JP2023511443A - 普遍的免疫受容体を発現する操作された細胞の活性の量的制御 - Google Patents

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トゥールカス，アンドリュー
ミヌトロー，ニコラス
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ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア
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Abstract

本発明は、アダプター分子、例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇ部分と、膜貫通ドメインと、Ｔ細胞活性化のための細胞内ドメインとを含む普遍的免疫受容体を発現するように操作された細胞を使用して、哺乳動物において普遍的免疫受容体媒介性応答を刺激するための方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／９６５，５９３号の、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を有する。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所から授与されたＣＡ１６８９００およびＣＡ０１６５２０に基づく政府支援によってなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、ある種の血液悪性腫瘍の治療において劇的な応答を媒介することができ、このことから、再発／難治性（ｒ／ｒ）Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ-ＡＬＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の治療のためのチサゲンレクルユーセル、ならびに（ｒ／ｒ）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのアキシカブタゲンシロルユーセルという２種類のＣＤ１９標的化ＣＡＲ Ｔ細胞製品のＦＤＡ承認に至っている。ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞治療を受けた患者の高い寛解率および長期の無腫瘍生存が理由で、この分野ではその使用が他の悪性腫瘍にも拡大されている。他のＢ細胞特異的抗原、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、およびＣＤ２２を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞の臨床試験では有望な結果が得られているが、血液悪性腫瘍および固形腫瘍においてＣＡＲ Ｔ細胞療法の成功が広く達成されるまでには、特有の毒性およびその後の再発に関連するものを含む、いくつかの課題に対処する必要がある。
ＣＡＲは、細胞外抗原標的化ドメイン、例えば、ｓｃＦｖが、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢおよび／またはＣＤ２８がＣＤ３ζと直列になったもの）と付着したもので構成され、抗原特異的なＭＨＣ非依存的Ｔ細胞標的化を可能にする。このデザインは、単一抗原の標的化における使用には有効であるが、ＣＡＲ Ｔ細胞の使用を複数の種類の腫瘍に広げることには固有の限界があり、重篤な有害事象および毒性の可能性もある。
ほとんどの薬物は用量調節が可能であり、予測可能な薬物動態および薬力学に従うが、従来のＣＡＲ-Ｔ細胞療法は、注入後に容易には制御できない生きた薬物である。標的抗原を認識すると、投与されたＣＡＲ Ｔ細胞はレシピエント内で急速に増殖して多数となり、炎症性サイトカインを放出することができ、これは場合によっては、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性、または脳浮腫などの重篤で時には致死的な副作用を招き、それは医学的管理を必要とする。場合によっては、ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的化された抗原を同じく発現する非悪性組織も標的化して破壊し、致死的な可能性のあるオンターゲット・オフ腫瘍毒性を招く可能性がある。
これらの課題に加えて、厳格なＣＡＲアーキテクチャは、単一の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する標的化も制限する。このアプローチは、ＣＤ１９などの遍在性パンＢ細胞マーカーを標的とする場合に有効な可能性があるが、その有効性は、不均一なＴＡＡ発現を有する腫瘍を標的とする場合、または再発した抗原陰性腫瘍の状況では損なわれる。チサゲンレクルユーセルＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞レシピエントの約３５％は治療後に再発し、再発疾患の過半数には、非機能的であるかまたは膜貫通ドメインを欠く蛋白質切断に起因するＣＤ１９抗原喪失の遺伝的機構が関係している。抗原喪失の別の機序としては、標的化抗原エピトープを欠く抗原スプライスバリアントの出現、腫瘍細胞系列転換、ＣＤ１９抗原のトロゴサイトーシス、および、まれな一例として、白血病性Ｂ細胞へのＣＡＲ遺伝子の偶発的な導入が挙げられる。単一抗原の標的化はまた、様々な抗原発現パターンを有する腫瘍細胞によってしばしば構成される固形腫瘍の治療においても問題がある。この場合には、ＥＧＦＲｖＩＩＩの標的化で報告されているように、単一抗原の選択的標的化は、不完全な排除および適応耐性を引き起こす可能性がある。
当技術分野には、副作用およびオフ腫瘍毒性が最小限となる、腫瘍を標的とする免疫療法のための組成物および方法に対する明らかな需要がある。本発明は、当技術分野におけるこの満たされていない需要に応える。
本明細書に記載されるように、本発明は、アダプター分子、例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇ部分と、膜貫通ドメインと、Ｔ細胞活性化のための細胞内ドメインとを含む普遍的免疫受容体を発現するように操作された細胞を使用して、哺乳動物において普遍的免疫受容体媒介性応答を刺激するための方法に関する。
一態様では、本発明は、哺乳動物において腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、本方法は、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を哺乳動物に投与するステップ、（ｂ）相互アダプター分子に連結された第１の作用物質を哺乳動物に投与するステップであって、第１の作用物質は腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合する、ステップ、および（ｃ）相互アダプター分子に連結された第２の作用物質を哺乳動物に投与するステップであって、第２の作用物質は腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原である、ステップを含む、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、本方法は、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を哺乳動物に投与するステップ、（ｂ）相互アダプター分子に連結された第１の作用物質の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、第１の作用物質はがんによって発現される第１の抗原に特異的に結合する、ステップ、および（ｃ）相互アダプター分子に連結された第２の作用物質の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、第２の作用物質はがんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原である、ステップを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む。
ある特定の実施形態では、第１および／または第２の作用物質は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている。
ある特定の実施形態では、第１および／または第２の作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。
ある特定の実施形態では、第１および／または第２の作用物質は抗体であり、ヒトＩｇＧである。
ある特定の実施形態では、相互アダプター分子、ＳｐｙＴａｇ、またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して第１および／または第２の作用物質に連結されている。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞は自己細胞である。
ある特定の実施形態では、免疫受容体は、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む。
ある特定の実施形態では、共刺激分子は、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。
ある特定の実施形態では、哺乳動物への投与の前に、細胞を第１および／または第２の作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前武装化細胞を哺乳動物に投与する。
ある特定の実施形態では、第１および／または第２の作用物質を哺乳動物に投与する前に、細胞を哺乳動物に投与する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせる方法であって、（ａ）細胞のある量を、相互アダプター分子に連結された作用物質のある量と接触させるステップであって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、細胞外ドメインはアダプター分子を含み、作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、作用物質の量および／または細胞の量は、腫瘍に対してそのレベルの溶解活性を生じさせるように選択される、ステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞のある量を哺乳動物に投与するステップ、および（ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質のある量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の量および／または作用物質の量は、がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、ステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、細胞の量に対して作用物質の量を増加させることが溶解活性のレベルを上昇させ、細胞の量に対して作用物質の量を減少させることが溶解活性のレベルを低下させる。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む。
ある特定の実施形態では、作用物質は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている。
ある特定の実施形態では、作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。
ある特定の実施形態では、物質は抗体であり、ヒトＩｇＧである。
ある特定の実施形態では、相互アダプター分子、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞は自己細胞である。
ある特定の実施形態では、免疫受容体は、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む。
ある特定の実施形態では、共刺激分子は、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。
ある特定の実施形態では、哺乳動物への投与の前に、細胞を作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前武装化細胞を哺乳動物に投与する。
ある特定の実施形態では、作用物質を哺乳動物に投与する前に、細胞を哺乳動物に投与する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を哺乳動物に投与するステップ、および（ｂ）その後に、相互アダプター分子に連結された作用物質を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞の有効量を哺乳動物に投与するステップ、（ｂ）その後に、相互アダプター分子に連結された作用物質の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む。
ある特定の実施形態では、作用物質は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている。
ある特定の実施形態では、作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。
ある特定の実施形態では、物質は抗体であり、ヒトＩｇＧである。
ある特定の実施形態では、相互アダプター分子、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞は自己細胞である。
ある特定の実施形態では、免疫受容体は、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む。
ある特定の実施形態では、共刺激分子は、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。
別の態様では、本発明は、細胞表面での普遍的免疫受容体の代謝回転を定量する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を、相互アダプター分子に連結された作用物質と接触させ、それによって武装化受容体を生成させるステップ、および（ｂ）基準量に対する武装化受容体の量を決定するステップを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、基準量は、前の時点での武装化受容体の量である。
ある特定の実施形態では、武装化受容体の量は、作用物質を標識して、標識された作用物質を検出することによって決定される。
ある特定の実施形態では、作用物質を、ｍｙｃ-タグ、ＦＬＡＧ-タグ、Ｈｉｓ-タグ、ＨＡ-タグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、フルオロフォア（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ））、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヒスチジン、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、放射性同位体、重金属、超常磁性ナノ粒子、および、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７，１０-四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７-トリアザシクロノナン-１，４，７-三酢酸（ＮＯＴＡ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を含む放射性同位体標識のために使用される任意の種類の化合物を含む標識分子と連結または接触させることによって標識する。
ある特定の実施形態では、本方法は、（ｃ）細胞および作用物質を腫瘍細胞と接触させるステップをさらに含む。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む。
ある特定の実施形態では、作用物質はＳｐｙＴａｇに連結されている。
ある特定の実施形態では、作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。
ある特定の実施形態では、作用物質は抗体であり、ヒトＩｇＧである。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態では、免疫受容体は、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む。
ある特定の実施形態では、共刺激分子は、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を哺乳動物に投与するステップ、および（ｂ）相互アダプター分子に結合された作用物質の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含み、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞のある量を哺乳動物に投与するステップ、および（ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質のある量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含み、がんは、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、基準レベルは、健常組織での抗原の発現レベルである。
ある特定の実施形態では、細胞外ドメインは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む。
ある特定の実施形態では、作用物質は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている。
ある特定の実施形態では、作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。
ある特定の実施形態では、作用物質は抗体であり、ヒトＩｇＧである。
ある特定の実施形態では、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞は自己細胞である。
ある特定の実施形態では、哺乳動物への投与の前に、細胞を作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前武装化細胞を哺乳動物に投与する。
ある特定の実施形態では、作用物質を哺乳動物に投与する前に、細胞を哺乳動物に投与する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するための遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質であって、腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質は腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質は腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原であり、免疫受容体、第１の作用物質および第２の作用物質は哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質であって、がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質はがんによって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質はがんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原である、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせるのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を作用物質のある量と接触させ、細胞の量に対する作用物質の量は、腫瘍に対してそのレベルの溶解活性を生じさせるように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量および作用物質のある量を哺乳動物に投与し、細胞の量および／または作用物質の量は、がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、かつ作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、かつ作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激することにおける、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用であって、腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質は腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質は腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原であり、免疫受容体、第１の作用物質および第２の作用物質は哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物における遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用であって、がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質はがんによって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質はがんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原である、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせることにおける、遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を作用物質のある量と接触させ、細胞の量に対する作用物質の量は、腫瘍に対してそのレベルの溶解活性を生じさせるように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量および作用物質のある量を哺乳動物に投与し、細胞の量および／または作用物質の量は、がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激することにおける遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激することにおける遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、かつ作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、かつ作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解されるであろう。本発明を説明するために、現時点で好ましい例を実施形態の図面に示す。しかし、本発明は、図面に示される実施形態の厳密な構成および計器装備に限定されないことを理解されたい。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体標的化リガンドの開発を示す一連の略図および画像である。図１Ａ：臨床グレードのヒトＩｇＧへのタンパク質Ｇ-ＳＴ架橋の略図。図１Ｂ：ハーセプチンをプロテインＧ-ＳＴまたはプロテインＧ-ＳＴＤＡと架橋させて、その後にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-Ｖｅｎｕｓと反応させ、クーマシー染色による還元条件下でのＳＤＳ-Ｐａｇｅゲルにより分析した。図１Ｃ：ＤＡＲＰｉｎ９．２６-ＳＴおよびＤＡＲＰｉｎ９．２６-ＳＴＤＡをＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-Ｖｅｎｕｓと反応させ、クーマシー染色を用いてＳＤＳ-Ｐａｇｅゲルにより分析した。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体が発現されること、およびＳｐｙＴａｇ標識リガンドとの共有結合ローディングが可能であることを示す一連の略図、画像、およびグラフである。図２Ａ：レンチウイルスＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体構築物の概略図。図２Ｂ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体を発現するＳＫＯＶ３細胞を、２０００ｎＭのＲＦＰ-ＳＴまたはＲＦＰ-ＳＴＤＡを含有する培養培地中でインキュベートした。２つの成分間の共有結合形成を、還元条件下のＳＤＳ-Ｐａｇｅゲルおよび全ＣＤ３ζタンパク質に対するウエスタンブロット染色を介して検出した。図２Ｃ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を、様々な量のハーセプチン-ＳＴにより、３７℃で１時間かけて武装化した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体へのハーセプチン-ＳＴのローディングは、ＡＰＣポリクローナル抗ヒトＩｇＧによる染色およびフローサイトメトリー分析によって検出した。図２Ｄ：様々な濃度でのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体の共有結合（ＤＡＲＰｉｎ９．２６-ＳＴ）と非共有結合（ＤＡＲＰｉｎ９．２６-ＳＴ）との最大ローディングの比較。図２Ｅ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を、様々な量の固定化ハーセプチン-ＳＴを含有するウェル内で１６時間インキュベートした。上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγに関して分析した。エラーバーは平均＋／-標準偏差を表す。データポイントは、３回の反復試験の平均である。代表的なＴ細胞ドナーを示す。＊Ｐ＜．０５；＊＊Ｐ＜．０１；＊＊＊Ｐ＜．００１。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞が種々の抗原発現腫瘍株の宿主に対してインビトロ溶解機能を有し得ることを示す一連の略図およびグラフである。図３Ａ：武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体溶解（左）およびオンデマンド溶解（右）の略図。図３Ｂ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞または非形質導入（Ｕｎｔ）Ｔ細胞を、様々な濃度のハーセプチン-ＳＴにより武装化して、ＳＫＯＶ３（Ｈｅｒ２＋）腫瘍細胞の存在下で共培養した。図３Ｃ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を抗原特異的および非特異的ＩｇＧにより武装化し、ＭＤＡ-ＭＢ-４６８（ＥＧＦＲ＋／Ｈｅｒ２-）またはＲａｍｏｓ（ＣＤ２０＋／ＥＧＦＲ-）腫瘍細胞のいずれかと共培養した。図３Ｄ：抗原特異的ＤＡＲＰｉｎにより武装化したＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を、ルシフェラーゼを発現するＳＫＯＶ３、ＭＤＡ-ＭＢ-４６８、またはＡ１８４７（ＥｐＣＡＭ＋）腫瘍細胞と共培養した。図３Ｅ：ＤＡＲＰｉｎ９．２６-ＳＴ武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ＝３：１）と共に、またはそれ無しで２４時間インキュベートし、培養物から取り出して、培地＋／-２０００ｎＭ ＤＡＲＰｉｎ９．２６-ＳＴ中でインキュベートした。受容体武装化を、抗ｍｙｃ染色およびフローサイトメトリー分析を介して分析した。図３Ｆ：非武装ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞をＳＫＯＶ３腫瘍細胞と共に４時間インキュベートし、その後にハーセプチン-ＳＴまたはハーセプチン-ＳＴＤＡを添加した（時間＝０）。図３Ｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を様々な濃度のＤＡＲＰｉｎ９．２６-ＳＴまたはＤＡＲＰｉｎ９．２６-ＳＴＤＡにより武装化し、ルシフェラーゼを発現するＳＫＯＶ３腫瘍細胞と共培養した。図３Ｂおよび３Ｆ：リアルタイム細胞分析を使用して溶解を測定した。図３Ｃ、３Ｄおよび３Ｇ：残存ルシフェラーゼ発現を２０時間後に計算した。共培養はすべて、７：１のＥ：Ｔ比を使用して行った。エラーバーは平均＋／-標準偏差を表す。データポイントは３回の反復試験の平均である。代表的なＴ細胞ドナーを示す。＊Ｐ＜．０５；＊＊Ｐ＜．０１；＊＊＊Ｐ＜．００１。 ２つの標的化リガンドを有するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞の同時武装化により、二重抗原標的化が可能な単一細胞生成物が生じることを示す一連の略図およびグラフである。図４Ａ：単一標的化リガンドローディングと二重標的化リガンドローディングとを比較した略図。図４Ｂ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を、１０００ｎＭのｍｙｃ-９．２６-ＳＴ（αＨｅｒ２；赤）、１０００ｎＭのＦｌａｇ-Ｅｏ１-ＳＴ（αＥＧＦＲ；青）、または同時にその両方の各１０００ｎＭ（緑）のいずれかにより武装化した。受容体ローディングは、蛍光コンジュゲート抗ｍｙｃおよび抗ｆｌａｇ抗体の組合せにより検出し、フローサイトメトリーを介して評価した。図４Ｃ：単一または二重武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を、Ｈｅｒ２またはＥＧＦＲのいずれかとルシフェラーゼとを発現するＲａｍｏｓ細胞と共培養した。残存ルシフェラーゼ発現を２０時間後に計算した。共培養はすべて７：１のＥ：Ｔ比を用いて行った。データポイントは３回の反復試験の平均である。代表的なＴ細胞ドナーを示す。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞がインビボで腫瘍増殖を防止することを示す一連のグラフおよび画像である。ＮＳＧマウス（各群ｎ＝４）に対して、第０日にルシフェラーゼを発現する１×１０６個のＳＫＯＶ３腫瘍細胞を、続いて第７日に１２．５×１０６個のハーセプチン-ＳＴ武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞を腹腔内注射した。ハーセプチン-ＳＴを第８日に投与し、その後は投薬期間中、３日毎に注射した（図５Ａ、オレンジ色のボックス；図５Ｂ、点線）。注射量はマウス１匹当たりの用量を示す。図５Ａ：腫瘍増殖を発光によってモニターし、個々の各マウスについて平均放射輝度としてプロットした。図５Ｂ：処置されたマウスの発光画像。図５Ｃ：図５Ａで処置されたマウスの生存曲線。図５Ｄ：Ｔ細胞注入後の第７日および第２１日における全ヒトＴ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋）のＴｒｕＣｏｕｎｔ分析。エラーバーは平均＋／- ＳＥＭ（Ａ）または平均＋／-標準偏差を表す。図５Ｄ．＊Ｐ＜．０５；＊＊Ｐ＜．０１；＊＊＊Ｐ＜．００１。 ＳｐｙＴａｇ標識標的化リガンドの産生を示す一連の画像である。図６Ａ：リツキシマブまたはセツキシマブをプロテインＧ-ＳＴと架橋させ、その後にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-Ｖｅｎｕｓと反応させ、クーマシー染色による還元条件下でＳＤＳ-Ｐａｇｅゲルにより分析した。図６Ｂ：ＤＡＲＰｉｎｓ Ｅｃ１-ＳＴおよびＥ０１-ＳＴをＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-Ｖｅｎｕｓと反応させ、クーマシー染色を用いてＳＤＳ-Ｐａｇｅゲルにより分析した。 レンチウイルス形質導入を介した安定な細胞株におけるタンパク質の発現を示す一連のグラフである。図７Ａ：ＳＫＯＶ３-ＧＦＰおよびＳＫＯＶ３-ＧＦＰ-ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζ細胞を、２０００ｎＭのｍｙｃ-ＲＦＰ-ＳＴを含有する培養培地中でインキュベートした。細胞を抗ｍｙｃ抗体を介して受容体武装化に関して染色し、フローサイトメトリーを介して分析した。図７Ｂ：抗Ｈｅｒ２および抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体で共染色したＲａｍｏｓ-Ｈｅｒ２細胞およびＲａｍｏｓ-ＥＧＦＲ細胞。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞溶解機能に対する抗原発現レベルおよび二重武装化の影響を示す一連のグラフである。図８Ａ：Ｈｅｒ２発現に関して染色したＳＫＯＶ３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１、ＣＲＬ５８０３、およびＭＤＡ-ＭＢ-４６８細胞株。図８Ｂ：１０００ｎＭまたは１００ｎＭのハーセプチン-ＳＴにより武装化したＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞の、図８Ａの細胞株に対する溶解機能。図８Ｃ：Ｈｅｒ２（赤）およびＥＧＦＲ（青）発現に関して染色したＳＫＯＶ３細胞とアイソタイプ対照（灰色）との対比。図８Ｄ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞を、５０ｎＭのｍｙｃ-９．２６-ＳＴ（αＨｅｒ２；青）、５０ｎＭのＦｌａｇ-Ｅｏ１-ＳＴ（αＥＧＦＲ；赤）、または同時にその両方の各５０ｎＭ（緑）のいずれかにより武装化し、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞と共培養した。残存ルシフェラーゼ発現を２０時間後に計算した。共培養はすべて７：１のＥ：Ｔ比を用いて行った。図８Ｄの統計学的有意性を、Ｔｕｋｅｙ事後検定による一方向ＡＮＯＶＡを使用して計算した。エラーバーは平均＋／-標準偏差を表す。データポイントは３回の反復試験の平均である。代表的なＴ細胞ドナーを示す。＊Ｐ＜．０５；＊＊Ｐ＜．０１；＊＊＊Ｐ＜．００１。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞およびＣＡＲ Ｔ細胞の溶解機能の比較を示すプロットである。１０００ｎＭのハーセプチン-ＳＴにより武装化したＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞、または４Ｄ５ ＣＡＲ Ｔ細胞を、様々なＥ：Ｔ比でＳＫＯＶ３（Ｈｅｒ２＋）腫瘍細胞の存在下で共培養した。残存ルシフェラーゼ発現を２０時間後に計算し、各Ｅ：Ｔ比で非形質導入Ｔ細胞に対して標準化した。エラーバーは平均＋／-標準偏差を表す。データポイントは３回の反復試験の平均である。代表的なＴ細胞ドナーを示す。 武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体の代謝回転の基本速度を示す一連のヒストグラムである。休止ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞をハーセプチン-ＳＴにより最大限に武装化し、ローディングされた受容体に関して２４時間毎に分析して、ローディングされた受容体の細胞表面からの喪失率を決定した。非武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を陰性対照として染色した（グレーのヒストグラム）。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞による処置が重量の変化をもたらさなかったことを示すプロットである。ＮＳＧマウス（各群ｎ＝４）に対して、第０日に１×１０６個のＳＫＯＶ３腫瘍細胞を、続いて第７日に１２．５×１０６個のハーセプチン-ＳＴ武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞を腹腔内注射した。ハーセプチン-ＳＴを第８日に投与し、その後は３日毎に注射した。注射量はマウス１匹当たりの用量を示す。（Ａ）各マウスの体重を処置の経過中にモニターした。処置群では体重変化は観察されなかったが、対照群では腹水形成に起因する体重変化の増加が起こった。エラーバーは平均＋／-標準偏差を表す。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞が、悪性ＳＣ腫瘍モデルにおいて腫瘍が増殖する速度を遅くすることを示す一連のプロットである。ＮＳＧマウス（各群ｎ＝５）に対して、第０日に１×１０６個のＳＫＯＶ３腫瘍細胞を、続いて第６日にハーセプチン-ＳＴにより武装化した１２．５×１０６個のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞を皮下注射した。Ｔ細胞注入の１日後に５０μｇのハーセプチン-ＳＴ標的化リガンドを投与し、その後は試験全体にわたって３日毎に注射した。腫瘍体積はキャリパー測定（Ａ）によってモニターした。黒線は個々のマウスを表し、赤線は平均腫瘍体積を表す。腫瘍増殖がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζ単独群に比して有意に低下した時点をアスタリスク（＊）で示す。＊Ｐ＜．０５；＊＊Ｐ＜．０１；＊＊＊Ｐ＜．００１。 受容体の上流にＧＦＰおよびＴ２ Ａ部位を含む、表記されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体の形質導入効率を示す。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体が発現されること、およびＳｐｙＴａｇ標識リガンドとの共有結合ローディングが可能であることを示す。具体的には、ＧＦＰをｍｙｃ-Ｈｅｒ２ ＤＡＲＰｉｎ-ＳｐｙＴａｇ００３と共に含むＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３-ＢＢζのローディングを表すプロットを示す。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３-ＢＢｚを発現するＴ細胞を、ｍｙｃ-Ｈｅｒ-２ ＤＡＲＰｉｎ-ＳｐｙＴａｇ００３（１０００ｎＭ）と共に３０分間インキュベートした。受容体ローディングはＡｌｅｘａ６４７蛍光コンジュゲート抗ｍｙｃ抗体を用いて検出し、フローサイトメトリーを介して評価した。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３を発現するＴ細胞上のＳｐｙＴａｇ００３の滴定を示す。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ００３-ΔζＴ細胞を、漸増濃度のｍｙｃ-ＴＬ-ＳｐｙＴａｇ００３と共に５分間または３０分間インキュベートした。Ｍｙｃ発現をフローサイトメトリーにより測定して、受容体ローディングを定量した。ローディングのピークは１００～２００ｎＭであり、高濃度では減少する。
本発明は、普遍的免疫受容体を発現するように操作された細胞を使用する、複数抗原の標的化、制御可能な細胞活性、および腫瘍の選択的標的化に関する。普遍的免疫受容体は、養子Ｔ細胞療法の急速に登場しつつある一形態であり、従来のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法が直面する安全性および抗原回避の課題を克服する可能性がある。二機能性抗原特異的標的化リガンドを介して抗原認識ドメインとＴ細胞シグナル伝達ドメインとをデカップリングすることによって、普遍的免疫受容体は、Ｔ細胞エフェクター機能を調節すること、および単一の受容体で複数の抗原を標的とすることができる。本明細書に記載されるのは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＳｐｙＴａｇ化学の適用を通じてＴ細胞表面での標的化リガンドの翻訳後共有結合を可能にする初の普遍的免疫受容体である、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体の開発である。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体は、ＳｐｙＴａｇ標識標的化リガンドの付加を介して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、初代ヒトＴ細胞を種々の腫瘍抗原に対して再方向付けした。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞の活性は、標的抗原およびＳｐｙＴａｇ標識標的化リガンドの両方の存在に依存し、このため機能の用量依存的制御が可能となった。受容体と標的化リガンドとの共有結合形成の変異性破壊により、再方向付けされたＴ細胞機能は依然として可能であったが、抗腫瘍機能は有意に損なわれた。したがって、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体は、迅速な抗原特異的受容体の集合、複数抗原の標的化、および制御可能なＴ細胞活性を可能にする。
本発明は、がん、感染症、および自己免疫障害を含む種々の障害を治療するために有用な養子細胞療法のための組成物および方法に関する。本発明は、本明細書でＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体と称する普遍的免疫受容体を発現するように改変されたＴ細胞の養子細胞移入のための戦略に関する。本発明の受容体は、所望の抗原に対する特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。一実施形態では、本発明のＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体は、細胞外標識結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞質ドメインまたはそうでなければ細胞内ドメインとを含む。
本発明は、Ｔ細胞活性化のための細胞内シグナル伝達成分と、膜貫通領域と、ペプチドタグが融合される細胞外ヒンジ領域とを含有する免疫受容体構築物への、短いヌクレオチド配列の組込みを通じての普遍的免疫受容体戦略を提供する。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＳｐｙＴａｇ部分を組み入れた任意の分子によって結合され得るその表面上にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを発現するように操作される。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分を組み入れた任意の分子によって結合され得るその表面上にＳｐｙＴａｇ免疫受容体を発現するように操作される。結合させ得る分子には、Ｔ細胞を表面抗原に対して再方向付けし得るもの（例えば、抗体、ｓｃＦｖ、受容体、リガンド、アプタマーなど）またはｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞追跡のための標識化剤が含まれるが、これらに限定されない。さらに、再方向付け用分子（例えば、抗体）上の相互タグを、例えば、コンジュゲーション、融合、またはライゲーションを通じての標識化剤との結合によって標識して、診断のために使用される抗原特異的標識化剤として、臨床試験に対する患者の適格性を決定するために、標的組織中の抗原に対する最大結合の時間を決定するために（健常組織において残留作用物質を伴わずに）、および治療に対する応答をモニターする手段として、利用することができる。
定義
別に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の試験のための実施において使用することができるが、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。本発明の記載および請求においては、以下の用語を使用する。
また、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書において、冠詞の文法的対象である１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「１つの要素」は、１つまたは複数の要素を意味する。
本明細書で使用される「約」は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、指定された値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、さらに好ましくは±０．１％の変動を範囲に含むことを意味するが、これはそのような変動が開示される方法を実施するために適切であるためである。
「活性化」は、本明細書で使用される場合、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能を伴うこともある。「活性化Ｔ細胞」という用語は、特に、細胞分裂中のＴ細胞を指す。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の供給源または組換え供給源に由来するインタクトな免疫グロブリンであり得、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体を含む、種々の形態で存在し得る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。
用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
「抗体重鎖」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する構造にあるすべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうち、大きい方を指す。
