JP2006518853A - ハイスループットおよびハイコンテント・スクリーニングのための蛋白質断片の相補性アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
本書をもって次のことを証する。我々、カナダ国モントリオールの居住者でカナダ国の公民ステファン・W・ミフニク(Stephen W. Michnick)、カナダ国モントリオールの居住者でカナダ国の公民イングリッド・レミー(Ingrid Remy)、カリフォルニア州リバーモアの居住者でアメリカ合衆国の公民ジェイン・ラマーディン(Jane Lamerdin)、カリフォルニア州マウンテンビューの居住者でアメリカ合衆国の公民ヘレン・ユー(Helen Yu)、カリフォルニア州サンラモンの居住者でアメリカ合衆国の公民ジョン・ウエストウィック(John Westwick)、およびカリフォルニア州プレザントンの居住者でアメリカ合衆国の公民マルニエ・L・マクドナルド(Marnie L. MacDonald)は、以下を明細書とする「ハイスループットおよびハイコンテント・スクリーニングのための蛋白質断片の相補性アッセイ」においていくつかの新規で有用な改良発明を行った。
細胞スクリーニング法は、細胞可溶化物を分析する準生化学的な方法、もしくは生細胞アッセイ法の2群に大別することができる。本発明では、主として細胞全体を用いるアッセイに焦点を当てている。細胞全体を用いるアッセイ方法は、アッセイの原理によって異なるが、大部分は共通して発光もしくは蛍光の検出様式を採る。発光とは、エネルギーが特異的に分子に誘導されて励起状態を生じる現象である。発光には、蛍光、リン光、化学発光および生物発光が含まれる。
シグナル伝達および遺伝子発現を伴う細胞事象のモニタリングを可能にする転写レポータ・アッセイを構築するのに、細胞利用のレポータがよく用いられている。レポータ遺伝子アッセイでは、標的の生物活性を検出が容易な酵素もしくは蛋白質レポータの発現と結びつける。種々のレポータ遺伝子に転写制御エレメントを融合させることによって、こうした系から細胞内の遺伝子発現に対する一連のシグナル伝達事象の影響が「報知(report)」される。特定の反応エレメントの合成繰返し体をこのレポータ遺伝子の上流に挿入することにより、生細胞内の特定の経路を賦活化することで生成されるシグナル伝達分子に反応したその発現を調節することができる。転写レポータ遺伝子およびその応用の多様性は極めて広く、例えば、ベ−タ・ガラクトシダーゼ(beta−gal)、ルシフェラーゼ、アルカリ・ホスファターゼ(発光アッセイ)、GFP、エクオリンおよび種々の比較的新しい生物発光もしくは蛍光レポータを用いた薬剤スクリーニング系が挙げられる。
シグナル伝達蛋白質の細胞内区画化は、生化学的経路の賦活化のされ方を規定する点のみならず、経路の賦活化による所望の生理学的な結果に影響を及ぼす点でも、重要な現象である。薬の発見に関しては、異なる分子特性を有するそれ自体蛍光性の種々の蛋白質がクローニングされ入手可能となった結果、上記の面で大きな進展が見られている。ハイコンテント(ハイコンテキストとも呼ばれる)スクリーニング(HCS)は、細胞の画像に基づく解析を利用して、細胞過程の刺激もしくは阻害剤への反応による蛋白質の細胞内配置および再分布を検出する生細胞使用のアッセイ法である。HCSでは蛍光プローブを使用することができ、例えば、受容体の細胞内移行は、トランスフェリン受容体に結合する蛍光標識リガンドを用いて測定することができる。多くの場合、個々の蛋白質は、−対象とする蛋白質をGFPなどの検出可能部分と融合させた−融合蛋白質として発現させるか、固定後、Cy3もしくは別の適切な色素に結合させた抗体を用いるなどして免疫組織化学法により検出する。このような方法で、蛋白質の細胞内配置を実時間でイメージングし、追跡することができる。最大の開発領域の1つは、GFPの色を変えた変異体その他の比較的最近単離された新規な蛍光蛋白質の用途にあり、これらの蛋白質を用いると、マルチカラー・アッセイなどのさらに一層進歩した生細胞利用アッセイ法の構築が可能になる。生細胞内のGFP融合蛋白質の再分布を追跡することにより主要な細胞内シグナル伝達経路を分析する一連のGFPアッセイ法が開発されている。HCSによる薬物スクリーニングの目標は、主要なシグナル伝達蛋白質のその細胞内作用部位への移動を阻害することにより病的経路を遮断する治療化合物を同定することにある。
単一蛋白質のモニタリングとは対照的に、蛋白質−蛋白質相互作用アッセイは、2種の蛋白質間の複合体の存在および量を評価することができる。
PCAは、細胞内蛋白質−蛋白質複合体の結合、解離もしくは局在化を測定するための、FERTおよびBRETに代わる方法となる。PCAにより生細胞内の蛋白質−蛋白質複合体の量および細胞内局在を測定し、定量化することが可能になる。PCAの場合、蛋白質は、遺伝子操作により作製するポリペプチド断片との融合体として発現されるが、このポリペプチド断片自体は(a)蛍光性もしくは発光性部分ではなく、(b)天然に存在するものではなく、(c)レポータの断片化により作製されるものである。
本発明の目的は、生細胞の自然な状態を用いた大規模な薬の発見のための方法を提供することにある。
(a)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の第1断片と、
2)前記第1断片と融合している第2分子と、
を含む第1の融合産物と、
(b)1)前記第1レポータ分子の第2断片と、
2)前記第2断片に融合している第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)(a)および(b)の2つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物を含む薬の発見のためのアッセイ組成物に関する。
(a)1)断片同士が結合により検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の第1断片と、
2)前記第1断片と融合している第2分子と、
を含む第1の融合産物と、
(b)1)前記第1レポータ分子の第2断片と、
2)前記第2断片に融合している第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)(a)と(b)の2つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物を含む薬の発見のためのアッセイ組成物に関する。
前記核酸分子が、
(a)1)断片同士が結合により検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の断片と、
2)前記第1レポータ分子の断片と融合している第2分子と、
