CN104204192A - 间充质干细胞调理的基质及其产生和使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了间充质干细胞调理的基质和用于制备调理的基质的方法。该方法包括在包含烟酰胺或烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的基质中培养MSC并且收集调理的基质。还提供了包含间充质干细胞调理的基质的组合物及其用途。

Description

间充质干细胞调理的基质及其产生和使用方法
技术领域和背景技术
本发明在其一些实施方案中涉及来自间充质干细胞培养物的培养基的制备和用途。
间充质干细胞(MSCs)是非造血细胞，其能够分化成特定类型的间充质或结缔组织，包括脂肪、骨、软骨、弹性、神经元、肝脏、胰腺，肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定分化路径取决于机械影响和/或内源性生物活性因子的各种影响，例如由宿主组织建立的生长因子、细胞因子和/或局部微环境条件。
MSC在整个成年有机体中位于不同的组织宿主中并且具有使对于这些组织为特异性的细胞类型“再生”的能力。这些组织的实例包括脂肪组织、脐带血、骨膜、滑膜、肌肉、真皮、周细胞、血、骨髓和海绵骨。
即使MSC在体外相对容易繁殖，在延长的培养期间它们的增殖潜力和它们的干细胞特性连续降低。例如，已显示培养物的扩充导致过早衰老(由连续形态和功能变化表征的老化过程)。细胞变得大得多，具有不规则和扁平的形状和细胞质变得较多粒状。这些与衰老相关的缺陷可连续从体外培养开始而获得(PLoS ONE,May 2008|Volume 3|Issue 5|e2213)。因此，对于由在培养物的扩充之后保持他们的特性的均匀MSC的一个供体的大批商业化的成功制造仍然是个挑战。
MSC被认为是免疫赦免的并且对于移植是有用的，因此进行了大量的间充质干细胞的培养和扩充。
当被移植时，MSC通过多个分泌的生物活性因子例如细胞因子、生长因子和血管生成因子施加它们对其它细胞的影响(Wang et al,J Hemat Oncol.2012,5:19)。培养的间充质和间充质干细胞将这些因子分泌成培养基，赋予该基质作为对细胞培养物的补充物、作为其治疗组合物或来源和作为对于MSC自身的使用的潜在经济的附属物或替代物的潜在有用的性质。
Xu等人的美国专利号6,642,048公开了来自用于多潜能干细胞的不含滋养层的培养的MSC细胞培养物的不含细胞的调理的基质，但需要hESC的转染。Herrera Sanchez等人的美国专利申请号2012/0251489教导了由肝干细胞制备不含细胞的调理的基质及其用于抑制肿瘤细胞增殖的用途。Habib等人的美国专利申请号20110262392教导了由特定的培养的粘附骨髓细胞群及其用于调节癌症细胞中的细胞凋亡。Lim等人的美国专利申请号20100323027教导了由采用添加FGF2(FGF碱性)生长的间充质干细胞的培养物制备不含细胞的调理的基质及其各种治疗用途。已经建议了来自培养的转基因的分化hESCs(Xu et al.,2004)和来自间充质干细胞与老鼠OP9细胞系的的共培养物(Barberi et al.,2005)，但是介绍了异低等动物传染源的致肿瘤性或感染的不可接受的风险。
其它的研究表明例如间充质干细胞调理的基质的潜力：用于抑制肺疾病中的肺纤维化的(Cargnoni et al,Cytotherapy 2012；14:153-61)，增强了肾疾病中的肾修复(van Koppen et al,PLoS one 2012；7:1-12)，刺激糖尿病大鼠中的血管发生和破裂修复(Wang et al,JTissue Eng Regen Med 2012；6:559-69)、促进伤口愈合(Yew et al Cell Transplantation,2011；20:693-706)和降低MI中的梗塞面积(Gnecchi et al,Meth Mol Biol 2009；482:281-94)。
在过去的几年里已经广泛研究了用于MSC中增加的增殖和存活的方法，并且提出了用于增加这些细胞的扩充效率的许多因素。不同的培养条件产生可以以不同方式调理基质的细胞。
例如，涉及MSC的扩充的许多方案包括在碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)的存在下培养(Vet Res Commun.2009Dec；33(8):811-21)。已显示b-FGF不仅包含MSC增殖潜力，而它还在整个早期促有丝分裂周期中保留成骨性、脂肪形成和软骨形成的分化潜力。
已显示血管内皮生长因子(VEGF)增加MSC增殖[Pons et al.,BiochemBiophys Res Commun 2008,376:419-422]。
已显示肝细胞生长因子(HGF)影响增殖、迁移和分化(Furge et al.,Oncogene 2000,19:5582-5589]。
衍生自血小板的生长因子(PDGF)为MSC的有效的促细胞分裂剂[Kang etal.,J Cell Biochem 2005,95:1135-1145]。
已显示表皮生长因子(EGF)和肝素结合的EGF两者促进MSC的体外扩充而不引发分化成任何特定的谱系[Kang et al.,J Cell Biochem 2005,95:1135-1145]。除了它对MSC的促有丝分裂的影响以外，EGF还增加了菌落形成单位的数目25％[Tamama et al.,J Biomed Biotechnol 2010.,795385]。
通过活化标准的Wnt路径添加Wnt3a同时增加了MSC的增殖和存活，同时防止分化成成骨细胞谱系。
已知在调理的基质中可以找到的其它生长因子引起间充质肝细胞分化成特定的谱系。已知转化生长因子β(TGFβ)例如影响体外软骨形成谱系的细胞，促进间充质浓缩、预软骨细胞增殖、制备细胞外基质和软骨特异性分子沉积，同时抑制终末分化[Bonewald et a.,J Cell Biochem 1994,55:350-357；LongobardiL,J Bone Miner Res 2006,21:626-636]。
已知增强骨分化的转化生长因子β组的另一个组员BMP-3，已被示出增加MSC增殖三倍[Stewart A et al.,Cell Physiol 2010,223:658-666].。
烟酰胺(NA)，尼克酸的酰胺形式(维生素B3)是碱交换基材和具有单和多ADP核糖基转移酶活性的依赖于NAD(+)-的有力的抑制剂。ADP核糖机化涉及不同设置的生物过程的改变(Corda D,Di Girolamo M.2003；22(9):1953-1958；Rankin PW,et al.,J Biol Chem.1989；264:4312–4317；Banasik M.et al.,J Biol Chem.1992；267:1569–1575；Ueda K,Hayaishi O,AnnuRev Biochem.1985；54:73–100；Smith S.Trends Biochem Sci.2001；26:174–179；Virág L,SzabóC.Pharm.Reviews.2002；54:375-429)。
WO 07/063545公开了烟酰胺用于造血干细胞群和/或祖细胞群的扩充用途。
WO 03/062369公开了烟酰胺、和CD38的其它抑制剂用于已知在体外扩充的干细胞和祖细胞中的分化的用途。然而，WO 03/062369没有教导施用烟酰胺特定的时间间隔或调理基质的制备或用途。
美国专利申请号20050260748教导了在低钙浓度的存在下采用烟酰胺分离和扩充间充质干细胞。
其它的背景技术包括Farre et al.,Growth Factors,2007Apr；25(2):71-6。
发明内容
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了制备调理的细胞培养基的方法，该方法包括(a)在包含烟酰胺的基质中培养间充质干细胞群，和(b)收集该调理的细胞培养基。
根据本发明的一些实施方案，在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的基质中实施所述培养间充质干细胞群。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了制备调理的细胞培养基的方法，该方法包括(a)在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的基质中培养间充质干细胞群，和(b)收集该调理的细胞培养基。