「抗体軽鎖」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する構造にあるすべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうち、小さい方を指す。κおよびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
用語「合成抗体」は、本明細書で使用される場合、組換えＤＮＡ技術を使用して作製される抗体、例えば、本明細書に記載されるバクテリオファージによって発現される抗体などを意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって作製される抗体であって、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現するもの、またはその抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、ここでそのＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能であって周知である合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
用語「抗原」または「Ａｇ」は、本明細書で使用される場合、免疫応答を惹起する分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生、特異的免疫コンピテント細胞の活性化、またはその両方のいずれかを伴い得る。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として働き得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、それ故に、本明細書で使用される用語である「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、限定はされないが、複数の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するために種々の組合せで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が作製合成され得るか、または生物試料に由来し得ることは容易に明らかである。そのような生物試料は、限定はされないが、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液を含むことができる。
本明細書で使用される用語「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、余命の増加、またはがん性状態に関連する様々な生理学症状の改善によって明らかにされ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」は、腫瘍が最初に発生することの予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても明らかにすることができる。
用語「自己抗原」は、本発明によれば、免疫系によって誤って異物として認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原は、細胞表面受容体を含む、細胞タンパク質、リン酸化タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答に起因する障害と定義される。自己免疫障害は、自己抗原に対する不適切で過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例としては、アジソン病、脂肪性脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、脈管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、用語「自己の」は、後に個体に再導入される同一個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
「同種」は、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
「異種移植」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
本明細書で使用される用語「がん」は、異常細胞の急速で制御されない増殖によって特徴付けられる疾患と定義される。がん細胞は局所的に広がることもあれば、血流およびリンパ系を介して身体の他の部位に広がることもある。様々ながんの例としては、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がんなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「共刺激リガンド」は、この用語が本明細書で使用される場合、Ｔ細胞上のコグネイト共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドがローディングされたＭＨＣ分子との結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を含む。共刺激リガンドには、限定はされないが、ＣＤ７、Ｂ７-１（ＣＤ８０）、Ｂ７-２（ＣＤ８６）、ＰＤ-Ｌ１、ＰＤ-Ｌ２、４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ-Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ-Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７-Ｈ３に特異的に結合するリガンドが含まれ得る。また、共刺激リガンドは、特に、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４-１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドも範囲に含むが、これらに限定されない。
「共刺激分子」は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによってＴ細胞による共刺激応答、例えば、限定はされないが増殖を媒介する、Ｔ細胞上のコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。
「共刺激シグナル」は、本明細書で使用される場合、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルとの組み合わせで、Ｔ細胞増殖および／または重要な分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを導くシグナルを指す。
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、疾患が改善されなければ動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。これに対して、動物における「障害」は、その動物が恒常性を維持することはできるが、その動物の健康状態が障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。未治療のままに放置されても、障害が必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすわけではない。
本明細書で使用される「有効量」は、治療的または予防的な利益をもたらす量を意味する。
「コードする」は、定義されたヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ）配列または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的過程において他の重合体および高分子の合成のためのテンプレートとしての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、ならびにそれに起因する生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によって細胞または他の生物システムにおいてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であって、通常は配列表として提供されるコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして使用される非コード鎖の両方を、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称することができる。
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織もしくは系の内部に由来するか、またはそれらの内部で産生される任意の材料を指す。
本明細書で使用される場合、用語「外因性」は、生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の材料を指す。
本明細書で使用される用語「発現」は、そのプロモーターによって推進される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。
「発現ベクター」は、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは発現のための十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み入れるコスミド、プラスミド（例えば、裸のもの、またはリポソーム内に含有される）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの、当技術分野で公知のものがすべて含まれる。
「相同な」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。比較される２つの配列の両方で、ある位置が同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットによって占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれで、ある位置がアデニンによって占められる場合、これらの分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性の割合は、２つの配列によって共有される一致するかまたは相同な位置の数を、比較する位置の数によって除算した上で１００を乗算した関数である。例えば、２つの配列における１０の位置のうち６が一致するかまたは相同である場合には、２つの配列は６０％相同である。一例として、ＤＮＡ配列であるＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。一般に比較は、２つの配列が最大の相同性を与えるように整列化された場合に行われる。
本明細書で使用される用語「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」は、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。Ｂ細胞によって発現される抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と時に呼ばれる。タンパク質のこのクラスに含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥである。ＩｇＡは、体内分泌物、例えば、唾液、涙液、母乳、消化管分泌物、ならびに気道および泌尿生殖器の粘液分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは最も一般的な流血中抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対象において一次免疫応答で産生される主要な免疫グロブリンである。これは凝集、補体結合、および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。ＩｇＤは既知の抗体機能を有しない免疫グロブリンであるが、抗原受容体としての役割を果たす可能性がある。ＩｇＥは、アレルゲンへの曝露に際して肥満細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
本明細書で使用される場合、「説明材料」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用し得る刊行物、記録、図表、または他の任意の表現媒体を含む。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の核酸、ペプチド、および／もしくは組成物を含有する容器に添付されてもよく、または核酸、ペプチド、および／もしくは組成物を含有する容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明材料および化合物がレシピエントによって共同的に使用されることを意図して、説明材料を容器とは別に出荷してもよい。
「単離された」は、天然の状態から変えられた、または取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば、宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
本発明に関連して、一般的に存在する核酸塩基に関して以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
別段の指示がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり、かつ同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、一部の型においてイントロンを含み得る程度まで、イントロンも含み得る。
本明細書で使用される「レンチウイルス」は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという点で、レトロウイルスの中でも独特である。それらはかなりの量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達し得るため、遺伝子伝達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶはすべてレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで有意なレベルの遺伝子導入を達成するための手段を与える。
本明細書で使用される用語「調節する」は、治療もしくは化合物の非存在下の対象における応答のレベルと比較して、および／または他の点では同一であるが未治療である対象における応答のレベルと比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、対象、好ましくはヒトにおいて、天然のシグナルまたは応答を撹乱させ、および／またはそれに影響を与え、それによって有益な治療応答を媒介することを範囲に含む。
別段の指示がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり、かつ同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンも含み得る。
用語「作動可能に連結された」は、調節配列と異種核酸配列との間の、後者の発現を結果的にもたらす機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能的関係の下で配置されている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続的であり、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、同じリーディングフレーム内にある。
用語「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルと比較して異常なレベルであることを示すことを意図する。腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で公知の標準的なアッセイによって決定することができる。
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）もしくは胸骨内注射、または輸注法が含まれる。
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書において互換的に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｔｕの別を問わずに本明細書に記載の方法を適用しうる、任意の動物またはその細胞を指す。ある非限定的な実施形態では、患者、対象または個体はヒトである。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドの重合体である。したがって、本明細書で使用される核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらが単量体「ヌクレオチド」に加水分解され得るという一般知識を有する。単量体ヌクレオチドは加水分解されてヌクレオシドになる。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、限定はされないが、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲ（商標）などを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって、ならびに合成手段によって得られる、すべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに接合された２つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当技術分野において一般的にタンパク質と称される長鎖の両方を指し、それらには多くのタイプがある。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質などが含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組合せが含まれる。
本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列と定義される。
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現のために必要な核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の場合には、この配列は、エンハンサー配列、および遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントを含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現する配列であってもよい。
「恒常的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理的条件下で、遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、実質的にプロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
「特異的に結合する」という用語は、抗体に関して本明細書で使用される場合、特異的な抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識せず結合もしない抗体を意味する。例えば、１つの種に由来する抗原に特異的に結合する抗体は、１つまたは複数の種に由来するその抗原にも結合し得る。しかし、そのような異種間反応性は、それ自体、抗体の特異的としての分類を変えるものではない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なるアレル形態にも結合し得る。しかし、そのような交差反応性は、それ自体、抗体の特異的としての分類を変えるものではない。ある場合には、用語「特異的結合」または「特異的に結合すること」は、抗体、タンパク質、またはペプチドの第２の化学種との相互作用に関して、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存すること、例えば、抗体がタンパク質全般ではなく特異的なタンパク質構造を認識してそれに結合することを意味するために使用し得る。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」および抗体を含有する反応において、エピトープＡを含有する分子（または遊離性の非標識Ａ）の存在は、抗体に結合する標識されたＡの量を減少させる。
用語「ＳｐｙＴａｇ」および「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」は、一般に弱いタンパク質-タンパク質相互作用を克服する、便利なタンパク質カップリングツールを指す（「Ｓｐｙ」は、細菌である化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を指す）。ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムは、不可逆的なペプチドライゲーションを生み出すことから、タンパク質の結合、標識、または固定化のために理想的である。ＳｐｙＴａｇは遺伝的にコードされたペプチドであり、その遺伝的にコードされたパートナーであるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとの結合に際して自発的なアミド結合を形成する。ＳｐｙＴａｇは広範囲の条件下でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと反応し、反応後の生成物は非常に安定である（Zachari et al., 2012, PNAS vol. 109:12, pp.690-697）。
用語「刺激」は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とそのコグネイトリガンドとの結合によって誘導され、それによってＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達などの、ただしこれに限定されないシグナル伝達イベントを媒介する一次応答を意味する。刺激は、ＴＧＦ-βのダウンレギュレーション、および／または細胞骨格構造の再編成などのような特定の分子の発現変化を媒介することができる。
「刺激分子」は、この用語が本明細書で使用される場合、抗原提示細胞上に存在するコグネイト刺激リガンドに特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
「刺激リガンド」は、本明細書で使用される場合、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在する場合に、Ｔ細胞上のコグネイト結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称する）に特異的に結合して、それによって、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野で周知であり、特に、ペプチドがローディングされたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、およびスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を範囲に含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。また、実質的に精製された細胞は、その天然に存在する状態に通常付随する他の細胞型から分離された細胞も指す。ある場合には、実質的に精製された細胞の集団は、均一な細胞集団を指す。他の場合には、この用語は、単に、天然の状態で通常付随する細胞から分離された細胞を指す。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。他の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでは培養されない。
本明細書で使用される用語「治療的」は、治療および／または予防を意味する。治療効果は、疾病状態の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
用語「治療有効量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が見出そうとしている、組織、系、または対象の生物学的または医学的な反応を誘発する対象化合物の量を指す。用語「治療有効量」は、投与された場合に、治療される障害または疾患の徴候または症状のうちの１つまたは複数の発生を予防するか、またはそれをある程度改善するのに十分な、化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重などに依存して異なる。
疾患を「治療する」は、この用語が本明細書で使用される場合、対象が被っている疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を低下させることを意味する。
本明細書で使用される用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、外因性核酸が宿主細胞中に移入または導入される過程を指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクトされた、外因性核酸によって形質転換された、または外因性核酸を形質導入された細胞である。この細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
本明細書で使用される語句「転写制御下に」または「作動可能に連結された」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドに関して正しい位置および向きにあることを意味する。
本明細書で使用される場合、「普遍的免疫受容体」は、（ｉ）細胞外アダプター分子に付着した１つまたは複数の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、および（ｉｉ）相互アダプター分子を介してアダプター分子に結合することができ、かつ標的（例えば、標的細胞上の抗原、例えば、腫瘍細胞によって発現される抗原）に特異的に結合し得る標的化リガンドという、分割されているが相互作用性である２つの部分を有する受容体である。それ故に、標的化リガンドは免疫学的架橋として作用し、標的と受容体上の細胞外アダプター分子との両方に結合して、抗原特異的Ｔ細胞エフェクター機能を誘発する。
本明細書で使用される場合、「アダプター分子」および「相互アダプター分子」（または「タグ」および「相互タグ」）は、結合ペアシステムにおける一対の構成要素を指し、ここでペアの各々は、他方に特異的に結合する。結合ペアシステムの例には、限定はされないが、Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇおよびビオチン／アビジンが含まれる。結合は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。「アダプター分子」は対のうちの一方を指し、「相互アダプター分子」はアダプター分子の結合パートナーを指す。したがって、Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇシステムでは、アダプター分子は、例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであってもよく、その相互アダプター分子はＳｐｙＴａｇとなり、その反対に、アダプター分子はＳｐｙＴａｇであってもよく、その相互アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとなる。
本明細書で使用される場合、用語「武装化受容体」または「武装化された普遍的免疫受容体」は、その２つの相互作用部分が互いに連結または結合している普遍的免疫受容体、すなわち、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインおよび細胞外アダプター分子を含有する部分が、相互アダプター分子を介してアダプター分子に結合することができて、かつ標的（例えば、腫瘍細胞などの細胞によって発現される抗原）に特異的に結合することができる標的化リガンドに連結または結合しており、それ故に「武装化受容体」または「武装化された普遍的免疫受容体」が標的に結合して抗原特異的Ｔ細胞エフェクター機能を誘発することを可能にするものを指すことを意味する。これに対して、「非武装化受容体」または「武装化されていない普遍的免疫受容体」は、その２つの相互作用部分が互いに連結も結合もしていない普遍的免疫受容体、すなわち、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインおよび細胞外アダプター分子を含む部分が、相互アダプター分子を介してアダプター分子に結合することができて、かつ標的（例えば、腫瘍細胞などの細胞によって発現される抗原）に特異的に結合することができる標的化リガンドに連結も結合もしていないものを指す。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用し得る物質の組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結び付いたポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むが、これらに限定されない、多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなども含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらには限定されない。
範囲：本開示の全体を通じて、本発明の様々な態様を範囲の形式で提示することができる。範囲の形式における記載は、単に便宜上および簡潔さのためであって、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定とみなされるべきではないことが理解される必要がある。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内にあるすべての可能な部分的範囲とともに個々の数値も具体的に開示していると考慮されるべきである。例えば、１から６までのような範囲の記載は、具体的に開示される部分的範囲、例えば、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどとともに、その範囲内にある個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６も有すると考慮されるべきである。これは範囲の幅広さとは関係なく適用される。
説明
現行の遺伝子操作細胞療法は、抗原特異性、患者の利用しやすさ、および腫瘍または細胞の型に制限がある。固定された抗原特異性を有するＣＡＲを作製する代わりとなる選択肢は、Ｔ細胞受容体の特異性を必要に応じて変化させることが可能な普遍的Ｔ細胞受容体を作り出すことである。これは、特有のペプチドまたはタンパク質タグを発現するＴ細胞を操作することによって達成することができ、それを標的化リガンド（例えば、抗体、抗体結合ドメイン、タンパク質スカフォールド、アプタマー、受容体など）、イメージング剤、ハプテン、酵素などと融合しているかまたは付着している相補的結合パートナーによって翻訳後に標識することができる。後に任意の標的化リガンドによって標識することができる単一の操作された普遍的Ｔ細胞を作り出すことの利点には、Ｔ細胞の大規模なパネルを非常に迅速かつ容易に作り出す能力、複数の特異性を有する個々のＴ細胞を調製する能力、およびＴ細胞特異性を時間経過と共に変化させる能力が含まれるが、これらに限定されない。
Ｔ細胞エフェクター機能の時間的および量的な制御を可能にすることを目的としてプロトタイプＣＡＲ構造を拡張するために、ビオチンとアビジンとの相互作用を利用するタグ特異的受容体が作り出され、Urbanska et al., Cancer Research 2012, 72 (7), 1844-1852に開示された。ビオチン-ビオチン結合免疫受容体と呼ばれるこの受容体は、普遍的免疫受容体（ＵＩＲ）と命名された、急速に拡大しつつあるオルソゴナル受容体のクラスに属する（Minutolo et al., Frontiers in Oncology 2019, 9, 176; 25-35; Clemenceau et al., Blood 2006, 107 (12), 4669-4677. Tamada et al., lin Cancer Res 2012, 18 (23), 6436-6445 ; Kudo et al., Cancer Research 2013, 74 (1); Urbanska et al., Journal of Translational Medicine 2014, 12 (1), 347; Ochi et al., Cancer Immunology 2014, 2 (3), 249-262 ; Feldmann et al., Oncotarget 2014, 5 (0). ; Kim et al., J Am Chem Soc 2015, 137 (8), 2832-2835 ; Rodgers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016, 113 (4). ; Ma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016, 113 (4), E450-E458; Cho et al., Cell 2018, No. Mol. Ther. Oncolytics 3 2016）。ＵＩＲは、（ｉ）細胞外アダプタータンパク質に付着した標準的な細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、および（ｉｉ）アダプタータンパク質に結合し得る標的化リガンドという、分割されているが相互作用性である２つの部分から構成される。標的化リガンドは免疫学的架橋として作用し、標的細胞上のＴＡＡおよび受容体上の細胞外アダプターの両方に結合して、抗原特異的Ｔ細胞エフェクター機能を誘発する。
ＴＡＡ認識をＴ細胞シグナル伝達からデカップリングすることによって、ＵＩＲは、ＣＡＲ Ｔ細胞が現在直面しているいくつかの問題に対処することができる。ＵＩＲはＴ細胞エフェクター機能を推進させる上で抗原特異的標的化リガンドの存在に依拠するため、Ｔ細胞エフェクター機能の用量依存的な制御（Minutolo et al., Frontiers in Oncology 2019, 9, 176）、ならびに迅速な活性化および拡大が原因となってＣＡＲ Ｔ細胞で認められる毒性、例えばＣＲＳの軽減（Rodgers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016, 113 (4)）を可能にする。さらに、ＵＩＲは、複数の標的化リガンドの使用を介して単一細胞生成物で複数のＴＡＡを標的化し得るモジュール式プラットフォームを提供し、単一抗原の喪失に関連するＴＡＡ不均一性および再発の問題に対処する。
現在、ＵＩＲはすべて、標的化リガンドとＵＩＲとの非共有結合性相互作用に依拠している。今回、本発明者らは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＳｐｙＴａｇ化学の使用を介して標的化ドメインの受容体への翻訳後共有結合を可能にする次世代ＵＩＲシステムの開発について詳述する。Zakeriらによって開発された、タンパク質ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとそのコグネイトペプチドＳｐｙＴａｇとの相互作用は、共有結合性アミド結合の迅速かつ自発的な形成を導く（Zakeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012, 109 (12), E690-7）。ペプチド-タンパク質ペアの間の反応は、生理的に妥当な温度およびｐＨレベルの範囲にわたって起こることから、これはｉｎ ｖｉｖｏでの使用のための有望な候補となる（Zakeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012, 109 (12), E690-7）。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＳｐｙＴａｇは、生きている哺乳動物細胞培養物、ならびにＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびＳｐｙＴａｇドメインを含有するタンパク質を内因性に発現するトランスジェニックＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において、膜に存在する受容体を標識するためにも使用されている（Bedbrook et al., Chem. Biol. 2015, 22 (8), 1108-1121）。以上を総合すると、広範囲にわたる強固な反応性条件と、哺乳動物細胞および生きている生物の両方におけるその使用とが相まって、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＳｐｙＴａｇシステムは、ＣＡＲを模倣するＵＩＲ構造のｄｅ ｎｏｖｏ構築のための好ましい選択肢となる。
本明細書に記載されるのは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質をその細胞外ドメインとして含有し、それに標準的な第二世代ＣＡＲ細胞内シグナル伝達ドメインが付着している、開発されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体である。ＳｐｙＴａｇで標識されたＴＡＡ特異的標的化リガンドが加わることにより、自発的な自己触媒性イソペプチド結合の形成を通してＣＡＲ様受容体のオンデマンド形成が可能になる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体を発現する一次ヒトＴ細胞には、標的化リガンドを定量的にローディングすることができ、それにより、再方向付けされたＴ細胞エフェクター機能および腫瘍細胞溶解の用量設定可能な制御が可能になる。単一細胞生成物としてでさえ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体Ｔ細胞は、ＳｐｙＴａｇで部位特異的に標識された臨床グレードの抗体、ならびにＳｐｙＴａｇが遺伝的に融合された標的化リガンドの追加を介して、数々の腫瘍抗原を認識することができる。本明細書に記載される結果は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体システムの柔軟性および有効性を示す。
複数抗原の標的化
本発明は、複数の抗原、特に腫瘍によって発現される２つまたはそれ以上の異なる抗原を標的化するために普遍的免疫受容体を発現するように操作された細胞の使用に関する。本明細書にさらに記載されるように、二重武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴは、単一武装化細胞のみ（図８Ｄ）と比較して、腫瘍溶解の増加を達成することが見出された。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を特異性の異なる２つの抗体で（指定の用量で）武装化することにより、２つの異なる抗原を共発現するがん細胞に対する活性が増強されることが示された。
したがって、一態様では、哺乳動物において腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現する、方法が提供される。別の態様では、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現する、方法が提供される。一実施形態では、本方法は、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を哺乳動物に投与するステップ、（ｂ）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇに連結された第１の作用物質を哺乳動物に投与するステップであって、第１の作用物質は腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合する、ステップ、（ｃ）相互アダプター分子に連結された第２の作用物質を哺乳動物に投与するステップであって、第２の作用物質は腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原である、ステップを含む。
一部の態様では、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するため、またはがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質であって、腫瘍またはがんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質は腫瘍またはがんによって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質は腫瘍またはがんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原であり、免疫受容体、第１の作用物質および第２の作用物質は哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質が提供される。
他の態様では、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激すること、またはがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療することにおける、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用であって、腫瘍またはがんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質は腫瘍またはがんによって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質は腫瘍またはがんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原であり、免疫受容体、第１の作用物質および第２の作用物質は哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用が提供される。
一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、相互アダプター分子はＳｐｙＴａｇである。一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＴａｇであり、相互アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。
一部の実施形態では、第１および第２の作用物質の両方の投与は、第１の作用物質のみまたは第２の作用物質のみの投与と比較して、抗腫瘍活性の増強をもたらす。一部の実施形態では、第１の作用物質および／または第２の作用物質のより少量を互いに組み合わせて投与する場合に、第１の作用物質のみまたは第２の作用物質のみが投与される場合に達成される抗腫瘍活性のレベルと比較して、同程度または同じレベルの抗腫瘍活性が達成される。
一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、相互アダプター分子はＳｐｙＴａｇである。一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＴａｇであり、相互アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む。一実施形態では、細胞外ドメインはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む。
一部の実施形態では、作用物質は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている。一実施形態では、作用物質はＳｐｙＴａｇに連結されている。別の実施形態では、作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。別の態様では、作用物質は抗体である。一実施形態では、作用物質はヒトＩｇＧである。
一実施形態では、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。一実施形態では、細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、細胞は自己細胞である。
別の実施形態では、普遍的免疫受容体は、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激分子は、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。一実施形態では、抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、またはＣＤ２０である。
一実施形態では、哺乳動物への投与の前に、細胞を作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前武装化細胞を哺乳動物に投与する。別の実施形態では、作用物質を哺乳動物に投与する前に、細胞を哺乳動物に投与する。一部の実施形態では、投与される作用物質の量および／または数もしくは量は、所望のレベルの溶解活性を生じさせるように選択または調整される。
溶解活性の制御