を含む第1レポータ融合産物と、
(b)1)前記第1レポータ分子の第2断片と、
2)第2もしくは第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)(a)と(b)との2つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物をコードしている配列を含むアッセイ組成物を提供する。
(a)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の第1断片と、
2)前記第1断片と融合している第2分子と、
を含む第1の融合産物と、
(b)1)前記第1レポータ分子の第2断片と、
2)前記第2断片に融合している第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第2レポータ分子の第1断片と、
2)この第1断片と融合している第4分子と、
を含む第3の融合産物と、
(d)1)前記第2レポータ分子の第2断片と、
2)前記第2断片に融合している第5分子と、
を含む第4の融合産物と、
(e)(a)、(b)、(c)および(d)の融合産物のの組み合わせと、
からなる群から選ばれる産物を含む、薬の発見のためのアッセイ組成物を提供する。
前記核酸分子が、
(a)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の断片と、
2)前記第1分子の断片と融合している第2分子と、
を含む第1レポータ融合産物と、
(b)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第2レポータ分子の断片と、
2)前記第2分子の前記断片と融合している第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)(a)と(b)との2つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物をコードしている配列を含むアッセイ組成物を提供する。
HTSもしくはHCSアッセイを構築するプロセスの概略を図1に示した。HTSもしくはHCSアッセイに用いるべき遺伝子は、相互作用する既知もしくは新規蛋白質のいずれをコードしていてもよい。これらの相互作用する蛋白質は、おとり(bait)対ライブラリスクリーニング;(遺伝子毎の)2つ1組の相互作用のマッピング;および/または経路もしくは相互作用性蛋白質ペアの予備知識の活用を含む1つまたは1つ以上の方法により選択することができる。この略図の番号3および4の蛋白質は、受容体媒介性細胞シグナル伝達経路に関与することが分かっており(もしくはこれを示すことができ)、この経路をブロックする化合物を同定するHTSもしくはHCSスクリーニングを構築するために選択することができる。全ての蛋白質−蛋白質複合体が経路のアゴニスト、アンタゴニスト、賦活剤もしくは阻害剤に反応する訳ではないことに留意されたい。PCAを用いることにより経路の活性を選び出して報知することができる「標識(sentinel)」としての機能を果たす蛋白質−蛋白質ペアを同定することができるのは本発明の利点である。いずれにせよ、一旦対象遺伝子が同定されれば、以下のスキームに従って、アッセイを構築することができる:即ち、レポータ断片ペアF1/F2を作製する(一部のレポータについては表Iに列挙してある)。例えば、図1に(3,4)として示した蛋白質−蛋白質ペアをコードする2種の対象遺伝子を用いて、一方が可変リンカーおよびF1レポータ断片にインフレームで融合させた遺伝子「3」を含み、他方が可変リンカーおよびF2レポータ断片にインフレームで融合させた遺伝子「4」を含むことにより対象遺伝子、リンカーおよびレポータ断片がインフレームとなり、プロモータに動作可能なように結合するようにした2種の発現構成体を作製する。(多シストロン性ベクターを用いることもできる。選択可能なベクターの詳細については実施例12に記載されている)。図1の遺伝子は5’末端で融合されているので、コードされている対象蛋白質はこの融合体のN−末端にあることになるが、他の組み合わせ、ならびにベクターの構築およびベクターのエレメントの詳細については図16に示した。細胞を相補性F1、F2遺伝子構成体でコトランスフェクションすることにより蛋白質を発現させる。一過性アッセイを実施することができ、また、安定な細胞株は、この株を得るのに選択マーカもしくは生存選択PCAを用いることにより、「内部にPCA」を有するものとして構築することができる。得られる細胞もしくは安定細胞株は、対象化学物質ライブラリと併せてHTSもしくはHCSのために用いる。
多種多様なレポータの中から選択することができることにより本発明が大規模な薬の発見に特に有用となることは当業者には明瞭に理解されよう。PCAの原理によれば、単一(単量体)蛋白質として天然に存在するレポータを含む任意のレポータを断片化することができることにより、このことが可能になる。従って、一連の蛋白質発現レベル、細胞種および検出方法に適していると考えられる特定の波長および強度の光を発するレポータを選択することができる。薬の発見のための対象となる生物学的プロセスおよび生化学的標的が広範囲にわたるので、柔軟性は本発明の重要な特徴である。一部の蛋白質では、経路を−例えば、受容体アゴニストもしくは薬物によって−賦活化すると、蛋白質−蛋白質複合体の形成が、この複合体の細胞内局在の変化を伴うことなく、増大もしくは低減する。蛋白質により形成された蛋白質−蛋白質複合体の数が増加もしくは減少すると、PCAが生じるシグナルがそれぞれ増強もしくは低減する。この場合、対象複合体の量を示す大量の蛍光シグナルを測定するのにハイスループット・アッセイ方式を用いることができる。本明細書には、経路標識としてChkl/p53、p53/p53、PKB/hFtl、PDKl/hFt1、FKBP/TOR(FRAP)、IkBa/p65およびIkBa/ユビキチンを選択した3種の経路の例を示した。NFkB(p50/p65)などの他の蛋白質の場合、経路を賦活化すると、ある細胞内区画の別の区画に対する(膜対細胞質、細胞基質対核などの)蛋白質−蛋白質複合体の量比に変化が生じる。後者の場合、細胞内の蛋白質−蛋白質複合体の部位に再構築されたレポータが生じる蛍光シグナルの存在部位を特定するのにハイスループット・アッセイ方式を用いることができる。
HTSおよびHCSのための蛍光および発光アッセイ
本発明のこの第1の実施例は、蛍光および発光PCAを用いる多種多様の有用なアッセイの構築方法を示すと共に、標準的なHTSおよびHCS計測を併用したハイスループットおよびハイコンテント・アッセイへのこれらの利用方法を示したものである。DNA損傷応答経路のエレメントを使用した。
