案中，提供了包含如本文所述的CAR的低氧MIL。在一些实施方案中，低氧MIL处于约0.5%至约5%氧气的环境中。在一些实施方案中，低氧MIL处于约1%至约2%氧气的环境中。在一些实施方案中，低氧MIL处于约1%至约3%氧气的环境中。在一些实施方案中，低氧MIL处于约1%至约4%氧气的环境中。低氧MIL是已在低氧环境(诸如本文描述的那些)中孵育一段时间的MIL，诸如本文描述的那些。如本文所述，低氧MIL也可在存在抗CD3/抗CD28珠或其他类似的活化试剂的情况下被活化。因此，包含CAR的低氧MIL也可以是活化的低氧MIL。

细胞(或亲代细胞)可用包含编码CAR的核苷酸序列的载体转染、转化或转导。载体可以是慢病毒载体(LV)。例如，LV编码CAR，其组合特异性抗体的抗原识别结构域与CD3ζ、CD28、4-1BB或其任何组合的细胞内结构域。因此，在一些情况下，转导的MIL可引发CAR-介导的T-细胞应答。

通过常规转染方法将携带CAR的载体转染至MIL中。可以使用任何病毒载体，只要它可以被感染或转染至MIL中。转染、转化或转导可以在相对于MIL的扩增/活化的第0天或第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天或第7天进行。在扩增后的第10天至第14天，MIL表达CAR。这些MIL是CD3阳性的并表达IFNγ。活化的MIL还根据活化的方法以不同的比率表达CD4和CD8。

在扩增/活化后的第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天收获MIL。可以将活化和收获的MIL进行洗涤，计数和针对CD3、CD4、CD8和GFP进行表型分析。可以将它们等分并冷冻用于将来使用。

VII. 治疗方法

本文提供了CAR将原代MIL的特异性重定向至肿瘤抗原的用途。因此，在一些实施方案中，提供了用于在哺乳动物中刺激对靶细胞群或组织的MIL-介导的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用表达CAR的MIL的步骤，其中CAR包括与预定靶标特异性相互作用的结合部分、包含例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分和共刺激信号传导区。

在一些实施方案中，提供了细胞疗法，其中MIL被遗传修饰以表达CAR并将CAR-MIL输注给有此需要的受体。输注的细胞能够在受体中杀伤肿瘤细胞(或其他靶标)。不像抗体疗法，CAR-MIL能够在体内复制，导致长期持续存在，这可导致持续的肿瘤控制。

在一些实施方案中，CAR-MIL可经历强健的体内MIL扩增，并可持续延长的时间量。

可治疗的癌症包括没有血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以是非实体肿瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或者可以是实体肿瘤。待用CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病("ALL")、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病和成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。

实体肿瘤是通常不含有囊肿或液体区域的异常组织块。实体肿瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体肿瘤诸如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴样恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合型神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成髓细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤(menangioma)、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤和脑转移瘤)。

在一些实施方案中，CAR的抗原结合部分(antigen bind moiety portion)被设计为治疗特定的癌症。例如，被设计为靶向CD19的CAR可用于治疗癌症和病症，包括但不限于前-B急性淋巴母细胞白血病("ALL")(儿科适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、同种异体骨髓移植后的挽救等。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向CD22以治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症和病症包括但不限于前-B ALL (儿科适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、同种异体骨髓移植后的挽救等，可使用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的CAR的组合治疗。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向间皮素以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向CD33/IL3Ra以治疗急性髓性白血病等。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向c-Met以治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向PSMA以治疗前列腺癌等。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向糖脂F77以治疗前列腺癌等。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向EGFRvIII以治疗成胶质细胞瘤等。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向GD-2以治疗成神经细胞瘤、黑色素瘤等。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向NY-ESO-1 TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤等。

在一些实施方案中，CAR可被设计为靶向MAGE A3 TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑色素瘤等。

然而，实施方案不应解释为仅限于本文公开的抗原靶标和疾病。相反，实施方案应解释为包括与疾病(其中CAR可用于治疗所述疾病)相关的任何抗原靶标。

CAR-修饰的MIL也可充当用于在受试者、诸如人中的离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。

就离体免疫而言，在将细胞施用于哺乳动物之前，体外发生以下中的至少一种：i)细胞的扩增，ii) 将编码CAR的核酸引入细胞中，和/或iii) 细胞的冷冻保存。在一些实施方案中，所有步骤在将细胞施用于哺乳动物之前进行。