別の態様では、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせる方法が提供される。さらに別の態様では、対象（例えば、哺乳動物）におけるがんを治療する方法であって、がんに対する溶解活性のレベルの制御をもたらす、方法が提供される。ほとんどの薬物は用量調節が可能であり、予測可能な薬物動態および薬力学に従うが、従来のＣＡＲ-Ｔ細胞療法は、注入後に容易には制御できない生きた薬物である。標的抗原を認識すると、投与されたＣＡＲ Ｔ細胞はレシピエント内で急速に増殖して多数となり、炎症性サイトカインを放出することができ、これは場合によっては、重篤で時には致死的な副作用を招く。本明細書の他の箇所に記載されるように、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体を発現する初代ヒトＴ細胞には、標的化リガンドを定量的にローディングすることができ、これにより、再方向付けされたＴ細胞エフェクター機能および腫瘍細胞溶解の用量設定可能な制御が可能になることが示された。
一実施形態では、本方法は、細胞のある量を、相互アダプター分子に連結された作用物質のある量と接触させるステップを含み、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、細胞外ドメインはアダプター分子を含み、作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、作用物質の量および／または細胞の数は、腫瘍に対してそのレベルの溶解活性を生じさせるように選択される。別の実施形態では、本方法は、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞のある量を哺乳動物に投与するステップ、（ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質のある量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の量および／または作用物質の量は、がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、ステップを含む。
一態様では、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせるのに使用するため、またはがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための、遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍またはがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を作用物質のある量と接触させ、細胞の量に対する作用物質の量は、腫瘍またはがんに対してそのレベルの溶解活性を生じさせるように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質が提供される。
別の態様では、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせること、またはがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療することにおける、遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍またはがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を作用物質のある量と接触させ、細胞の量に対する作用物質の量は、腫瘍またはがんに対してそのレベルの溶解活性を生じさせるように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質の使用が提供される。
溶解活性のレベルは、選択される任意のレベル、例えば、腫瘍細胞を効果的に溶解し、哺乳動物における望ましくない副作用を最小限にする溶解活性のレベルであり得る。溶解活性のレベルは、あらかじめ決定された溶解活性のレベルであり得る。一部の実施形態では、溶解活性のレベルは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の細胞傷害性である。一実施形態では、細胞の量に対して作用物質の量を増加させること（例えば、武装化用量の増加）は、溶解活性のレベルを上昇させる。別の実施形態では、細胞の量に対して作用物質の量を減少させること（例えば、武装化用量の減少）は、溶解活性のレベルを低下させる。
一実施形態では、本方法は、哺乳動物の腫瘍量またはがんの量を決定するステップ、および腫瘍量またはがんの量に基づいて、腫瘍またはがんに対してそのレベルの溶解活性を生じさせるために、細胞の量に対する作用物質の量を選択するステップを含む。腫瘍量またはがんの量は、標準的な手法、例えば、固形腫瘍に関する腫瘍のサイズの測定、流血中がん細胞の数（例えば、白血病患者の場合）、またはがんマーカーのレベルの決定によって決定することができる。
一実施形態では、本方法は、細胞のある用量および／または作用物質の量を哺乳動物に投与して、治療が有効であるかどうかを決定し、有効でなければ、細胞の用量および／または作用物質の量を増加することを含む。一実施形態では、哺乳動物により多くの作用物質を投与する。別の実施形態では、哺乳動物に、本明細書で定義される第２の（またはさらなる）作用物質を投与する。
一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、相互アダプター分子はＳｐｙＴａｇである。一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＴａｇであり、相互アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む。一実施形態では、細胞外ドメインはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む。
一部の実施形態では、作用物質は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている。一実施形態では、作用物質はＳｐｙＴａｇに連結されている。別の実施形態では、作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。別の態様では、作用物質は抗体である。一実施形態では、作用物質はヒトＩｇＧである。
一実施形態では、アダプター分子または相互アダプター分子は、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。一実施形態では、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。一実施形態では、細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、細胞は自己細胞である。
別の実施形態では、普遍的免疫受容体は、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激分子は、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。
一実施形態では、抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、またはＣＤ２０である。
一実施形態では、哺乳動物への投与の前に、細胞を作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前武装化細胞を哺乳動物に投与する。別の実施形態では、作用物質を哺乳動物に投与する前に、細胞を哺乳動物に投与する。一部の実施形態では、投与される作用物質の量および／または投与される細胞の数もしくは量は、所望のレベルの溶解活性を生じさせるように選択または調整される。
「オンデマンド」標的化
別の態様では、本発明は、腫瘍の「オンデマンド」標的化を使用する、哺乳動物において腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を刺激する方法、およびがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法を提供する。本明細書の他の箇所に記載されるように、武装化されていて、しかし非武装化されていないＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞は、抗原を発現する腫瘍細胞を標的化して死滅させることができることが見出され、非武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞に標的化リガンドを後から添加することによって、非武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞エフェクター機能を一時的に誘発させ得ることがさらに示された。したがって、非武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を対象に投与することができ、この非武装化細胞は対象においてがん細胞の存在下で不活性であるが、後の時点で標的化リガンドを投与して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を武装化して腫瘍溶解を誘発させ、がん死滅能力を「オンデマンド」で誘発することが可能である。
したがって、一実施形態では、本方法は、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を哺乳動物に投与するステップ、（ｂ）その後に、相互アダプター分子に連結された作用物質を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含む。
別の態様では、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するため、またはがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための、遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞および作用物質が提供される。
別の態様では、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激すること、またはがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療することにおける、遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞および作用物質の使用が提供される。
一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、相互アダプター分子はＳｐｙＴａｇである。一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＴａｇであり、相互アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む。一実施形態では、細胞外ドメインはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む。
一部の実施形態では、作用物質は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている。一実施形態では、作用物質はＳｐｙＴａｇに連結されている。別の実施形態では、作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。別の態様では、作用物質は抗体である。一実施形態では、作用物質はヒトＩｇＧである。
一実施形態では、アダプター分子または相互アダプター分子は、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。一実施形態では、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。一実施形態では、細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、細胞は自己細胞である。
別の実施形態では、普遍的免疫受容体は、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激分子は、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。
一実施形態では、抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、またはＣＤ２０である。
一部の実施形態では、投与される作用物質の量および／または投与される細胞の数もしくは量は、所望のレベルの溶解活性を生じさせるように選択または調整される。
抗原発現レベルに基づく腫瘍の標的化
高濃度の抗体により武装化されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞とは異なり、抗原高発現標的細胞に対する感受性はあるが、抗原低発現標的細胞に対する感受性はないことが、驚いたことに見出された。この所見は、健常組織上に発現される高リスク抗原を標的とする抗体と共に適用された場合のＴ細胞の安全性に重要な意味を有する。
したがって、他の態様では、４-１ＢＢの細胞内ドメインを含有する免疫受容体を発現するように操作された細胞を使用して、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激する方法、およびがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法が提供される。一実施形態では、本方法は、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む普遍的免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞のある量を哺乳動物に投与するステップ、および（ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質のある量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含み、がんは、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている。腫瘍における抗原発現のレベルを決定するための方法は、当技術分野で周知の任意の方法、例えば、免疫組織化学的方法であり得る。
一部の態様では、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するため、またはがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための、遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍またはがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、がんまたは腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質が提供される。
他の態様では、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激すること、またはがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療することにおける、遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍またはがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、かつ作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、腫瘍またはがんは、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質の使用が提供される。
一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、相互アダプター分子はＳｐｙＴａｇである。一部の実施形態では、アダプター分子はＳｐｙＴａｇであり、相互アダプター分子はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む。一実施形態では、細胞外ドメインはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む。
一部の実施形態では、作用物質は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている。一実施形態では、作用物質はＳｐｙＴａｇに連結されている。別の実施形態では、作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。別の態様では、作用物質は抗体である。一実施形態では、作用物質はヒトＩｇＧである。
一実施形態では、アダプター分子または相互アダプター分子は、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。一実施形態では、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。一実施形態では、細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、細胞は自己細胞である。
一実施形態では、抗原は、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、またはＣＤ２０である。
一実施形態では、哺乳動物への投与の前に、細胞を作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前武装化細胞を哺乳動物に投与する。別の実施形態では、作用物質を哺乳動物に投与する前に、細胞を哺乳動物に投与する。一部の実施形態では、投与される作用物質の量および／または投与される細胞の数もしくは量は、所望のレベルの溶解活性を生じさせるように選択または調整される。
組成物
本発明は、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含む、あるタイプの普遍的免疫受容体を提供する。細胞外ドメインは、細胞外結合ドメインとも称される特有の結合エレメントを含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインはヒンジ領域も含む。細胞内ドメインまたはそうでなければ細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含む普遍的免疫受容体の一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。
普遍的免疫受容体の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、または普遍的免疫受容体の細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインが組み入れられていてもよい。本明細書で使用される場合、用語「スペーサードメイン」は、一般に、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖の細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大３００アミノ酸、好ましくは１０から１００アミノ酸、最も好ましくは２５から５０アミノ酸で構成され得る。
本発明は、細胞に直接形質導入することができる普遍的免疫受容体を発現し得るレトロウイルスベクター構築物およびレンチウイルスベクター構築物を含む。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトさせることができるＲＮＡ構築物またはＤＮＡ構築物を含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを生成する方法は、特別に設計されたプライマーを用いるテンプレートのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）と、その後のｐｏｌｙＡ付加を含み、それにより、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現させようとする遺伝子、ならびにポリＡ尾部を含有し、典型的には長さ５０～２０００塩基である構築物が産生される。そのようにして産生されたＲＮＡは、様々な種類の細胞に効率良くトランスフェクトさせることができる。一実施形態では、テンプレートは、普遍的免疫受容体に関する配列を含む。
普遍的免疫受容体をコードするポリヌクレオチドベクターを調製することができる。続いて、普遍的免疫受容体を発現するように細胞株を操作することができ、普遍的免疫受容体を発現する細胞を単離して、本明細書に開示される方法に使用することができる。
普遍的免疫受容体を発現する細胞を、当業者に公知の手法を使用して、対象への投与のために製剤化することができる。普遍的免疫受容体を発現する細胞の製剤は、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。製剤に含まれる賦形剤は、例えば、標識の性質、細胞組成、および投与様式に応じて異なる目的を有する。一般に使用される賦形剤の例としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、等張化剤、増量剤、ならびに潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、普遍的免疫受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、そのようなドメインの任意の所望の供給源に由来し得る。
細胞外標識結合ドメイン
本発明の普遍的免疫受容体の細胞外ドメインは、アダプター分子（例えば、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）を含む。一実施形態では、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、任意の目的の分子に結合していてよいその相互タグ、すなわち、それぞれＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇと結び付いている。一実施形態では、細胞外ドメインまたは相互タグは、Ｉｇ重鎖からなってもよく、それには続いて、ＣＨ１およびヒンジ領域の存在が理由となってＩｇ軽鎖が共有結合性に結び付いていてもよく、またはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの存在が理由となって他のＩｇ重鎖／軽鎖複合体が共有結合性に結び付いていてもよい。後者の場合、キメラ構築物に接合される重鎖／軽鎖複合体は、キメラ構築物の抗体特異性とは異なる特異性を有する抗体を構成してもよい。抗体の機能、所望の構造およびシグナル伝達に応じて、鎖全体を使用してもよく、または切断された鎖を使用してもよく、その場合、ＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣＨ３ドメインの全部または一部を除去してもよく、またはヒンジ領域の全部もしくは一部を除去してもよい。
本発明は、それぞれ相互タグ：ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む任意の分子に結合する、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇシステムを使用する養子Ｔ細胞療法の普遍的戦略に基づく。ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分に結合され得る、例えば、融合され得る、コンジュゲートされ得る、ライゲートまたは標識され得る任意の分子が、本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明の分子は、タンパク質（抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、タンパク質スカフォールド、受容体、リガンド）、ペプチド、オリゴヌクレオチド、イメージング／標識化剤などを範囲に含む。本発明において有用な他の種類の標識の例としては、ｍｙｃ-タグ、ＦＬＡＧ-タグ、Ｈｉｓ-タグ、ＨＡ-タグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、フルオロフォア（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、ビオチン、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヒスチジン、ストレプトアビジン、アビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカラニンホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、フルオレセイン、および量子ドットナノ結晶を含む任意のタイプの蛍光物質、放射性同位体、ならびに１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７，１０-四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、および１，４，７-トリアザシクロノナン-１，４，７-三酢酸（ＮＯＴＡ）を含む放射性同位体標識のために使用される任意の種類の化合物が挙げられる。
一実施形態では、本発明の普遍的免疫受容体は、抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合エレメントを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの種類および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾病状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択してもよい。したがって、本発明の普遍的免疫受容体における抗原部分ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫感染症、自己免疫疾患ならびにがん細胞に関連するものが挙げられる。
一実施形態では、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターは、Ｔ細胞表面上に、それぞれＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分を組み入れた任意の分子に結合し得る、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを発現するように設計された普遍的免疫受容体を含む。一実施形態では、この分子は、標的特異的または抗原特異的な結合エレメントを含む。結合ドメインは、特定の疾患または障害に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する標的、リガンド、または抗原を認識するように選択することができる。一部の実施形態では、抗原は、特定の過剰増殖性疾患と関連し得る。ある特定の態様では、本発明の過剰増殖性疾患抗原としては、限定はされないが、原発性または転移性の黒色腫、中皮腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がんおよび腺がん、例えば、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がんなどを含むがんに由来するものが挙げられる。一般に、がん性腫瘍が本ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体システムによって認識され得る細胞表面抗原を有する限り、がんは任意のタイプのがんであり得る。
本発明は、腫瘍抗原に方向付けられた普遍的免疫受容体に限定されない。そうではなくて、疾患または障害に関連する任意の標的、リガンド、または抗原を、本発明の普遍的免疫受容体によって標的化することができる。例えば、一実施形態では、本発明の普遍的免疫受容体は、ウイルス抗原に標的化される。別の実施形態では、本発明の普遍的免疫受容体は、自己抗原に標的化される。自己抗原は、通常は健常者に忍容される抗原であるが、自己免疫障害では適応免疫応答を誘導する。例えば、表皮カドヘリンは、尋常性天疱瘡において自己免疫反応を誘導する自己抗原である。本発明の組成物によって標的化されるのに有用な他の非限定的な自己抗原（それらに関連する自己免疫障害と共に記載される）としては、膵臓β細胞抗原（インスリン依存型糖尿病）、アセチルコリン受容体（重症筋無力症）、甲状腺刺激ホルモン受容体（グレーブス病）、インスリン受容体（低血糖症）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（免疫性血小板減少性紫斑病）、Ｒｈ血液型抗原（自己免疫性溶血性貧血）、リウマチ因子ＩｇＧ複合体（関節リウマチ）、およびミエリン塩基性タンパク質（実験的自己免疫性脳脊髄炎、多発性硬化症）が挙げられる。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、本発明のＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体は、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムに結合した細胞外ドメインと融合している膜貫通ドメインを含むように設計することができる。一実施形態では、普遍的免疫受容体における他のドメインと通常結び付いている膜貫通ドメインが使用される。ある場合には、膜貫通ドメインを、そのようなドメインの同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるように選択するか、またはアミノ酸置換によって改変することができる。
膜貫通ドメインは、天然の供給源または合成供給源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともその膜貫通領域を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは合成性であってもよく、その場合、それは主として疎水性残基、例えば、ロイシンおよびバリンを含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されるであろう。任意選択で、好ましくは２から１０アミノ酸の長さの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、普遍的免疫受容体の膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成してもよい。グリシン-セリンのダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
細胞質ドメイン
本発明のＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体の細胞質ドメインまたはそうでなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、普遍的免疫受容体が内部に配置された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」は、細胞の専門化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に専門化された機能の遂行を指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分を使用する範囲で、そのような切断された部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断された部分を含むことを意味する。
本発明の普遍的免疫受容体において使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例としては、抗原受容体の結合後にシグナル伝達の開始に協調して働くＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
ＴＣＲのみを介して生成されたシグナルはＴ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲを介して抗原依存性一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）と、抗原非依存的様式で作用して二次的または共刺激シグナルをもたらすもの（二次細胞質シグナル伝達配列）という、２つの異なるクラスの細胞質シグナル配列によって媒介されると言うことができる。
一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を、刺激的様式または抑制的様式のいずれかで調節する。刺激様式で作用する主要な細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。
本発明において特に有用な一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。本発明の普遍的免疫受容体における細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。
好ましい一実施形態では、普遍的免疫受容体の細胞質ドメインは、ＣＤ３-ゼータシグナル伝達ドメインを、単独で、または本発明の普遍的免疫受容体の状況において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように設計することができる。例えば、普遍的免疫受容体の細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含む普遍的免疫受容体の一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４-１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。したがって、本発明では、共刺激シグナル伝達エレメントとして主にＣＤ２８および４-１ＢＢが例示されるが、他の共刺激エレメントも本発明の範囲内にある。
本発明の普遍的免疫受容体の細胞質シグナル伝達部分の内部の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で互いに連結され得る。任意選択で、好ましくは長さが２から１０アミノ酸の間である短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが結合を形成してもよい。グリシン-セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３-ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３-ゼータ、ＣＤ２８、４-１ＢＢなどの任意の組合せを含むように設計される。
一実施形態では、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体は、細胞質ドメインを実質的に欠いてもよく、または細胞質ドメインは、シグナル伝達能を実質的に欠いてもよい。そのような実施形態では、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体は、限定はされないが、抗体、サイトカイン、およびイメージング部分を含む、タグ付けされたタンパク質をＴ細胞表面に付着させるためのアンカー分子として機能し得る。
分子の標識
本発明は、相互ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分を有する標識された分子に方向付けられたＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体を範囲に含む。目的の分子は、当技術分野で公知の任意の方法によって標識することができる。例えば、一実施形態では、標識された分子を含む組成物は、普遍的免疫受容体に結合される。分子は、例えば、抗原結合ドメインまたはその断片、例えば、抗体、抗体断片、およびｓｃＦｖ、ペプチド、タンパク質スカフォールド、核酸、アプタマー、リボザイム、小分子などを含む任意の分子であり得る。一部の態様では、目的の分子は標識を欠くが、依然として普遍的免疫受容体と相互作用する。例えば、一実施形態では、目的の分子を含む組成物は標識を欠くが、普遍的免疫受容体を含む第２の組成物は標識を含有する。
一態様では、普遍的免疫受容体標的化リガンドを作製する方法であって、アダプター分子または相互アダプター分子を、標的化リガンドに対するアダプター分子または相互アダプター分子の光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して標的化リガンドに連結するステップを含む、方法が提供される。別の態様では、標的化リガンドを含む組成物であって、標的化リガンドが、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介してアダプター分子または相互アダプターに連結されている、組成物が提供される。一部の実施形態では、アダプター分子は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇである。一部の実施形態では、相互アダプター分子は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇである。一部の他の実施形態では、標的化リガンドは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。一部の実施形態では、標的化リガンドはヒトＩｇＧである。一部の実施形態では、標的化リガンドは、臨床グレードの抗体である。
分子の任意の既知のセットを使用して、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体を、目的の抗原に標的化させることができる。分子の非限定的な例としては、抗原結合ドメインまたはその断片、例えば、抗体、抗体断片、およびｓｃＦｖ、ペプチド、タンパク質スカフォールド、オリゴヌクレオチド、小分子、ならびにリガンドを含む、任意の分子が挙げられる。分子に結合され得る、例えば、融合され得る、コンジュゲートされ得る、ライゲートされ得る、または付着され得る標識の周知の例としては、ｍｙｃ-タグ、ＦＬＡＧ-タグ、Ｈｉｓ-タグ、ＨＡ-タグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、フルオロフォア（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、ビオチン、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヒスチジン、ストレプトアビジン、アビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、量子ドットナノ結晶を含む任意の種類の蛍光物質、放射性同位体、および、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７，１０-四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７-トリアザシクロノナン-１，４，７-三酢酸（ＮＯＴＡ）を含む放射性同位体標識のために使用される任意の種類の化合物が挙げられる。
そのような標識のいずれかによる分子の標識は、直接的または間接的に行うことができる。標識は、化学的カップリングおよび化学的架橋剤などの手法を使用して、分子にコンジュゲートさせることができる。あるいは、標識された分子を融合タンパク質としてコードするポリヌクレオチドベクターを調製することができる。その後に細胞株を操作して標識分子を発現させることができ、標識分子を培養培地から単離し、精製して、本明細書に開示される方法に使用することができる。標識されたアミノ酸、標識されたペプチド、標識されたタンパク質、または分子レポーターを、発現されたタンパク質のライゲーションを介して（例えば、ソルターゼ、インテインなどを使用して）、分子にライゲートさせることもできる。
標識された分子は、当業者に公知の技術を使用して、対象への投与のために製剤化することができる。標識された分子の製剤は、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。製剤中に含まれる賦形剤は、例えば、標識の性質、抗原結合組成物、および投与様式に応じて異なる目的を有する。一般に使用される賦形剤の例としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、等張化剤、増量剤、ならびに潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、普遍的免疫受容体は、標識されていない中間体に結合する細胞外ドメインを含み、この中間体は続いて分子または標識された分子に結合する。
ベクター
本発明は、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体の配列を含むＤＮＡ構築物を範囲に含み、この配列は、細胞内ドメインの核酸配列に作動可能に連結された細胞外ドメインの核酸配列を含む。一実施形態では、細胞外ドメインはＳｐｙＴａｇドメインを含む。別の実施形態では、細胞外ドメインはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを含む。本発明の普遍的免疫受容体において使用され得る例示的な細胞内ドメインとしては、ＣＤ３-ゼータ、ＣＤ２８、４-１ＢＢなどの細胞内ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。ある場合には、普遍的免疫受容体は、ＣＤ３-ゼータ、ＣＤ２８、４-１ＢＢなどの任意の組合せを含むことができる。
一実施形態では、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇ免疫受容体構築物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、または配列番号３０を含む。以下の表１に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇ免疫受容体構築物の配列識別子をまとめている。
Figure 2023511443000001
Figure 2023511443000002
一実施形態では、本発明の普遍的免疫受容体は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇドメイン、ヒトＣＤ８アルファヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８およびＣＤ３-ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準的な手法を使用して、当技術分野で公知の組換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を合成的に産生することもできる。
本発明はまた、本発明のＤＮＡ（例えば、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインをコードするＤＮＡ）が挿入されたベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定な組込みおよび娘細胞におけるその増殖を可能にすることから、長期的な遺伝子移入を達成するための好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入を行うことができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターを上回るさらなる利点を有する。また、レンチウイルスベクターには、免疫原性が低いというさらなる利点もある。
手短にまとめると、普遍的免疫受容体をコードする天然性または合成性核酸の発現は、典型的には、普遍的免疫受容体（例えば、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）ポリペプチドまたはその一部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結させ、その構築物を発現ベクターに組み入れることによって達成される。ベクターは、真核生物における複製および組込みに好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含有する。
本発明の発現構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して、核酸免疫処置および遺伝子治療にも使用することができる。遺伝子送達のための方法は当技術分野で公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
核酸は、いくつかの種類のベクター中にクローニングすることができる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクター中にクローニングすることができる。特に関心のあるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシークエンシングベクターが挙げられる。
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に提供することもできる。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的である複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカー（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；および米国特許第６，３２６，１９３号）を含有する。
いくつかのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための簡便なプラットフォームを提供する。当技術分野で公知の技術を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。続いて組換えウイルスを単離し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達することができる。いくつかのレトロウイルスシステムが当技術分野で公知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターが当技術分野で公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近、いくつかのプロモーターが開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟性があり、そのため、エレメントが互いに逆位になった場合または移動した場合にもプロモーター機能は保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターの場合には、プロモーターエレメント間の間隔を、活性が低下し始めるまでに５０ｂｐの間隔まで増やすことができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協働的にまたは独立して機能して、転写を活性化するように見える。
好適なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を推進することができる強力な恒常的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子-１α（ＥＦ-１α）である。しかし、限定はされないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン-バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ-Ｂａｒｒ）ウイルス初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない、他の恒常的プロモーター配列を使用してもよい。さらに、本発明は、恒常的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用により、そのような発現が望まれる場合には作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができ、または発現が望まれない場合には発現をオフにすることができる分子スイッチが提供される。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
普遍的免疫受容体ポリペプチドまたはその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするための選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含有することもできる。他の態様では、選択マーカーは、別のＤＮＡ片を保有し、コトランスフェクション手順に使用されてもよい。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方が、宿主細胞における発現を可能にするための適切な調節配列に隣接していてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどのような抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされる可能性のある細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在しないか、またはレシピエント生物もしくは組織によっては発現されない遺伝子であって、何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって、その発現が顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡをレシピエント細胞に導入した後の適切な時間にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌性アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。好適な発現系は周知であり、既知の手法を用いて調製してもよいし、または商業的に入手してもよい。一般に、最も高レベルのレポーター遺伝子発現を示す最小の５’フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして同定されている。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結させて、プロモーターにより推進される転写を調節する能力に関して作用物質を評価するために使用することができる。
遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターに関連して、ベクターは、当技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって、宿主細胞に移入することができる。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス性送達システムを利用する場合には、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。宿主細胞への核酸の導入には（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで）、脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸を脂質と会合させてもよい。脂質と会合させた核酸は、リポソームの水性の内部に封入されてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在してもよく、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに付着してもよく、リポソームに封じ込められてもよく、リポソームと複合体を形成してもよく、脂質を含有する溶液中に分散してもよく、脂質と混合されてもよく、脂質と組み合わされてもよく、脂質中の懸濁液として含有されてもよく、ミセルと共に含有されているかもしくはミセルと複合体を形成してもよく、または他の様式で脂質に付随してもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。それらはまた、単純に溶液中に散在していてもよく、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成している可能性がある。脂質は、天然に存在する脂質であっても合成性脂質であってもよい脂肪性物質のことである。例えば、脂質としては、細胞質中に天然に存在する脂肪液滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドを含有する化合物のクラスが挙げられる。
使用のために好適な脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手することができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ & Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ-Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約-２０℃で保管することができる。クロロホルムが唯一の溶媒として使用されるが、これはそれがメタノールよりも蒸発しやすいためである。「リポソーム」は、閉じた脂質二重層または凝集体の生成によって形成される、様々な単層および多層の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質の二重層膜および内側の水性媒体を伴う小胞構造を有すると特徴付けることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらはリン脂質を過剰量の水溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分の自己再構成が起こった後に、閉じた構造の形成が生じ、脂質二重層の間に水および溶解した溶質が封じ込められる（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかし、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も範囲に含まれる。例えば、脂質は、ミセル構造をとってもよく、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在してもよい。また、リポフェクタミン核酸複合体も企図される。
外来性核酸を宿主細胞に導入するために、または他の様式で細胞を本発明の阻害剤に曝露させるために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、種々のアッセイを行うことができる。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ、ならびにＰＣＲ；特定のペプチドの存在または不存在を、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法）によって、または本発明の範囲に含まれる作用物質を同定するための本明細書に記載されるアッセイによって検出するための、「生化学的」アッセイが挙げられる。
ＲＮＡトランスフェクション
一実施形態では、本発明の遺伝子改変Ｔ細胞は、ＲＮＡの導入を通じて改変される。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体ＲＮＡを、一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生じたテンプレートを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成される。任意の供給源からの目的のＤＮＡを、ＰＣＲによって、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ合成のためのテンプレートに直接変換することができる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、またはＤＮＡの他の任意の適切な供給源であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために望まれるテンプレートは、本発明の普遍的免疫受容体である。例えば、例えば、普遍的免疫受容体のＲＮＡのテンプレートは、標識結合ドメインを含む細胞外ドメイン、ＣＤ８のヒンジと膜貫通ドメインとを含む膜貫通ドメインを含み、細胞質ドメインはＣＤ３-ゼータのシグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、ＰＣＲのために使用されるＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノム由来の天然に存在するＤＮＡ配列に由来しうる。一実施形態では、ＤＮＡは、遺伝子の一部分の目的の完全長遺伝子である。遺伝子は、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全体を含みうる。遺伝子は、エクソンおよびイントロンを含みうる。一実施形態では、ＰＣＲのために使用されるＤＮＡはヒト遺伝子である。別の実施形態では、ＰＣＲのために使用されるＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを含むヒト遺伝子である。ＤＮＡがあるいは、天然に存在する生物において通常は発現されない人工ＤＮＡ配列であってもよい。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために共にライゲートされる、遺伝子の部分を含むものである。共にライゲートされるＤＮＡの部分は、単一の生物に由来しても、または複数の生物に由来してもよい。
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのテンプレートを生成するために使用される。ＰＣＲを行うための方法は、当技術分野において周知である。ＰＣＲに使用するためのプライマーは、ＰＣＲのためのテンプレートとして使用しようとするＤＮＡの領域に対して実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的な」は、本明細書で使用される場合、プライマー配列中の塩基の大半もしくはすべてが相補的であるか、または１つもしくは複数の塩基が非相補的もしくはミスマッチ性である、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲのために使用されるアニーリング条件下で、意図したＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、ＤＮＡテンプレートの任意の部分に対して実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーを、５’および３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される遺伝子の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。また、プライマーを、目的の特定のドメインをコードする遺伝子の一部分を増幅するように設計することもできる。一実施形態では、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全体または部分を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲのために有用なプライマーは、当技術分野で周知の合成法によって作製される。「順方向プライマー」は、増幅させようとするＤＮＡ配列の上流にある、ＤＮＡテンプレート上のヌクレオチドに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「上流」は、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするＤＮＡ配列の５’側にある場所を指して使用される。「逆方向プライマー」は、増幅させようとするＤＮＡ配列の下流にある、二本鎖ＤＮＡテンプレートに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「下流」とは、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするＤＮＡ配列の３’側にある場所を指して使用される。
ＰＣＲのために有用な任意のＤＮＡポリメラーゼを、本明細書に開示される方法に使用することができる。試薬およびポリメラーゼは、いくつかの供給元から販売されている。
安定性および／または翻訳効率を高める能力を有する化学構造を使用することもできる。ＲＮＡは５’および３’ＵＴＲを有することが好ましい。一実施形態では、５’ＵＴＲは長さがゼロから３０００ヌクレオチドの間である。コード領域に付加される５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域とアニールするＰＣＲ用のプライマーを設計することを含むがこれに限定されない、種々の方法によって変化させることができる。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な５’および３’ＵＴＲの長さを改変することができる。
５’および３’ＵＴＲは、目的の遺伝子の天然に存在する内因性５’および３’ＵＴＲであってよい。あるいは、ＵＴＲ配列を順方向および逆方向プライマーに組み入れることによって、またはテンプレートの他の任意の改変によって、目的の遺伝子にとって内因性でないＵＴＲ配列を付加することもできる。目的の遺伝子にとって内因性でないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を改変するために有用な可能性がある。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵリッチエレメントはｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。このため、当技術分野で周知であるＵＴＲの特性に基づき、転写されたＲＮＡの安定性が高まるように３’ＵＴＲを選択または設計することができる。
一実施形態では、５’ＵＴＲは内因性遺伝子のＫｏｚａｋ配列を含み得る。あるいは、目的の遺伝子にとって内因性でない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲによって付加する場合には、５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスＫｏｚａｋ配列を設計し直すこともできる。Ｋｏｚａｋ配列は一部のＲＮＡ転写物の翻訳の効率を高めることができるが、すべてのＲＮＡについて効率的な翻訳を可能にするために必要なわけではないように思われる。多くのｍＲＮＡに対するＫｏｚａｋ配列の必要性は、当技術分野で公知である。他の実施形態では、５’ＵＴＲを、そのＲＮＡゲノムが細胞内で安定であるＲＮＡウイルスから導き出すことができる。他の実施形態では、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、様々なヌクレオチド類似体を３’または５’ＵＴＲに使用することができる。
遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡテンプレートからのＲＮＡの合成を可能にするためには、転写のプロモーターが、転写させようとする配列の上流でＤＮＡテンプレートに付着する必要がある。ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの５’末端に付加すると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、転写させようとするオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に組み入れられるようになる。好ましい一実施形態では、本明細書の他所に記載されるように、プロモーターはＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。
好ましい一実施形態では、ｍＲＮＡは５’末端のキャップおよび３’ポリ（Ａ）尾部の両方を有し、それらがリボソーム結合、翻訳の開始および細胞におけるｍＲＮＡ安定性を決定付ける。環状ＤＮＡテンプレート、例えばプラスミドＤＮＡ上では、ＲＮＡポリメラーゼは真核細胞における発現には適さない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直鎖化されたプラスミドＤＮＡの転写では、転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物トランスフェクションには有効でない、正常サイズのｍＲＮＡがもたらされる。
直鎖状ＤＮＡテンプレート上で、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写物の３’末端をテンプレートの最終塩基を越えて伸長させることができる（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)）。
ＤＮＡテンプレートへのポリＡ／Ｔ連鎖の従来の組み込み方法は分子クローニングである。しかし、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列はプラスミド不安定性を引き起こす恐れがあり、このことが、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡテンプレートに欠失および他の異常がしばしば高度に混入する理由となっている。このためにクローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、往々にして信頼性も損なわれる。このことが理由で、クローニングを伴わずにポリＡ／Ｔ ３’連鎖を有するＤＮＡテンプレートの構築を可能にする方法が非常に望まれている。
転写ＤＮＡテンプレートのポリＡ／Ｔセグメントは、ポリＴ尾部、例えば１００Ｔ尾部など（サイズは５０～５０００ Ｔであり得る）を含有する逆方向プライマーを使用することによってＰＣＲ中に、またはＤＮＡライゲーションもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えを含むがこれらに限定されない他の任意の方法によってＰＣＲの後に、産生することができる。ポリ（Ａ）尾部はまた、ＲＮＡに安定性を与え、その分解も低下させる。一般に、ポリ（Ａ）尾部の長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関関係にある。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部は１００～５０００個の間のアデノシンである。
ＲＮＡのポリ（Ａ）尾部は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写後に、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ-ＰＡＰ）を使用することによって、さらに伸長させることができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部の長さを１００ヌクレオチドから３００～４００ヌクレオチドに増やすことにより、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍に高くなる。さらに、異なる化学基を３’末端に付着させることもｍＲＮＡ安定性を高める可能性がある。そのような付着物は、改変／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含有し得る。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、ＡＴＰ類似体をポリ（Ａ）尾部に組み入れることができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに高めることができる。
５’キャップもまた、ＲＮＡ分子に安定性を与える。好ましい一実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生されるＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップは、当技術分野で公知であって本明細書に記載される手法を使用して提供される（Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)）。
本明細書に開示される方法によって生成されるＲＮＡはまた、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡに対するキャップ非依存的なリボソーム結合を開始させて翻訳開始を助長する、任意のウイルス配列、染色体配列または人工的に設計された配列であり得る。細胞の透過性および生存能力を高める因子、例えば、糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化物質および界面活性剤を含有し得る、細胞エレクトロポレーションのために好適である任意の溶質を含めることができる。
ＲＮＡは、いくつかの様々な方法のうちの任意のもの、例えば、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ-ＩＩ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、（ＥＣＭ ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）またはＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリマーカプセル封入、ペプチド媒介性トランスフェクション、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック粒子送達システム（例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照）を含むがこれらに限定されない、市販の方法を使用して、標的細胞に導入することができる。
遺伝子改変されたＴ細胞
一部の実施形態では、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体配列は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用して細胞内に送達される。普遍的免疫受容体を発現するレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、形質導入された細胞を担体として使用するか、またはカプセル封入された、結合された、もしくは裸のベクターの無細胞性の局所的または全身性の送達を使用して、様々な種類の真核細胞、ならびに組織および全生物体の中に送達することができる。使用される方法は、安定した発現が必要であるか、または十分である任意の目的に対するものであり得る。
他の実施形態では、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡを使用して細胞内に送達される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡ普遍的免疫受容体は、トランスフェクトされた細胞を担体として使用するか、またはカプセル封入された、結合された、もしくは裸のｍＲＮＡの無細胞性の局所的または全身性の送達を使用して、様々な種類の真核細胞、ならびに組織および全生物体の中に送達することができる。使用される方法は、一過性発現が必要であるか、または十分である任意の目的に対するものであり得る。
開示される方法は、遺伝子改変されたＴ細胞が標的がん細胞を死滅させる能力の評価を含め、基礎研究および治療法において、がん、幹細胞、急性および慢性感染症、ならびに自己免疫疾患の分野において、Ｔ細胞活性のモジュレーションのために適用され得る。一部の実施形態では、改変されたＴ細胞は標識され、ひとたび対象に移行すると、ｉｎ ｖｉｖｏで追跡可能である。
本方法はまた、例えば、プロモーター、または投入ＲＮＡの量を変化させることによって、発現のレベルを広範囲にわたって制御する能力も提供し、そのために発現レベルを個別に調節することが可能になる。さらに、ＰＣＲに基づくｍＲＮＡ産生の手法は、種々の構造およびそれらのドメインの組合せを有する普遍的免疫受容体ｍＲＮＡの設計を非常に容易にする。例えば、同じ細胞内の複数の普遍的免疫受容体上の種々の細胞内エフェクター／共刺激ドメインを変化させることにより、普遍的免疫受容体が抗原結合エレメントに付着した相互タグと結び付いた後の、複数の抗原標的に対する最高レベルの細胞傷害性、および同時に正常細胞に対する最も低い細胞傷害性を評価する、受容体の組合せの構造の決定が可能になる。
本発明のＲＮＡトランスフェクション法の１つの利点は、ＲＮＡトランスフェクションが本質的に一過性であり、かつベクターを用いないことである。ＲＮＡ導入遺伝子をリンパ球に送達して、短時間のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性化の後に、その中で、いかなる別のウイルス配列も必要としない最小発現カセットとして発現させることができる。これらの条件下では、宿主細胞ゲノム中への導入遺伝子の組込みが起こる可能性は低い。ＲＮＡのトランスフェクションの効率の高さ、およびリンパ球集団全体を均質に改変させるその能力から、細胞のクローニングは必要でない。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ-ＲＮＡ）を用いるＴ細胞の遺伝子改変では、どちらも様々な動物モデルで継続的に検討されてきた、２種類の戦略を利用する。リポフェクションまたはエレクトロポレーションの手段によって、細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡがトランスフェクトされる。好ましくは、移入されたＩＶＴ-ＲＮＡの長期間にわたる発現を達成するために、様々な改変を使用してＩＶＴ-ＲＮＡを安定化することが望ましい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのテンプレートとして標準化された様式で利用され、かつ安定化されたＲＮＡ転写物が産生されるように遺伝子改変されている、いくつかのＩＶＴベクターが文献で公知である。現在、当技術分野で使用されるプロトコールは、以下の構造を有するプラスミドベクターに基づく：ＲＮＡ転写を可能にする５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、それに続く、３’および／または５’側に非翻訳領域（ＵＴＲ）が隣接している目的の遺伝子と、５０～７０個のヌクレオチドＡを含む３’ポリアデニルカセットである。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の前に、環状プラスミドはＩＩ型制限酵素（認識配列は切断部位に対応する）によってポリアデニルカセットの下流で直鎖化される。したがって、ポリアデニルカセットは転写物における後のポリ（Ａ）配列に対応する。この手順の結果として、いくつかのヌクレオチドは、直鎖化の後に酵素切断部位の一部として残存し、伸長するか、または３’末端でポリ（Ａ）配列を覆い隠す。この非生理的な突出部が、そのような構築物から細胞内で産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすか否かは不明である。
ＲＮＡには、より従来のプラスミドまたはウイルスによるアプローチを上回るいくつかの利点がある。ＲＮＡ供給源からの遺伝子発現は転写を必要とせず、トランスフェクション後にタンパク質産物が迅速に産生される。さらに、ＲＮＡは核ではなく細胞質に到達しさえすればよく、そのため、典型的なトランスフェクション法によって、極めて高率でのトランスフェクションがもたらされる。加えて、プラスミドに基づくアプローチは、目的の遺伝子の発現を推進するプロモーターが、試験中の細胞において活性があることを必要とする。
別の態様では、ＲＮＡ構築物をエレクトロポレーションによって細胞内に送達することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／００１４６４５号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５２６３０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００５／００７０８４１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４／００５９２８５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００４／００９２９０７Ａ１号明細書に教示されているような、哺乳動物細胞への核酸構築物のエレクトロポレーションの処方物および方法を参照されたい。任意の既知の細胞型のエレクトロポレーションのために必要な電場強度を含む様々なパラメーターは、関連研究文献ならびに当技術分野における数多くの特許および出願において一般に公知である。例えば、米国特許第６，６７８，５５６号明細書、米国特許第７，１７１，２６４号明細書および米国特許第７，１７３，１１６号明細書を参照されたい。エレクトロポレーションの治療適用のための装置は市販されており、これには例えば、ＭｅｄＰｕｌｓｅｒ（商標）ＤＮＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｏ／Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）があり、米国特許第６，５６７，６９４号明細書、米国特許第６，５１６，２２３号明細書、米国特許第５，９９３，４３４号明細書、米国特許第６，１８１，９６４号明細書、米国特許第６，２４１，７０１号明細書および米国特許第６，２３３，４８２号明細書などの特許に記載されている。また、エレクトロポレーションを、例えば、米国特許出願公開第２００７０１２８７０８Ａ１号明細書に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞のトランスフェクションのために使用することもできる。また、エレクトロポレーションを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に核酸を送達するために利用することもできる。このように、当業者に公知の多くの利用可能なデバイスおよびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用した、発現構築物を含む核酸の細胞へのエレクトロポレーション媒介性投与は、目的のＲＮＡを標的細胞に送達するための素晴らしい新たな手段となる。
Ｔ細胞の供給源
本発明のＴ細胞の増大および遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源を対象から入手する。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態では、当技術分野で入手可能な任意の様々なＴ細胞株を使用することができる。本発明のある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、当業者に公知の任意の様々な手法、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離を使用して対象から収集された血液ユニットから得られる。好ましい一実施形態では、個体の流血由来の細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を、血漿画分を除去するために洗浄した上で、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地中に配置することができる。本発明の一実施形態では、これらの細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な一実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを含まず、かつ、マグネシウムを含まないか、またはすべてではないものの多くの二価カチオンを含まない。この場合にも、驚いたことに、カルシウム非存在下での最初の活性化ステップにより、活性化の増強がもたらされる。当業者は容易に理解するであろうが、洗浄ステップは、当業者に公知の方法によって、例えば、半自動化「フロースルー」遠心分離（例えばＣｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を、製造元の説明書に従って使用することによって実現することができる。洗浄の後に、細胞を、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋非含有、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または緩衝剤を伴うかもしくは伴わない他の食塩水中などに再懸濁させてもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去して、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。
別の実施形態では、赤血球を溶解させた上で、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配での遠心分離によるか、または向流遠心分離溶出法によって単球を枯渇させることによって、Ｔ細胞を末梢血リンパ球から単離する。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞といったＴ細胞の特定の部分集団を、陽性選択法または陰性選択法によってさらに単離することができる。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ-４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３ｘ２８）結合ビーズとの、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間にわたるインキュベーションによって単離される。一実施形態では、この期間は約３０分間である。さらなる一実施形態では、この期間は、３０分間～３６時間またはそれ以上、およびそれらの間のすべての整数値の範囲にわたる。さらなる一実施形態では、この期間は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間である。さらに別の好ましい実施形態では、この期間は１０～２４時間である。好ましい一実施形態では、インキュベーション期間は２４時間である。白血病の患者からのＴ細胞の単離のためには、２４時間といった比較的長いインキュベーション時間を使用することにより、細胞収量を増やすことができる。腫瘍組織または免疫機能低下個体から腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する際のように、他の細胞型と比較してＴ細胞がわずかしか存在しないあらゆる状況で、Ｔ細胞を単離するために比較的長いインキュベーション時間を使用することができる。さらに、比較的長いインキュベーション時間の使用により、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕捉効率を高めることもできる。したがって、単にこの時間を短縮または延長することによって、Ｔ細胞はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズへの結合が可能になるか、および／またはビーズのＴ細胞に対する比を増加もしくは減少することにより（本明細書でさらに説明するように）、Ｔ細胞の部分集団は、培養開始時もしくはこの過程の他の時点で、これについてもしくはこれに対して優先的に選択されうる。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少することにより、Ｔ細胞部分集団は、培養開始時もしくは他の望ましい時点で、これについてまたはこれに対して優先的に選択される。当業者は、本発明の状況において複数ラウンドの選択も使用し得ることを認めると思われる。ある特定の実施形態では、この選択手順を実行し、活性化および増大の過程において「選択されない」細胞を使用することが望ましいことがある。「選択されない」細胞に、さらに選択のラウンドを施すこともできる。
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーに方向付けられた抗体の組合せにより実現することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに方向付けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを介した細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するためにモノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ-ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を濃縮するかまたは陽性選択することが望ましいことがある。または、ある特定の実施形態では、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の類似の選択方法によって、調節性Ｔ細胞を枯渇させる。
陽性または陰性選択によって望ましい細胞集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。ある特定の実施形態では、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積の著しい減少（すなわち、細胞の濃度の増加）が望ましいことがある。例えば、一実施形態では、細胞２０億個／ｍｌの濃度を使用する。一実施形態では、細胞１０億個／ｍｌの濃度を使用する。さらなる一実施形態では、細胞１億個／ｍｌよりも高いものを使用する。さらなる一実施形態では、１０００万個／ｍｌ、１５００万個／ｍｌ、２０００万個／ｍｌ、２５００万個／ｍｌ、３０００万個／ｍｌ、３５００万個／ｍｌ、４０００万個／ｍｌ、４５００万個／ｍｌまたは５０００万個／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、７５００万個／ｍｌ、８０００万個／ｍｌ、８５００万個／ｍｌ、９０００万個／ｍｌ、９５００万個／ｍｌ、または１億個／ｍｌからの細胞濃度を使用する。さらなる一実施形態では、１億２５００万個／ｍｌまたは１億５０００万個／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度を使用することにより、増加した細胞収量、細胞活性化および細胞増大を生じることができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血病血、腫瘍組織など）からの、目的の標的抗原を弱く発現する細胞の捕捉効率を高めることができる。そのような細胞集団は、治療的価値があり、かつ得ることが望ましい。例えば、高い濃度の細胞の使用は、通常弱くＣＤ２８を発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞をより効率的に選択することを可能にする。
関連した一実施形態では、より低い濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物の高度の希釈により、粒子と細胞との間の相互作用は最小化される。これにより、これらの粒子と結合する所望の抗原を大量に発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、希釈した濃度でＣＤ８＋ Ｔ細胞よりもより効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞濃度は、５×１０６個／ｍｌである。他の実施形態では、使用される濃度は、約１×１０５個／ｍｌ～１×１０６個／ｍｌ、およびその間の任意の整数値であることができる。
他の実施形態では、細胞を、回転器において、様々な時間の長さにわたって様々な速度で、２～１０℃または室温のいずれかでインキュベートすることもできる。
また、刺激のためのＴ細胞を、洗浄ステップの後に凍結することもできる。理論に拘束されることは望まないが、凍結ステップおよびそれに続く解凍ステップは、細胞集団における顆粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な製品を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後に、これらの細胞を凍結液中に懸濁させてもよい。多くの凍結液およびパラメーターが当技術分野で公知であり、かつこの状況において有用であるが、１つの方法は、２０％ ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ ＤＭＳＯ、または３１．２５％ Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ-Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ ＤＭＳＯ、または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の適した細胞凍結培地の使用を伴い、続いてこれらの細胞は、１分間に１℃の速度で-８０℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンク内で気相中に貯蔵される。その他の制御された凍結法に加え、即時-２０℃または液体窒素中での制御されない凍結を使用してもよい。
ある特定の実施形態では、凍結保存細胞を本明細書に記載される通りに解凍および洗浄して、室温で１時間静置した後に、本発明の方法を使用する活性化を行う。
また、本発明に関連して、本明細書に記載されたような増大された細胞が必要となる前の期間での、対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の収集も企図される。そのために、増大させようとする細胞の供給源を必要な任意の時点で収集し、Ｔ細胞などの所望の細胞を、本明細書に記載されるもののような、Ｔ細胞療法から利益を受ける任意の様々な疾患または病状に対するＴ細胞療法に後に使用するために単離して凍結することができる。一実施形態では、血液試料またはアフェレーシス物を、全般的に健常な対象から採取する。ある特定の実施形態では、血液試料またはアフェレーシス物を、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない全般的に健常な対象から採取し、目的の細胞を、後に使用するために単離して凍結する。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を増大させ、凍結して、後の時点で使用する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるような特定の疾患の診断後間もなく、しかしいかなる治療も行わないうちに、患者から試料を収集する。さらなる一実施形態では、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス薬、化学療法、放射線療法、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去薬、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、ならびに照射などの作用因子による治療を含むが、これらに限定されない、任意の様々な妥当な治療様式の前の対象由来の血液試料またはアフェレーシス物から単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子で誘導されるシグナル伝達にとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）。さらなる一実施形態では、細胞を患者から単離して、骨髄移植もしくは幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法薬、外部ビーム照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用するＴ細胞除去療法とともに（例えば、その前、同時またはその後に）、後に使用するために凍結する。別の実施形態では、細胞を事前に単離した上で、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンによるＢ細胞除去療法後の治療のために後で使用するために凍結する。