根据本发明的一些实施方案，在包含DMEM的基质中实施培养。
根据本发明的一些实施方案，在包含血清或血小板裂解物的基质中实施培养。
根据本发明的一些实施方案，间充质干细胞衍生自选自骨髓、脂肪组织、胎盘和脐带血的组织。
根据本发明的一些实施方案，烟酰胺选自烟酰胺、烟酰胺类似物、烟酰胺代谢产物、烟酰胺类似物代谢产物及其衍生物。
根据本发明的一些实施方案，在塑料表面实施培养并且间充质细胞为粘附塑料的细胞。
根据本发明的一些实施方案，MSC群由异质细胞群组成。
根据本发明的一些实施方案，至少70％的异质细胞群为MSC。
根据本发明的一些实施方案，基质的钙浓度大于1.8mM。
根据本发明的一些实施方案，实施培养至少一个星期，或至少3次传代。
根据本发明的一些实施方案，烟酰胺的浓度为1-20mM。
根据本发明的一些实施方案，FGF4的浓度为10-100ng/ml。
根据本发明的一些实施方案，在没有血小板衍生的生长因子(PDGF)或成纤维细胞生长因子2(FGF2)或两者的基质中实施所述培养。
根据本发明的一些实施方案，培养间充质干细胞群包括在没有烟酰胺的基质中培养间充质干细胞群第一时间段；然后在包含烟酰胺和FGF4的基质中培养该群第二时间段。
根据本发明的一些实施方案，在不诱发间充质干细胞的分化的条件下实施所述培养。
根据本发明的一些实施方案，没有烟酰胺的基质没有FGF4。
根据本发明的一些实施方案，没有烟酰胺的基质包含FGF4。
根据本发明的一些实施方案，实施在没有烟酰胺的基质中的培养至少一天。
根据本发明的一些实施方案，实施在没有烟酰胺的基质中的培养至少一个星期。
根据本发明的一些实施方案，该方法还包括浓缩该调理的基质。
根据本发明的一些实施方案，在包含血清的培养基中培养间充质干细胞第一时间段，然后在不含血清的培养物中培养第二时间段，并且其中从第二时间段的培养物收集该调理的基质。
根据本发明的一些实施方案，第二时间段为24-48小时。
根据本发明的一些实施方案，提供了通过本发明的方法制备的间充质干细胞调理的基质。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含1-20mM烟酰胺和降低水平的IL-6的间充质干细胞调理的基质，并且其中所述调理的基质具有抗发炎和促有丝分裂的活性。
根据本发明的一些实施方案，该调理的基质的特征在于：与来自没有采用添加的烟酰胺培养的间充质干细胞的调理的基质中至少一种因子的水平相比，提高水平的至少一种选自HGF、KGF和TGFβ的生物活性因子。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含本发明的调理的基质或其生物活性部分和药物可接受的辅药、稀释剂或载体的药用组合物。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含本发明的调理的基质或其生物活性部分和化妆品可接受的辅药、稀释剂或载体的药物化妆品组合物。
根据本发明的一些实施方案，本发明的调理的基质用于治疗需要其的受试者的发炎性疾病。
根据本发明的一些实施方案，发炎性疾病为迟发型超敏反应。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了培养细胞的方法，该方法包括在包含本发明的调理的基质的培养基中培养细胞。
根据本发明的一些实施方案，细胞为角质形成细胞。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含细胞和培养基的细胞培养物，该基质包含本发明的调理的基质。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明属于的领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文中描述的那些类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，仍然将合适的方法和材料描述如下。在冲突的情况下，以包括定义的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明属于的领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文中描述的那些类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，仍然将合适的方法和材料描述如下。在冲突的情况下，以包括定义的本专利说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
附图说明
参考所附的绘图和图像在本文中仅举例描述本发明的一些实施方案。现在详细地特别参考附图，强调所示的细节为举例并且出于本发明的实施方案的说明性讨论的目的。在这方面，获自附图的描述使本领域技术人员清楚可如何实践本发明的实施方案。
在附图中：
图1是说明碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，FGF2)对烟酰胺增加间充质干细胞的增殖的能力具有负面影响的棒图。
图2A-2B说明了肝素结合的EGF类生长因子(HB-EGF)对烟酰胺增加两个不同批次的间充质干细胞的增殖的能力具有负面影响。
图3A-D是说明了烟酰胺(NAM)和FGF4(50ng/ml)对间充质干细胞的扩充的协同活性。采用FGF4(50ng/ml)、NAM(5mM)或FGF4+NAM的组合处理四个不同批次的MSC培养物。显示了在所示的传代下的累积细胞计数。
图3E是具有和不具有FGF4的烟酰胺对通过培养物的5次传代的衍生自骨髓的MSC增殖的影响的图表。使用菲科(Ficoll)和塑料粘附方法分离衍生骨髓的间充质干细胞，并且采用胎牛血清将其培养几次传代。–NAM-FGF4＝对照物(浅蓝色圆)，-NAM+FGF4＝具有50ng/ml FGF4的培养物(深蓝色圆)，+NAM-FGF4＝具有5mM NAM的培养物(粉色圆)，+NAM+FGF4＝具有50ng/ml FGF4和5mM NAM的培养物(红色圆)。注意一起添加烟酰胺和FGF4在整个所有传代的MSC增殖中的协同效果。
图4A-B是说明烟酰胺(NAM)保持采用FGF4培养的MSC的未分化状态的图表。采用FGF4(50ng/ml)、NAM(5mM)或FGF4+NAM的组合处理两个不同批次的MSC培养物。通过Cedex细胞计数器分析细胞大小。
图5A-D是说明采用NAM+FGF4的组合扩充的细胞为未分化的MSC(CD105+CD45-)的图表。采用FGF4(50ng/ml)、NAM(5mM)或FGF4+NAM的组合处理四个不同批次的MSC培养物。通过FACS分析MSC(CD105+CD45-)的百分比。
图6A-D是说明在采用NAM+PDGF-BB的MSC扩充之后获得的不一致的结果的棒图。采用PDGF-BB(50ng/ml)、NAM(5mM)或PDGF-BB+NAM的组合处理四个不同批次的MSC培养物。显示了在所示的传代处的累积细胞计数。
图7A-D是说明采用PDGF-BB或PDGF-BB+NAM的组合处理的MSC培养物与在PDGF-BB的不存在下培养的MSC相比包含除了污染培养物的MSC以外的更高分数的细胞的图表。采用PDGF-BB(50ng/ml)、NAM(5mM)或PDGF-BB+NAM的组合处理四个不同批次的MSC培养物。通过FACS分析MSC(CD105+CD45-)的百分比。
图8A-B是说明NAM与FGF4之间一致的协同效果与FGF4与PDGF-BB之间的协同或附加效国的不存在的比较的柱图。此外，NAM、FGF4和PDGF-BB的组合对MSC扩充具有不利的影响。采用PDGF-BB(50ng/ml)、FGF4(50ng/ml)和NAM(5mM)或如所示的两个或三个因子的组合处理MSC培养物。显示了在所示的传代处的累积细胞计数。
图9A-B是说明PDGF-BB支持MSC培养物中除MSC以外的细胞扩充的图表。这种影响没有被NAM和/或FGF4所缓和。采用PDGF-BB(50ng/ml)、FGF4(50ng/ml)和NAM(5mM)或如所示的两个或三个因子的组合处理MSC培养物。通过FACS分析MSC(CD105+CD45-)的百分比。