BLA PCAにより数値化した相互作用を確認し、その細胞内局在を評価するために、同じDNA損傷応答エレメントを用いてGFP PCAを構築し、複合体の細胞内局在を蛍光顕微鏡によりイメージングした(図2(A)、左側パネル)。PCRにより、p53およびChk1をコードしている完全長のcDNAを増幅させた。この融合遺伝子は、GFP[1]−p53のゼオシン(Zeocin)選択マーカおよびGFP[2]−Chk1およびGFP[2]−p53のハイグロマイシン・マーカを有するpCDNA3.1発現ベクター(インビトロゲン社)内にサブクローニングした。(GGGGS)2(配列番号1)からなる可変10−アミノ酸リンカーにより、対象遺伝子とYFP断片とを離隔した。対象遺伝子とこのレポータ断片との間に可変リンカーを用いることにより、融合体の配向および配列が蛋白質断片を極近接して組み込むのに最適なものとなることが保証される(J.N.ペルティエ(J.N. Pelletier)、F.−X.C.−ヴァロワ(F.-X. C.-Valois)、S.W.ミフニク(S.W. Michnick)、1998年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズUSA(Proc Nail Acad Sci USA)95:p12141−12146)。GFP[1]はGFPのアミノ酸1乃至158番目に相当し、GFP[2]はGFPのアミノ酸159乃至239番目に相当し、pCMS−EGFP(クロンテク社)からPCRによって増幅させた。
また、我々は蛋白質−断片相補性を利用する発光アッセイ(PCA)の使用について実証を試みた。ミフニクほか(Michnick et al.)(米国特許第6,270,964号)により開示された方法を用いてRenillaルシフェラーゼ(RLuc)の断片をデザインした。160番目のグルタミン酸残基(E160)が完全な状態のRLucの断片と一致するオリゴヌクレオチドを合成することを選択した。別の断片部位を使用することも可能であり、従って、本発明が本明細書で用いている特定の断片に限定されないことに留意されたい。出発/停止コドンとなるように断片内に設けたコドンには下線が引かれている。上記蛋白質断片が構築物の5’末端にある場合は開始メチオニン(atgコドン)がこれの前方に来るが、この断片が構築物の3’末端にある場合は開始メチオニン(atgコドン)が対象遺伝子の前方に来ることに留意されたい。従って、本発明は天然型のメチオニンを有するF1断片ばかりでなく、F1断片が構築物の3’末端にあることになる場合に上記開始メチオニンを除去するように修飾された同じF1断片をもカバーしている。同様に、本発明は、天然では開始メチオニンで始まらないF2断片だけでなく、F2断片が構築物の5’末端にあることになる場合に開始メチオニンを含むように修飾された同じF2断片をもカバーしている。
GFP PCAよりも明るいシグナルを有するハイコンテント・アッセイを構築するために、黄色蛍光を生じるGFP断片の2種の変異型を作製した。第1断片の配列は、完全長のEYFPに相当する。完全長EYFPは、完全長GFPに対してスペクトル特性が向上することが分かっている(タバレほか(Tavare et at.)2001年、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー(Journal of Endocrinology)170:297−306)。本明細書に記載したPCAは、先ず、EGFPの既存のオリゴヌクレオチド断片にEYFPに特有の突然変異S65G、S72AおよびT203Y(24)を導入することにより作製し、完全長EYFP(21、15)の1乃至158番目および159乃至239番目のアミノ酸に相当するYFP[1]およびYFP[2]と命名した断片を得た。次いで、YFP[1]およびYFP[2]に相当する合成オリゴヌクレオチド(ブルー・ヘロン社(Blue Heron))を直接用いて開始することによりアッセイを構築した。断片YFP[1]およびYFP[2]の組成は以下の通りであった:
新規な蛋白質-蛋白質相互作用の確認および定量的アッセイの構築
次に、本発明で開示し、図1に示したPCA法を用いてPI−3−キナーゼおよびPKA/PKC−媒介性経路の新規な蛋白質−蛋白質相互作用を同定した後、この新規な相互作用を利用して定量的なスクリーニングを行った。先ず、GFP PCAによりcDNAライブラリのスクリーニングを行うことによってPKBと相互作用する蛋白質を同定した。このGFP PCAスクリーニングによりPKBとFt1との間の新規な相互作用が同定された。続いて、このGFP PCAを用いてPKB/Ft1およびPDK1/Ft1の蛍光アッセイ法を構築した。この経路の構成およびPKB/hFt1相互作用の位置については図5(A)に示した。以下に、PCAを用いたライブラリのスクリーニング方法およびアッセイの構築方法を記載する。
COS−1細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS、ハイクローン社)を補充したDMEM(ライフ・テクノロジーズ社)中で増殖させた。ヒトTag−Jurkat T細胞株は、SV40ラージT抗原を発現し、NF−AT結合部位の3つのタンデム型コピーがlacZ遺伝子の転写を誘導する組込みβ−ガラクトシダーゼ・レポータ・プラスミドを収容している。これは、10%FBS、1mMピルビン酸ナトリウムおよび10mMヘペスを補充したRPMI−1640(ライフ・テクノロジーズ社)中で増殖させた。
YFP PCAを用いたハイスループット・アッセイ
次に、我々は、適切な薬理学的情報をもたらす定量的なアッセイ法としてPCAを用いることができることを明らかにしようとした。以下の例では、FKBP(FK506結合蛋白質)およびその同族パートナFRAP(FKBP−ラパマイシン−結合性蛋白質)のよく特徴付けられた相互作用を用いた。この相互作用は未処理細胞では極低いレベルで生じるが、免疫抑制剤ラパマイシンにより顕著に誘発される。FKBP/FRAP相互作用を標識とするヒトの成長(growth)経路の構成は、図6Aに示した。
PCAによる遺伝子毎の相互作用のマッピング