本発明のさらなる一実施形態では、Ｔ細胞を、治療後に患者から直接入手する。これに関して、ある種のがん治療、特に免疫系に障害を及ぼす薬物による治療の後には、患者が通常であれば治療から回復中である治療後間もない時点で、得られるＴ細胞の品質が、それらがｅｘ ｖｉｖｏで増大する能力の点で最適であるか改善されていることが観察されている。同様に、本明細書に記載された方法を使用するｅｘ ｖｉｖｏ操作の後にも、これらの細胞は生着およびｉｎ ｖｉｖｏ増大の増強のために好ましい状態にある可能性がある。したがって、本発明に関連して、この回復相の間に、Ｔ細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血液細胞を収集することが企図される。さらに、ある特定の実施形態においては、動員（例えば、ＧＭ-ＣＳＦによる動員）レジメンおよび条件付けレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増大にとって有利に働く状態を、特に治療法の後のある規定された時間枠の間に、対象において作り出すことができる。例示的な細胞型には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞が含まれる。
Ｔ細胞の活性化および増大
所望の普遍的免疫受容体を発現させるためのＴ細胞の遺伝子改変の前または後のいずれにおいても、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書、同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載された方法を使用して、Ｔ細胞を活性化して増大させることができる。
一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質、およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが付着した表面との接触によって増大させられる。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片または抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアを伴うプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触などによって、刺激することができる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の同時刺激のためには、アクセサリー分子と結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例には、９．３、Ｂ-Ｔ３、ＸＲ-ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が含まれ、当技術分野で一般に公知である他の方法と同様に使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999）。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルを、様々なプロトコールによって与えることができる。例えば、各シグナルを与える作用物質は、溶液中にあってもよく、または表面と結合させてもよい。表面と結合させる場合、これらの作用物質を同じ表面に結合させてもよく（すなわち、「シス」フォーメーション）、または別々の表面に結合させてもよい（すなわち、「トランス」フォーメーション）。または、一方の作用物質を溶液中の表面に結合させ、もう一方の作用物質が溶液中にあってもよい。一実施形態では、共刺激シグナルを与える作用物質を細胞表面と結合させ、一次活性化シグナルを与える作用物質は溶液中にあるか、または表面と結合させる。ある特定の実施形態では、両方の作用物質が溶液中にあってもよい。別の実施形態では、これらの作用物質は可溶形態にあり、続いて、Ｆｃ受容体を発現する細胞または抗体またはこれらの作用物質と結合する他の結合物質などの表面と架橋結合することができる。これに関しては、例えば、本発明においてＴ細胞を活性化および増大させるために使用することを企図している人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）についての、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書および同第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
一実施形態では、２種の作用物質を、同じビーズ上に、すなわち「シス」か、または別々のビーズ上に、すなわち「トランス」かのいずれかとして、ビーズ上に固定化する。一例として、一次活性化シグナルを与える作用物質は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを与える作用物質は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片である。そして、両方の作用物質を等モル量で同じビーズに同時固定化する。一実施形態では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増大およびＴ細胞増殖のためにビーズに結合させる各抗体を１：１の比で使用する。本発明のある特定の態様では、ビーズに結合させる抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比として、１：１の比を使用して観察される増大と比較してＴ細胞増大の増加が観察されるようなものを使用する。特定の一実施形態では、１：１の比を使用して観察される増大と比較して約１～約３倍の増加が観察される。一実施形態では、ビーズに結合させるＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００、およびそれらの間のすべての整数値の範囲にある。本発明の一態様では、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子と結合され、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は１未満である。本発明のある特定の実施形態では、ビーズに結合させる抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ３抗体との比は、２：１よりも大きい。特定の一実施形態では、ビーズに結合させる抗体に１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。別の実施形態では、ビーズに結合させる抗体に１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。さらなる一実施形態では、ビーズに結合させる抗体に１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。別の実施形態では、ビーズに結合させる抗体に１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。好ましい一実施形態では、ビーズに結合させる抗体に１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。別の実施形態では、ビーズに結合させる抗体に１：３のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。さらに別の実施形態では、ビーズに結合させる抗体に３：１のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。
Ｔ細胞または他の細胞標的を刺激するために、粒子と細胞との比として１：５００～５００：１およびその間の任意の整数値を使用することができる。当業者が容易に理解するように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存しうる。例えば、小さいサイズのビーズは２、３個の細胞と結合しうるに過ぎないが、一方、より大きいビーズは多くと結合しうる。ある特定の実施形態では、細胞と粒子との比は１：１００～１００：１およびその間の任意の整数値の範囲にあり、さらなる実施形態では、この比は１：９～９：１およびその間の任意の整数値を含み、これを同じくＴ細胞を刺激するために使用することができる。Ｔ細胞の刺激をもたらす、抗ＣＤ３が結合した粒子および抗ＣＤ２８が結合した粒子とＴ細胞との比は、上述したように様々であり得るが、いくつかの好ましい値には、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１が含まれ、ここで粒子とＴ細胞とは少なくとも１：１が１つの好ましい比である。一実施形態では、１：１またはそれ未満である粒子と細胞との比を使用する。１つの特定の実施形態では、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる実施形態では、粒子と細胞との比は、刺激の日に応じて変化しうる。例えば、一実施形態では、粒子と細胞との比は第１日に１：１～１０：１であり、その後最長１０日間にわたって毎日または１日おきに追加の粒子を細胞に添加して、最終的な比が１：１～１：１０となる（添加の日の細胞数に基づく）。１つの特定の実施形態では、粒子と細胞との比は刺激の１日目に１：１であり、刺激の３日目および５日目に１：５に調節される。別の実施形態では、粒子は毎日または１日おきに添加され、最終的な比は１日目に１：１であり、刺激の３日目および５日目には１：５である。別の実施形態では、粒子と細胞との比は刺激の１日目に２：１であり、刺激の３日目および５日目に１：１０に調節される。別の実施形態では、粒子は毎日または１日おきに添加され、最終的な比は１日目に１：１であり、刺激の３日目および５日目には１：１０である。当業者は、様々な他の比が、本発明における使用に適することを理解するであろう。特に、比は粒子サイズならびに細胞のサイズおよび型に応じて多様となる。
本発明のさらなる一実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞を、作用物質でコーティングされたビーズと一緒にし、その後にビーズと細胞を分離した上で、続いて細胞を培養する。代替的な一実施形態では、培養の前に、作用物質でコーティングされたビーズと細胞を分離せずに、一緒に培養する。さらなる一実施形態では、ビーズおよび細胞を磁力などの力の印加によってまず濃縮して、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させて、それにより、細胞刺激を誘導する。
例として、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が付着した常磁性ビーズ（３ｘ２８ビーズ）をＴ細胞と接触させることによって、細胞表面タンパク質をライゲートすることができる。一実施形態では、細胞（例えば、１０４～１０９個のＴ細胞）およびビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ-４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ、１：１の比）を、緩衝液中、好ましくはＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）中で一緒にする。この場合も、当業者は、あらゆる細胞濃度を用い得ることを容易に理解するであろう。例えば、標的細胞が試料中に非常に稀であって、試料のわずかに０．０１％を構成してもよく、または試料の全体（すなわち、１００％）が目的の標的細胞で構成されてもよい。したがって、あらゆる細胞数が本発明の状況の範囲に含まれる。ある特定の実施形態では、粒子と細胞を一緒にして混合する体積を著しく減らして（すなわち、細胞の濃度を高めて）、細胞と粒子の最大の接触を確実にすることが望ましい可能性がある。例えば、一実施形態では、細胞約２０億個／ｍｌの濃度を使用する。別の実施形態では、細胞１億個／ｍｌ超を使用する。さらなる一実施形態では、１０００万個、１５００万個、２０００万個、２５００万個、３０００万個、３５００万個、４０００万個、４５００万個、または５０００万個／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、７５００万個、８０００万個、８５００万個、９０００万個、９５００万個または１億個／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、細胞１億２５００万または１億５０００万個／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度を使用することにより、細胞収量、細胞活性化、および細胞増大の増加がもたらされうる。さらに、高い細胞濃度を使用することにより、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のように目的の標的抗原を弱く発現する細胞のより効率的な捕捉が可能になる。ある特定の実施形態では、そのような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、入手することが望ましい。例えば、高濃度の細胞を使用することにより、通常は比較的弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択が可能にある。
本発明の一実施形態では、混合物を、数時間（約３時間）～約１４日間、またはその間の任意の整数値単位の時間にわたって培養し得る。別の実施形態では、混合物を２１日間培養し得る。本発明の一実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を約８日間一緒に培養する。別の実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を２～３日間一緒に培養する。数回の刺激サイクルも望ましく、その結果、Ｔ細胞の培養時間は６０日間またはそれより長くなる。Ｔ細胞の培養に適した条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン-２（ＩＬ-２）、インスリン、ＩＦＮ-γ、ＩＬ-４、ＩＬ-７、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ-α、または当業者に公知である細胞増殖のための他の添加物を含む、増殖および生存のために必要な因子を含み得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉｕｍ １６４０または、Ｘ-ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））が含まれる。細胞の増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えば、Ｎ-アセチル-システインおよび２-メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加された、血清非含有であるか、またはＴ細胞の増殖および増大のために十分な、適量の血清（または血漿）もしくは規定されたホルモンのセットおよび／もしくは一定量のサイトカインが加えられた、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ-Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α-ＭＥＭ、Ｆ-１２、Ｘ-Ｖｉｖｏ １５、およびＸ-Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれうる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物のみに含められ、対象に輸注される細胞の培養物には含められない。標的細胞は、増殖を支えるために必要な条件下、例えば適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ ＣＯ２）の下で維持される。
多様な刺激時間にわたって曝露されたＴ細胞は、異なる特性を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスを受けた末梢血単核細胞生成物は、ヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも多く有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増大では、約８～９日目より前には主としてＴＨ細胞からなるＴ細胞集団が産生するが、約８～９日目以後、Ｔ細胞の集団はＴＣ細胞の集団を次第に多く含むようになる。したがって、治療の目的によっては、主としてＴＨ細胞で構成されるＴ細胞集団を対象に輸注することが有利な場合がある。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合には、このサブセットをより高度に増大させることが有益な場合がある。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーのほかに、他の表現型マーカーも、細胞増大の過程の経過中顕著に、しかし大部分は再現性を伴って変動する。このため、そのような再現性により、活性化Ｔ細胞生成物を特定の目的に合わせて作ることが可能になる。
治療適用
本発明は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインをＴ細胞受容体の細胞内ドメインと組み合わせた普遍的免疫受容体を発現するように改変された細胞（例えば、Ｔ細胞）を範囲に含む。ある場合には、普遍的免疫受容体は、１つまたは複数の共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む。したがって、ある場合には、改変されたＴ細胞は、普遍的免疫受容体により媒介されるＴ細胞応答を誘発することができる。
本発明は、一次Ｔ細胞の特異性を、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分を組み入れた任意の所与の分子へと再方向付けするための、普遍的免疫受容体の使用を提供する。したがって、本発明はまた、哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、標的抗原を（例えば、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分で）タグ付け／標識するステップ、および普遍的免疫受容体を発現するＴ細胞を哺乳動物に投与するステップを含み、普遍的免疫受容体は、タグ付け／標識された標的と特異的に相互作用する結合部分、ＴＣＲの細胞内ドメイン（例えば、ヒトＣＤ３ゼータの細胞内ドメイン）、および共刺激シグナル伝達領域を含む、方法も提供する。
一態様では、本発明は、複数の抗原、特に腫瘍によって発現される２つまたはそれ以上の異なる抗原を標的化するために普遍的免疫受容体を発現するように操作された細胞の使用に関する。本明細書にさらに記載されるように、二重武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴは、単一武装化細胞のみ（図８Ｄ）と比較して、腫瘍溶解の増加を達成することが見出された。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を特異性の異なる２つの抗体で（指定の用量で）武装化することにより、２つの異なる抗原を共発現するがん細胞に対する活性が増強されることが示された。
別の態様では、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせる方法が提供される。さらに別の態様では、対象（例えば、哺乳動物）におけるがんを治療する方法であって、がんに対する溶解活性のレベルの制御をもたらす、方法が提供される。本明細書の他の箇所に記載されるように、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体を発現する初代ヒトＴ細胞は、標的化リガンドを定量的にローディングすることができ、これにより、再方向付けされたＴ細胞エフェクター機能および腫瘍細胞溶解の用量設定可能な制御が可能になることが示された。標的抗原を認識すると、投与されたＣＡＲ Ｔ細胞がレシピエント内で急速に増殖して多数となり、炎症性サイトカインを放出することができる従来のＣＡＲ Ｔ細胞療法と比較して、患者における制御可能なＴ細胞活性および溶解は、投与されたＴ細胞の制御されていない急速な増殖から生じる望ましくない副作用を最小限にするのに役立つ。
さらに別の態様では、腫瘍の「オンデマンド」標的化を使用する、哺乳動物において腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を刺激する方法、およびがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法が提供される。非武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を対象に投与することができ、この非武装化細胞は対象においてがん細胞の存在下で不活性であるが、後の時点で標的化リガンドを投与して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を武装化して腫瘍溶解を誘発させ、がん死滅能力を「オンデマンド」で誘発することが可能である。
さらに他の態様では、４-１ＢＢの細胞内ドメインを含有する普遍的免疫受容体を発現するように操作された細胞を使用して、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激する方法、およびがんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法が提供される。高濃度の抗体により武装化されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞とは異なり、抗原高発現標的細胞に対する感受性はあるが、抗原低発現標的細胞に対する感受性はないことが、驚いたことに見出された。この所見は、健常組織上に発現される高リスク抗原を標的とする抗体と共に適用された場合のＴ細胞の安全性に重要な意味を有する。
一実施形態では、標的分子のタグ付け／標識は、タグ付けおよび／または標識された分子を含む組成物を哺乳動物に投与するステップを含む。Ｔ細胞およびタグ付け／標識された分子の投与は、任意の順序で行われ得る。例えば、一実施形態では、標識された分子を、Ｔ細胞の投与に先立って哺乳動物に投与する。別の実施形態では、タグ付け／標識された抗原の投与に先立って、Ｔ細胞を哺乳動物に投与する。別の実施形態では、哺乳動物へのＴ細胞の投与の前に、普遍的免疫受容体をタグ付け／標識された分子に結合させることができる。
タグ付け／標識された分子、またはタグ付け／標識された分子を含む組成物は、当業者に公知の様式および手法を使用して対象に投与することができる。例示的な様式としては、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射による、動脈内、心臓内、関節内、滑膜内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内または腹腔内が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、標識された組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態では、本発明の標識された組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。タグ付け／標識された分子、またはタグ付け／標識された分子を含む組成物を、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注入してもよい。タグ付け／標識された分子、またはタグ付け／標識された分子を含む組成物は、標的抗原をタグ付け／標識するために有効であってかつ患者を治療するために有効な量で投与される。対象に投与される特定の量は、位置、供給源、実体、障害の程度および重症度、治療される個体の年齢および状態などに応じて広い範囲の間で多様となる。
一実施形態では、本発明は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体を発現するようにＴ細胞が遺伝子改変される、あるタイプの細胞療法を含む。ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、抗原結合ドメインを含む分子に結合された、例えば、融合された、標識された、ライゲートされたまたはコンジュゲートされた、その相互タグ、すなわちＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇと関連付けられている。続いて、普遍的免疫受容体システムを、それを必要とするレシピエントに投与する。別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇ結合分子またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合分子を、遺伝子改変細胞に先立って哺乳動物に投与する。さらに別の実施形態では、普遍的免疫受容体は、遺伝子改変細胞を哺乳動物に投与する前に、ＳｐｙＴａｇ結合分子またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合分子に結合される。投与された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を死滅させることができる。
本明細書に具体的に開示されるのは、ヒトＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにヒトＣＤ２８およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと共に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインをコードするレンチウイルスベクターであるが、本発明は、本明細書の他の箇所に記載されるように、構築物の各構成要素について任意の数の変形を含むと解釈されるべきである。
本発明はまた、２つまたはそれ以上の別個の標的などの複数の標的を同時に標的化する方法も提供する。例えば、一実施形態では、複数の別個の分子が、直接的または間接的にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇでタグ付け／標識される。例えば、一実施形態では、異なる分子が、各分子に対して特異的なＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇにそれぞれ結合され、例えば、標識され、コンジュゲートされ、ライゲートされ、または融合されて、その後、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇに結合した複数の異なる分子が哺乳動物に投与される。相互タグ（ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）を含む普遍的免疫受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞の投与は、複数の別個の相互タグ付け分子の各々に対する改変Ｔ細胞の標的化を可能にする。一実施形態では、本方法は、遺伝子改変細胞を哺乳動物に投与する前に、複数の異なるＳｐｙＴａｇ結合分子またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合分子を哺乳動物に投与するステップを含む。そのような実施形態では、普遍的免疫受容体は、複数の異なるＳｐｙＴａｇ結合分子またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合分子に結合し得る。別の実施形態では、本方法は、遺伝子改変細胞を哺乳動物に投与する前に、普遍的免疫受容体を複数の異なるＳｐｙＴａｇ結合分子またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合分子に結合させるステップを含む。
別の実施形態では、複数の異なる分子が、複数の特異的Ｔ細胞によって標的化される。例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇ普遍的免疫受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞が、複数の異なる分子の各々に対して特異的である相互ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇに結合された、例えば、標識された、コンジュゲートされた、ライゲートされたまたは融合された複数の異なる分子に結合される。続いて、これらの多特異性Ｔ細胞を哺乳動物に投与する。遺伝子改変された多特異性Ｔ細胞の投与は、改変されたＴ細胞を、複数の異なる相互にタグ付けされた分子の各々に対して標的化することを可能にする。
本発明はまた、複数の別個の標的、例えば、２つまたはそれ以上の別個の標的（例えば、２つまたはそれ以上の異なる抗原）の逐次標的化の方法も提供する。例えば、一実施形態では、第１の分子を、直接的または間接的にタグ付け／標識する。例えば、一実施形態では、第１の抗原に特異的な第１のＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタグ付けされた分子を哺乳動物に投与する。一実施形態では、本方法は、第１のタグ付けされた分子に結合する相補的ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合ドメインを含む普遍的免疫受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を投与して、それにより、Ｔ細胞を第１の抗原に標的化するステップを含む。一実施形態では、本方法は、直接的または間接的に第２の分子をタグ付け／標識することを含む。例えば、一実施形態では、第２の抗原に対して特異的な第２のタグ付けされた分子（第２のＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタグ付けされた分子など）を、哺乳動物に投与する。ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを含む普遍的免疫受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞は第２のタグ付けされた分子に結合し、したがって、第２の抗原に方向付けされる。一実施形態では、本方法は、遺伝子改変細胞を哺乳動物に投与する前に、複数の異なるＳｐｙＴａｇ結合分子またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合分子を哺乳動物に逐次的に投与するステップを含む。一実施形態では、本方法は、Ｔ細胞を第２の抗原に方向付けする前に、第１の抗原を発現する細胞の排除を可能にするために、第１および第２のタグ付けされた分子の投与の間に十分な時間をおくステップを含む。さらに別の実施形態では、本方法は、遺伝子改変細胞を哺乳動物に投与する前に、普遍的免疫受容体を複数の異なるＳｐｙＴａｇ結合分子またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合分子に逐次的に結合させるステップを含む。当業者には理解されるであろうが、本発明の方法は、追加の別個の標的抗原の標的化のためのさらなる反復を範囲に含む。
一実施形態では、本発明は、タグ付けされた抗原を標的とする普遍的免疫受容体を、がんを治療するために使用する方法を提供する。治療され得るがんとしては、血管形成されていない腫瘍、またはまだ実質的に血管形成されていない腫瘍のほか、血管形成された腫瘍が挙げられる。がんは、非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫など）を含んでもよく、または固形腫瘍を含んでもよい。本発明のＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体を用いて治療されるがんの種類としては、癌腫、芽細胞腫、および肉腫、ある種の白血病またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性病変、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。
血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液（または血行性）がんの例としては、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性の白血病ならびに赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、毛様細胞白血病および骨髄形成異常症を含む、白血病が挙げられる。
固形腫瘍は、通常は嚢胞も液体領域も含まない、組織の異常腫瘤である。固形腫瘍は良性のことも悪性のこともある。様々な種類の固形腫瘍が、それらを形成する細胞の種類によって名付けられている（肉腫、癌腫およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、褐色細胞腫、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝細胞腫、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱がん、黒色腫、ならびにＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形性神経膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン種、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移など）が挙げられる。一実施形態では、本発明は、ウイルス、細菌、寄生虫、または他の感染症に関連する抗原を標的とする普遍的免疫受容体を、感染症を治療するために使用する方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、自己抗原を標的とするＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体を、自己免疫障害を治療するために使用する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを含む普遍的免疫受容体を発現するように免疫抑制性調節性Ｔ細胞を遺伝子改変することを含む。一実施形態では、自己抗原結合ドメインを含む分子を相互タグ（それぞれＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇ）でタグ付けするステップ、およびＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを含む普遍的免疫受容体を発現するように改変された調節性Ｔ細胞を投与することを含む。一実施形態では、自己抗原に対する調節性Ｔ細胞の標的化は、自己抗原に向けられる自己免疫応答を低下させる。例えば、一実施形態では、標的自己抗原への結合を介した遺伝子改変調節性Ｔ細胞の活性化は、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖を低下させる。本発明の方法によって治療可能である自己免疫障害の非限定的な例としては、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植片対宿主病、関節リウマチ、乾癬、皮膚炎、自己免疫性Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症などが挙げられる。当業者には理解されるであろうが、本発明は、自己抗原に対する自己免疫応答によって特徴付けられる任意の自己免疫疾患を治療するために有用である。本発明は、自己抗原が現在知られている自己免疫疾患、および自己抗原が将来解明されるであろう自己免疫疾患の治療を範囲に含む。
しかし、本発明は、本明細書に開示される抗原標的および疾患のみに限定されると解釈されるべきではない。そうではなくて、本発明は、普遍的免疫受容体を使用して疾患を治療することができる疾患に関連する任意の抗原標的を含むと解釈されるべきである。
本発明の普遍的免疫受容体改変Ｔ細胞はまた、哺乳動物におけるｅｘ ｖｉｖｏ免疫処置および／またはｉｎ ｖｉｖｏ治療法のためのワクチンの一種としても役立ち得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
ｅｘ ｖｉｖｏ免疫処置に関しては、細胞を哺乳動物に投与する前に、以下の少なくとも１つをｉｎ ｖｉｔｒｏで行う：ｉ）細胞の増大、ｉｉ）普遍的免疫受容体をコードする核酸の細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。
ｅｘ ｖｉｖｏ手順は当技術分野で周知であり、以下でより詳細に考察する。手短に述べると、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離した上で、本明細書に開示される普遍的免疫受容体を発現するベクターによって遺伝子改変する（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入またはトランスフェクトを行う）。普遍的免疫受容体改変細胞を哺乳動物レシピエントに投与することにより、治療的利益を得ることができる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、普遍的免疫受容体改変細胞はレシピエントに対して自己であり得る。あるいは、細胞はレシピエントに対して同種、同系または異種であり得る。
造血幹細胞および始原細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増大のための手順は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載されており、これを本発明の細胞に適用することができる。他の好適な方法は当技術分野で公知であり、このため、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞の増大のいかなる特定の方法にも限定されない。手短に述べると、Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養および増大は以下を含む：（１）ＣＤ３４＋造血幹細胞および始原細胞を、哺乳動物から、末梢血採取物または骨髄エクスプラントから収集すること；ならびに（２）そのような細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増大させること。米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載された細胞増殖因子のほかに、ｆｌｔ３-Ｌ、ＩＬ-１、ＩＬ-３およびｃ-ｋｉｔリガンドなどの他の因子を、細胞の培養および増大のために使用することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏ免疫処置に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明はまた、患者における抗原に向けての免疫応答を誘発するためのｉｎ ｖｉｖｏ免疫処置のための組成物および方法も提供する。
一般に、本明細書に記載の通りに活性化および増大された細胞は、免疫機能が低下した個体において生じる疾患の治療および予防に利用することができる。特に、本発明の普遍的免疫受容体改変Ｔ細胞は、がんの治療に使用される。ある特定の実施形態では、本発明の細胞は、がんを発症するリスクのある患者の治療に使用される。したがって、本発明は、がんの治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に対して、本発明の普遍的免疫受容体改変Ｔ細胞の治療的有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
本発明のＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ普遍的免疫受容体改変Ｔ細胞は、単独で、または希釈剤および／またはＩＬ-２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた薬学的組成物として投与することができる。手短に述べると、本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載される標的細胞集団を、１つまたは複数の薬学的または生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤を含有してもよい。本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化されることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、治療（または予防）しようとする疾患に適した様式で投与されてよい。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定され得る。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」または「治療量」が提示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態の個体差を考慮して、医師が決定することができる。一般に、本明細書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、細胞１０４～１０９個／ｋｇ体重、好ましくは細胞１０５～１０６個／ｋｇ体重であって、これらの範囲内のすべての整数値を含む投与量で投与することができる。また、Ｔ細胞組成物をこれらの用量で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般的に公知である輸注手法を使用することによって投与することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照）。特定の患者に関する最適な投与量および治療レジメンは、疾患の徴候に関して患者をモニタリングして、それに応じて治療を調節することによって、医療の当業者によって容易に決定され得る。
ある特定の実施形態では、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、続いてその後に血液を再び採取して（またはアフェレーシスを行って）、それ由来のＴ細胞を本発明に従って活性化した上で、これらの活性化および増大されたＴ細胞を患者に再び輸注することが望まれる可能性がある。この過程を２、３週毎に複数回行うことができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は１０ｃｃ～４００ｃｃの採取血から活性化させることができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採取血から活性化される。理論に拘束されるわけではないが、この複数回の採血／複数回の再輸注プロトコールを使用することは、Ｔ細胞のある特定の集団を選別するために役立つ可能性がある。
本組成物の投与は、エアゾール吸引、注射、経口摂取、輸液、植え込みまたは移植を含む、任意の簡便な様式で実施することができる。本明細書に記載される組成物は、患者に対して、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に投与することができる。一実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、患者に対して、皮内注射または皮下注射によって投与される。別の実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物を腫瘍内、リンパ節内または感染部位に直接注射してもよい。
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法、またはＴ細胞を治療的レベルまで増大させることが当技術分野で公知である他の方法を使用して活性化および増大された細胞を、ＭＳ患者に対する抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン-２、シタラビン（ＡＲＡ-Ｃとしても知られる）もしくはナタリズマブ治療、乾癬患者に対するエファリズマブ治療、またはＰＭＬ患者に対する他の治療などの薬剤による治療を含むがこれらに限定されない、任意の様々な妥当な治療様式と共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与する。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞を、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６など、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨなどの他の免疫除去薬、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、サイトキサン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用してもよい。これらの薬物は、カルシウム依存型ホスファターゼのカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、または増殖因子が誘導したシグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）かのいずれかである（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）。さらなる一実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法薬、外部ビーム照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて（例えば、その前、同時またはその後に）、患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどによるＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量の化学療法薬に続いて末梢血幹細胞移植を行う標準治療を受けることができる。ある特定の実施形態では、移植後に、対象は本発明の増大された免疫細胞の輸注を受ける。さらなる一実施形態では、増大された細胞は、手術の前または後に投与される。