图10A-H是说明PDGF-BB支持MSC培养物中除MSC以外的细胞扩充的第34天MSC培养物的照片。这种影响没有被NAM和/或FGF4所缓和。采用PDGF-BB(50ng/ml)、FGF4(50ng/ml)和NAM(5mM)或如所示的两个或三个因子的组合处理MSC培养物。
图11是说明在第一次传代之前在播种+/-NAM的培养物中表达间充质干细胞标记的衍生自BM的粘附细胞的百分比的棒图。在烟酰胺的存在或不存在下使用Ficoll和“塑料粘附”方法将单核细胞与骨髓分离。在3-4天后清洗掉非粘附细胞并且每3-4天更换基质。进行FACS分析以便获得在第一次传代之前(播种后8天)表面分子的表达水平。
图12A-C是说明在不同浓度的烟酰胺中六次传代之后衍生自脂肪组织的间充质干细胞的表型表征的棒图。
图13是说明在+/-不同浓度的烟酰胺中处理的培养物的第一次传代之后衍生自骨髓的间充质干细胞的表型表征的棒图。使用菲科(Ficoll)和“塑料粘附”方法将单核细胞与骨髓分离。在3-4天后清洗掉非粘附细胞并且每3-4天更换基质。进行FACS分析以便获得在第一次传代之后(播种后8天)表面分子的表达水平。
图14是说明不同浓度的烟酰胺(在第3次传代和在随后的每次传代添加)对第6次传代的MSC数目的影响。烟酰胺显著改进培养物中衍生自脂肪的间充质干细胞扩充。
图15是说明具有和不具有FGF4的烟酰胺对通过4次传代的培养物的衍生自脂肪的MSC增殖的影响的图表。使用胶原酶消化和塑料粘附方法将衍生自脂肪的间充质干细胞分离，并采用胎牛血清培养几次传代。–NAM-FGF4＝对照物(蓝色菱形)，+NAM-FGF4＝具有5nM NAM的培养物(红色正方形)，+NAM+FGF4＝具有50ng/ml FGF4和5mM NAM的培养物(绿色三角形)。注意到烟酰胺和FGF4一起添加对衍生自脂肪的MSC增殖的协同影响；
图16是详述具有和不具有FGF4的烟酰胺对在第4次传代的衍生自脂肪的MSC增殖中有核细胞增殖的影响的图表。如图15所述将衍生自脂肪的间充质干细胞隔离并培养。–NAM-FGF4＝对照物，+NAM-FGF4＝具有5nM NAM的培养物，+NAM+FGF4＝具有50ng/ml FGF4和5mM NAM的培养物。注意到烟酰胺和FGF4一起添加对培养物中总有核细胞的增殖的协同影响；
图17是说明在烟酰胺和FGF4的存在下培养衍生自脂肪的MSC对培养的间充质干细胞的大小的有益影响的棒图。如图15所述将衍生自脂肪的间充质干细胞分离并培养。通过Cedex细胞计数器分析细胞大小。–NAM-FGF4＝对照物，+NAM-FGF4＝具有5nM NAM的培养物，+NAM+FGF4＝具有50ng/ml FGF4和5mM NAM的培养物。注意到在烟酰胺的存在下生长的MSC细胞的较小大小，和采用烟酰胺和FGF4生长的甚至更小的MSC。
图18A-C是说明在烟酰胺的存在下培养对细胞大小和粒度的有益影响的图表和曲线图。图18C显示在烟酰胺的存在下生长的细胞较小和较少粒状的(大部分细胞在红色圆中)，这与没有采用烟酰胺生长的较大和较多粒状的细胞(黑色圆)截然相反。对于图18A，所使用的烟酰胺的浓度为5mM。
图19A-B是说明在烟酰胺的存在下生长的间充质干细胞比在相同条件下在烟酰胺的不存在下生长的间充质干细胞为更少粒状的图表和曲线图。
图20A-B是说明在第3次传代采用(图20B)或没有采用(图20A)培养的MSC上进行的体外伤口愈合化验的结果的照片。在伤口形成4天后观察到伤口愈合。
图21是说明烟酰胺对衍生自骨髓的间充质干细胞倍增时间的影响。从培养开始和在每个随后的传代添加烟酰胺。
图22是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的调理的基质的肝细胞生长因子(HGF)含量的提高的棒图。使用菲科(Ficoll)和塑料粘附方法将骨髓与间充质干细胞分离，并且添加烟酰胺和FGF4(+NAM+FGF4)、添加烟酰胺(+NAM-FGF4)和不添加烟酰胺或FGF(-NAM-FGF4)采用胎牛血清培养几次传代。在第4次传代24小时之前，改变基质并且添加不具有胎牛血清或FGF4的新鲜基质。收集来自第4次传代培养物的培养基并通过ELISA分析HGF含量。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝5mM NAM,+NAM+FGF4＝5mM NAM+50ng/ml FGF4。注意到组合的FGF4和烟酰胺对HGF分泌的明显影响；
图23是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的调理的基质的转化生长因子β(TGFβ)含量的提高的棒图。如上图22所示将骨髓间充质干细胞分离并培养。在第4次传代24小时之前，将培养基质改变成不具有胎牛血清或FGF4的基质，将其从第4次传代培养物收集并通过ELISA化验TGFβ含量。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝5mM NAM,+NAM+FGF4＝5mMNAM+50ng/ml FGF4。注意到组合的FGF4和烟酰胺对TGFβ分泌的明显影响；
图24是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的调理的基质的角质形成细胞生长因子(KGF)含量的提高的棒图。如上图22所示将骨髓间充质干细胞分离并培养。在第4次传代24小时之前，将培养基改变成不具有胎牛血清或FGF4的基质，将其从第4次传代培养物收集并通过ELISA化验KGF含量。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝5mM NAM,+NAM+FGF4＝5mMNAM+50ng/ml FGF4。注意到组合的FGF4和烟酰胺对KGF分泌的明显影响；
图25是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的调理的基质的细胞因子IL-6(IL-6)含量的降低的棒图。如上图22所示将骨髓间充质干细胞分离并培养。在第4次传代24小时之前，将培养基质改变成不具有胎牛血清或FGF4的基质，将其从第4次传代培养物收集并通过ELISA化验IL-6含量。-NAM,-FGF4＝对照物；+NAM–FGF4＝5mM NAM,+NAM+FGF4＝5mM NAM+50ng/ml FGF4。注意到组合的FGF4和烟酰胺对IL-6分泌的明显降低；
图26是说明来自经烟酰胺处理的MSC培养物的调理的基质对老鼠的迟发型超敏反应的免疫调节影响的棒图。使用菲科(Ficoll)和塑料粘附方法将骨髓间充质干细胞分离，并且采用添加烟酰胺(+NAM)和不添加烟酰胺(-NAM)采用胎牛血清培养几次传代。在第4次传代24小时之前，采用不具有胎牛血清的新鲜基质更换基质。在基质更换24小时之后收集来自第4次传代培养物的采用添加烟酰胺(+NAM)和不添加烟酰胺(-NAM)的培养物的培养基。以一个小时的间隔5次将添加烟酰胺(+NAM)、不添加烟酰胺(-NAM)的培养基或盐水(对照物)施加(局部)至在采用恶唑酮敏化6天之后采用恶唑酮激发的老鼠耳朵。在施加24小时之后测量的耳朵厚度表明与来自采用添加烟酰胺(5mM)培养的MSC的调理的基质的DTH反应的增强抑制。
图27说明浓缩来自经烟酰胺处理的MSC培养物的调理的基质对老鼠的迟发型超敏反应的免疫调节影响。如上图26将骨髓间充质干细胞分离并培养。在基质更换24小时后收集来自第4次传代培养物的添加烟酰胺(+NAM)和不添加烟酰胺(-NAM)的培养物的培养基，并且如上所述在(局部)施加至被激发的老鼠耳朵之前通过超滤将盐水(对照物)浓缩十倍。在施加24小时之后测量的耳朵厚度表明与来自采用添加烟酰胺(5mM)培养的MSC的调理的基质的浓缩的DTH反应的增强抑制。
图28是说明来自经烟酰胺和FGF-4处理的MSC培养物的调理的基质对老鼠的迟发型超敏反应的免疫调节影响的棒图。如上图26将骨髓间充质干细胞分离并且不添加烟酰胺或FGF4(-NAM-FGF4)、添加FGF4(-NAM+FGF4)和添加烟酰胺和FGF4(+NAM+FGF4)采用胎牛血清培养几次传代。在第4次传代24小时之前，改变基质并且添加不具有胎牛血清和不具有FGF4的新鲜基质。在基质更换24小时之后收集来自第4传代的培养基，并且在(局部)施加到如上所述激发的老鼠耳朵之前将其冷冻储存。在施加24小时之后测量的耳朵厚度表明与来自采用添加烟酰胺(5mM)和FGF4(50ng/ml)培养的MSC的调理的基质的DTH反应的抑制的协同增强。对照物＝盐水，没有调理的基质。–NAM-FGF4＝来自不具有NAM或FGF4的培养物的调理的基质，-NAM+FGF4＝来自具有50ng/ml FGF4的培养物的调理的基质，+NAM+FGF4＝来自具有50ng/mlFGF4和5mM NAM的培养物的调理的基质。