図1から明らかなように、蛋白質−蛋白質相互作用は、遺伝子毎の相互作用のマッピングなどの種々の方法により同定することができる。本発明の態様をさらに明示し、PCAを系統的に適用することにより相互作用する蛋白質を迅速大量に同定することができることを示すために、遺伝子毎の相互作用のマッピングを行って新規な蛋白質−蛋白質相互作用を同定した。遺伝子毎の相互作用のマッピングは、互いに対して規定されたセットの遺伝子をテストすることが望まれる場合に、またはアッセイの最適化のために、おとり(bait)対ライブラリ・スクリーニングに代わるものとなる。さらに、遺伝子毎の相互作用のマッピングでは、完全長の蛋白質を他の完全長の蛋白質との相互作用についてテストすることが可能になる。この原理を示すために、図16によってデザインしたYFP PCA構築物内のランダムに選択した完全長cDNAを、96−穴式プレート内にYFP[l]/YFP[2]ペアとしてロボットを用いてプールし、Fugeneトランスフェクション試薬を用いて各DNAプールの50ngをHEK293T細胞中にトランスフェクションした。細胞の各96−穴マイクロタイター・プレートは異なる蛋白質−蛋白質ペア形成を示す28種のPCAおよび4組の対照(1組の陽性対照および3組の陰性対照)を含み、これらは全て3回ずつアッセイした。トランスフェクションの48時間後、細胞をヘキスト33342と短時間インキュベートすることにより、標準化のために各ウェルの細胞計数を行った。蛍光強度の測定値は、YFPもしくはヘキストに適切な個別の設定によりモレキュラー・デバイシズ(Molecular Devices)プレート・リーダーを用いて得た。データは統計解析のため転送し、リレーショナル・データベースとして保存した。陰性対照と統計的に異なる相互作用を(スチューデントt−検定により求めた)有意水準および平均蛍光単位により選別した。
従って、我々は、よく特徴付けられた細胞シグナル伝達経路の多数の個々の段階に対するアッセイ法の構築にPCAを適用し、また、こうしたアッセイ法を化学物質ライブラリのスクリーニングに持ち込むことを試みた。図8は、NFkB転写因子複合体(p65/p50)の役割を含む、TNF受容体から核に至る経路の構成を示したものである。TNFがその受容体に結合すると、IKK複合体が活性化され、その結果、プロテアソームによるIkBaのリン酸化および分解が起こる。IkBaが分解すると、NFkB転写因子複合体(p65/p50)が遊離型となって細胞質から核へ転位し、そこで炎症に関与する遺伝子の転写を開始させることができる。ALLN、エポキソミシン(および現在使われている抗癌剤ベルケード(Velcade)(商標))などのプロテアソーム阻害剤はIkBaの分解をブロックし、細胞基質にNFkBの貯留を生じる。
生細胞内の個々の蛋白質-蛋白質複合体の可視化
図1に示した一般的なスキームに従って、TNF経路の既知のエレメントをコードする完全長のcDNAを用い、また、DHFR PCA(赤色蛍光)および/またはYFP PCA(黄色/緑色蛍光)を用いて一連のPCAを構築した(図9)。これらのPCA構築物では、p65、p50、CBP、CBPnt、TNFRI、TRAF2の読み取り枠およびユビキチンの単一コーディング単位をPCR増幅させ、DHFRもしくはYFPの相補性の断片にインフレームで融合させ、pCDNA3.1zeo中にサブクローニングした。遺伝子のREFSEQもしくはGENBANK識別子としては、NM009045(p65/Re1A)、NM003998(NFkBl/p50)、AY033600、NM004380(CBP)、NM003824(FADD)、NM003789(TRADD)、BC033810(TRAF2)、XM032491(IKKベータ)、BC000299(IKKガンマ)およびユビキチンC(BC039193)を使用した。CBPnt[(S66385(1..2313)]はCBPのアミノ末端771個のアミノ酸に相当する。ユビキチンCは76kDaユビキチン単量体に相当する。
多色アッセイ法
また、それぞれが異なる蛍光シグナルを生成する種々のレポータを用いてPCAを構築することができることにより、多色アッセイ法の構築も可能になる。この原理の証明として、/p65複合体を、DHFR PCAにより検出されるCBP/p65複合体(赤色)を同時に発現する細胞においてYFP PCA(黄色/緑色)を用いて可視化した。同時に、前述のようにして、DHFRレポータ融合体DHFR−F[1,2]−CBPntおよびp65−DHFR−F[3]、ならびにYFPレポータ融合体IkBa−YFP[1]およびYFP[2]−p65を用いてCHO細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後、細胞をTxR−MTXで染色し、DHFR PCAおよびYFP PCAについてそれぞれ記載したようにして顕微鏡により視覚化した。図9から明らかなように、IkBa/p65複合体により生成されるシグナルが細胞基質内に局在する(YFP PCAにより生じる黄色/緑色シグナル)のに対して、CBP/p65により生成されるシグナルは核内に明確に局在する(テキサスレッドを用いたDHFRにより生じる赤色シグナル)。
NFkB転位のハイコンテント・アッセイ
PCAを用いて生細胞における経路の賦活化および阻害を検出することができることを明示するために、我々は、先ず、TNF−アルファへの反応によるp65/p50複合体の核転位量を測定し、ALLNによる阻害を評価するための一過性ハイコンテント・アッセイ法を構築した。融合遺伝子は、YFP[1]−p50のゼオシン(Zeocin)選択マーカおよびYFP[2]−p65のハイグロマイシン・マーカを含むpCDNA3.1発現ベクター(インビトロゲン社)中にサブクローニングした。(GGGGS)2(配列番号1)からなるリンカーにより対象遺伝子とYFP断片を離隔した。CHO DUKXB 11細胞を96−穴プレートに8×103個/ウェルの濃度で接種し、24時間後に、Fugene(ベーリンガー・マンハイム社)をメーカーの説明書に従って用い、1:1のモル比のYFP[1]およびYFP[2]融合体遺伝子でトランスフェクションした。各サンプルにつきウェル当たり計20ngのDNAを用いた。トランスフェクションの36時間後、細胞を、0.25%FBSを補充したaMEM中でさらに16乃至18時間インキュベートすることにより、血清不足状態にした。サイトカインによる誘導を行うため、一部の細胞を25ng/mlのmTNF(ベーリンガー・マンハイム社)で30分間処理した。NFkBの核転位に対するプロテアソーム阻害の影響を調べるため、上記の血清不足状態の細胞を、mTNFアルファによる誘導期間の前および期間中に40μg/mlのALLN(カルビオケム社)で1時間処理した。次いで、この細胞をPBSで洗浄し、NFkB複合体の細胞内部位(subcellular location)を可視化して、ニコン・エクリプスTE2000蛍光顕微鏡を用いて励起波長485nmおよび発光波長527nmで画像を獲得した。蛍光強度の定量的な分析はメタモルフ(Metamorph)ソフトウェア(ユニバーサル・イメージング社、モレキュラー・デバイシズ社)を用いて行った。
内部にPCAを有する安定な反応性細胞株