患者に投与される上記の治療の投与量は、治療される病状および治療のレシピエントの正確な性質に応じて多様となる。ヒトへの投与に関する投与量の増減は、当技術分野で許容される実践に従って行うことができる。Ｔ細胞の投与およびスケジュール設定に関する戦略は考察されている（Ertl et al, 2011, Cancer Res, 71:3175-81; Junghans, 2010, Journal of Translational Medicine, 8:55）。
スクリーニング
一実施形態では、本発明は、例えば、抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマーなどを含む、可能性のある抗原結合組成物をスクリーニングするための方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合ドメインを含む普遍的免疫受容体を発現するように改変されたＴ細胞を使用して、標的抗原に結合する組成物の能力について、相互にタグ付けされた組成物（すなわち、それぞれＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇ部分でタグ付けされる）をスクリーニングする。一実施形態では、本発明のスクリーニングシステムは、診断のために、治験における患者の適格性を決定するために、標的組織における抗原への最大結合時間を決定するために（健常組織において残留作用物質を伴わずに）、および治療に対する応答をモニタリングする手段として使用される。一実施形態では、普遍的免疫受容体発現改変Ｔ細胞を含む細胞ベースのアッセイを使用して、組成物をスクリーニングする。一実施形態では、アッセイは、タグ付けされた組成物をアッセイに投与すること、およびＴ細胞によって誘導される検出可能な応答を検出することを含む。例えば、一実施形態では、アッセイは、Ｔ細胞の活性化を検出することを含む。別の実施形態では、アッセイは、分泌されたサイトカインのレベルを検出することを含む。一実施形態では、抗原結合組成物を得ようとする標的抗原は、表面上に、例えば、細胞培養プレートまたはビーズに固定化される。別の実施形態では、アッセイは、標的抗原を発現する細胞を含む。
普遍的免疫受容体（ＵＩＲ）の代謝回転を定量する方法
一態様では、細胞表面での普遍的免疫受容体の代謝回転を定量する方法が提供される。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇとの結合は共有結合であるため、武装化された普遍的免疫受容体が細胞表面上で代謝回転する速さを評価することが可能である。代謝回転の速度の知識は、例えば、患者に対する抗体用量の戦略またはレジメンを規定する際に有用であり得る。
一実施形態では、本方法は、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む細胞外ドメインとを含む普遍的免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む作用物質と接触させ、それによって武装化受容体を生成させるステップ、および（ｂ）基準量に対する武装化受容体の量を決定するステップを含む。一実施形態では、基準量は、前の時点での武装化受容体の量である。
一実施形態では、哺乳動物に細胞および作用物質を逐次的または同時に投与し、哺乳動物をモニタリングして、武装化受容体のレベルを決定する。武装化受容体のレベルが腫瘍またはがんを治療するのに不十分であると判定された場合、哺乳動物にさらなる細胞および／または作用物質を投与する。
一実施形態では、作用物質はＳｐｙＴａｇに連結されている。別の実施形態では、作用物質は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである。別の実施形態では、物質は抗体であり、ヒトＩｇＧである。
一実施形態では、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である。一実施形態では、細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、細胞は自己細胞である。別の実施形態では、普遍的免疫受容体は、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激分子は、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである。
一実施形態では、武装化受容体の量は、作用物質を標識して、標識された作用物質を検出することによって決定される。作用物質は、作用物質を標識分子と連結または接触させることによって標識することができ、標識分子としては、例えば、ｍｙｃ-タグ、ＦＬＡＧ-タグ、Ｈｉｓ-タグ、ＨＡ-タグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、フルオロフォア（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、ビオチン、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヒスチジン、ストレプトアビジン、アビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、量子ドットナノ結晶を含むあらゆる種類の蛍光物質、放射性同位体、重金属、超磁性ナノ粒子、および、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７，１０-四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７-トリアザシクロノナン-１，４，７-三酢酸（ＮＯＴＡ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を含む放射性同位体標識のために使用される任意の種類の化合物が挙げられる。
そのような標識のいずれかによる作用物質の標識は、直接的または間接的に行うことができる。標識は、化学的カップリングおよび化学的架橋剤などの手法を使用して分子にコンジュゲートさせることができる。あるいは、標識された分子を融合タンパク質としてコードするポリヌクレオチドベクターを調製することもできる。続いて、細胞株を操作して標識された分子を発現させ、標識された分子を培養培地から単離して、精製し、本明細書に開示される方法に使用することができる。標識されたアミノ酸、標識されたペプチド、標識されたタンパク質、または分子レポーターを、発現されたタンパク質のライゲーションを介して（例えば、ソルターゼ、インテインなどを使用して）、分子にライゲートすることもできる。
一実施形態では、武装化受容体の量は、質量分析によって決定される。
本発明を、以下の実験的実施例を参照することによってさらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、別に指定されない限り、限定を意図してはいない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、そうではなくて、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意およびすべての変形物を範囲に含むと解釈されるべきである。
当業者は、さらなる説明がなくても、前述の説明および以下の例示的な例を使用して、本発明の化合物を作製し利用し、特許請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するが、開示のその他の部分を限定するとは決して解釈されないものとする。
これらの実験に使用した材料および方法について、以下に説明する。
Ａ２４-プロテインＧ-ＳｐｙＴａｇ（Ａ２４-ＰＧＳＴ）、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、およびＤＡＲＰｉｎ-ＳｐｙＴａｇ構築物のクローニング
７ｘＧＧＳリンカーおよびＳｐｙＴａｇに融合された、２４番目のアミノ酸位置にアンバーコドンを含有するプロテインＧのＨＴＢ１ドメインを、以前の研究（Warden-Rothman et al., Anal Chem 2013, 85 (22), 11090-11097.; Hui et al., Bioconjugate Chemistry 2015, 26 (8), 1456-1460）で詳述された通りに、ＮｄｅＩおよびＡｇｅＩクローニング部位を介してｐＳＴＥＰＬベクター中にクローニングした。ｍｙｃ-ＤＡＲＰｉｎ９．２６-ＳｐｙＴａｇ、ｍｙｃ-Ｅｏ１-ＳｐｙＴａｇ、およびｍｙｃ-Ｅｃ１-ＳｐｙＴａｇを合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、ＮｄｅＩおよびＡｇｅＩクローニング部位を介してｐＳＴＥＰＬベクター中にクローニングした（Kasaraneni, N., mBio 2017, 8 (6), e01860-17; Steiner et al. Journal of Molecular Biology 2008, 382 (5), 1211-1227; Stefan et al. Mol Biol 2011, 413 (4), 826-843）。Ｆｌａｇ-Ｅｏ１-ＳｐｙＴａｇを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）伸長を使用して、Ｅｏ１-ＳｐｙＴａｇ構築物の５’末端にＮｄｅＩ切断部位およびＦｌａｇ-タグを付加した。続いて、上述の方法に従って、Ｆｌａｇ-Ｅｏ１-ＳｐｙＴａｇをｐＳＴＥＰＬベクター中にクローニングした。５’末端にＮｄｅＩ切断部位およびｍｙｃ-タグを付加し、３’末端にＸｈｏＩ切断部位を付加するプライマーを使用するＲＦＰのＰＣＲ増幅を介してＭｙｃ-ＲＦＰ-ＳｐｙＴａｇを作製し、その後、付加された切断部位を使用して、ｐＳＴＥＰＬベクター中の７ｘＧＧＳ-ＳｐｙＴａｇの上流にクローニングした。５’末端にＮｈｅＩ切断部位を付加し、３’末端にＸｈｏＩ切断部位を付加するプライマーを使用するＶｅｎｕｓのＰＣＲ増幅を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-Ｖｅｎｕｓを作製し、続いて、付加された切断部位を使用して、ｐＳＴＥＰＬベクター中のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-７ｘＧＧｓドメインの下流にクローニングした。
上記の構築物のＳｐｙＴａｇ-ＤＡバージョンを作製するために、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、ＳｐｙＴａｇコーディング領域にＡからＣへの点変異を導入するための順方向（５’-ＧＣＡＴＡＴＣＧＴＴＡＴＧＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＡ-３’）および逆方向（５’-ＴＣＧＴＴＧＧＣＴＴＧＴＡＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＡＴＡＡＣＧＡＴＡＴＧＣ-３’）プライマーと共に使用して、Ａｓｐ１１７をＡｌａ１１７に変異させた（Ｚａｋｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１２，１０９（１２），Ｅ６９０-７）。
すべてのプラスミド配列をシークエンシングにより確認した。
細菌発現タンパク質の発現および精製
Ａ２４-プロテインＧ-ＳｐｙＴａｇ（Ａ２４-ＰＧＳＴ）配列およびｐＥＶＯＬ-ｐＢｐＦを含有するｐＳＴＥＰＬプラスミドを、Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に共形質転換した。１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび２５ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む溶原性ブロス（ＬＢ）中の細菌スターター培養物を、振盪インキュベーター（２３０ｒｐｍ、３７Ｃ）内で８時間増殖させた。続いてスターター培養物を、１００μｍｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｍｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５００μＭ Ｌ-ベンゾイルフェニルアラニン（Ｂａｃｈｅｍ）、０．１％ ｗ／ｖ Ｌ-（＋）-アラビノース（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）、および０．５％ ｖ／ｖグルコースを含有する自己誘導培地（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）中に１：１０００に希釈し、振盪インキュベーター（２３０ｒｐｍ、３７Ｃ）内で１６時間増殖させた。
ＤＡＲＰｉｎおよびＲＦＰ構築物を含有するすべてのｐＳＴＥＰＬプラスミドを、Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。培養物を１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．５％ ｖ／ｖグルコースを含有する自己誘導培地（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）中で上記のように増殖させた。
培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。ペレットを、０．４ｍｇ／ｍＬリゾチーム、４μｇ／ｍＬ ＤＮアーゼ、およびＥＤＴＡ非含有細胞質プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＢ-ＰＥＲ溶解緩衝液中に、ペレット０．８～１グラム当たり緩衝液５ｍＬの比で再懸濁させた。溶解物を室温で１時間回転させ、その後に-８０Ｃで３０分間凍結させた。続いて細胞溶解物を室温で解凍し、続いて１５，０００ｘｇで１０分間、４Ｃで遠心分離した。溶解物の水層を収集し、Ｔａｌｏｎ ５０／５０金属アフィニティー樹脂（５０／５０樹脂１ｍｌ／細菌培養物１００ｍｌ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有する１０ｍＬのＰｏｌｙ-Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム中で室温で１時間インキュベートした。溶解物をカラムに通過させ、樹脂ビーズを、マグネシウムおよびカルシウムを含まない５カラム容量の滅菌１ｘＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で洗浄した。
ソルターゼ切断精製は、以前に記載された通りに実行した（Warden-Rothman et al. Anal Chem 2013, 85 (22), 11090-11097）。手短に述べると、２ｍＭトリグリシンおよび５０μＭ塩化カルシウムを含有する１ｘＰＢＳを各カラム（５０／５０樹脂１ｍＬ当たり緩衝液５００μＬ）に添加し、３７Ｃで２時間インキュベートした。溶出液を収集し、濾過滅菌して、後の使用のために４Ｃで保存した。
ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、タンパク質濃度を決定した。ＳｐｙＴａｇドメインの機能性を試験するために、タンパク質を過剰量のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-Ｖｅｎｕｓと混合して、室温で３０分間インキュベートした。試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥ還元ゲル（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）上で泳動させて、イソペプチド結合形成を確認した。ｉｎ ｖｉｖｏ試験では、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１１４相分離法（Liu et al., Clin Biochem 1997, 30, 455-463）を使用してエンドトキシンを除去した。エンドトキシンレベルは、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）-ＰＴＳシステムおよびカブトガニアメーバ細胞抽出液（ＬＡＬ）試験カートリッジ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、１０エンドトキシン単位／ｍＬ未満であることが確認された。
Ａ２４-プロテインＧ-ＳｐｙＴａｇの臨床グレードＩｇＧへの光活性化部位特異的コンジュゲーション
Ａ２４-プロテインＧ-ＳｐｙＴａｇ（Ａ２４-ＰＧＳＴ）を、Ｈｕｉら（Hui et al., Bioconjugate Chemistry 2015, 26 (8), 1456-1460）によって以前に記載された方法に従って、臨床グレードＩｇＧ（トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ）に架橋させた。手短に述べると、Ａ２４-ＰＧＳＴ精製後、１μｇのＩｇＧを完全に架橋させるのに必要なＡ２４-ＰＧＳＴの体積を決定するために、小パイロットコンジュゲーション試験を実施した。コンジュゲーションをＵＶ光下で４Ｃで２時間行わせ、試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥ還元ゲル（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）上に泳動させて、ＩｇＧ重鎖のＡ２４-ＰＧＳＴとのコンジュゲーションを確認した。続いて、最大コンジュゲーションを達成することが決定された体積／重量比を、同じステップに従う大量バッチ生産のために使用した。
過剰なＡ２４-ＰＧＳＴを除去するために、試料を１００ｋＤａ ＭＷＣＯスピン濾過カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）にて１４，０００ｘｇで遠心分離し、続いて１ｘＰＢＳで５ｘカラム容量で洗浄した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。試料は後の使用のために４Ｃで保存した。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
タンパク質の発現、プロテインＧ-ＳｐｙＴａｇとＩｇＧ重鎖との架橋、およびＳｐｙＴａｇ標識標的化リガンドとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ試薬との共有結合形成を決定するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。試料を２-メルカプトエタノールの存在下で９５Ｃで５分間煮沸し、４～１５％勾配Ｔｒｉｓ／グリシンゲル（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）上にローディングした。ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１時間染色し、その後に水で一晩かけて脱色した。
レンチウイルス構築物のクローニングおよびレンチウイルスパッケージング
切断型ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒΔ）（Li et al., J. Mol. Biol. 2014, 426 (2), 309-317）をコードする遺伝子断片を合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化した。インサートを、ＣＤ２８-ＣＤ３ζ、４１ＢＢ-ＣＤ３ζのいずれかを含有するか、または機能的な細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（デルタ-ゼータ；Δζ）細胞内ドメインを欠く第三世代複製不全レンチウイルスベクター中にライゲートした。ＧＦＰをコードする領域およびＴ２Ａ部位は受容体の上流にあり、ＧＦＰを代替マーカーとして使用して導入遺伝子発現の検出が可能であった（図２Ａおよび図１３）。同じ方法を使用して、ＣＤ２８-ＣＤ３ζまたは４１ＢＢ-ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインのいずれかを含有するハーセプチン由来ｓｃＦｖ（４Ｄ５）（Zhao, 2009）を使用して抗Ｈｅｒ２キメラ抗原受容体をクローニングした。すべての受容体の発現は、ＥＦ１ａプロモーター（Milone et al., Molecular Therapy 2009, 17 (8), 1453-1464）により推進された。
ＨＥＲ２ ＷＴは、Ｍｉｅｎ-Ｃｈｉｅ Ｈｕｎｇ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド#１６２５７；http://n2t.net/addgene:16257；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１６２５７）（Li et al., Cancer Cell 2004, 6 (5), 459-469）から供与を受けた。ＥＧＦＲ ＷＴは、Ｍａｔｔｈｅｗ Ｍｅｙｅｒｓｏｎ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド#１１０１１；http://n2t.net/addgene:11011；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１１０１１）（Greulich et al., Plos Med 2005, 2 (11), e313）から供与を受けた。Ｈｅｒ２配列およびＥＧＦＲ配列をＰＣＲによって増幅し、制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化した。遺伝子配列を、第三世代複製不全レンチウイルスパッケージングベクター中のＥＦ１ａプロモーターの下流にライゲートした。
複製不全レンチウイルスを、以前に記載された通りに（Smith et al., Molecular Therapy 2016, 24 (11), 1987-1999）、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞を使用して作製した。手短に述べると、ｐＥＬＮＳ伝達プラスミドおよびレンチウイルスパッケージングプラスミドｐＶＳＶ（ＶＳＶ糖タンパク質発現ベクター）、ｐＲＳＶ．ＲＥＶ（Ｒｅｖ発現ベクター）、およびｐＭＤＬｇ／ｐ．ＲＲＥ（Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミド）を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞にトランスフェクトした。２４時間および４８時間の上清を回収し、２５，０００ｒｐｍで２時間の超遠心分離によりウイルスをペレット化した。濃縮されたウイルスを、使用時まで-８０Ｃで保存した。代替マーカーＧＦＰの測定を通じて、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞のウイルス形質導入を使用してウイルス力価（ＩＵ／ｍＬ）を決定した。
細胞株
樹立されたヒト腫瘍細胞株ＳＫＯＶ３、ＭＤＡ-ＭＢ-４６８、Ａ１８４７、ＣＲＬ５８０３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１、Ｒａｍｏｓ、およびＨＥＫ２９３Ｔを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。細胞は、１０％ ＦＢＳ（ＶＷＲ）、１００ Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で構成される完全培地（ＣＭ）中で、３７Ｃ、５％ ＣＯ２で培養した。すべての細胞株について、定期的にマイコプラズマの検査を行った。
Ｒａｍｏｓ-Ｈｅｒ２およびＲａｍｏｓ-ＥＧＦＲ株を作製するためには、Ｒａｍｏｓ細胞に、いずれかのタンパク質のコード配列を含有するレンチウイルスによる形質導入を行った。続いて細胞を増殖させて、抗Ｈｅｒ２（ＡＰＣ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または抗ＥＧＦＲ抗体（ＰＥ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）のいずれかで染色し、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、タンパク質発現について選別した。
ＳＫＯＶ３-ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζを作製するためには、ＳＫＯＶ３細胞に、ＧＦＰ-Ｔ２Ａ-ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζのコード配列を含むレンチウイルスによる形質導入を行った。細胞を増殖させて、ＦＡＣＳを使用してＧＦＰ発現について選別した。
健常ドナー初代ヒトＴ細胞は、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から購入した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞を等量混合して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３：１の比で刺激した。拡大過程中、Ｔ細胞は３７Ｃ、５％ ＣＯ２でＣＭ中で維持した。２４時間後に、レンチウイルスを感染多重度（ＭＯＩ）５～１０で添加した。活性化の７日後に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを、磁気分離によって培養物から取り出した。Ｔ細胞を０．５～１×１０６個／ｍＬの密度でさらに７日間培養した。レンチウイルス添加後に、５０～１００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ-２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含むＣＭを添加し、機能アッセイにＴ細胞を使用する２日前まで維持した。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、拡大過程中のＴ細胞数および体積を継続的に追跡した。形質導入効率は、ＧＦＰの発現に関してフローサイトメトリーにより検出した。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞の武装化および武装化受容体の検出
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ発現Ｔ細胞を、様々な濃度のＳｐｙＴａｇ標識標的化作用物質を含有するＣＭ中に再懸濁させた。細胞を３７Ｃおよび５％ ＣＯ２で３０～６０分間インキュベートし、続いてＣＭで２回洗浄した。ＩｇＧ-ＳｐｙＴａｇ武装化Ｔ細胞の染色のために、ＬｉｇｈｔｎｉｎｇＬｉｎｋ ＡＰＣ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を結合させたヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。ｍｙｃ-またはＦｌａｇ-ＤＡＲＰｉｎ-ＳｐｙＴａｇ武装化Ｔ細胞の染色のためには、抗Ｍｙｃ-Ａｌｅｘａ６４７（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または抗ＦＬＡＧ-ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）のいずれかを使用した。染色された細胞をフローサイトメトリーによって分析した（図１４および図１５）。
受容体代謝回転実験のために、Ｔ細胞を増大させて、平均体積が３００ｆＬ未満となるまで静置し、続いて上述のようにＳｐｙＴａｇ標識ＩｇＧまたはＳｐｙＴａｇ標識ＤＡＲＰｉｎのいずれかにより武装化した。基礎代謝回転については、Ｔ細胞をＣＭ中に維持し、ローディングされた受容体で２４時間毎に合計９６時間染色した。抗原誘導性の代謝回転については、Ｔ細胞を３：１のエフェクター対標的比で組み合わせて、培養２４時間後に染色した。
ウエスタンブロット法
ＳＫＯＶ３-ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζを、２０００ｎＭ ｍｙｃ-ＲＦＰ-ＳｐｙＴａｇまたはｍｙｃ-ＲＦＰ-ＳｐｙＴａｇ-ＤＡのどちらかと共に３７Ｃで１時間インキュベートした。細胞を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液をプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号５８９２９７０００１）と共に使用して溶解させて、５分間遠心分離した。続いて溶解物を回収し、タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。８０μｇのタンパク質試料を、５％ β-メルカプトエタノール（ＢｉｏＲａｄ）を含有するローディング緩衝液（Ｌａｍｍｅｌｉ緩衝液；ＢｉｏＲａｄ）と混合し、９５Ｃで５分間インキュベートした。試料を４～１５％ Ｍｉｎｉｇｅｌｓ ｐｒｏｔｅａｎ ＴＧＸ（ＢｉｏＲａｄ）にローディングし、１５０ Ｖで１時間泳動させた。タンパク質ラダー（ＢｉｏＲａｄ）を試料と共に泳動させた。タンパク質試料を、１００Ｖで１時間、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移行させた。膜をＴＢＳＴ（１％ Ｔｗｅｅｎ）（ＢｉｏＲａｄ）で洗浄し、精製マウス抗ヒトＣＤ３ζ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ；１：１，０００）、抗ヒト／マウス／ラットＧＡＰＤＨ（Ｒ&Ｄ；１：２０，０００）、およびペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１：１０，０００）を含む一次抗体および二次抗体とインキュベートした。一次抗体および二次抗体インキュベーションステップの間に膜を３回洗浄した。ＥＣＬプライムウエスタンブロット法検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ#ＲＰＮ２２３６）を使用して膜を現像し、ＧＥ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００シリーズ撮像システムを使用して撮像した。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞のエフェクター機能の試験
サイトカイン分泌アッセイのために、ハーセプチン-ＳＴタンパク質をコーティング緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中で希釈し、平底ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｓｉｇｍａ）中で、４Ｃで一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳで２回洗浄して、７０，０００個の免疫受容体（＋）細胞を各ウェルに添加した。プレートを通気性シールで覆い、３７Ｃおよび５％ ＣＯ２で１６時間インキュベートした。回収した上清は、後に使用するために-２０Ｃで保存した。ヒトＩＦＮγγＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、含まれるプロトコールに従ってＩＦＮγγ分泌レベルを評価した。
溶解機能のエンドポイント試験は、Ｌｕｃ-Ｓｃｒｅｅｎ（商標）Ｅｘｔｅｎｄｅｄ-Ｇｌｏｗ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞溶解のためには、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を、正確な濃度の上記の適切なＳｐｙＴａｇ標識標的化リガンドと共にインキュベートした。武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞およびコメツキムシ緑色ルシフェラーゼ（ＣＢＧ）発現腫瘍細胞を、７：１のＥ：Ｔ比で２００ｕＬのフェノール非含有ＣＭ中で混合し、３７Ｃおよび５％ ＣＯ２で一晩インキュベートした。プレートを１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各ウェルから１００μＬの培地を取り出して、製造元のプロトコールに従ってルシフェラーゼ緩衝液を添加した。ルシフェラーゼの読取り値をマイクロプレートリーダーを使用して得た。オンデマンド溶解のためには、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞、標的化リガンド、および腫瘍細胞をフェノール非含有ＣＭ中で同時に組み合わせた。他のすべてのステップは武装化溶解と同じ方法で行った。細胞傷害性は、次の式：［１－（Ｔ細胞＋標的化リガンド＋標的細胞）／（標的細胞のみ）－１－（Ｔ細胞＋標的細胞）／（標的細胞のみ）］×１００を使用して計算した。
リアルタイム溶解分析は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析機器（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。付着した腫瘍細胞をプレーティングし、３７Ｃ、５％ ＣＯ２で器具内で一晩インキュベートした。続いて、上記の通りに武装化した後に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を添加した。オンデマンド溶解のためには、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を腫瘍細胞に添加して、４時間インキュベートした後に、標的化リガンドを添加した。細胞傷害性の計算は、ＲＴＣＡソフトウェア（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。
異種移植モデル
ＮＯＤ-ｓｃｉｄ ＩＬ２ Ｒγγｎｕｌｌを、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｃｏｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から購入した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの施設内実験動物委員会が承認したプロトコールに従って、６～１２週齢の雌マウスを病原体のない環境で飼育した。腹腔内（Ｉ．Ｐ．）腫瘍モデルについては、マウスに１×１０６個のＳＫＯＶ３-ＣＢＧ＋ＧＦＰ腫瘍細胞を腹腔内注射した。７日後に、１２．５×１０６個のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体Ｔ細胞を１０００ｎＭのハーセプチン-ＳＴにより武装化して、腹腔内注射した。ＳｐｙＴａｇ標識標的化リガンドを、Ｔ細胞注射の１日後に腹腔内注射し、以後は治療停止まで３日ごとに注射した。腫瘍進行は、以前に記載された通りの生物発光イメージング（Lanitis et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 2012, 20 (3), 633-643）を介して測定し、前肢と後肢の間の腹部にゲートされた平均放射輝度として定量化した。マウスは腹水形成により体重が２０％増加した時点で屠殺した。腫瘍注射後の第１１日までに注射部位に触知可能な皮下（ＳＣ）腫瘍を形成したマウスは全群から除外した。
血液試料は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｃｏｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）により、眼窩後方出血を介して収集された。末梢血Ｔ細胞は、提供されたプロトコール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い、Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標）Ｔｕｂｅｓを使用して定量した。染色パネルは、抗ヒトＣＤ３（ブリリアントバイオレット６０５；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ４５（ＰＥ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ヒトＣＤ８（ＡＰＣ-Ｈ７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）よりなった。
ＳＣ腫瘍モデルについては、マウスに１×１０６個のＳＫＯＶ３-ＣＢＧ＋ＧＦＰ腫瘍細胞を側腹部に皮下注射した。６日後に、１２．５×１０６個のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体Ｔ細胞を武装化し、腹腔内注射した。ＳｐｙＴａｇ標識標的化リガンドをＴ細胞注入の１日後に腹腔内注射し、以後は治療停止まで３日毎に注射した。腫瘍進行はキャリパー測定により測定し、次の式を使用して定量した：体積＝３．１４／６（長さ×（幅）２）、式中、長さは最長直径であり、幅は最短直径である。
統計分析
特に記載のない限り、データは平均＋／-標準偏差（ＳＤ）として報告する。特に記載のない限り、独立両側ｔ検定を使用して統計分析を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアを統計分析に使用した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
ビデオ
１０００ｎＭ（Ｖ１）、１００ｎＭ（Ｖ２）、１０ｎＭ（Ｖ３）、または０ｎＭ（Ｖ４）のハーセプチン-ＳＴにより武装化したＧＦＰ-ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞は、核ＲＦＰを発現するＨｅｒ２＋ ＳＫＯＶ３細胞の用量依存的溶解を示す。１０００ｎＭ（Ｖ５）のハーセプチン-ＳＴで武装したＧＦＰ-ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ΔζＴ細胞では、腫瘍細胞の溶解は観察されなかった。Ｈｅｒ２＋ ＳＫＯＶ３細胞と共培養した非武装ＧＦＰ-ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞にハーセプチン-ＳＴを添加すると、溶解機能が誘導される（Ｖ６；ハーセプチン-ＳＴを４８時間後に添加）。
実験の結果を以下に説明する。
ＳｐｙＴａｇ標識腫瘍抗原標的化リガンドの作製
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体システムは、ＳｐｙＴａｇドメインを含有する標的化リガンド、およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体を発現するＴ細胞という、２つの主な構成要素で構成される（図１Ａ）。本発明者らは、ＳｐｙＴａｇ含有標的化リガンドを作製するために、部位特異的コンジュゲーションおよび遺伝子融合という２つのアプローチを用いた。ＳｐｙＴａｇの臨床グレードＩｇＧへの部位特異的コンジュゲーションは、Hui et al Bioconjugate Chemistry 2015, 26 (8), 1456-1460によって開発された光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）アダプタータンパク質を使用して達成した。このアダプタータンパク質は、ＣＨ２-ＣＨ３接合部でヒトＩｇＧのＦｃ部分と相互作用するＩｇＧ結合性細菌細胞壁タンパク質であるプロテインＧに由来する（Sauer-Eriksson et al., Struct Lond Engl 1993 1995, 3 (3), 265-278）。アンバー-ｔＲＮＡサプレッサーのアミノアシル-シンターゼ対を使用して、Ａ２４アミノ酸位置に非天然アミノ酸ベンゾイルフェニルアラニン（ＢＰＡ）を組み入れたプロテインＧ-ＳｐｙＴａｇを発現させた。ＩｇＧと一緒に組み合わされると、Ａ２４-プロテインＧ-ＳｐｙＴａｇはＩｇＧのＦｃドメインに非共有結合性に結合する。ＵＶ光（３６５ｎｍ）に曝露されると、ＢＰＡ分子は活性化され、プロテインＧ-ＳｐｙＴａｇを部位特異的にＦｃドメインに共有結合架橋させる（図１Ａ）。最終的なＩｇＧ分子は、このため、Ｆｃドメインの両側に１個ずつ、共有結合した２個のプロテインＧ-ＳｐｙＴａｇ分子を含有する（図１Ａ）。
プロテインＧ-ＳｐｙＴａｇと架橋された臨床グレードの抗体の、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを還元することによる分析により、ハーセプチン（図１Ｂ）、セツキシマブ、およびリツキシマブに対するＩｇＧ重鎖のほぼ完全な架橋が示され、これは２つのタンパク質の結合質量（合わせて約６０ｋＤａ）に等しいバンドシフトによって示された（図６Ａ）。ＵＶ曝露後のＳｐｙＴａｇドメインの機能性の維持を示すために、本発明者らは、ハーセプチン-ＳｐｙＴａｇを過剰量のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-Ｖｅｎｕｓ（３８ｋＤａ）と共にインキュベートした。沸騰および還元条件下で両タンパク質のおおよその結合質量（１００ｋＤａ）で維持されるシフトしたバンドの形成が、単一の重鎖-プロテインＧバンドの喪失とともに観察され、これにより、この２つのタンパク質間の共有結合の形成が示された（図１Ｂ）。標的化リガンドの種類のレパートリーをさらに広げるために、Ｃ末端ＳｐｙＴａｇドメインを含有する、Ｈｅｒ２（ＤＡＲＰｉｎ９．２６；２２．５ｋＤａ）（Kasaraneni et al., mBio 2017, 8 (6), e01860-17）（図１Ｃ）、ＥＧＦＲ（Ｅ０１；２２．４ｋＤａ）（Steiner et al., Journal of Molecular Biology 2008, 382 (5), 1211-1227）、またはＥｐＣＡＭ（ＥＣ１；２２．８ｋＤａ）（Stefan et al., J Mol Biol 2011, 413 (4), 826-843）（図６Ｂ）標的化設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を、ソルターゼタグ発現タンパク質ライゲーション（ＳＴＥＰＬ）システム（Warden-Rothman et al., Anal Chem 2013, 85 (22), 11090-11097）を使用して発現させた。ＳｐｙＴａｇの機能性を過剰量のＶｅｎｕｓ-ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとのコンジュゲーションによって再度検証したところ、２つのタンパク質成分のおおよその結合分子量（６１ｋＤａ）で、沸騰および還元条件下での分解に対して抵抗性であるシフトしたバンドの形成が示された（図１Ｃ、図６Ａ～図６Ｂ）。
以前の研究により、アスパラギン酸からアラニンへの変異を含有するＳｐｙＴａｇバリアント（ＳｐｙＴａｇ-ＤＡ）の反応が、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとの共有結合形成を喪失させる一方で、非共有結合性複合体の形成は、２００ｎＭのＫｄで依然として可能であることが示されている（Zakeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012, 109 (12), E690-7）。共有結合形成に関する陰性対照として役立てるために、ハーセプチン-ＳＴＤＡおよび９．２６-ＳＴＤＡ標的化リガンドも作製した（図１Ｂ～図１Ｃ）。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体のクローニング、発現および検出
８４アミノ酸の切断型ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Li et al., J. Mol. Biol. 2014, 426 (2), 309-317）を、ＣＤ３ζとタンデムに並んで４-１ＢＢまたはＣＤ２８共刺激ドメインのいずれかを含有する、以前に検証されたレンチウイルス構築物（Lanitis et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 2012, 20 (3), 633-643 ; Song et al., Human gene therapy 2013, 24 (3), 295-305）中にクローニングして、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζ免疫受容体を作製した。細胞内シグナル伝達ドメインを欠くＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体も作製し、陰性対照として用いた（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒΔζ；図２Ａ）。構築物はすべて、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドの上流にｅＧＦＰを含有し、ＧＦＰおよび受容体の共発現が可能であり、初代ヒトＴ細胞形質導入の代替マーカーとしてＧＦＰを使用することが可能であった。