图29是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的调理的基质对老鼠的迟发型超敏反应的免疫调节影响的棒图。如上图26将骨髓间充质细胞分离并且添加烟酰胺(+NAM-FGF4)及添加烟酰胺和FGF4(+NAM+FGF4)采用胎牛血清培养几次传代。在第4次传代24小时之前，改变基质并且添加不具有胎牛血清和不具有FGF4的新鲜基质。在(局部)施加到如上所述激发的老鼠耳朵之前如图28收集和储存来自第4次传代培养物的培养基质。在施加24小时之后测量的耳朵厚度表明与来自采用添加烟酰胺(5mM)和FGF4(50ng/ml)培养的MSC的调理的基质的DTH反应的抑制的协同增强。对照物＝盐水，没有调理的基质。+NAM-FGF4＝来自具有5mM NAM并且不具有FGF4的培养物的调理的基质，+NAM+FGF4＝来自具有50ng/ml FGF4和5mM NAM的培养物的调理的基质。
图30是说明来自经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的调理的基质对老鼠的迟发型超敏反应的免疫调节影响依赖于时间的增加的棒图。如上图26将骨髓间充质细胞分离并培养。在第4次传代24或48小时之前将培养的基质变成不具有胎牛血清和不具有FGF4的基质。在施加24小时之后测量的耳朵厚度表明与来自采用添加烟酰胺(5mM)和FGF4(50ng/ml)培养的MSC的调理的基质(+NAM+FGF4＝来自具有50ng/ml FGF4和5mM NAM的培养物的调理的基质)的DTH反应的抑制的协同增强。对照物＝盐水，没有调理的基质。+NAM+FGF424小时＝来自采用NAM和FGF4培养、在更换基质24小时之后收集的细胞的调理的基质，+NAM+FGF448小时＝来自采用NAM和FGF4培养、在更换基质48小时之后收集的细胞的调理的基质；
图31A-31B是说明来自采用和不采用烟酰胺或烟酰胺和FGF4培养的间充质细胞的调理的基质对培养物中角蛋白细胞增殖的影响。图31A：在生长基质中培养正常人类角蛋白细胞一次传代，并且将其再播种在90％的生长基质和10％的来自采用(+NAM)和不采用5mM烟酰胺(-NAM)培养的MSC的调理的基质中。注意到对角蛋白细胞增殖的巨大影响。图31B：在生长基质中培养正常人类表皮角蛋白细胞，并且将其再播种在90％的生长基质和10％的来自采用(+NAM)和不采用5mM烟酰胺(-NAM)以及采用或不采用50ng/ml FGF4(+FGF4)培养的MSC的调理的基质中。注意到采用添加FGF4(+NAM+FGF4)的增殖增加。
图32A和32B是说明经烟酰胺和FGF4处理的MSC培养物的调理的基质对在活化的MNC中制备TNFα的影响。采用w/PHA活化外周血MNC并采用或不采用以所指出的比例添加调理的基质进行培养。在活化72小时之后的培养物上清液通过ELISA化验TNFα。图32A是调理的基质的单次施用－柱1－对照物－活化的MNC w/o调理的基质；柱2－对照物－未活化的MNC w/o调理的基质；柱3－活化的MNC w/相等体积添加调理的基质–NAM–FGF4；柱4－活化的MNC w/1/5体积添加调理的基质–NAM–FGF4；柱5－活化的MNCw/1/10体积添加调理的基质–NAM–FGF4；柱6－活化的MNC w/相等体积添加调理的基质+NAM+FGF4；柱7－活化的MNC w/1/5体积添加调理的基质+NAM+FGF4；柱8－活化的MNC w/1/10相等体积添加调理的基质+NAM+FGF4；柱9－对照物未活化的MNC w/相等体积添加调理的基质－NAM－FGF4；柱10－对照物未活化的MNC w/相等体积添加调理的基质+NAM+FGF4。+NAM＝5mM烟酰胺。+FGF4＝50ng/ml FGF4。图32B是调理的基质的三天连续施用－柱1－对照物－活化的MNC w/o调理的基质；柱2－对照物－未活化的MNC w/o调理的基质；柱3－活化的MNC w/1.66体积添加调理的基质–NAM–FGF4；柱4－活化的MNC w/0.83体积添加调理的基质–NAM–FGF4；柱5－活化的MNC w/0.28体积添加调理的基质–NAM–FGF4；柱6－活化的MNC w/1.66体积添加调理的基质+NAM+FGF4；柱7－活化的MNC w/0.83体积添加调理的基质+NAM+FGF4；柱8－活化的MNC w/0.28相等体积添加调理的基质+NAM+FGF4；柱9－对照物未活化的MNC w/1.66体积添加调理的基质－NAM－FGF4；柱10－对照物未活化的MNC w/1.66体积添加调理的基质+NAM+FGF4。+NAM＝5mM烟酰胺。+FGF4＝50ng/ml FGF4。注意到来自采用烟酰胺和FGF4生长的MSC的调理的基质的发炎反应强烈的依赖剂量的抑制。
具体实施方式
本发明在其一些实施方案中，涉及包含通过间充质干细胞的培养物调理的细胞培养基的组合物和制备该调理的基质的方法及其用途。特别地，本发明在其一些实施方案中，涉及来自采用烟酰胺或烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)培养的间充质干细胞的调理的基质。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解本发明不必要将其应用限制于以下的描述中提出或通过实施例例示的细节。本发明能为其它实施方案或能以各种方式实践或进行。
间充质干细胞(MSC)的多能特性使这些细胞成为有吸引力的治疗手段和用于移植的候选物，能在细胞和基因治疗策略两者的背景下在广泛的临床应用中起到重要作用。
此外，MSC由于它们分化、提供营养供养和调节先天免疫反应而对于再生医学和发炎状况的临床治疗是有吸引力的。正在用于指示的多种临床试验例如骨髓和软骨修复、心脏再生、临界性肢体缺血、急性局部缺血条件、糖尿病、局限性肠炎和移植物抗宿主病中测试MSC的治疗潜力。对细胞的分化潜力和目标组织移植潜力不具有有害影响的有效间充质干细胞扩充方案对于任何这些策略的成功是关键的。
虽然研究了生长因子对MSC扩充的影响，但是本发明人发现虽然当在烟酰胺的存在下培养时生长因子例如碱性FGF(bFGF)、HB-EGF或血小板衍生的生长因子(PDGF)对间充质干细胞增殖具有不可再现或甚至负面的影响(图1、2、6)，但是FGF4连同烟酰胺一起出乎意料地显示对间充质干细胞扩充/增殖的可再现的协同活性(图3A-3E)。
此外，本发明人表明烟酰胺对采用FGF4培养的间充质干细胞的细胞大小、对由细胞的标记表型证明的播种效率(图11-13)、对没有诱发分化的扩充(图12A-C)和对更均匀、更少粒状的MSC群的扩充(图20A-C和图21A-B)的预料不到的影响。此外，本发明人示出采用烟酰胺培养的MSC增殖更迅速从而降低倍增时间(参见图26)并显著更迅速达到融合(图14-17、26和27)。
本发明的一些实施方案利用的MSC培养物优选包括三种细胞族，这通过它们的形态特征定义：小和非粒状的细胞(以下称为RS-1)、小和粒状的细胞(以下称为RS-2)和大和适度粒状的细胞(以下称为成熟MSC)。通过使用例如免疫荧光法、原位混合和活性化验来识别各种细胞表面标记的存在或不存在，可化验培养物中这样的细胞的存在和浓度。
当在本发明的一些实施方案的培养条件下培养MSC时，它们表现出对于造血干细胞标记CD34、CD11B、CD43和CD45的负染色。小分数的细胞(小于10％)对于CD31和/或CD38可为微阳性的。此外，成熟MSC对于造血干细胞标记CD117(c-Kit)可为微阳性的，对于成骨MSC标记Stro-1可为适度阳性的[Simmons,P.J.&Torok-Storb,B.(1991).Blood 78,5562]并且对于胸腺细胞和外周T淋巴细胞标记CD90(Thy-1)可为阳性的。另一方面，RS-1细胞对于CD117和Strol标记为阴性的并且对于CD90标记为微阳性的，并且RS-2细胞对于所有这些标记为阴性的。
采用烟酰胺培养的间充质细胞可将生物活性因子分泌成基质。本发明人已观察到从采用烟酰胺培养的间充质细胞收集的基质包含提高水平的生长因子和细胞因子(例如肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、转化生长因子β)和降低水平的致炎因子(例如IL6)(参见实施例8和图28-31)。向基质添加FGF4还提高了基质中生长因子的水平，同时还降低了培养基中IL6的水平(参见实施例8)。观察到本发明的分离的培养基具有强烈的体外免疫调节性质(参见图32A和32B)、强烈的体内抗发炎作用(参见图26-30)以及培养物中细胞增强的增殖(参见图31A-31B)。