安定な細胞株は、冷凍貯蔵細胞からいつでもアッセイを再構築することができるので、HTSの標準となる。内部にPCAを有する確固たる安定細胞株の構築を明示するために、HEK293T細胞を、10%FBS(ジェミニ・バイオ−プロダクツ社(Gemini Bio−Products))、1%ペニシリンおよび1%ストレプトマイシンを補充したMEMアルファ培地(インビトロゲン社)中で増殖させ、5%CO2の37℃インキュベータ内に維持した。先ず、細胞を、YFP[2]−p65をコードするベクターを用いてコトランスフェクションし、100μg/mlのハイグロマイシンB(インビトロゲン社)を用いて安定な細胞株を選択した。次いで、選択した細胞株をYFP[l]−p50でトランスフェクションした。50μg/mlのハイグロマイシンBおよび500μg/mlのゼオシンによる二重抗菌性選択の後、YFP[l]−p50/YFP[2]−p65を発現する安定な細胞株を単離した。免疫ブロット分析および蛍光顕微鏡法により、その融合体遺伝子を安定的に発現する細胞クローンを同定した。各トランスフェクタントの単一細胞株を選択してさらに特徴付けを行った。これらの株の蛍光は、少なくとも25継代にわたって安定である(データは示されていない)。安定なMEK/ERK細胞株−下記のようにして構築した−は、TNF作用のための対照として用いた。全てのトランスフェクションで、Fugene 6(ロッシュ社)をメーカーの説明書に従って使用した。YFP[l]−p50/YFP[2]−p65を安定的に発現する細胞を、壁の黒いポリ−リジン被覆96−穴プレート(グライナー社(Greiner))中に20,000個/ウェル接種した。24時間後、これらの細胞をヒトTNF−アルファ(ロッシュ社)と共に30分間インキュベートした。次いで、核を10μg/mlのヘキスト33342で10分間染色した。細胞はHBSS(インビトロゲン社)で洗浄し、同じ緩衝液中に保存した。次に、蛍光を可視化し、それぞれ470/35および535/60の励起および発光フィルターを取り付けたディスカバリ−1(Discovery−1)自動蛍光撮像装置(モレキュラー・デバイシズ社(Molecular Devices))を用いて画像を獲得した。示されている場合、細胞を25μMのALLN(カルビオケム社)で60分間処理した後、この阻害剤を存在させたまま、TNFによる誘導を行った。下記のハイスループット・スクリーニング作戦では、細胞は、化合物(10μM)で60分間前処理した後、薬物の存在下にTNFアルファで30分間刺激した。次いで、細胞をHBSSの2%ホルムアルデヒド溶液で固定した後、ヘキスト33342で染色した。液処理は全て、バイオメック(Biomek)FX(ベックマン(Beckman))機器を用いて行い、画像は前述のようにして獲得した。画像の解析はイメージJ(Image J)を用いて行った。転位は、所与の条件のいくつかの画像に対して(nで示した)細胞集団の平均蛍光強度の核/細胞質比を算出することにより評価した。
PCAによる化学物質ライブラリのハイスループット・スクリーニング
ハイスループット・スクリーニングにおけるPCAの利用を明示するために、前記p50/p65 PCAを発現するように遺伝子操作された細胞を用いて、化合物のジェネシス・プラス・コレクション(マイクロソース・ディスカバリ・システムズ社)をアッセイした(図12[C])。ジェネシス・プラスは960種の化合物のコレクションであり、毒性もしくは蛍光性が既知の化合物を含む。このような特性を有する化合物を含めることは、これらが分析を複雑にするので、HTSアッセイのバリデーションにおいて重要である。ウェル中の化合物の最終濃度は10μMとし、全てのウェルにはDMSOを0.5%の濃度で含ませた。細胞は化合物(もしくはビヒクル)で90分間処理した後、25ng/mlのTNFで30分間処理した。固定および核の染色後、自動蛍光顕微鏡プラットホーム(ディスカバリ−1;ユニバーサル・イメージング社/モレキュラー・デバイス社)を用いて蛍光を分析した。
PCA法の一般性
さらに、PCAに対して任意のレポータを併用することができることを明らかにするため、我々は、DHFR PCAを用いたTNF経路のアッセイ法についても構築した(図13)。NFkBサブユニットp65およびp50(N−末端436個のアミノ酸に相当)のコーディング領域を、それぞれマウスおよびヒトcDNAからPCR増幅させ、pCDNA3.1zeo(インビトロゲン社)内で15アミノ酸可変リンカー(GGGGS)3(配列番号30)、次いでDHFR断片F[1,2]もしくはF[3]の下流にインフレームで結合させた。pCDNA3.1には別個にIkBaをサブクローニングした。これらの遺伝子の一過性発現のために、8×104DHFR欠損CHO DXB11細胞を12穴プレートに接種し、24時間後に、Fugene(ベーリンガー・マンハイム社)をメーカーの使用説明書に従って用い、[F1,2]−p65、[F3]−p50およびIkBaを各融合構築物のモル比1:1:1で用いてトランスフェクションした。対照には、示されている場合、IkBaの代わりに空のpCDNA3.1を用いた。DNAはウェル当たり計1μg用いた。
蛍光強度の変化を利用したアッセイ:IkBa/p65
ユビキチン結合およびプロテアソーム分解の結果であるIkBaのTNF誘導性分解により、結合NFkBが解放され、この転写因子の核内への転移が起こる。従って、IkBa−NFkB複合体の分解はNFkB媒介性遺伝子制御の重要な段階である。このレベルのNFkB経路の調節を視覚化するために、我々はIkBa/p65 PCAを発現する安定な細胞株を作製した(図14)。対照としてはERK1/MEK1を用いた。ERK1をYFP[1]の5’末端に結合させると同時に、IkBaおよびMEK1をN−末端融合体としてYFP[2]に付加した。この融合遺伝子を、YFP[1]−p50、IkBa−YFP[1]およびERK1−YFP[1]のゼオシン(Zeocin)選択マーカならびにYFP[2]−p65およびERK1−YFP[2]のハイグロマイシン選択マーカを含むpCDNA3.1発現ベクター(インビトロゲン社)中にサブクローニングした。また、(GGGGS)2(配列番号1)からなるリンカーによって対象遺伝子とYFP断片を離隔した。
蛋白質のユビキチン結合についてのアッセイおよびプロテアソーム阻害剤同定におけるその利用
多くの蛋白質の選択的な分解は、蛋白質がユビキチンへの共有結合による分解の標的となる一連の段階からなるユビキチン・システムから始まる。ユビキチンは高度に保存された76−アミノ酸ポリペプチドである。1970年代中頃に発見されて以来、ユビキチンは、損傷蛋白質の除去などの細胞のハウスキーピング機能と関連づけられてきた。最近、ユビキチンはプラズマ細胞膜から核に至る種々の細胞内部位(subcellular location)の他の重要なプロセス、例えば、細胞周期の進行、シグナル伝達、転写調節、受容体の下方制御およびエンドサイトーシスに関与していることが明らかになった。
ベクターおよびベクター・エレメント