离体过程是本领域众所周知的，并在以下更充分地讨论。简而言之，从哺乳动物(诸如人)分离细胞并用本文公开的表达CAR的载体进行遗传修饰(即体外转导或转染)。可将CAR-MIL施用于哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且CAR-MIL就受体而言可以是自体的。或者，细胞就受体而言可以是同种异体的、同基因的或异种异体的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗以外，本文也提供了用于体内免疫以在患者中引发针对抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常，如本文所述活化并扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫功能受损的个体中出现的疾病。在一些实施方案中，CAR-修饰的MIL用于治疗CCL。在一些实施方案中，细胞用于治疗处于发展CCL的风险中的患者。因此，提供了用于治疗或预防CCL的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的CAR-修饰的MIL。

CAR-修饰的MIL可单独或者作为与稀释剂和/或与其他组分、诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合的药物组合物施用。简而言之，药物组合物可包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的靶细胞群。这样的组合物可包含缓冲液、诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物、诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸、诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂、诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)和防腐剂。在一些实施方案中，组合物被配制成用于静脉内施用。

药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的量和频率将根据诸如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度等因素来确定，尽管适当的剂量可通过临床试验来确定。

当指明“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的组合物的准确量可由医生考虑到患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度和状况的个体差异来确定。通常可以说，包含本文描述的MIL的药物组合物可以10⁴-10⁹个细胞/kg体重，优选地10⁵-10⁶个细胞/kg体重(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用。MIL组合物也可以这些剂量施用多次。细胞可通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见例如Rosenberg等人, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988)。用于特定患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗而容易地确定。

受试组合物的施用可以任何便利的方式实施，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输液、植入或移植。本文描述的组合物可皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在一些实施方案中，MIL组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在一些实施方案中，MIL组合物通过静脉内注射施用。MIL的组合物可例如直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位。

在一些实施方案中，使用本文描述的方法或本领域已知的其中将MIL扩增至治疗水平的其他方法活化并扩增的细胞，连同(例如在之前、同时或之后)任何数目的以下相关治疗治疗模式施用于患者：包括但不限于用药剂、诸如抗病毒疗法、西多福韦和白介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)的治疗或用于MS患者的那他珠单抗治疗或用于牛皮癣患者的依法珠单抗治疗或用于PML患者的其他治疗。在一些实施方案中，MIL可与化学疗法、放射；免疫抑制药剂、诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506；抗体或其他免疫清除药剂、诸如CAM PATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法、cytoxin、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素) (Liu等人, Cell 66:807-815, 1991; Henderson等人, Immun 73:316-321, 1991;Bierer等人, Curr. Opin. Immun 5:763-773, 1993)。在一些实施方案中，细胞组合物连同骨髓移植、使用化疗药物诸如氟达拉滨、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的MIL消除疗法一起(例如在之前、同时或之后)施用于患者。在一些实施方案中，细胞组合物在B细胞消除疗法，诸如与CD20反应的药剂例如Rituxan之后施用。例如，在一些实施方案中，受试者可经历高剂量化学疗法的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在一些实施方案中，在移植之后，受试者接受本文描述的扩增的免疫细胞的输注。在一些实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。

待施用于患者的治疗剂量将随着所治疗的病况的准确性质和治疗受体而变化。可根据领域接受的实践进行用于人施用的剂量缩放。例如，对于成人患者，CAMPATH的剂量通常在1至约100 mg的范围内，通常持续1和30天之间的时段每天施用。在一些实施方案中，每日剂量为每天1-10 mg，尽管在一些情况下可使用多达每天40 mg的较大剂量(描述于美国专利号6120766中)。

VIII. 受试者

受试者可以是具有MIL的任何生物体。例如，受试者可选自啮齿动物、犬、猫、猪、绵羊、牛、马和灵长类动物。受试者可以是小鼠或人。

受试者可能具有赘生物。赘生物可以是良性赘生物、恶性赘生物或继发性赘生物。赘生物可能是癌症。赘生物可以是淋巴瘤或白血病，诸如慢性淋巴细胞性白血病(“CLL”)或急性淋巴母细胞白血病(“ALL”)。受试者可能具有成胶质细胞瘤、成髓细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、卡波西肉瘤、急性髓性白血病和B系恶性肿瘤。受试者可具有多发性骨髓瘤。

受试者可能具有急性髓性白血病、腺癌、骨肉瘤、淋巴母细胞白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞性非霍奇金淋巴瘤、B系淋巴样恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结直肠癌、上皮癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、白血病、淋巴瘤、肺癌、套细胞淋巴瘤、成髓细胞瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、前列腺癌、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌、横纹肌肉瘤。

如本文所述，已经证明以下内容：1)生产CAR-修饰的MIL的可行性，2)CAR-MIL保留其固有的肿瘤抗原-特异性和功能能力 - 这是CAR-PBL所缺乏的，并且3)与匹配的CAR-PBL相比，CAR-MIL在体外更有效地杀伤。这些数据表明，CAR-MIL不仅可以提供更好的抗原特异性杀伤，而且更重要地，通过靶向内源性抗原库，它们还可以预防或使经由抗原逃逸变体复发的风险最小化，并因此增加CAR过继性T细胞疗法的总体效力。