因此，根据本发明的一些实施方案的一些方面，提供了制备调理的培养基的方法，该方法包括(a)在包含烟酰胺的基质中培养间充质干细胞群，和(b)收集该调理的细胞培养基。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，在包含烟酰胺和FGF4的基质中培养间充质干细胞群。
因此，根据本发明的一些实施方案的其它方面，提供了制备调理的培养基的方法，该方法包括(a)在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的基质中培养间充质干细胞群，和(b)收集该调理的细胞培养基。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，该间充质干细胞为人类。
根据本发明的这个方面的另一个实施方案，将间充质干细胞与新生儿分离。
可将间充质干细胞与各种组织和脂肪组织分离，各种组织包括但不限于骨髓、外周血、血、胎盘(例如胎盘的胎儿侧)、脐带血、脐带、羊水、胎盘。如本文中使用的，术语“衍生自”是指间充质干细胞的来源组织。
由Kassis等人[Bone Marrow Transplant.2006May；37(10):967-76]描述了将间充质干细胞与外周血分离的方法。由Kern等人[Stem Cells,2006；24:1294-1301]描述了分离和培养脂肪组织、胎盘和脐带血间充质干细胞的方法。
可通过吸出将骨髓与个体的髂嵴分离。可通过FICOL-PAQUE密度梯度或通过使用Hetastarch(羟乙基淀粉)消除血红细胞来分离低密度BM单核细胞(BMMNC)。优选地，通过采用相等体积的汉克平衡盐溶液(HBSS；GIBCOLaboratories,Grand Island,NY,USA)稀释BM吸出物(通常20ml)并且在约10ml的菲科(Ficoll)柱(Ficoll-Paque；Pharmacia,Piscataway,NJ,USA)内将稀释的细胞分层，产生间充质干细胞结构。在2,500x g下离心30分钟之后，将单核细胞层从界面移除并悬浮在HBSS中。然后将细胞在1,500x g下离心15分钟并且重新悬浮在完整的基质中(MEM，不具有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的α基质；GIBCO)；20％衍生自许多为了MSC的快速生长而选择的胎牛血清(Atlanta Biologicals,Norcross,GA)；100个单位/ml的盘尼西林(GIBCO)，100μg/ml链霉素(GIBCO)；和2mM L-谷氨酰胺(GICBO)。
可通过抽脂法或注射器抽吸从任何含脂肪的组织例如从皮下脂肪获得衍生自脂肪组织的MSC，并且可通过脂肪和脂肪细胞的移除或使用Celution系统(Cytori Therapeutics)按照如上对于制备MSC所述的相同步骤手动分离单核细胞。
如提及的，该方法包括在包含烟酰胺和FGF4的基质中培养(例如体外或体内)间充质干细胞。
根据本发明的这个方面，在不诱发分化的条件下(例如在分化因子的不存在下或在未分化量的分化因子的存在下)培养细胞。
本发明考虑在从它们的来源分离之后直接培养间充质干细胞或培养对于间充质干细胞已进行预先选择的细胞群。因此，本发明考虑同时培养包含MSC的异质细胞群和对于MSC被富集的更均质的细胞群，其中大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％为MSC。此外，考虑的是与如下文进一步所述的培养同时富集MSC。
将理解异质细胞群的组成将取决于细胞的来源。因此，例如如果选择胎盘作为细胞来源，那么异质细胞群将包含胎盘细胞以及间充质干细胞。如果选择骨髓作为细胞来源，那么异质细胞群将包含血细胞。
根据一种方法，在聚苯乙烯塑料表面上(例如在烧瓶中)培养(体内或体外)细胞群从而通过移除非粘附细胞(即非间充质干细胞)来富集间充质干细胞。可在烟酰胺和FGF4中培养之前、在烟酰胺和FGF4中培养的同时和/或在烟酰胺和FGF4中培养之后实施该富集MSC的方法。因此，根据本发明的一些实施方案的一些方面，间充质干细胞为“粘附的”或“粘附塑料的”细胞(例如在移除非粘附的非间充质干细胞之后保持粘附于塑料表面的细胞)。
选择MSC的其它方法在本领域是已知的，包括例如抵抗间充质干细胞标记的阳性选择和/或抵抗造血干细胞和前体标记例如CD34、CD133、CD8等的阴性选择。确定蛋白质表面表达的方法在本领域中公知的。实例包括免疫方法例如FACS分析以及生物化学方法(细胞表面标记，例如放射、荧光、抗生物素蛋白-生物素)。
将理解还可在烟酰胺和/或FGF4中培养之后进行选择阶段。这还可作为预先选择阶段来实施或代替预先选择阶段。
如文本中使用的，术语“生长基质”或“基础基质”是指对于支持培养物中的细胞生长为有效的氨基酸、维生素、盐和营养素的溶液，但是通常这些化合物将不支持细胞生长除非补充其它的化合物。营养素包括可由细胞代谢的碳来源(例如糖如葡萄糖)以及对于细胞存活所必要的其它化合物。这些是由于一种或多种将对于合成化合物所必要的(一种或多种)蛋白质(例如基本氨基酸)编码的基因的不存在因而细胞自身不能合成的化合物，或相对于细胞可合成的化合物，由于它们的特别发展状态，将必要的生物合成蛋白质编码的(一个或多个)基因没有以充分水平被表达。许多生长基质在哺乳动物细胞培养物领域中是已知的，例如杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified EagleMedia)(DMEM)和DMEM/F12，但是可采用可补充有烟酰胺和/或FGF4和支持处于显著未分化状态的灵长类原始干细胞的生长的任何碱基质。
如本文中使用的，术语“调理的基质”是指进一步补充有衍生自在基质中培养的间充质干细胞、优选人类间充质干细胞的可溶性因子(“衍生自培养物的生长因子”)的生长基质。在一些实施方案中，调理的基质为通过骨髓或衍生自脂肪的间充质干细胞、特别是人类间充质干细胞的生长来调理的生长基质。用于将调理的基质与细胞培养物分离的技术在本领域中是已知的。在本发明的一些实施方案中，调理的基质基本上不含细胞。在该上下文中，“基本上不含细胞”是指与制备该调理的基质的培养物相比包含比每单位提及的细胞数少约10％、少约5％、1％、0.1％、0.01％、0.001％和0.0001％的调理的基质。如本文中使用的，术语“调理的基质”还包括已通过浓缩、过滤、提取、分级或其它用于保存、增加能力、改进稳定性、移除杂质等的手段来处理的基质。因此，调理的基质包括例如如下所定义的提取物和分级物。
将理解本发明人示出了在浓缩的调理的基质之后保留了根据本发明的方法制备的调理的基质的生物活性(参见图27)。这是明显的，因为所采用来浓缩调理的基质的超滤方法移除了很多小分子例如烟酰胺。不受单一理论限制，因而可建议调理的基质的生物活性不取决于如在生长基质中提供的相同浓度的烟酰胺的存在。因此，根据本发明的一些实施方案，调理的基质的生物活性不是调理的基质中烟酰胺的浓度的函数。
此外还将理解调理的基质还可包括在调理的基质的隔离和收集之后添加的其它组分，例如防腐剂、抗微生物剂和抗真菌剂、营养素、生物活性剂如细胞因子和炎症趋化因子、药物等。另外还可通过在使用或储存之前加热例如巴氏消毒法或高压灭菌来加工该调理的基质。可将调理的基质储存为冷藏或冷冻。在一个实施方案中，调理的基质可在约-5°至约-80℃下储存为冷冻的。在另一个实施方案中，将调理的基质脱水(例如烘干、冻干等)并干燥储存，并且在使用之前以所需的浓度(例如采用水)重新配制。在又一个实施方案中，可以以其干燥形式使用、施加或施用脱水的调理的基质(例如用于局部应用或具有赋形剂、载体等的配制剂)。
根据一些实施方案，在从间充质干细胞培养物移除生长基质和更换新鲜基质之后收集调理的基质。在一些实施方案中，在更换基质至少约12小时之后，在更换基质约24小时、约36小时、约48小时、约60小时或更长之后收集调理的基质。本发明人示出了在更换24小时之后收集时的调理的基质的生物活性是明显的，并且随着在更换之后培养物中的额外时间而提高(参见图30)。因此，根据一些实施方案，在更换24或48小时之后收集调理的基质。在一些实施方案中，更换基质，并且在恰好细胞的一次传代之前例如在第1次传代之前、在第2次传代之前、在第3次传代之前、在第4次传代之前或更多收集调理的基质。在一个实施方案中，在第3次传代之前或在第4次传代之前替换基质和收集调理的基质。