ＳｐｙＴａｇが、細胞表面に発現されるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体に共有結合的に連結し得るか否かを明らかにするために、不死化がん細胞株ＳＫＯＶ３に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζ構築物を発現するように形質導入を行い（図７Ａ）、続いて可溶性ＲＦＰ-ＳｐｙＴａｇタンパク質とインキュベートした。ＣＤ３ζに対するウエスタンブロット染色を介して評価したところ、インキュベーションにより、還元条件下での分解に抵抗性のあるシフトしたバンドの形成がもたらされ、２つのタンパク質間の共有結合形成が確認された（図２Ｂ）。５０ｋＤａ～３７ｋＤａの間の残りのシフトしていないバンドは、全細胞溶解物がゲル上にローディングしたことから、細胞内受容体に相当する可能性が高い。ＲＦＰ-ＳｐｙＴａｇ-ＤＡタンパク質とのインキュベーションにより、ＳｐｙＴａｇにおける重要なアスパラギン酸残基のアラニンへの変異が、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとの共有結合を形成する能力を喪失させることが示された（図２Ｂ）。次に、初代ヒトＴ細胞に形質導入を行ってＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体を発現させ、様々な濃度のハーセプチン-ＳＴとインキュベートしたところ、ＡＰＣ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（図２Ｃ）による染色を介して検出されるように、受容体の用量依存的ローディング（「武装化」）がもたらされた。加えて、ＳｐｙＴａｇとコンジュゲートされた標的化リガンド（９．２６-ＳＴ）とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体との間の共有結合形成は、特に低濃度で、最大の標的化リガンド武装化を達成するために必要であった（図２Ｄ）。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性
初代ヒトＴ細胞上のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体のＳｐｙＴａｇとの会合が特異的活性化を誘導するか否かを明らかにするために、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を様々な量の固定化ハーセプチン-ＳＴの存在下でインキュベートした。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ΔζＴ細胞とは異なり、固定化ハーセプチン-ＳＴの存在下でＩＦＮγγを用量依存的に分泌し（図２Ｅ）、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞の方がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞よりも免疫学的感受性が高かった（Ｐ＜．００１）。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体は、標的化リガンドによって共有結合性に武装され、それが分解されるまで受容体に抗原特異性を恒久的に固定することができる最初の普遍的免疫受容体であるため、本発明者らは、過剰量の標的化リガンドの非存在下で、前武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞の溶解能を評価した。十分な量の標的化リガンドが、細胞表面の受容体上に共有結合性に武装化され、抗原認識に際してがん細胞のＴ細胞溶解を誘発し得るか否かを明らかにしようとした（図３Ａ、左）。ハーセプチン-ＳＴにより武装化されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζはＨｅｒ２（＋）ＳＫＯＶ３腫瘍細胞を溶解したが、一方、ハーセプチン-ＳＴにより武装化した非形質導入およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ΔζＴ細胞は、２０時間の共培養後にわずかな溶解活性しか示さなかった（図３Ｂ）。溶解は用量依存的な様式で起こり、ハーセプチン-ＳＴ武装化濃度の増加は溶解能力の増加と相関し（図３Ｂ）、以前に観察された用量依存的な受容体ローディング（図２Ｃ）と一致した。生細胞イメージングを使用した溶解機能の観察でこれらの結果が確認され、武装化用量依存的なＴ細胞クラスター形成も示された（ビデオ）。１０００ｎＭのハーセプチン-ＳＴにより武装化されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ΔζＴ細胞では、腫瘍細胞溶解およびＴ細胞クラスター形成は観察されず、これは溶解およびクラスター形成が活性化依存性であることを示す。
さらに、用量依存的な武装化は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞が、標的抗原を様々なレベルで発現する腫瘍細胞を認識する能力にも影響を及ぼした。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞は、高レベルの抗原を発現する腫瘍細胞を武装化濃度依存的な様式で溶解することができたが、より低レベルのＨｅｒ２を発現する細胞株に対しては機能性を失った（図８Ａ～８Ｂ）。対照的に、高度に武装化されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞は、様々なＨｅｒ２発現を有する腫瘍細胞を標的とすることができ、その溶解能力はＨｅｒ２発現のレベルと相関した。武装化濃度が低下すると、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞は、より低レベルのＨｅｒ２を発現する腫瘍細胞株に対する有効性を失った（図８Ａ～８Ｂ）。
２８ζまたはＢＢζ細胞内シグナル伝達ドメインのいずれかを含有するＨｅｒ２標的化キメラ抗原受容体Ｔ細胞と比較した場合、ハーセプチン-ＳＴによって最大に武装化されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞は、特に低いＥ：Ｔ比では、ＣＡＲよりも効果が低いことが見出された（図９）。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζは、ＥＧＦＲを標的とする抗体セツキシマブ-ＳＴまたはＣＤ２０を標的とする抗体リツキシマブ-ＳＴにより武装化された場合に、それぞれＥＧＦＲ陽性またはＣＤ２０陽性腫瘍細胞を溶解することもできた（図３Ｃ）。既製の臨床グレード抗体に使用される部位特異的標識法は、Ｈｕｉらによって以前に示され、さらに重鎖バンドコンジュゲーション後（図１Ｂ）のほぼ完全なシフトによって示されるように、両方のＩｇＧ重鎖へのＳｐｙＴａｇペプチドの付加をもたらした（Hui et al., Bioconjugate Chemistry 2015, 26 (8), 1456-1460）。この多価標識法は、２つのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体が同じ抗体上の２つのＳｐｙＴａｇペプチドによって架橋された場合、または２つのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞が同じ抗体上のＳｐｙＴａｇペプチドによって互いに係留された場合に、抗原非依存的な活性化を引き起こす可能性がある。しかし、２つのＳｐｙＴａｇペプチドにより全く同様にコンジュゲートされた非標的化対照抗体により武装化されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞は有意な溶解を媒介せず、このことから標的化リガンドの二価ＳｐｙＴａｇ標識は、武装化に際してＴ細胞の認識し得るほどの抗原非依存性活性化を引き起こさないことが示された（図３Ｃ）。二価標識抗体は、固定化された場合にＴ細胞活性化を誘導することができた。腫瘍抗原Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、またはＥｐＣＡＭを標的とする設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を含有するＳｐｙＴａｇの共有結合性ローディングはまた、抗原発現腫瘍細胞の特異的溶解ももたらし、このことはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体を保有するＴ細胞を用いて複数の種類の標的化リガンドを使用し得る可能性を示す（図３Ｄ）。
抗原認識およびＣＡＲ Ｔ細胞の活性化により、ＣＡＲは細胞内に取り込まれ、細胞表面で検出可能な濃度が低下する（Walker et al., Molecular Therapy 2017, 25 (9), 2189-2201）。抗原刺激の状況下でのＴ細胞表面上の武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体喪失の速度を評価するために、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を武装化し、洗浄して、抗原発現腫瘍細胞の存在下または非存在下で共培養した。抗原発現腫瘍細胞の非存在下では、中程度の武装化受容体喪失が生じ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞と比較して２４時間以内により急速な喪失をきたした。ＣＡＲｓ５２と同様に、抗原発現がん細胞で刺激した場合に、武装化受容体発現は同じ時点でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞のいずれにも検出されなかった（図３Ｅ）。しかし、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞はいずれも再武装化が可能であり、Ｔ細胞によるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体の発現は維持され、新たに導入された標的化リガンドと結合し得ることが示された（図３Ｅ）。非活性化細胞における細胞表面からの武装化受容体喪失の速度を測定するために、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を静止状態におき、続いてハーセプチン-ＳＴにより武装化し、以後は２４時間毎にフローサイトメトリーを介して検出可能な武装化受容体について分析した。その結果からは、武装化受容体レベルが時間と共に徐々に減衰し、武装化後約９６時間で完全喪失が起こることが示される（図１０）。
武装化されているが非武装化されてはいないＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞が、抗原発現腫瘍細胞を標的化して死滅させることができるという所見に基づき、非武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞エフェクター機能は、抗原発現腫瘍細胞との共培養下で、非武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞への標的化リガンドの後の添加によって一時的に誘発され得るとの仮説を立てた（図３Ａ、右）。「オンデマンド」がん細胞溶解を試験するために、非武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞を、標的化リガンドの非存在下でＳＫＯＶ３（Ｈｅｒ２＋／ＣＤ２０-）腫瘍細胞と４時間インキュベートした。４時間後にハーセプチン-ＳＴを添加したところ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞（図３Ｆ）のいずれかを含有する培養液中で急速な腫瘍細胞溶解が誘導された。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞と比較して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞はハーセプチン-ＳＴの添加により迅速に反応し、より低い標的化リガンド濃度で標的細胞を溶解し、より高レベルの最大溶解に到達した。種々の用量のハーセプチン-ＳＴでＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞でも同等なレベルの最大溶解が達成されたが、初期溶解動態は用量依存的に生じた（図３Ｆ）。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞は、より低いハーセプチン-ＳＴ用量でより低い最大溶解が起こるという、より調節可能な反応を示した。
溶解機能に対する共有結合形成の影響の試験
受容体武装化およびＴ細胞活性化に対する共有結合形成の影響を試験するために、ハーセプチン-ＳＴとハーセプチン-ＳＴＤＡ、または抗Ｈｅｒ２ ＤＡＲＰｉｎｓ９．２６-ＳＴと９．２６-ＳＴＤＡとをそれぞれ比較する「武装化」および「オンデマンド」溶解実験の両方を実施した（図３Ｆおよび３Ｇ）。９．２６-ＳＴにより武装化されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞はＨｅｒ２＋ ＳＫＯＶ３腫瘍細胞を溶解したが、９．２６-ＳＴＤＡにより武装化されたものは溶解の減少または非溶解を示した（図３Ｇ）。この結果は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体の最大のローディングのためには、特に低い武装化濃度では、共有結合形成が必要であることを示す以前のデータと一致する（図２Ｄ）。共有結合形成も「オンデマンド」溶解に影響を及ぼした。ハーセプチン-ＳＴＤＡの添加は、同じ用量で、ハーセプチン-ＳＴと比較して、より遅い溶解速度およびより低い最大溶解をもたらした（図３Ｆ）。すべての場合において、過剰量のハーセプチン-ＳＴＤＡで武装化または共培養した場合に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞と比較してエフェクター機能の増加を示した（図３Ｆおよび３Ｇ）。
同時受容体武装化および二重抗原標的化
共有結合性の普遍的免疫受容体ローディングの１つの利点は、異なる特異性を有する複数の標的化リガンドをＴ細胞表面の受容体に固定して、複数の抗原を同時に標的化する能力を有する単一細胞生成物を作製し得ることである（図４Ａ）。このことを検討するために、フローサイトメトリーによる検出のための特有のタグを含有するＨｅｒ２標的化（９．２６-ＳＴ）およびＥＧＦＲ標的化（Ｅ０ｏ１-ＳＴ）ＤＡＲＰｉｎを、単独または組合せで、１：１のモル比でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞にローディングした（図４Ｂ）。タグ染色およびフローサイトメトリー分析により、単一のＤＡＲＰｉｎがローディングされたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞が単一のタグに関してのみ染色されることが明らかになり、一方、両方のＤＡＲＰｉｎとコインキュベートされたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞は各々のタグに対して同等の染色を示し、それ故に同等の武装化を示した（図４Ｂ）。これらの二重武装化Ｔ細胞は、Ｈｅｒ２＋／ＥＧＦＲ-およびＥＧＦＲ＋／Ｈｅｒ２-Ｒａｍｏｓ細胞（図７Ｂ）の両方を溶解することができたが、単一のＤＡＲＰｉｎ標的化リガンドで武装されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞は、規定の標的抗原を発現する細胞のみを溶解することができた。二重武装化Ｔ細胞によって媒介される特異的細胞溶解のレベルは、その単一武装化対応物に類似しており、このことはこの単一細胞生成物が複数の抗原を同時に標的とし得ることを示す（図４Ｃ）。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ΔζＴ細胞は、武装化作用物質にかかわらず不活性のままであった（図４Ｃ）。
二重抗原発現腫瘍株に対する組合せ武装化増強ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞機能の能力を評価するために、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞を低用量の９．２６-ＳＴまたはＥ０１-ＳＴのいずれか、または両方の組合せにより武装化した。Ｈｅｒ２＋／ＥＧＦＲ＋ ＳＫＯＶ３腫瘍株と共培養すると（図８Ｃ）、二重武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞は、単一武装化のみの細胞に比して、腫瘍溶解の増加を達成した（図８Ｄ）。
異種移植腫瘍モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
本発明者らは次に、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）-ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスを使用する異種移植腫瘍モデルにおいて、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞システムの有効性を試験した。本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏ結果により、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-２８ζＴ細胞はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞よりも強力なエフェクター機能を示すことが示されたことから、本発明者らは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζ受容体を使用して前臨床モデルを先に進めることを選択した。
本発明者らは、卵巣がんの腹腔内モデルを使用して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を試験した。Ｈｅｒ２＋ ＳＫＯＶ３卵巣癌腫瘍細胞を腹腔（腹腔内）に注射し、７日間かけて定着させた。第７日に、ハーセプチン-ＳＴにより武装化されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞を、１０００ｎＭの濃度でマウスに腹腔内注射した。１つの群には武装化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ΔζＴ細胞を投与して、抗原依存的Ｔ細胞刺激に依存しないＴ細胞注入または標的化リガンド投与によって引き起こされる腫瘍減少に関する対照とした。第８日から開始して、追加の標的化リガンドを投与し、その後は投薬期間中に３日毎に連続投与した（図５Ａ；オレンジ色のボックス）。
用量２５μｇのハーセプチン-ＳＴと同時投与されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ΔζＴ細胞による処置はビヒクル対照と類似しており、このことはこの腫瘍が標的化リガンドのみまたはシグナル伝達欠損Ｔ細胞の注入に対して感受性ではないことを示す（図５Ａ～５Ｂ）。用量２５μｇのハーセプチン-ＳＴと同時投与されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞は、マウスの４分の３で検出可能な腫瘍を除去することができ、他のすべての処置群と比較して生存期間を延長した（図５Ａ～５Ｃ）。腫瘍再発は、標的化リガンド処置の休止後の第３０日にマウス１匹で認められた。用量１２．５μｇのハーセプチン-ＳＴと同時投与されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞は、一部のマウスで腫瘍量の一過性減少を示したが、処置の過程で有効性を維持せず、このことは腫瘍排除を推進するためには十分なレベルの標的化リガンドが提供されなければならないことを示す。末梢血Ｔ細胞レベルのピークは全群でＴ細胞注入後第７日に検出され、シグナル伝達を行えるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞数はＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-Δζ群のそれを上回った（図５Ｄ）。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞群におけるヒトＴ細胞数は、２つの標的化リガンド用量群の間で同程度であり、このことは標的化リガンドの利用能が有効な治療にとっての制約の１つであることを示唆する。さらに、処置群では毒性による体重減少は見られなかったが、対照群のマウスでは腫瘍進行中の腹水形成に起因する体重増加が見られた（図１１）。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムの全身送達を評価するために、急速に増殖する高悪性度の皮下Ｈｅｒ２＋ ＳＫＯＶ３腫瘍モデルにおいて前臨床試験を行った。その結果、ハーセプチン-ＳＴとの同時投与で腹腔内注射されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ-ＢＢζＴ細胞のみと比較して、腫瘍接種後２２日まで腫瘍体積の減少を誘導することが示された（図１２）。
普遍的免疫受容体は、標準的なＣＡＲ-Ｔ細胞療法を改善し、治療デザインの限界に対処することを目的とした新たな技術である（Minutolo et al., Frontiers in Oncology 2019, 9, 176）。抗原を発現する腫瘍細胞に対してＴ細胞を再方向付けするための標的化リガンドの使用を介して、ＵＩＲは、Ｔ細胞エフェクター機能の用量依存的な制御を可能にすると同時に、複数の腫瘍抗原を標的とするために単一受容体の単一細胞生成物の使用も可能にする。現在のＵＩＲプラットフォームは、その細胞外アダプタータンパク質と標的化リガンドタグとの間の非共有結合性相互作用に依拠しており、注入前に抗原特異性を共有結合性にローディングすることができない。
今回、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇ化学を介した免疫受容体への標的化リガンドの翻訳後共有結合を可能にし、複数の腫瘍関連抗原に対するＴ細胞の再方向付けを媒介する、新規な普遍的免疫受容体プラットフォームを開発した。細胞外ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインとＣＤ２８-ＣＤ３ζまたは４-１ＢＢ-ＣＤ３ζ細胞内ドメインとを含有する２つの機能的ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体構築物を作製し、初代ヒトＴ細胞におけるそれらの発現を示した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体を発現するＴ細胞を標的腫瘍抗原に対して再方向付けするために、本発明者らは、標的化リガンド作製の２つの方法を使用した。Ｈｕｉらによって開発されたＬＡＳＩＣアダプタータンパク質法を使用して、本発明者らは、既製の臨床グレードの抗体をＳｐｙＴａｇ部分で部位特異的に標識することができた（Hui et al., Bioconjugate Chemistry 2015, 26 (8), 1456-1460）。この方法は、抗体単剤療法では利益が得られないか、または抗体単剤療法に抵抗性となる患者において、その抵抗性が抗原喪失に起因しない場合に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞および臨床グレード抗体という２つの有利な可能性のある組合せを可能にする（Rezvani et al., Best Practice & Research Clinical Haematology 2011, 24 (2), 203-216; Karapetis et al., The New England Journal of Medicine 2008, 359 (17), 1757-1765）。一価標的化リガンドを、ＳｐｙＴａｇの種々の設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）への遺伝子融合を介してさらに作製した。これらの標的化リガンドの使用を通じて、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体がｉｎ ｖｉｔｒｏで複数の腫瘍抗原を標的とする能力が示された。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞をＳｐｙＴａｇ標的化リガンドと共に移入することにより、高悪性度の皮下腫瘍の増殖の制御が導かれ、免疫不全マウス異種移植モデルにおいて定着した腹腔内疾患が排除される。
特に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇとの間の共有結合の形成は、最適なＴ細胞エフェクター機能にとって重要であった。ＳｐｙＴａｇ-ＤＡ変異体とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体の間に形成された一過性結合（Ｋｄ＝２００ｎＭ）は受容体ローディングの実質的な損失を招き（図２Ｄ）、これは続いて溶解能の減少をもたらした（図３Ｇ）。標的化リガンドを培養液に直接添加した場合には、共有結合を形成できないことにより、低濃度でのエフェクター機能が大幅に低下するか、または完全に喪失した（図３Ｆ）。このことは、標的化リガンドと受容体との間の共有結合形成が、標的化リガンド濃度が低い場合に重要な可能性があることを示す。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体システムは、ＣＡＲ-Ｔ細胞療法が現在直面しているいくつかの限界に対処し得ることが、本明細書において開示される。これらの限界のうちの１つは、注入後にＣＡＲ Ｔ細胞を制御できないことである。標的抗原に結合すると、ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化および増殖が急速に起こる可能性があり、ＣＲＳ、または正常組織のオンターゲット・オフ腫瘍溶解といった問題を招く可能性がある（Grupp et al., The New England Journal of Medicine 2013, 368 (16), 1509-1518 ; Morgan et al., Molecular Therapy 2010, 18 (4), 843-851; Lamers et al., Molecular Therapy 2013, 21 (4), 904-912）。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞のエフェクター機能は、腫瘍曝露前に受容体に共有結合性にローディングされるか、または注入後に注入される標的化リガンドの量に基づいて調節可能であること、および標的化リガンドを有しないＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞は腫瘍細胞を標的とすることができないことが示された。本発明者らの腹腔内マウスモデルにおいて、至適用量以下の標的化リガンドは腫瘍の増殖を招くことが認められ、このことは十分なレベルの標的化リガンドの連続投与がＴ細胞機能の延長に必要であることを示す。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを用いてＴ細胞エフェクター機能を減弱する手段として、標的化リガンドの用量を漸増、減少、または中止し得ることにより、オンターゲット・オフ腫瘍毒性の軽減が可能になる可能性がある。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞は、抗体、ならびにＤＡＲＰｉｎの使用と共に機能し、さらにｓｃＦｖｓ、Ｆａｂ、および小分子コンジュゲートの使用にも拡大される可能性がある。これにより、短い半減期を有する標的化リガンドがより迅速にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞エフェクター機能の停止を招くことになるため、もう一層の制御が可能になる可能性がある。ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ-Ｔ細胞療法を受けている患者では、ＣＤ１９＋正常Ｂ細胞が継続的に除去されるため、Ｂ細胞形成不全が長期間持続する。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞は標的化リガンドの非存在下では非反応性であり、それ故に標的化リガンドの中断を介して、腫瘍排除後の正常なＢ細胞集団の再建を可能にする可能性がある。
抗原陰性腫瘍集団の増殖は、単一抗原を標的とするＴ細胞療法が直面するもう一つの問題である。これは、不均一な腫瘍抗原発現、腫瘍抗原のダウンレギュレーション、トロゴサイトーシス、またはスプライスバリアントの発現を含む、数多くの理由で起こり得る（Bagashev et al., The Importance of CD19 Exon 2 for Surface Localization: Closing the Ig-like Loop. 2015; Sotillo et al., Cancer Discovery 2015, 5 (12), 1282-1295; Jacoby et al., Nature Communications 2016, 7 (1), ncomms12320 ; Gardner et al., Blood 2016, 127 (20), 2406-2410; Hamieh et al., Nature 2019, 1-5. ; Ruella et al. Nature Medicine 2018, 24 (10), 1499-1503）。抗原喪失を介した腫瘍回避を克服するために、他のグループは、単一のＴ細胞生成物５７において複数のＣＡＲを発現させること、複数のエピトープ結合ドメインを有するＣＡＲを発現させること（Grada et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids 2013, 2 (7), e105 ; Hegde et al., J Clin Invest 2016, 126 (8), 3036-3052 ; Schneider et al., J Immunother Cancer 2017, 5 (1), 42）、または２つの異なるＣＡＲ集団を含む組合せＴ細胞生成物を作製すること（Ruella et al., J Clin Invest 2016, 126 (10), 3814-3826）を提唱している。これらのアプローチは抗原喪失の軽減に役立つ可能性があるが、安全性および毒性の懸念に対処しておらず、標的化が可能な抗原の総数には依然として制限がある。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ Ｔ細胞は、広範囲にわたる腫瘍抗原を溶解することができ、今回、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、およびＣＤ２０について原理証明が行われている。複数の標的化リガンドを有するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体Ｔ細胞を同時に武装化し得ることにより、複数の腫瘍抗原を同時に標的化することができる単一のベクターおよび単一細胞生成物の作製が可能になることがさらに示された。Ｔ細胞による新しいＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ受容体の継続的発現と組み合わされた武装化受容体の代謝回転は、標的化リガンドによる再武装を可能にし（図３Ｅ）、以前にビオチン結合免疫受容体で示されているような（Urbanska et al., Cancer Research 2012, 72 (7), 1844-1852）、逐次的な抗原標的化も可能にする。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体システムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で有望であることが示されているが、その使用拡大に当たっての潜在的な限界を認識することが重要である。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇシステムはそれ自体、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢの第２の免疫グロブリン様コラーゲン接着ドメイン（ＣｎａＢ２）に由来する。これらのタンパク質が細菌起源であることは、それらに免疫原性がある可能性があり、それ故に患者の免疫系によって抑制される可能性があることを意味する。同様の問題は、マウス由来のｓｃＦｖドメインを有するＣＡＲで、それに対して患者がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を発現することで難題となっている（Beatty et al., Cancer Immunology Research 2014, 2 (2), 112-120）。しかし、以前の研究で、免疫能のあるマウスにおけるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫原性が試験されており、今回使用したものと同様の切断型のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が有意に低い抗体レベルを誘導したことが報告されている（Liu et al., Sci Rep 2014, 4, 7266）。
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体、およびＵＩＲ全般は、治療研究のための刺激的な新しい手段を提供する。しかし、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の分野とほぼ同様に、最適な臨床移行は、ＵＩＲに関連する特有の課題に直面することにかかっている。例えば、複数の抗原を単一の受容体で標的化する能力は、腫瘍関連抗原およびそれらの抗原に対する臨床グレードの標的化リガンドの発見、検証、および安全性プロファイリングに依拠する。最適な標的化リガンドのサイズおよび受容体ヒンジドメインの間隔は、標的化抗原エピトープに基づいて異なり得ることから、いくつかの抗原を標的化するためには、最適な普遍的免疫受容体およびそれらの標的化リガンドのペアを設計する際の課題もあり得る（Rodgers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016, 113 (4); Ma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016, 113 (4), E450-E458）。さらに、ＵＩＲ Ｔ細胞の臨床的生産は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法と同様に、しばしば患者のＴ細胞を出発点とする細胞材料に依存する。したがって、ＵＩＲ療法は、既存のＴ細胞の消耗および老化、注入後の増殖および持続不良、固形腫瘍へのＴ細胞浸潤の欠如という共通の問題に対処する必要もあり（Maude et al., The New England Journal of Medicine 2014, 371 (16), 1507-1517; Fraietta et al., Nature Medicine 2018, 24 (5), 563-571; Lanitis et al., Ann Oncol 2017; Mueller et al., Clinical Cancer Research 2018, clincanres.0758.2018)、それらが、それ以外であれば有効であるＣＡＲ-Ｔ細胞療法を、特定の適応症において制限する可能性がある。
本明細書に記載されるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ免疫受容体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの数々の腫瘍抗原に対するＴ細胞のその後の再方向付けのための標的化リガンドの翻訳後共有結合性ローディングを可能にする、初の普遍的免疫受容体である。このプラットフォーム技術は、複数の抗原を同時に標的とする単一ベクター、単一受容体のための方法を提供する一方で、持続性Ｔ細胞応答を経時的に生じさせ、調節し、かつ多様化するための継続的な再武装化も可能にする。
本明細書に引用される各々のおよびすべての特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は具体的な実施形態を参照して開示されているが、本発明の他の実施形態および変形物も、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのそのような実施形態および同等の変形物を含むと解釈されることを意図している。
実施形態の列挙
以下の列挙された実施形態が提供されるが、その番号付けは重要性のレベルを指定するものと解釈されるべきではない。
実施形態１は、哺乳動物において腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、本方法は、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を哺乳動物に投与するステップ、（ｂ）相互アダプター分子に連結された第１の作用物質を哺乳動物に投与するステップであって、第１の作用物質は腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合する、ステップ、および（ｃ）相互アダプター分子に連結された第２の作用物質を哺乳動物に投与するステップであって、第２の抗原は腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原である、ステップを含む方法を提供する。
実施形態２は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を哺乳動物に投与するステップ、（ｂ）相互アダプター分子に連結された第１の作用物質の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、第１の作用物質はがんによって発現される第１の抗原に特異的に結合する、ステップ、および（ｃ）相互アダプター分子に連結された第２の作用物質の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、第２の作用物質はがんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原である、ステップを含む、方法を提供する。
実施形態３は、細胞外ドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む、実施形態１または２の方法を提供する。
実施形態４は、第１および／または第２の作用物質が、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている、実施形態１～３のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態５は、第１および／または第２の作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、実施形態１～４のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態６は、第１および／または第２の作用物質が抗体であり、ヒトＩｇＧである、実施形態１～５のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態７は、相互アダプター分子、ＳｐｙＴａｇ、またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して第１および／または第２の作用物質に連結されている、実施形態１～６のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態８は、細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、実施形態１～７のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態９は、細胞が自己細胞である、実施形態１～８のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態１０は、免疫受容体が、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む、実施形態１～９のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態１１は、共刺激分子が、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである、実施形態１０の方法を提供する。
実施形態１２は、哺乳動物への投与の前に、細胞を第１および／または第２の作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前武装化細胞を哺乳動物に投与する、実施形態１～１１のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態１３は、第１および／または第２の作用物質を哺乳動物に投与する前に、細胞を哺乳動物に投与する、実施形態１～１１のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態１４は、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせる方法であって、（ａ）細胞のある量を、相互アダプター分子に連結された作用物質のある量と接触させるステップであって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、細胞外ドメインはアダプター分子を含み、作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、作用物質の量および／または細胞の量は、腫瘍に対してそのレベルの溶解活性を生じさせるように選択される、ステップを含む方法を提供する。
実施形態１５は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞のある量を哺乳動物に投与するステップ、および（ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質のある量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の量および／または作用物質の量は、がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、ステップを含む方法を提供する。
実施形態１６は、細胞の量に対して作用物質の量を増加させることが溶解活性のレベルを上昇させ、細胞の量に対して作用物質の量を減少させることが溶解活性のレベルを低下させる、実施形態１４～１５のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態１７は、細胞外ドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む、実施形態１４～１６のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態１８は、作用物質が、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている、実施形態１４～１７のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態１９は、作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、実施形態１４～１８のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態２０は、作用物質が抗体であり、ヒトＩｇＧである、実施形態１４～１９のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態２１は、相互アダプター分子、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている、実施形態１４～２０のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態２２は、細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、実施形態１４～２１のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態２３は、細胞が自己細胞である、実施形態１４～２２のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態２４は、免疫受容体が、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む、実施形態１４～２３のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態２５は、共刺激分子が、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである、実施形態１４～２４のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態２６は、哺乳動物への投与の前に、細胞を作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前武装化細胞を哺乳動物に投与する、実施形態１５～２５のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態２７は、作用物質を哺乳動物に投与する前に、細胞を哺乳動物に投与する、実施形態１５～２６のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態２８は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を哺乳動物に投与するステップ、および（ｂ）その後に、相互アダプター分子に連結された作用物質を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含む方法を提供する。