实施例

以下实施例为说明性的，但不是本文描述的方法和组合物的限制。在疗法中通常遇到的对本领域技术人员显而易见的各种条件和参数的其他合适的修改和适应性改变处于实施方案的精神和范围内。

实施例1：骨髓的收集

在IRB批准的癌症患者知情同意下，从髂嵴收集骨髓样品。使用ficoll梯度从骨髓除去红血细胞。对于一些实验，从多发性骨髓瘤患者(n=11)收集骨髓样品。对于一部分患者(n=8)，在骨髓抽吸时还收集匹配的外周血。如本文所提供，将MIL和PBL活化、扩增和转导。MIL和PBL分别源自患者的骨髓和血液样品。将骨髓单核细胞和外周血单核细胞(PBMC)以10X10⁶个细胞/ml冷冻在液氮中，直至活化和扩增时。

实施例2：CAR设计

使用衍生自达雷木单抗的scFv，生成第2代4-1BB-CD3ζ CD38 CAR，称为CAR38：

BCMA和PSMA CAR构建体如下：

BCMA-特异性CAR使用衍生自鼠抗人BCMA抗体克隆C11D5.3的scFv。使用该BCMAscFv的CAR最初报道于：Carpenter RO, Evbuomwan MO, Pittaluga S,等人Clin. CancerRes. 2013 19(8):2048-2060。

PSMA-特异性CAR使用衍生自人抗人PSMA抗体J591的scFv。使用该PSMA scFv的CAR最初报道于：Santoro SP, Kim S, Motz GT, 等人 Cancer Immunol Res. 2105 3(1):68-84。

实施例3：MIL的扩增和活化

在第0天(“D0”)或扩增的第一天，将先前冷冻的骨髓缓慢解冻至培养基中，洗涤，并获得细胞计数以及存活率和恢复率。为了活化，在单独的IL-2或IL-7、IL-15、IL-21的组合存在的情况下培养MIL。使用以下抗体组合，在抗体缀合的磁珠存在的情况下培养MIL：

抗CD3/抗CD28，

抗CD2/抗CD3/抗CD28四聚体，或

Hyper-Act CD3/CD28聚合物。

取决于待用CAR-MIL治疗的癌症的类型，可以优化活化方法。将IL-2以200IU/ml添加至培养基中。然后将细胞铺板在U-型底板或袋中，并在低氧条件下在37℃下孵育，直至第3天(“D+3”或“D3”)。

通过用95%氮气和5% CO2气体混合物冲洗低氧室或细胞培养袋3分钟来实现低氧条件。这导致容器中例如1-2%或更少的O₂气体。然后将细胞在低氧环境(1%-3%氧气)中与细胞培养基孵育三天，即，直至D+3。

在D+3，在200IU/ml的IL-2和其他细胞因子(即IL-7、IL-15、IL-21或组合，各自的量可以在0-500IU/ml之间变化)的存在下，将细胞/平板转移至常氧环境。

取决于生长条件，在显微镜下目视检查和/或细胞计数后，将具有胚细胞(blasts)的活跃生长的样品用新鲜培养基+细胞因子以1:1分开。不需要分开的样品将需要更换培养基，其中一半的培养基体积用新鲜的培养基+细胞因子替代。

取决于细胞浓度、大小和活力，在D+7至D+14之间的任何时间收获MIL。

一旦收获，如果使用CD3/28珠来活化，则MIL在磁铁上去珠，或者如果扩增是基于四聚体的，则MIL用细胞培养基洗涤，或者如果扩增是基于聚合物的，则MIL用Hyper actCloudz试剂洗涤。

实施例4：将CAR转导至MIL中

在D0、D+3或D+5用慢病毒CAR转导或感染MIL。CAR是作为靶受体的CD38或CD19或BCMA或PSMA构建体。根据批次的浓度和滴度预先确定添加的慢病毒的量。例如，在200ul培养基中具有200K MIL的96-孔U形底板每孔可以接收2ul – 20ul病毒，这取决于病毒的类型和所使用的批次滴度。

对于每种CAR构建体，使用T2a切割序列将GFP连接至CAR，使得GFP和CAR以1:1分子比率等同地表达，并且使得GFP可以用作转导和CAR表达的标志物。通过在第一步中用生物素化的BCMA (BCMA-生物素)标记细胞，随后在第二步中用链霉抗生物素蛋白-PE-Cy7 (SA-PE-Cy7)标记细胞来分析BCMA-CAR表面表达。一组未转导和BCMA-CAR-转导的PBL作为实例显示(参见图1)。