在一些实施方案中，在收集调理的基质之前用于更换的基质与在先前的培养周期期间使用的生长基质不同。在一些实施方案中，在收集调理的基质之前提供的更换基质(因此和调理的基质)是不含血清的基质。在另一个实施方案中，更换基质(因此和调理的基质)没有FGF4。
因此，根据本发明的一个实施方案的一个方面，将间充质干细胞在包含血清的培养基中培养第一时间段，然后在不含血清的培养基中培养第二时间段，并且从第二时间段的培养物收集调理的基质。在又一个实施方案中，将细胞在包含FGF4的培养基中培养第一时间段，然后在没有FGF4的培养基中培养第二时间段(并且由此收集调理的基质)。在又一个实施方案中，第一时间段的培养基包含血清和FGF4两者，并且第二时间段的培养基不含血清并且没有FGF4。
如本文中使用的，“烟酰胺”是指烟酰胺以及衍生自烟酰胺、其类似物的产物和烟酰胺或烟酰胺类似物的代谢产物，例如NAD、NADH和NADPH。
如本文中使用的，短语“烟酰胺类似物”是指已知与烟酰胺作用相似的任何分子。烟酰胺类似物的代表性实例包括但不限于苯甲酰胺、烟碱硫代酰胺(nicotinethioamide)(烟酰胺的硫醇类似物)、烟酸、α-氨基-3-吲哚丙酸和组蛋白/蛋白脱乙酰基酶的血清族的抑制剂。烟酰胺类似物衍生物的实例包括但不限于取代的苯甲酰胺、取代的烟酰胺和烟碱硫代酰胺和N取代的烟酰胺和烟碱硫代酰胺。
在一个特定的实施方案中，以至少约1mM至20mM的浓度供应烟酰胺。在其它实施方案中，以至少约1mM至10mM、例如约2.5mM、约5mM、约7.5mM的浓度供应烟酰胺浓度。
成纤维细胞生长因子4、FGF4(地图位置11q13.3)基因产品、FGF-4/HBGF-4/KFGF是衍生自前体蛋白质的N端30AA分裂的176AA长蛋白质。FGF-4包含单一N联接糖基化位置。未糖基化的FGF-4分裂成两种NH2端部阶段的肽(13和15kDa)，其为更加活性的，具有比野生型蛋白质具有更高的肝素亲和力。
根据一个特定的实施方案，FGF4是人类FGF4。重组FGF4蛋白质是可商购的(例如从Sigma Aldrich，在那里在杆状病毒中制备它并且在N端分裂以产生148AA蛋白质；或从Invitrogen，在那里在大肠杆菌中制备它)。
在一个特定的实施方案中，以至少约1-1000ng/ml的浓度向培养物供应FGF4。在其它实施方案中，以至少约10-200ng/ml、10-100ng/ml、例如约50ng/ml的浓度供应FGF4浓度。
在一个特定的实施方案中，包含烟酰胺和FGF4两者的培养基质没有其它的生长因子例如PDGF、HB-EGF或bFGF(FGF2)。
将理解当提到没有特定组分的基质时，本发明考虑该基质包含该组分，但是以低于其最小活性的浓度。因此，例如一定的基质可包含痕量的上述生长因子，然而，本发明的方法涉及没有外源性添加的生长因子的基质，其低于在商业基质的式子中包括的或起因于基质组分浓度的总体调整。因此，根据特定的实施方案，包含烟酰胺和FGF4的基质可包含任何上述的其它生长因子但以小于1ng/ml的浓度。
可向其添加烟酰胺和FGF4的典型细胞基质为杜尔贝科改良MEM(DMEM)。或者，细胞基质可为Ham's F12。其它考虑的基质包括HEM RPMI、F-12等。
将注意到许多培养基包含作为维生素补充物的烟酰胺，例如MEMα(8.19μM烟酰胺),RPMI(8.19μM烟酰胺),DMEM(32.78μM烟酰胺)和格拉斯哥(Glascow's)基质(16.39μM烟酰胺)，然而，本发明的方法涉及外源性添加的烟酰胺，其补充任何包括基质的式子的烟酰胺和/或烟酰胺部分，或起因于基质组分浓度的总体调整。
在本发明的一个实施方案中，细胞培养基具有大于约1.8mM或大于约2mM或大于约5mM的高钙浓度。将理解钙浓度计算为包括已经存在于培养基中的总钙浓度。
因此，例如如果基质为杜尔贝科改良MEM(DMEM)(其已经具有约1.8mM的钙离子浓度)，那么不需要添加额外的钙。如果细胞基质为具有约0.9mM的钙离子浓度的Ham's F12，那么应添加额外的钙从而总钙浓度高于1.8mM。在一个实施方案中，额外的钙来源可为血清。
在培养期间，基质可包含对于细胞新陈代谢所需的补充物例如谷氨酰胺和其它氨基酸、维生素、矿物质和有用的蛋白质例如转铁蛋白等。该基质还可包含防止受酵母、细菌和真菌污染的抗生素，例如盘尼西林、链霉素、庆大霉素等。如果要培养细胞，那么条件应接近生理条件(优选地，pH为约6至约8，并且温度为约30℃至约40℃)。
还考虑了常氧或缺氧条件。
根据一个实施方案，培养基不含血清(即不含血清的基质)并且包含血清替换物，其包括但不限于血小板裂解物(在播种和/或扩充期间)。
根据又一个实施方案，该基质包含约10％肽牛血清。还考虑了人类血清。
本发明人已示出，与来自没有添加烟酰胺和/或FGF4培养的细胞的调理的基质相比，来自根据本发明的一些实施方案的方法制备的间充质干细胞的调理的基质富集生物活性因子和试剂。特别地，本发明的调理的基质包含提高水平的生长因子(HGF、KGF和TGFβ)和降低水平的促炎因子IL-6(参见实施例6和图22-25)。
因此，根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了包含1-20mM烟酰胺和降低水平的IL-6并具有抗发炎和促有丝分裂的活性的间充质干细胞调理的基质。根据一些实施方案，调理的基质的特征还在于：与来自在没有添加烟碱或烟碱和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质中生长因子的水平相比，提高水平的至少一种选自肝细胞生长因子(HGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)和转化生长因子β(TGFβ)的生物活性因子。在一些实施方案中，因子的水平为比来自没有添加烟碱或烟碱和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质中生长因子的水平高约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约100％、约150％、约200％、约250％或更多。在一些实施方案中，IL-6的水平为比来自没有添加烟碱或烟碱和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质中IL-6的水平低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约100％、约150％、约200％、约250％或更多。
根据本发明的这个方面的培养可实施有限量的时间，使得不发生扩充(例如仅在播种阶段期间)或进行较长的时间段从而允许间充质干细胞扩充(例如细胞增殖)，由此获得其增加的数量。
对于每一轮的增殖，可使用胰蛋白酶/EDTA或通过细胞刮片收获粘附细胞，并且通过窄的Pasteur塑料吸液管而离解，并且优选在约100至约10,000个细胞/cm2的密度下重新成板(replated)。
根据本发明的这个方面，可采取足够细胞扩充的时间段意指对于至少一个细胞分解所需要的时间长度。
根据一个实施方案，实施培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少一个星期、至少两个星期、至少三个星期、至少四个星期或至少五个星期。
根据另一个实施方案，实施培养不超过十个星期。
根据又一个实施方案，使细胞扩充至少两个群体倍增数、至少四个群体倍增数、至少六个群体倍增数、至少八个群体倍增数、至少十个群体倍增数、至少15个群体倍增数、至少20个群体倍增数、至少25个群体倍增数、至少30个群体倍增数、至少35个群体倍增数、至少40个群体倍增数、至少45个群体倍增数。
根据另一个实施方案，使细胞扩充不超过50个群体倍增数。
本发明考虑间充质干细胞扩充以及(或者代替)在烟酰胺和FGF4中培养的其它方法。
由于本发明人发现当在烟酰胺的存在下实施扩充过程的至少一部分时间时，获得了增加数目的间充质干细胞，优选包括在烟酰胺的存在下培养的其它扩充方法。
因此，根据本发明的另一方面，通过培养经播种的间充质干细胞群持续对于细胞扩充为充足的时间段制备调理的基质，其中在没有烟酰胺的基质中实施培养至少一部分时间段，在包含烟酰胺和FGF4的基质中实施该培养，并且从扩充的细胞培养物收集调理的基质。