本発明と併せて多数の異なるベクターを使用することができることは当業者には明らかであろう。有用なベクターのエレメントは、対象細胞、所望のプロモータ、レポータの選択、リンカーの長さおよびクローニング部位により必要に応じて変更することができる。本発明は、前記ベクター配列、そのエレメントもしくは前記遺伝子発現方法に限定されない。プラスミド、レトロウイルスおよびアデノウイルス・ベクターは全て、本発明に適合する。PCAに特有なベクターのデザインおよび特徴に焦点を当てたいくつかの例を以下に示す。これらの例は本発明の用途を限定するものではない。
HTSおよびHCS用細胞株の迅速選択が可能となる、蛍光もしくは発光PCAと生存−選択PCAとを組み合わせたデュアルPCA
PCAは、本発明のように、別々のプラスミド上に構築することができるが、図17に示したように、1つまたは1つ以上の多シストロン性ベクターをPCAと組み合わせて用いることもできる。この例によって、我々は、HTSもしくはHCSアッセイの構築が安定細胞株の作製に関連づけられる「デュアルPCA」を提供する。例えば、ロイシン・ジッパー誘導性(leucine zipper−directed)DHFR PCAを含む安定細胞株を作製するのに相補性の2シストロン性ベクターを用い、この場合、この細胞株は蛍光もしくは発光PCAをも含み、この蛍光もしくは発光シグナルは2つの対象蛋白質の相互作用により駆動される。
以下の特許および刊行物の引用文献を含む内容は全文引用により組み込まれている。
第6,294,330号 ミフニクほか(Michnick, et al.)
第6,428,951号 ミフニクほか(Michnick, et al.)
第5,989,835号 ダンレイほか(Dunlay, et al.)
第6,518,021号 タストラップほか(Thastrup, et al.)
第5,583,217号 クワンテほか(Quante et al.)
第5,516,902号 クワンテほか(Quante et al.)
第5,514,561号 クワンテほか(Quante et al.)
第5,338,843号 クワンテほか(Quante et al.)
刊行物
ペルティエ・J.N.(Pelletier, J.N.)、レミー・I.(Remy, I)、ミフニク・S.W.(Michnick, S.W.)(1998年).「蛋白質−断片の相補性アッセイ:蛋白質−蛋白質相互作用のインビボ検出の一般的方法(Protein-Fragment Complementation Assays: a General Strategy for the in vivo Detection of Protein-Protein Interactions.)」ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・テクニークス(Journal of Biomolecular Techniques)、10:p32−39.
レミー・I.(Remy, I)、ミフニク・S.W.(Michnick, S.W.)(1998年).「クローン選択および蛋白質断片の相補性アッセイによる蛋白質相互作用のインビボ定量化(Clonal Selection and In Vivo Quantitation of Protein Interactions with Protein Fragment Complementation Assays)」プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Pro. Natl. Acad Sci)USA、96:p5394−5399.
レミー・I.(Remy, I)、ペルティエ・J.N.(Pelletier, J.N.)、ガラニュウ・A.( Galarneau, A.)、ミフニク・S.W.(Michnick, S.W.)(2002年)「蛋白質断片相補法による蛋白質相互作用およびライブラリ・スクリーニング(Protein Interactions and Library Screening with Protein Fragment Complementation Strategies)」プロテイン−プロテイン・インタラクションズ:ア・モレキュラー・クローニング・マニュアル(Protein-protein interactions: A molecular cloning manual)、E.A.ゴレミス(E.A. Golemis)編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、第25章、25:p449−475.
レミー・I.(Remy, I)、ウイルソン・I.A.(Wilson, I.A.)、ミフニク・S.W.(Michnick, S.W.)(1999年)「リガンド誘発性構造変化によるエリスロポエチン受容体の賦活化(Erythropoietin receptor activation by a ligand-induced conformation change)」、サイエンス(Science)、283:p990−993.
ガラニュウ・A.(Galarneau, A.)、プリミュー・M.(Primeau, M.)、トルドー・L.−E.( Trudeau, L.-E.)、ミフニク・S.W.(Michnick, S.W.)(2002年)「蛋白質−蛋白質相互作用の検出のためのTEM1β−ラクタマーゼを用いた蛋白質断片の相補性アッセイ(A Protein fragment Complementation Assay based on TEM 1 13-lactamase for detection of protein-protein interactions)」ネイチャー・バイオテクノロジー(Nat Biotechnol)、20:p619−622.
ミフニク・S.W.(Michnick, S.W.)、レミー・I.(Remy, I)、C.−ヴァロワ・F.−X.(C.-Valois, F.-X.)、ヴァリー-ベリスル・A.(Vallee-Belisle, A.)、ガラニュウ・A.(Galarneau, A.)、ペルティエ・J.N.(Pelletier, J.N.)(2000年)「蛋白質断片相補法による蛋白質−蛋白質相互作用の検出(Detection of Protein-Protein Interactions by Protein Fragment Complementation Strategies)」パートAおよびB(ジョンN.アベルソン(John N. Abelson)、スコットDエムール(Scott D Emr)、ジェレミー・ソーナー(Jeremy Thorner)編)ア・ボリューム・オブ・メソッズ・イン・エンザイモロジー(A Volume of Methods in Enzymology)328:p208−230.