对于三种CAR中的每一种，对于匹配的MIL和PBL的CAR转导效率显示于图2中。平均转导效率和p值使用配对的T-检验计算。对于任何CAR，MIL和PBL之间的传导效率没有显著差异。具体地，显示MIL和PBL的八个匹配对的CAR38-传导效率，其中CAR-MIL和CAR-PBL的平均值分别为50.5%和61.1%。p值为0.20。12个匹配对的BCMA转导效率分别为46.4%和47.4%，其中p值为0.86；并且11个匹配对的PSMA转导效率分别为37.3%和40.1%，其中p值为0.68。

一部分生长中的MIL未被转导，即，未用CAR感染，以充当对照或未转导的(NT)MIL。当仅在平板中生长时，这是可能的。当将转导的CAR-转导的MIL与未转导的MIL进行比较时，发现相似的记忆表型。图3显示来自3个多发性骨髓瘤患者的匹配的非转导和CD38CAR转导的MILs的数据。数据显示，工程改造MIL以表达CAR并不显著改变其记忆表型。

从第4天直至选择的收获日(其可以是D+7至D+14之间的任一天)，取MIL的等分试样用于细胞计数、活力分析和通过流式细胞术分析表型。如果MIL活跃地生长，则将根据需要施用具有细胞因子的培养基，以保持理想的细胞浓度。在D+7，MIL用足够的细胞因子和培养基以1:4或4倍分开，直至D+10。在10-14天MIL扩增后，MIL表达CAR，且因此被称为CAR-MIL。这些活化的CD3阳性CAR-MIL表达IFNγ。活化的MIL以不同的比率表达CD4和CD8，这取决于受试者和活化方法。

将活化的MIL洗涤，计数，并通过流式细胞术针对CD3、CD4、CD8和GFP进行表型分析，用于得到转导的MIL和T细胞记忆标志物的百分比。然后将活化的MIL等分在冷冻培养基中，并冷冻在管或袋中，并储存在LN2冷冻机中，直至进一步使用。

实施例5：内源性TCR-介导的CAR-MIL的肿瘤特异性

使用先前描述的功能测定法在未转导的未修饰的和转导的CAR-修饰的MIL和PBL中定量肿瘤-特异性T细胞(参见Noonan等人, Sci. Transl. Med. (2015) 7(288))。简而言之，自体抗原-呈递细胞(APC)用来自多发性骨髓瘤癌细胞系的裂解物脉冲，并与CFSE-标记的MIL或PBL共培养。用膀胱癌细胞系裂解物或单独的培养基脉冲的APC用作阴性对照。CD38的肿瘤-特异性门控策略显示于图4中，而BCMA和PSMA的策略显示于图7中。肿瘤-特异性T细胞被定义为产生IFNγ的CFSE-低、CD3⁺群体。与匹配的未修饰的MIL相比，在CD38CAR-MIL中测量到相等或更多数量的肿瘤抗原特异性的产生IFNγ的T细胞(参见图5和6)，显示在与表达CD38的8226肿瘤细胞共培养和刺激之前(图5和图6)和之后(图6)，CD38 CAR-MIL保留其固有的肿瘤-特异性和功能性。图7中显示的数据是与用H929和U266骨髓瘤裂解物脉冲的自体骨髓APC共培养的一个代表性多发性骨髓瘤PSMA CAR-MIL样品的数据。类似地，图8和9表明BCMA和PSMA CAR MIL的结果。在未修饰或修饰的PBL中未检测到肿瘤抗原-特异性T细胞。因此，无论CAR的抗原特异性如何，在通过CAR刺激之前和之后，CAR-MIL均保留其固有的肿瘤特异性和功能性。

结果表明在MIL中表达CAR的可行性。数据表明，CAR-MIL保留其固有的肿瘤抗原-特异性和通过其内源性肿瘤抗原-特异性T细胞受体应答的能力——这是PBL-CAR似乎不具有的特性。因此，MIL具有比类似处境的PBL优异的杀伤能力。

实施例6：用于测量CAR-介导的抗原杀伤的基于FACS的细胞毒性

通过共培养杀伤测定法评价CAR-MIL的体外细胞裂解潜力，其经由流式细胞术(FACS)或使用ACEA xCelligence RTCA平台实时分析。图10-24描述进行的共培养杀伤测定，并显示与匹配的CAR-PBL相比，CAR-MIL在各种条件下的杀伤的能力。