如本文中使用的术语“扩充”是指由于细胞复制而增加细胞群中的细胞数目。
根据本发明的这个方面，在不诱发分化的条件下(例如在分化因子的不存在下)使细胞扩充。
如上文进一步描述的，经播种的未分化间充质干细胞群可为异质细胞群或净化的间充质干细胞群。
如提到的，没有烟酰胺的基质是指包含小于最小有效量(例如小于0.5mM或更优选小于0.05mM)的烟酰胺的基质。因此包含痕量的烟酰胺(如上文描述的)基质可用于本发明的这个方面。因此，根据一个特定的实施方案，没有外源性添加烟酰胺的基质在添加外源性烟酰胺作为补充物之前可包含在小于0.5mM或更优选小于0.05mM的浓度下的烟酰胺。根据一个实施方案，MSC为至少50％净化的、至少75％净化的或至少90％净化的。
可在包括上文中描述的那些或在美国专利申请号20050260748(通过引用并入本文)中描述的那些的基质中播种间充质干细胞群。
在烟酰胺和FGF4的存在下培养与在不烟酰胺的不存在下培养的时间比可变化并且可包括来自1:99；2:98；3:97；4:96,5:95；6:94；7:93；8:92；9:91；10:90；11:89；12:88；13:87；14:86；15:85；16:84；17:83；18:82；19:81；20:80；21:79；22:78；23:77；24:76；25:75；26:7427:73；28:72；29:71；30:70；31:69；32:68；33:67；34:66；35:65；36:64；37:63；38:62；39:61；40:60；41:59；42:58；43:57；44:56；45:55；46:54；47:53；48:52；49:51；50:50；51:49；52:48；53:47；54:46；55:45；56:44；57:43；58:42；59:41；60:40；61:39；62:38；63:37；64:36；65:35；66:34；67:33；68:32；69:31；70:30；71:29；72:28；73:27；74:26；75:25；76:24；77:23；78:22；79:21；80:29；81:19；82:18；83:17；84:16；85:15；86:14；87:13；88:12；89:11；90:10；91:9；92:8；93:7；94:6；95:5；96:4；97:3；98:2；99:1的所有比例。
根据一个实施方案，在烟酰胺的存在下实施至少一个完整的增殖回合。
将理解可在没有烟酰胺的基质中培养之前或之后实施在包含烟酰胺的基质的培养。
根据本发明的实施方案，没有烟酰胺的基质包含FGF4(以与包含烟酰胺的基质相同或不同的浓度)。
根据本发明的其它实施方案，没有烟酰胺的基质还没有FGF4。
此外，本发明人考虑了在烟酰胺和FGF4的存在下多于1个培养阶段，其中穿插在烟酰胺的不存在下的培养阶段，并且反之亦然。
根据一个实施方案，实施在烟酰胺和FGF4的存在下的培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少一个星期、至少二个星期、至少三个星期、至少四个星期或至少五个星期。
根据另一个实施方案，实施在烟酰胺的不存在下的培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少一个星期、至少二个星期、至少三个星期、至少四个星期或至少五个星期。
如提到的，可基于间充质干细胞表面标记的表达来选择间充质干细胞。选择或分选可包括通过一个或多个这样的表面标记从混合的细胞群选择间充质干细胞(MSC)。选择或分选步骤的使用还增强了对于MSC的分选严格性和选择特异性，并且还潜在地减少了来自起始材料的污染。
在分选之前，通常通过使用细胞分散剂将混合的细胞群分散。优选获得单一细胞群。可用于分散细胞的试剂实例包括但不限于胶原酶、分散酶、accutase、胰蛋白酶(胰蛋白酶－EDTA)、木瓜蛋白酶。还可进行作为替代或者另外的研磨以增加细胞的分散。
根据一个特定的实施方案，通过选择表达高于预定水平的VCAM-1/CD106(NP_001069.1)的细胞来实施选择。
根据另一个实施方案，通过选择表达高于预定水平的CD105(SH2)、CD73(SH3/4)、CD44、CD90(Thy-1)、CD71、STRO-1、CD29、CD166、CD146、CD106和CD271中的至少一种的细胞来实施选择。
根据又一个实施方案，通过选择表达低于预定水平的CD34、CD11B、CD43和CD45中的至少一种的细胞来实施选择。
已知许多方法用于基于抗原表达的选择或分选，并且任何这些方法可用于这里描述的选择或分选步骤。在特别优选的实施方案中，使用流式细胞器实现分析并且随后基于每个细胞特定的光散射和荧光特性来分选细胞。因此，可通过荧光活化细胞分选(FACS)实现选择或分选。可用于本发明的这个方面的示例性流式细胞器由例如Becton Dickinson(USA),Backman Coulter(USA),Partec(德国)的公司制造。
对于不表达CD45的细胞通常富集上述的细胞群。因此，根据另一个实施方案，如由FACS测量的小于10％的间充质细胞表达CD45。根据又一个实施方案，如由FACS测量的大于90％的间充质细胞表达CD90。根据又一个实施方案，如由FACS测量的大于95％的间充质细胞表达CD90。根据又一个实施案，如由FACS测量的大于90％的间充质细胞表达CD44。根据又一个实施方案，如由FACS测量的上数细胞群中大于95％的细胞表达CD44。
如提到的，本发明人考虑了在本文中描述的方案之前、期间或之后培养间充质干细胞的额外步骤。这样的额外步骤可包括在塑料表面培养和/或额外的扩充步骤例如如上文描述的在烟酰胺中重新培养。
在一些实施方案中，例如通过基于台盼蓝(Trypan Blue)排除和图形分析的细胞计数器根据细胞大小选择细胞。合适的细胞计数器包括但不限于Cedex计数器(Roche Innovatis)。可根据本发明的任何方法培养的细胞数目可为包括从小批－例如100x104个细胞到大批－例如100x1012或100x 1013个细胞的任何数目。当需要大批时，通常在生物反应器中(或在多水平工业烧瓶中)培养细胞，根据被培养的细胞数目选择其尺寸。
可用于生长商业数量的MSC的烧瓶和盆子的实例包括例如CorningHYPERFlaskTM细胞培养物容器、Corning CellSTACKTM室、CorningHYPERStackTM细胞培养物容器、40堆叠室和NUNC自动细胞工厂操纵器。
如本文中使用的术语“生物反应器”是指其中在受监测和控制的环境和操作条件例如pH、温度、压力、营养素供应和废物移除下开发生物和/或生物化学过程的任何装置。根据本发明的一个方案，适用于本发明的基础级生物反应器包括静态生物反应器、搅拌烧瓶生物反应器，旋转壁生物反应器、中空纤维生物反应器和直接灌注反应器(如在WO 2005/007799中进一步描述，通过引用将其内容并入)。
如实施例8(参见图31A和图31B)所示，包含本发明的一些实施方案的调理的基质的细胞培养基增强了培养物中细胞(角质形成细胞)的生长。因此，可单独使用调理的基质作为用于细胞培养物的基质，或作为用于细胞培养物的其它生长基质的补充物。根据，本发明的一个实施方案的一个方面，提供了包含细胞和培养基的细胞培养物，该培养基包含根据本发明的方法制备的间充质干细胞调理的基质。在另一个实施方案中，提供了在细胞培养物中培养物的细胞群。根据一个实施方案，细胞可为在培养物中可生长的任何细胞，并且培养物可为原始培养物、细胞系等。在一个实施方案中，细胞培养物为间充质干细胞培养物或角质形成细胞培养物。
本发明人已示出本发明的一些实施方案的调理的基质包含生物活性，特别是抗发炎和促有丝分裂的活性(参见本文中的实施例7和8)。因此，本发明的调理的基质或通过本发明的方法产生的调理的基质可用于各种目的，包括用于治疗用途、用于化妆用途、用于营养用途，用于调理的基质的任何组分的制备等的研究。因此，根据本发明的一些实施方案的一些方面，提供了处理需要其的受试者的疾病或紊乱的方法，该方法包括给需要其的受试者施用治疗有效量的本发明的调理的基质。将注意到包含由间充质干细胞分泌的任何试剂的间充质干细胞调理的基质还可适用于替代采用间充质干细胞本身的治疗或作为其附属。
术语“处理”是指抑制、防止或阻止病状(疾病、紊乱或状况)的发展和/或促使病状的减少、缓和或消退。本领域技术人员将理解可使用各种方法和化验来评价病状的发展，并且类似地，可使用各种方法和化验来评价病状的减少、缓和或消退。