レミー・I.(Remy, I)、ミフニク・S.W.(Michnick, S.W.)(2001年)「生細胞における生化学的ネットワークの視覚化(Visualization of Biochemical Networks in Living Cells)」プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Pro. Natl. Acad Sci)USA、98:p7678−7683.
シュミット・J.A.ほか(Schmid, J.A., et al.)(2000年)「緑色蛍光蛋白質(GFP)融合蛋白質を用いたNFカッパBおよびIカッパBアルファの動態に関する検討(Dynamics of NFkappaB and IkappaBalpha studied with green fluorescent protein (GFP) fusion proteins)」ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)275(22):p17035−17042.
本明細書に開示した本発明の多くの形態はここでは好ましい実施態様を構成するが、他の多くの実施態様も可能であり、さらに、これらの好ましい実施態様および他の可能な実施態様の細部は限定的なものと見なされるべきではない。本明細書に用いた用語が限定的なものではなく単に記述的なものであること、および特許請求した本発明の精神もしくは範囲から逸脱することなく種々の変更および均等範囲に属する多くの変形を行い得ることは、理解されよう。
Claims (39)
- 薬の発見のための方法であって、
(A)1つまたは1つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイ(protein-fragment complementation assay:PCA)を構築する工程と、
(B)前記アッセイの活性に対する化合物の効果を調べる工程と、
(C)前記アッセイの結果を用いて、所望の活性を有する化合物を同定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 化合物をスクリーニングする方法であって、
(A)細胞経路の1つまたは1つ以上の段階について蛋白質−断片の相補性アッセイを構築する工程と、
(B)前記アッセイの活性に対する前記化合物の効果を調べる工程と、
(C)スクリーニングの結果を用いて、対象細胞経路を賦活するもしくは阻害する化合物を同定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 化合物をスクリーニングする方法であって、
(A)化学物質のライブラリを選択する工程と、
(B)1つまたは1つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイを構築する工程と、
(C)前記ライブラリから前記アッセイに対する化合物の効果を調べる工程と、
(D)スクリーニングの結果を用いて、前記アッセイで発生するシグナルを増強もしくは低減させる特定の化合物を同定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 化合物をスクリーニングする方法であって、
(A)化学物質のライブラリを選択する工程と、
(B)1つまたは1つ以上の蛋白質−断片の相補性アッセイを構築する工程と、
(C)前記ライブラリから前記アッセイに対する化合物の効果を調べる工程と、
(D)スクリーニングの結果を用いて、前記アッセイで発生するシグナルの細胞内部位(subcellular location)を変える特定の化合物を同定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - アッセイを構築する方法であって、
(a)相互作用する蛋白質をコードする遺伝子を選択する工程と、
(b)適切なレポータ分子を選択する工程と、
(c)前記レポータ分子を断片化することにより、前記断片化がレポータ機能を可逆的に欠損させる工程と、
(d)前記レポータ分子の各断片を他の分子にそれぞれ融合もしくは結合させる工程と、
(e)前記断片に融合もしくは結合した分子同士の相互作用によって前記レポータ断片を再結合させる工程と、
(f)自動計測により前記レポータ分子の活性を測定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記レポータ分子が酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、リン光性蛋白質、単量体蛋白質、抗原もしくは抗体からなる群から選ばれることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記レポータ断片がオリゴヌクレオチド合成、完全な状態のレポータ分子の断片化、もしくは鋳型のDNA増幅によって作製されることを特徴とする請求項1乃至請求項6のいずれか1項に記載の方法。
- 光学的に検出可能なシグナルが前記アッセイで発生することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記アッセイで発生した前記シグナルが、蛍光、バイオルミネセンス、化学発光もしくはリン光であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記アッセイが、マルチウェルフォーマット、マイクロタイター・プレート、マルチスポットフォーマットもしくはアレイを用いて実施されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記アッセイが、蛍光分光法、発光分光法、蛍光励起細胞分析法、螢光励起細胞分離法、自動化されたの顕微鏡法、もしくは、自動化されたイメージング法(automated imaging)により実施されることを特徴とする請求項1乃至請求項6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アッセイが、生細胞、固定細胞、もしくは、細胞溶解液を用いて実施されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記PCAのレポータ断片に融合した分子が、(a)cDNAライブラリ・スクリーニング、(b)相互作用マッピング、および、(C)ペアの蛋白質間の相互作用の存在に関する予備知識、からなる群から選ばれる方法によって同定されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記アッセイのシグナルの細胞内分布、および/または、前記アッセイのシグナルの強度が測定されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記レポータ分子が、ジヒドロ葉酸還元酵素、ベータ・ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質もしくは黄色蛍光蛋白質であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記化合物が、合成分子、既知薬物、天然物、ペプチド、核酸、抗体および小型干渉性RNA(small interfering RNA)からなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 薬の発見のための蛋白質−断片の相補性アッセイであって、レポータ分子の別個の断片の再構築を含み、前記レポータ分子の断片の再構築によって光学的に検出可能なシグナルが発生することを特徴とするアッセイ。
- 薬の発見のための蛋白質−断片の相補性アッセイであって、前記アッセイのシグナルが自動化された計測により検出されることを特徴とするアッセイ。
- 前記レポータ分子が、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、リン光性蛋白質、単量体蛋白質、抗原、もしくは、抗体、からなる群から選ばれることを特徴とする請求項17に記載のアッセイ。
- 前記アッセイのシグナルが、蛍光、バイオルミネセンス、化学発光、もしくは、リン光であることを特徴とする請求項17もしくは請求項18に記載のアッセイ。
- マルチウェルフォーマット、マイクロタイター・プレート、マルチスポットフォーマットもしくはアレイを用いて実施されることを特徴とする請求項17に記載のアッセイ。