使用基于FACS的细胞毒性测定法测量CD38 CAR-介导的抗原-特异性杀伤(图10)。对于初级攻击，将未转导(NT)和CD38 CAR-转导的MIL和PBL与靶细胞以范围为1:1至1:10的CART:靶标比率进行共孵育。FACS用于测量在48小时杀伤的靶细胞的百分比(参见图10和11)。对于再攻击，在初级攻击开始后48小时添加与用于初级攻击相同数量的靶细胞，并在48小时后(初级攻击开始后96小时)通过FACS分析杀伤(图13)。使用四种靶细胞：两种表达CD38的细胞系：8226和经遗传修饰以表达CD38的K562 (K562-CD38)；和两种CD38-阴性细胞系：使用CRISPR-cas9敲除CD38的修饰的8226细胞系(CD38KO8226)和野生型未修饰的K562(K562)。图10和11显示，通过该测定，只有表达CD38 CAR的效应子进行杀伤并且它们仅杀伤CD38⁺靶标。

图14-16还显示在再攻击下的细胞裂解杀伤测定的结果。这些结果显示，当在初级攻击后2天(图14)、初级攻击后7天(图16)以及每2天重复攻击后再攻击时，CD38 CAR-MIL展示出与PBL相比优异的杀伤。初级攻击的效应子:靶标比率(E:T比率)为1:10(图14和15)或1:1(图16)；在初级8226攻击后2天(图14和15)或7天(图16)用5X10⁵个8226细胞再攻击各孔，并且在再攻击后2天通过FACS测量杀伤。

ACEA xCelligence RTCA共培养测定的结果显示于图17-19中。该测定实时测量CAR-特异性杀伤。在该测定中，如果靶细胞被杀伤，则发生阻抗降低。图17显示杀伤取决于BCMA CAR的表达。BCMA CAR-MIL杀伤靶细胞(红线)，而未转导的MIL则不杀伤(绿线)(参见图17)。单独的靶标与靶标加效应子相比之间的阻抗差异用于计算随时间的%杀伤。图18显示BCMA CAR-MIL和PBL的一个代表性的匹配对随时间的%杀伤。图19显示共培养测定结果，其将BCMA CAR-MIL与CAR-PBL在低E:T比率下杀伤的能力进行比较，其中靶标是经遗传修饰以表达BCMA的K562细胞(K562-BCMA)和RPMI8226细胞。对于10个匹配对，两者的比率均为1:10 E:T。匹配对通过线连接。CAR-MIL在10对中的7对中更好地杀伤。

使用基于FACS的细胞毒性测定法测量BCMA CAR-介导的抗原-特异性杀伤(图20)。在该测定中，在与效应细胞共培养之前，K562-BCMA靶细胞用CellTrace Violet标记。如图20中所表明，与CAR-MIL共培养后，活的CellTrace Violet-标记的K562-BCMA靶细胞的数目与未转导的MIL相比之间的差异用于计算CAR-特异性%杀伤。在图21中，在第0天进行攻击，然后在此后2天进行攻击，并且在此后7天再次进行攻击，然后测量杀伤。结果显示于图21中。

PSMA染色和对PSMA的ACEA共培养杀伤测定的结果显示于图22-24中。四种人前列腺癌细胞系和SW780膀胱癌细胞系的FACS染色结果显示于图22中。用于实时测量PSMA CAR抗原-特异性杀伤的ACEA共培养测定结果显示于图23中。再次，如果杀伤靶细胞，则发生阻抗下降。杀伤是CAR和抗原依赖性的。只有PSMA CAR-MIL进行杀伤，并且它们仅杀伤LnCapPSMA+靶标。单独的靶标与靶标加效应子相比之间的阻抗差异用于计算随时间的%杀伤。图24显示间隔五天攻击三次的PSMA CAR-MIL和PBL的两个匹配对的随时间的杀伤。数据显示，甚至当初级攻击偏好CAR-PBL时，PSMA CAR-MIL在次级攻击中也优于CAR-PBL。

实施例7：CAR-MIL的表征

由于是CD3，大多数表达CAR的MIL是T细胞。图34显示在与CD38+ RPMI8226肿瘤细胞共培养前(第0天)、之后2天和之后7天，来自3个多发性骨髓瘤患者的CD38 CAR-MIL和CAR-PBL的3个匹配对中的CD27+CD4+和CD27+CD8+ T细胞的百分比。抗原暴露后，CAR38-MIL中CD4+和CD8+ T细胞上的CD27表达增加，而在PBL上减少。这些结果表明，与CAR-PBL相比，CAR-MIL具有增加的干细胞样质量。图35显示在与CD38+ RPMI8226肿瘤细胞共培养前(第0天)、之后2天和之后7天，来自3个多发性骨髓瘤患者的CD38 CAR-MIL和CAR-PBL的3个匹配对中PD1+TIM3+CD4+和CD8+ T细胞的百分比。在抗原暴露后，与PBL相比，CAR-MIL中更少的CD4+和CD8+ T细胞共表达PD-1和TIM-3。这些结果表明，与CAR-PBL相比，在抗原暴露后，CAR-MIL耗竭较少。通过针对BCMA和CD38的细胞内细胞因子染色来测量CAR抗原刺激-特异性细胞因子产生；代表性结果显示于图25中。与CAR-PBL相比，BCMA CAR-MIL和CD38 CAR-MIL显示增加的IFNγ和TNFα细胞因子产生(图26和27)。与表达BCMA或CD38的K562细胞共培养24小时后，在CAR T细胞中测量IFNγ和TNFα产生。在图27中，匹配对用颜色编码并用线连接。抗原-特异性IFNγ CD3的百分比等于活的CD3+IFNγ+TNFα+的百分比。