実施形態２９は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞の有効量を哺乳動物に投与するステップ、および（ｂ）その後に、相互アダプター分子に連結された作用物質の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含む方法を提供する。
実施形態３０は、細胞外ドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む、実施形態２８または２９のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態３１は、作用物質が、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている、実施形態２８～３０のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態３２は、作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、実施形態２８～３１のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態３３は、作用物質が抗体であり、ヒトＩｇＧである、実施形態２８～３２のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態３４は、相互アダプター分子、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている、実施形態２８～３３のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態３５は、細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、実施形態２８～３４のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態３６は、細胞が自己細胞である、実施形態２８～３５のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態３７は、免疫受容体が、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む、実施形態２８～３６のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態３８は、共刺激分子が、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである、実施形態２８～３７のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態３９は、細胞表面での普遍的免疫受容体の代謝回転を定量する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を、相互アダプター分子に連結された作用物質と接触させ、それによって武装化受容体を生成させるステップ、および（ｂ）基準量に対する武装化受容体の量を決定するステップを含む方法を提供する。
実施形態４０は、基準量が、前の時点での武装化受容体の量である、実施形態３９の方法を提供する。
実施形態４１は、武装化受容体の量が、作用物質を標識して、標識された作用物質を検出することによって決定される、実施形態４０の方法を提供する。
実施形態４２は、作用物質を、ｍｙｃ-タグ、ＦＬＡＧ-タグ、Ｈｉｓ-タグ、ＨＡ-タグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、フルオロフォア（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ））、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヒスチジン、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、放射性同位体、および、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７，１０-四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７-トリアザシクロノナン-１，４，７-三酢酸（ＮＯＴＡ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を含む放射性同位体標識のために使用される任意の種類の化合物を含む標識分子と連結または接触させることによって標識する、実施形態４１の方法を提供する、
実施形態４３は、（ｃ）細胞および作用物質を腫瘍細胞と接触させるステップをさらに含む、実施形態３９～４２のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態４４は、細胞外ドメインがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む、実施形態３９～４３のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態４５は、作用物質がＳｐｙＴａｇに連結されている、実施形態３９～４４のいずれかの方法を提供する。
実施形態４６は、作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、実施形態３９～４５のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態４７は、作用物質が抗体であり、ヒトＩｇＧである、実施形態３９～４６のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態４８は、細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、実施形態３９～４７のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態４９は、免疫受容体が、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む、実施形態３９～４８のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態５０は、共刺激分子が、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである、実施形態３９～４９のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態５１は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を哺乳動物に投与するステップ、および（ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質の有効量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含み、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、方法を提供する。
実施形態５２は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞のある量を哺乳動物に投与するステップ、（ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質のある量を哺乳動物に投与するステップであって、作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合する、ステップを含み、がんは、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、方法を提供する。
実施形態５３は、基準レベルが、健常組織での抗原の発現レベルである、実施形態５１または５２のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態５４は、細胞外ドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む、実施形態５１～５３のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態５５は、作用物質が、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている、実施形態５１～５４のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態５６は、作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、実施形態５１～５５のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態５７は、作用物質が抗体であり、ヒトＩｇＧである、実施形態５１～５６のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態５８は、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して作用物質に連結されている、実施形態５１～５７のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態５９は、細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、実施形態５１～５８のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態６０は、細胞が自己細胞である、実施形態５１～５９のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態６１は、哺乳動物への投与の前に、細胞を作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前武装化細胞を哺乳動物に投与する、実施形態５１～６０のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態６２は、作用物質を哺乳動物に投与する前に、細胞を哺乳動物に投与する、実施形態５１～６１のいずれか１つの方法を提供する。
実施形態６３は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するための遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質であって、腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質は腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質は腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原であり、免疫受容体、第１の作用物質および第２の作用物質は哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質を提供する。
実施形態６４は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質であって、がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質はがんによって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質はがんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原である、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質を提供する。
実施形態６５は、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせるのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を作用物質のある量と接触させ、細胞の量に対する作用物質の量は、腫瘍に対してそのレベルの溶解活性を生じさせるように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
実施形態６６は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量および作用物質のある量を哺乳動物に投与し、細胞の量および／または作用物質の量は、がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
実施形態６７は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
実施形態６８は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合すし、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
実施形態６９は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、かつ作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
実施形態７０は、がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、かつ作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質を提供する。
実施形態７１は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激することにおける、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用であって、腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質は腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質は腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原であり、免疫受容体、第１の作用物質および第２の作用物質は哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用を提供する。
実施形態７２は、がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用であって、がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第１の作用物質はがんによって発現される第１の抗原に特異的に結合し、第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ第２の作用物質はがんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、第１の抗原と第２の抗原とは異なる抗原である、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用を提供する。
実施形態７３は、腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせることにおける、遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を作用物質のある量と接触させ、細胞の量に対する作用物質の量は、腫瘍に対してそのレベルの溶解活性を生じさせるように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。
実施形態７４は、がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量および作用物質のある量を哺乳動物に投与し、細胞の量および／または作用物質の量は、がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。
実施形態７５は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激することにおける遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。
実施形態７６は、がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質はがんによって発現される抗原に特異的に結合し、細胞のある量を哺乳動物に投与し、その後に作用物質のある量を哺乳動物に投与する、遺伝子改変細胞の使用を提供する。
実施形態７７は、腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激することにおける遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、かつ作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。
実施形態７８は、がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ作用物質は腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、細胞の有効量を哺乳動物に投与し、かつ作用物質の有効量を哺乳動物に投与し、腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質の使用を提供する。

Claims (78)

  1. 哺乳動物において腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を刺激する方法であって、前記腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、前記方法は、
    （ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を前記哺乳動物に投与するステップ、
    （ｂ）相互アダプター分子に連結された第１の作用物質を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記第１の作用物質は前記腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合する、ステップ、および
    （ｃ）相互アダプター分子に連結された第２の作用物質を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記第２の作用物質は前記腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、前記第１の抗原と前記第２の抗原とは異なる抗原である、ステップ
    を含む、方法。
  2. がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、前記がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、前記方法は、
    （ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を前記哺乳動物に投与するステップ、
    （ｂ）相互アダプター分子に連結された第１の作用物質の有効量を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記第１の作用物質は前記がんによって発現される第１の抗原に特異的に結合する、ステップ、および
    （ｃ）相互アダプター分子に連結された第２の作用物質の有効量を前記哺乳動物に投与するステップであって、第２の作用物質は前記がんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、前記第１の抗原と前記第２の抗原とは異なる抗原である、ステップ
    を含む、方法。
  3. 前記細胞外ドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記第１および／または第２の作用物質が、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第１および／または第２の作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記第１および／または第２の作用物質が、抗体であり、ヒトＩｇＧである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記相互アダプター分子、ＳｐｙＴａｇ、またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して前記第１および／または第２の作用物質に連結されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記細胞が自己細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記免疫受容体が、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記共刺激分子が、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記哺乳動物への投与の前に、前記細胞を前記第１および／または第２の作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前記前武装化細胞を前記哺乳動物に投与する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記第１および／または第２の作用物質を前記哺乳動物に投与する前に、前記細胞を前記哺乳動物に投与する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせる方法であって、
    （ａ）細胞のある量を、相互アダプター分子に連結された作用物質のある量と接触させるステップであって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記細胞外ドメインはアダプター分子を含み、前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、前記作用物質の量および／または前記細胞の量は、前記腫瘍に対して前記レベルの溶解活性を生じさせるように選択される、ステップ
    を含む、方法。
  15. がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、
    （ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞のある量を前記哺乳動物に投与するステップ、および
    （ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質のある量を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記作用物質は前記がんによって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞の量および／または前記作用物質の量は、前記がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、ステップ
    を含む、方法。
  16. 前記細胞の量に対して作用物質の量を増加させることが前記溶解活性のレベルを上昇させ、前記細胞の量に対して作用物質の量を減少させることが前記溶解活性のレベルを低下させる、請求項１４～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記細胞外ドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記作用物質が、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記作用物質が抗体であり、ヒトＩｇＧである、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記相互アダプター分子、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して前記作用物質に連結されている、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記細胞が自己細胞である、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記免疫受容体が、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記共刺激分子が、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記哺乳動物への投与の前に、前記細胞を前記作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前記前武装化細胞を前記哺乳動物に投与する、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記作用物質を前記哺乳動物に投与する前に、前記細胞を前記哺乳動物に投与する、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激する方法であって、
    （ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を前記哺乳動物に投与するステップ、および
    （ｂ）その後に、相互アダプター分子に連結された作用物質を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合する、ステップ
    を含む、方法。
  29. がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、
    （ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞の有効量を前記哺乳動物に投与するステップ、および
    （ｂ）その後に、相互アダプター分子に連結された作用物質の有効量を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記作用物質は前記がんによって発現される抗原に特異的に結合する、ステップ
    を含む、方法。
  30. 前記細胞外ドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 前記作用物質が、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記作用物質が抗体であり、ヒトＩｇＧである、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記相互アダプター分子、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して前記作用物質に連結されている、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記細胞が自己細胞である、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記免疫受容体が、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記共刺激分子が、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 細胞表面での普遍的免疫受容体の代謝回転を定量する方法であって、
    （ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を、相互アダプター分子に連結された作用物質と接触させ、それによって武装化受容体を生成させるステップ、および
    （ｂ）基準量に対する前記武装化受容体の量を決定するステップ
    を含む、方法。
  40. 前記基準量が、前の時点での前記武装化受容体の量である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記武装化受容体の量が、前記作用物質を標識して、前記標識された作用物質を検出することによって決定される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記作用物質が、前記作用物質を、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、フルオロフォア（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ））、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヒスチジン、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、放射性同位体、重金属、超常磁性ナノ粒子、および、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７，１０-四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７-トリアザシクロノナン-１，４，７-三酢酸（ＮＯＴＡ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）を含む放射性同位体標識のために使用される任意の種類の化合物を含む標識分子と連結または接触させることによって標識される、請求項４１に記載の方法。
  43. （ｃ）前記細胞および前記作用物質を腫瘍細胞と接触させるステップをさらに含む、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記細胞外ドメインがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記作用物質がＳｐｙＴａｇに連結されている、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記作用物質が抗体であり、ヒトＩｇＧである、請求項３９～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、請求項３９～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記免疫受容体が、共刺激分子の細胞内ドメインをさらに含む、請求項３９～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記共刺激分子が、４-１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原-１（ＬＦＡ-１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７-Ｈ３であるか、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドである、請求項３９～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激する方法であって、
    （ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を前記哺乳動物に投与するステップ、および
    （ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質の有効量を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合する、ステップ
    を含み、前記腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで前記抗原を発現するように方向付けられている、方法。
  52. がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療する方法であって、
    （ａ）Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変された細胞のある量を前記哺乳動物に投与するステップ、および
    （ｂ）相互アダプター分子に連結された作用物質のある量を前記哺乳動物に投与するステップであって、前記作用物質は前記がんによって発現される抗原に特異的に結合する、ステップ
    を含み、前記がんは、基準レベルに対して上昇したレベルで前記抗原を発現するように方向付けられている、方法。
  53. 前記基準レベルが、健常組織での前記抗原の発現のレベルである、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 前記細胞外ドメインが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＴａｇを含む、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記作用物質が、ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに連結されている、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記作用物質が、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、またはＤＡＲＰｉｎである、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記作用物質が抗体であり、ヒトＩｇＧである、請求項５１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記ＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが、光活性化部位特異的コンジュゲーション（ＬＡＳＩＣ）を介して前記作用物質に連結されている、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、マクロファージ、幹細胞、または調節性Ｔ細胞である、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記細胞が自己細胞である、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記哺乳動物への投与の前に、前記細胞を作用物質と接触させて前武装化細胞を生成させ、その後に前記前武装化細胞を前記哺乳動物に投与する、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記作用物質を前記哺乳動物に投与する前に、前記細胞を前記哺乳動物に投与する、請求項５１～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するための遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質であって、前記腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、
    前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、
    前記第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記第１の作用物質は前記腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合し、
    前記第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記第２の作用物質は前記腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、前記第１の抗原と前記第２の抗原とは異なる抗原であり、
    前記免疫受容体、第１の作用物質、および第２の作用物質は前記哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質。
  64. がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質であって、前記がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、
    前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、
    前記第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記第１の作用物質は前記がんによって発現される第１の抗原に特異的に結合し、
    前記第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記第２の作用物質は前記がんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、前記第１の抗原と前記第２の抗原とは異なる抗原である、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質。
  65. 腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせるのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞のある量を前記作用物質のある量と接触させ、前記細胞の量に対する前記作用物質の量は、前記腫瘍に対して前記レベルの溶解活性を生じさせるように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質。
  66. がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記がんによって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞のある量および前記作用物質のある量が前記哺乳動物に投与され、前記細胞の量および／または前記作用物質の量は、前記がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質。
  67. 腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞のある量が前記哺乳動物に投与され、その後に前記作用物質のある量が前記哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞および作用物質。
  68. がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記がんによって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞のある量が前記哺乳動物に投与され、その後に前記作用物質のある量が前記哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞および作用物質。
  69. 腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、
    前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、
    前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、
    前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、
    前記細胞の有効量が前記哺乳動物に投与され、かつ前記作用物質の有効量が前記哺乳動物に投与され、
    前記腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで前記抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質。
  70. がんの治療を必要とする哺乳動物においてがんを治療するのに使用するための遺伝子改変細胞および作用物質であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞の有効量が前記哺乳動物に投与され、かつ前記作用物質の有効量が前記哺乳動物に投与され、前記腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで前記抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質。
  71. 腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激することにおける遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用であって、前記腫瘍は少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、
    前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、
    前記第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記第１の作用物質は前記腫瘍によって発現される第１の抗原に特異的に結合し、
    前記第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記第２の作用物質は前記腫瘍によって発現される第２の抗原に特異的に結合し、前記第１の抗原と前記第２の抗原とは異なる抗原であり、
    前記免疫受容体、第１の作用物質、および第２の作用物質は前記哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用。
  72. がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用であって、前記がんは少なくとも２つの異なる抗原を共発現し、
    前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、
    前記第１の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記第１の作用物質は前記がんによって発現される第１の抗原に特異的に結合し、
    前記第２の作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記第２の作用物質は前記がんによって発現される第２の抗原に特異的に結合し、前記第１の抗原と前記第２の抗原とは異なる抗原である、遺伝子改変細胞、第１の作用物質、および第２の作用物質の使用。
  73. 腫瘍に対してあるレベルの溶解活性を生じさせることにおける遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞のある量を前記作用物質のある量と接触させ、前記細胞の量に対する前記作用物質の量は、前記腫瘍に対して前記レベルの溶解活性を生じさせるように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質の使用。
  74. がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記がんによって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞のある量および前記作用物質のある量が前記哺乳動物に投与され、前記細胞の量および／または前記作用物質の量は、前記がんに対してあるレベルの溶解活性をもたらすように選択される、遺伝子改変細胞および作用物質の使用。
  75. 腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激することにおける遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞のある量が前記哺乳動物に投与され、その後に前記作用物質のある量が前記哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞および作用物質の使用。
  76. がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記がんによって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞のある量が前記哺乳動物に投与され、その後に前記作用物質のある量が前記哺乳動物に投与される、遺伝子改変細胞および作用物質の使用。
  77. 腫瘍に対する普遍的免疫受容体媒介性免疫応答を、それを必要とする哺乳動物において刺激することにおける遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞の有効量が前記哺乳動物に投与され、かつ前記作用物質の有効量が前記哺乳動物に投与され、前記腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで前記抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質の使用。
  78. がんの治療を必要とする哺乳動物におけるがんの治療における遺伝子改変細胞および作用物質の使用であって、前記細胞は、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメインと、４-１ＢＢの細胞内ドメインと、膜貫通ドメインと、アダプター分子を含む細胞外ドメインとを含む免疫受容体を発現するように遺伝子改変されており、前記作用物質は相互アダプター分子に連結されており、かつ前記作用物質は前記腫瘍によって発現される抗原に特異的に結合し、前記細胞の有効量が前記哺乳動物に投与され、かつ前記作用物質の有効量が前記哺乳動物に投与され、前記腫瘍は、基準レベルに対して上昇したレベルで前記抗原を発現するように方向付けられている、遺伝子改変細胞および作用物質の使用。
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