- 蛍光分光法、発光分光法、蛍光励起細胞分析法、螢光励起細胞分離法、自動化された顕微鏡法、もしくは、自動化されたイメージング法により実施されることを特徴とする請求項17に記載のアッセイ。
- 前記アッセイが、生細胞、固定細胞、もしくは、細胞溶解液を用いて実施されることを特徴とする請求項17に記載のアッセイ。
- 前記アッセイのシグナルの細胞内分布、および/または、前記アッセイのシグナルの強度が測定されることを特徴とする請求項17に記載のアッセイ。
- 前記レポータ分子が、ジヒドロ葉酸還元酵素、ベータ・ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質、もしくは、黄色蛍光蛋白質であることを特徴とする請求項17に記載のアッセイ。
- 薬の発見のためのアッセイ組成物であって、第1レポータ分子の複数の相補性の断片を含む、前記相補性の断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現し、各断片が別の分子に融合されていることを特徴とするアッセイ組成物。
- 薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
(a)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の第1断片と、
2)前記第1断片と融合している第2分子と、
を含む第1の融合産物と、
(b)1)前記第1レポータ分子の第2断片と、
2)前記第2断片に融合している第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)(a)および(b)の2つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物を含むことを特徴とするアッセイ組成物。 - 薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
(a)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の第1断片と、
2)前記第1断片と融合している第2分子と、
を含む第1の融合産物と、
(b)1)前記第1レポータ分子の第2断片と、
2)前記第2断片に融合している第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)(a)および(b)の2つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物を含むことを特徴とするアッセイ組成物。 - 薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
レポータ断片の融合産物をコードしている核酸分子を含み、
前記核酸分子が、
(a)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の複数の断片と、
2)前記第1レポータ分子の断片と融合している第2分子と、
を含む第1レポータ融合産物と、
(b)1)前記第1レポータ分子の第2断片と、
2)第2もしくは第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)(a)および(b)の2つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物をコードしている配列を含む、
ことを特徴とするアッセイ組成物。 - 薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
(a)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の第1断片と、
2)前記第1断片と融合している第2分子と、
を含む第1の融合産物と、
(b)1)前記第1レポータ分子の第2断片と、
2)前記第2断片に融合している第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第2レポータ分子の第1断片と、
2)前記第1断片と融合している第4分子と、
を含む第3の融合産物と、
(d)1)前記第2レポータ分子の第2断片と、
2)前記第2断片に融合している第5分子と、
を含む第4の融合産物と、
(e)(a)、(b)、(c)および(d)の融合産物の組み合わせと、
からなる群から選ばれる産物を含むことを特徴とするアッセイ組成物。 - 薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
レポータ断片融合産物をコードしている核酸分子を含み、
前記核酸分子が、
(a)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第1レポータ分子の断片と、
2)前記第1レポータ分子の断片と融合している第2分子と、
を含む第1レポータ融合産物と、
(b)1)断片同士が結合したときに検出可能な活性を発現する第2レポータ分子の断片と、
2)前記第2レポータ分子の前記断片と融合している第3分子と、
を含む第2の融合産物と、
(c)(a)および(b)の2つの融合産物と、
からなる群から選ばれる産物をコードしている配列を含むことを特徴とするアッセイ組成物。 - 薬の発見のためのアッセイ組成物であって、レポータ断片に動作可能に結合した少なくとも1つの対象分子を含む発現ベクターを有することを特徴とするアッセイ組成物。
- 薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
(a)構成的なもしくは誘導性プロモータと、
(b)レポータ断片に動作可能に結合した対象遺伝子(gene of interest)と、を含む発現ベクターを有することを特徴とするアッセイ組成物。 - 薬の発見のためのアッセイ組成物であって、
(a)第1レポータの断片に動作可能に結合した第1の対象分子と、
(b)第2レポータの断片に動作可能に結合した第2分子と、を含む少なくとも1つの発現ベクターを有することを特徴とするアッセイ組成物。 - 1つまたは1つ以上のレポータ断片が、蛍光蛋白質、生物発光蛋白質、化学発光蛋白質、リン光性蛋白質、酵素、単量体蛋白質、抗体、および、抗原からなる群から誘導されることを特徴とする請求項26に記載のアッセイ組成物。
- レポータ断片に融合する分子のうちの少なくとも1つが、受容体、腫瘍抑制遺伝子、キナーゼ、キナーゼ基質、腫瘍遺伝子、アダプタ蛋白質、ユビキチン様分子、および、転写因子からなる群から選ばれることを特徴とする請求項1、17もしくは26のうちのいずれか1項による方法、アッセイもしくは組成物。
- レポータ断片に融合する分子のうちの少なくとも1つが、p53、Chkl、ATR、ATM、Rad 51、PDK2、STAT1、FKBP、FRAP、p70S6キナーゼ、S6蛋白質、4E−BP1、PPP2A、TNFR、TRADD、FADD、NFカッパBのp65サブユニット、NFカッパBのp50サブユニット、CBP、TRAF2、ユビキチン、IKK−ベータ、IKK−ガンマ、IカッパBアルファ、MEK、ERK、PI−3−キナーゼ、PKB、Ft1、GCN4、PDK1、GSK3、NF−AT、および、カルシニューリン、ならびに、これらのドメイン、断片、もしくは、相同物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項1、17もしくは26のうちのいずれか1項による方法、アッセイ、もしくは、アッセイ組成物。
- 前記経路が、DNA損傷応答経路、受容体チロシンキナーゼ経路、サイトカイン依存性経路、栄養素活性化経路、プロテアソーム経路、成長因子依存性経路、マイトジェン活性化経路、ホルモン依存性経路、熱ショック蛋白質経路、ユビキチン経路、細胞周期経路、T細胞経路、もしくは、アポトーシス経路であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記アッセイが、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、熱ショック蛋白質阻害剤、E3リガーゼ阻害剤、転写因子阻害剤、蛋白質−蛋白質相互作用阻害剤もしくはプロテアソーム阻害剤をスクリーニングするために用いられるることを特徴とする請求項1、17もしくは26のうちのいずれか1項に記載の方法、アッセイ、もしくは、アッセイ組成物。
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