实施例8：Isoplexis数据

通过使用Isoplexis单细胞技术，发现CART-工程改造的MIL比其匹配的外周血对应物更加多功能。使用该技术，在单细胞水平进行BCMA抗原-刺激后32种细胞因子的产生的测量(参见图28)。第一步是使用Miltenyi珠针对从匹配的CAR-MIL和CAR-PBL分离的CD4+和CD8+ T细胞富集样品。下一步是用抗原刺激。将分离的CD4+和CD8+ CART细胞用K562-BCMA或K562-NGFR对照靶细胞在37º、5% CO₂下刺激20小时。最后，加载样品并运行IsoLight。使用Miltenyi珠除去K562靶细胞，并将样品加载至IsoCode芯片上用于IsoLight分析。

作为结果，生成32-重单细胞、T细胞细胞因子应答组。按功能组颜色编码的32种细胞因子如下所示：

对BCMA CAR-MIL和PBL的六个匹配对运行IsoPlexis IsoLight 32-重测定。作为结果，发现BCMA抗原-刺激在CAR-MIL和CAR-PBL两者中诱导产生多功能细胞因子的CD4和CD8 CART细胞(参见图29)。对于来自每个样品的CD4+(图29的顶部图)和CD8+(图29的底部图) CART细胞，显示多功能性，其定义为每个细胞分泌2种或更多种细胞因子的细胞的百分比。用箭头指示显示高于NGFR对照的BCMA抗原-特异性的多功能性诱导的样品。对于来自每个样品的CD4+(图30的顶部)和CD8+(图30的底部) CART细胞，显示多功能强度指数(PSI)，其定义为多功能细胞的百分比乘以分泌的细胞因子的强度。再次，用箭头指示显示高于NGFR对照的BCMA抗原-特异性的多功能性诱导的样品。

图31显示颗粒酶B、IFNγ、IL-8、MIP-1a和MIP-1b是在BCMA刺激后由CAR-MIL和CAR-PBL产生的主要细胞因子。PSI组成拆分每种细胞因子对样品的总多功能强度的贡献，指示驱动样品的PSI的细胞因子。CAR-MIL和CAR-PBL的一个代表性匹配对的数据显示于图31中。

图32显示，CAR-MIL比CAR-PBL产生更多的效应子和趋化性细胞因子，尽管它们具有类似的调节性、炎性和刺激性细胞因子的产生。在MIL和PBL两者中，CD4 T细胞具有比CD8T细胞更高的PSI。

图33显示，与CAR-PBL相比，BCMA刺激后，CAR-MIL具有多功能细胞亚群的更多增加。点代表单细胞，并且较宽的圆圈按颜色加权，以表示亚群的优势。圈出高度上调的多功能亚群，其在MIL(蓝色)中比在PBL(橙色)中更丰富。基于各种细胞因子(包括颗粒酶B、IFN-g、IL-8、MIP-1a和MIP-1b)，区分MIL-和PBL-衍生的CART多功能亚群。

总之，与NGFR对照相比，来自CAR-MIL和CAR-PBL两者的CD4和CD8 T细胞表明响应于BCMA刺激的多功能性(每个细胞分泌2+种细胞因子)和多功能强度指数(PSI)的抗原特异性增加。当与CAR-PBL相比时，CAR-MIL表明在CD4和CD8 T细胞两者中增加的多功能性和增加的PSI。甚至当匹配的CAR-PBL未能做到这一点(匹配对3319/3320和3873/3874)时，CAR-MIL也表明显著的多功能性。CAR-MIL中增强的PSI由与抗肿瘤活性相关的效应子、刺激性和趋化性蛋白(包括颗粒酶B、IFN-g、IL-8、MIP-1a和MIP-1b)主导。据报道，在具有用CD19-特异性CAR-T疗法治疗的非霍奇金淋巴瘤的患者中，增加的PSI和增强的类似蛋白的分泌与改善的临床应答相关。

实施例9：体内BCMA CAR-MIL与CAR-PBL

67只NSG小鼠用5x10⁶个U266细胞攻击(第0天)。在U266攻击一天，小鼠已经200拉德辐射(第-1天)。在第24天，在MIL/PBL输注的早晨向小鼠给予100拉德。将小鼠随机化，并在U266肿瘤攻击后24天下午晚些时候(第24天)施用治疗。通过经由ELISA测量人血清IgE水平来监测U266肿瘤-进展。在治疗前4天(第20天)取基线治疗前人IgE血清测量值。在治疗后7天(第31天)(参见图36-8)，且其后每7天取治疗后人IgE测量值，直至肿瘤清除或安乐死。当肿瘤-进展引起麻痹迹象时，对小鼠进行安乐死。在安乐死时(T细胞输注后3-6周)，收集骨髓和脾，并使用流式细胞术来定量人CD3⁺ T细胞和CD138⁺肿瘤细胞的水平(参见图39-42)。

这些数据显示，BCMA CAR-MIL在体内比匹配的CAR-PBL更有效。在U266 iv攻击后第38、45和52天或T细胞输注后第14、21和28天，与CAR-PBL高剂量治疗小鼠相比，BCMA CAR-MIL高剂量治疗小鼠中的血清hIgE显著更低。低剂量CAR-MIL没有显著好于低剂量CAR-PBL，但与高剂量CAR-PBL相比表现相当(参见图38)。

使用FACS，测量来自对照和治疗小鼠的骨髓和脾中的人CD3+ T细胞和CD138 +肿瘤细胞的水平(参见图39和40)。这些结果显示，与PBL相比，在用MIL治疗的小鼠的骨髓(参见图41)和脾(参见图42)中检测到较高的人CD3T细胞百分比和较低的U266肿瘤细胞百分比。

实施例10：CAR-MIL用于治疗表达CD19的癌症(CD19+4-1BB+CD3ζ)

MIL获得自具有表达CD19的癌症(诸如淋巴瘤或急性淋巴母细胞白血病)的受试者。简而言之，如表1中所举例说明，在从受试者获得骨髓样品后，细胞用慢病毒转染/感染，所述慢病毒编码具有CD19特异性细胞外结构域的CAR构建体。如在WO2016037054 (其在此通过引用并入)中所述，还在低氧/常氧条件下，在抗CD3/抗CD28珠和细胞因子存在的情况下活化和扩增细胞。将活化并扩增的MIL施用于具有表达CD19的癌症的受试者。受试者的癌症得到治疗。

实施例11：CAR-MIL用于治疗表达PSMA的癌症(PSMA+4-1BB+CD3ζ)

MIL获得自具有表达PSMA的癌症(诸如前列腺癌)的受试者。简而言之，如表1中所举例说明，在从受试者获得骨髓样品后，细胞用慢病毒转染/感染，所述慢病毒编码具有PSMA特异性细胞外结构域的CAR构建体。如在WO2016037054 (其在此通过引用并入)中所述，还在低氧/常氧条件下，在抗CD3/抗CD28珠和细胞因子存在的情况下活化和扩增细胞。将活化并扩增的MIL施用于具有表达PSMA的癌症的受试者。受试者的癌症得到治疗。

实施例12：CAR-MIL用于治疗表达BCMA的癌症(BCMA+4-1BB+CD3ζ)

MIL获得自具有表达BCMA的癌症(诸如多发性骨髓瘤)的受试者。简而言之，如表1中所举例说明，在从受试者获得骨髓样品后，细胞用慢病毒转染/感染，所述慢病毒编码具有BCMA特异性细胞外结构域的CAR构建体。如在WO2016037054 (其在此通过引用并入)中所述，还在低氧/常氧条件下，在抗CD3/抗CD28珠和细胞因子存在的情况下活化和扩增细胞。将活化并扩增的MIL施用于具有表达BCMA的癌症的受试者。受试者的癌症得到治疗。

实施例13：CAR-MIL用于治疗B细胞淋巴瘤

MIL获得自具有B细胞淋巴瘤的受试者。简而言之，如在WO2016037054 (其在此通过引用并入)中所述，在从受试者获得骨髓样品后，在低氧条件下，在抗CD3/抗CD28珠和细胞因子存在的情况下孵育细胞。将编码CAR的核酸分子转染至MIL中，所述CAR包含CD19的细胞外结构域、CD19的跨膜结构域以及CD3ζ和4-1BB的细胞内结构域。然后使细胞在常氧条件下生长并使其扩增。将活化并扩增的MIL施用于具有B细胞淋巴瘤的受试者。受试者的B细胞淋巴瘤得到缓解。总之，本文提供的实施方案和实施例证明表达CAR的细胞可有效地用于治疗癌症。

实施例14：CAR-MIL用于治疗多发性骨髓瘤

MIL获得自具有多发性骨髓瘤的受试者。简而言之，如在WO2016037054 (其在此通过引用并入)中所述，在从受试者获得骨髓样品后，在低氧条件下，在抗CD3/抗CD28珠和细胞因子存在的情况下孵育细胞。将编码CAR的核酸分子转染至MIL中，所述CAR包含CD38的细胞外结构域、CD8的跨膜结构域以及CD3ζ和4-1BB的细胞内结构域。然后使细胞在常氧条件下生长并使其扩增。将活化并扩增的MIL施用于具有多发性骨髓瘤的受试者。受试者的多发性骨髓瘤得到缓解。

在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的任何美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物(包括CAS编号)都通过引用以其整体并入本文。

Claims (34)

1.细胞，其包含嵌合抗原受体(“CAR”)，其中：

所述细胞是骨髓浸润淋巴细胞(“MIL”)；

所述CAR包含可结合配体的细胞外结构域；且

所述CAR包含可起始细胞内信号传导级联的细胞内结构域。

2.权利要求1的细胞，其中所述细胞为CD3⁺。

3.权利要求1或2的细胞，其中所述细胞为CD4⁺。

4.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞为CD8⁺。

5.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞为CD45RO+。

6.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞为CD62L+。

7.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞为CXCR4+。

8.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞为4-1BB⁺。

9.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞为干扰素γ⁺。

10.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞为CD138⁺。

11.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞为CD33⁺。

12.前述权利要求中任一项的细胞，其中所述细胞为CD34^-。

13.权利要求1的细胞，其中所述配体是赘生细胞上表达的分子。

14.权利要求13的细胞，其中所述配体是神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2 (AS)、肠羧酸酯酶、突变hsp70-2、M-CSF、prostase、前列腺特异性抗原(“PSA”)、前列腺酸性磷酸酶(“PAP”)、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体、间皮素、MART-1、酪氨酸酶、GP 100、HER-2/Neu/ErbB-2、CD19、CD20、CD37、MART-1/MelanA (“MART-I”)、gp100 (Pmel 17)、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、p53、Ras、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EBVA、E6、E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白，β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、YLP或TPS。

15.权利要求13的细胞，其中所述配体是CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、BCMA、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1 TCR或MAGE A3 TCR。

16.权利要求13的细胞，其中所述配体是α-叶酸受体、碳酸酐酶9 (“CAIX”)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7、CD44v7、癌胚抗原(“CEA”)、表皮生长因子-2 (“EGF-2“)、上皮糖蛋白40 (“EGF-40”)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2 (HER2；Neu；CD340)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3 (HER3)、受体酪氨酸蛋白激酶 erbB-4 (HER4)、叶酸结合蛋白(“FBP”)、胎儿型乙酰胆碱受体、GD2、GD3、白介素-13受体亚基α-2 (“IL-13Rα2”)、激酶插入结构域受体(“KDR”；CD139)、κ-轻链、Lewis Y抗原(“LeY”)、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、细胞表面缔合的粘蛋白1 (“MUC1”)、前列腺干细胞抗原、前列腺特异性膜抗原、肿瘤相关糖蛋白72 (“TAG-72”)或VEGF-R2。

17.权利要求13的细胞，其中所述配体是由病原体表达的分子。

18.权利要求17的细胞，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌、寄生虫或类病毒。

19.权利要求13的细胞，其中所述CAR的细胞外结构域包含单链可变片段(“scFv”)结构域。

20.权利要求13的细胞，其中所述CAR的细胞内结构域包含CD3ζ、4-1BB和/或CD28的细胞内信号传导结构域。

21.一种用于治疗受试者中的病况的方法，其包括向所述受试者施用权利要求13的细胞。

22.一种用于制备重组MIL的方法，所述方法包括：

获得包含MIL的骨髓；和

用编码嵌合抗原受体的核酸转染、转化或转导所述MIL。

23.权利要求22的方法，其中所述骨髓获得自受试者。

24.权利要求23的方法，其中所述受试者具有赘生物。

25.权利要求23的方法，其中所述受试者具有自身免疫性疾病。

26.权利要求23的方法，其中所述受试者具有由病原体引起的感染。

27.权利要求22的方法，其进一步包括活化MIL。

28.权利要求22的方法，其进一步包括扩增MIL。

29.权利要求22的方法，其中所述方法包括制备多种重组MIL。

30.权利要求23的方法，其进一步包括在用编码嵌合抗原受体的核酸转染、转化或转导MIL之前，在低氧条件下孵育所述MIL。

31.权利要求30的方法，其中所述低氧条件包含约0.5%至约5%的氧气。

32.权利要求31的方法，其中所述低氧条件包含约1%至约2%的氧气。

33.权利要求30的方法，其进一步包括在用编码嵌合抗原受体的核酸转染、转化或转导MIL之后，在常氧条件下孵育MIL。

34.权利要求30的方法，其进一步包括在于低氧条件下孵育MIL的同时使所述MIL与抗CD3/抗CD28珠接触。

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