如本文中使用的，术语“防止”是指防止疾病、紊乱或状况在处于疾病风险但尚未被诊断患有该疾病的受试者中发生。
根据一个实施方案，疾病或紊乱选自骨或软骨疾病、神经变性疾病、心脏病、肝病、癌症、神经损害、伤口愈合、自身免疫疾病、移植物抗宿主疾病、脊髓损伤和组织再生。
适合于使用本发明的细胞处理的骨质缺损包括但不限于成骨不全、断裂、先天性骨质缺损等。
可使用本发明的调理的基质处理CNS疾病。可采用本文中的细胞有益地处理的CNS疾病或紊乱的代表性实例包括但不限于疼痛障碍、运动障碍、分离性障碍、心境障碍、情感障碍、神经变性疾病或障碍和痉挛性障碍。这样的状况的更具体的实例包括但不限于帕金森症、ALS、多发性硬化、亨廷顿氏疾病、自身免疫脑脊髓炎、糖尿病神经病变、青光眼神经病、黄斑变性、震颤和迟发性运动障碍、恐慌、焦虑、抑郁、酒精中毒、失眠、躁狂行为、阿尔茨海默氏症和癫痫。本发明的调理的基质可适用于关节状况的处理，包括但不限于骨关节炎、风湿性关节炎、炎症性关节炎、软骨软化、缺血性坏死、创伤性关节炎等。
间充质干细胞培养物调理的基质可用于增加移植的造血或其它干细胞的植入并且防止移植物抗宿主疾病，例如在骨髓抑制或用于如在用于心肌梗塞的移植中的组织修复的细胞移植。
组织再生：本发明的间充质干细胞调理的基质可用于促进组织再生。调理的基质的施用对于再生医学、自身免疫疾病、炎症状况、急性和慢性局部缺血状况整形外科、组织工程学、再生新组织和自然愈合患病或受伤的器官。
可使用本发明的间充质干细胞调理的基质来处理受试者的炎症性疾病或状况。炎症性疾病包括但不限于慢性炎症性疾病和急性炎症性疾病。
在一些实施方案中，炎症性疾病或状况与超敏反应相关。
与超敏反应相关的炎症性疾病
超敏反应的实例包括但不限于I型超敏反应、II型超敏反应、III型超敏反应、IV型超敏反应、速发型超敏反应、抗体介导的超敏反应、免疫复合物介导的超敏反应、T淋巴细胞介导的超敏反应和DTH。
I型或速发型超敏反应例如哮喘。
II型超敏反应包括但不限于，类风湿疾病、类风湿性自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、脊椎炎、强直性脊柱炎、全身性疾病、全身性自身免疫性疾病、全身性红斑狼疮、硬化症、全身性硬化症、腺疾病、腺性自身免疫性疾病、胰腺自身免疫性疾病、糖尿病、I型糖尿病、甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病，格雷夫丝病、甲状腺炎、自发自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、粘液性水肿、特发性粘液性水肿；自身免疫生殖疾病、卵巢疾病、卵巢自身免疫、自身免疫抗精子不育、反复流产、神经变性疾病、神经系统疾病、神经自身免疫性疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默氏病、重症肌无力、运动神经病、格-巴二氏综合症、神经病和自身免疫性神经病、肌无力疾病、朗–爱二氏肌无力综合征、副肿瘤性神经系统疾病、小脑萎缩，副肿瘤性小脑萎缩、副肿瘤性僵人综合征，小脑萎缩、进行性小脑萎缩、脑炎、罗斯默森脑炎、肌萎缩侧索硬化症、锡德纳姆舞蹈病、抽动秽语综合征、多内分泌腺病、自身免疫性多内分泌腺病；神经病、免疫不佳神经病；神经性肌强直、后天神经性肌强直、先天性多关节挛缩、心血管疾病、心血管自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、心肌梗死血栓形成、肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病、动脉炎、大动脉炎、川崎综合症；抗VIII因子自身免疫性疾病；脉管炎、坏死性小血管脉管炎、显微镜下多血管炎，许尔和斯特劳斯综合征、肾小球肾炎、微量免疫局部坏死性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎；抗磷脂综合征；心脏衰竭、心脏衰竭中的激动剂类β肾上腺素受体抗体、血小板减少性紫癜；溶血性贫血，自身免疫性溶血性贫血、胃肠道疾病、胃肠道自身免疫性疾病、肠疾病，慢性肠炎疾病、腹腔疾病(肌肉组织、肌炎的自身免疫性疾病，自身免疫性肌炎、干燥综合征；平滑肌自身免疫性疾病、肝脏疾病、肝自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化。
IV型或T细胞介导的超敏反应包括但不限于类风湿疾病、风湿性关节炎、全身性疾病、全身性自身免性疫病、全身性红斑狼疮、腺疾病、腺性自身免疫性疾病、胰腺疾病、胰腺自体免疫疾病、I型糖尿病；甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷斯夫病；卵巢疾病、前列腺炎、自身免疫性前列腺炎、多腺体综合征、自身免疫性多内分泌腺综合征、I型自身免疫性多内分泌腺综合征、神经系统疾病、自身免疫性神经系统疾病、多发性硬化症、神经炎、视神经炎、重症肌无力、僵人综合征、心血管疾病、心脏自身免疫美洲锥虫病、自身免疫性血小板减少性紫癜、防辅助性T淋巴细胞的自身免疫、溶血性贫血，肝疾病、自身免疫性肝疾病、肝炎、慢性活动性肝炎、胆汁性肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、肾疾病、肾自身免疫疾病、肾炎、间质性肾炎、结缔组织疾病、耳部疾病、自身免疫性结缔组织病、自身免疫性耳病、内耳疾病、皮肤病、皮肤疾病、表皮疾病、大疱性皮肤病、寻常性天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶性天疱疮。
迟发型超敏反应的实例包括但不限于接触性皮炎和药物性皮炎。
T淋巴细胞调节的超敏反应类型的实例包括但限于辅助T淋巴细胞和细胞毒性的T淋巴细胞。
辅助T淋巴细胞调节的超敏反应的实例包括但不限于Th1淋巴细胞介导的超敏反应和Th2淋巴细胞介导的超敏反应。
本发明的调理的基质可用于治疗自身免疫性疾病。
自身免疫性疾病包括但不限于自身免疫性心血管疾病、类风湿性疾病，自身免疫性腺疾病、自身免疫性胃肠道疾病、自身免疫性皮肤病、自身免疫性肝脏疾病、自身免疫性神经系统疾病、自身免疫性肌肉疾病、自身免疫性肾疾病、与繁殖相关的自身免疫性疾病、自身免疫性结缔组织疾病和自身免疫性全身性疾病。
自身免疫性心血管疾病的实例包括但不限于动脉粥样硬化、心肌梗塞、血栓形成、韦格纳肉芽肿病、大动脉炎、川崎综合征、抗因子VIII自身免疫性疾病、坏死性小血管脉管炎、显微镜下多血管炎、许尔和斯特劳斯综合征、微量免疫局部坏死和新月体性肾小球肾炎、抗磷脂综合征、抗体诱发心脏衰竭、血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、心脏自身免疫美洲锥虫病和抗辅助T淋巴细胞自身免疫。
自身免疫性类风湿疾病的实例包括但限于风湿性关节炎和强制性脊柱炎。
自身免疫性腺疾病的实例包括但不限于胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、格雷夫斯病、甲状腺炎、自发的自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、特发性粘液性水肿、卵巢自身免疫、自身免疫性抗精子不育、免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多内分泌腺综合征。疾病包括但不限于胰腺的自身免疫性疾病、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、特发性粘液性水肿、卵巢自身免疫、自身免疫抗精子不育症、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多内分泌腺综合征。
自身免疫性胃肠道疾病的实例包括但不限于慢性肠炎疾病、乳糜泻、大肠炎、回肠炎、节段性肠炎。
自身免疫性皮肤病的实例包括但不限于自身免疫性大疱性皮肤病，例如但不限于寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮和落叶性天疱疮。
自身免疫性肝疾病的实例包括但不限于肝炎、自身免疫性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化(和自身免疫性肝炎。
自身免疫性神经系统疾病包括但不限于多发性硬化、阿尔茨海默尔症、重症肌无力、神经病、运动神经病；格－巴二氏综合征和自身免疫性神经病、肌无力、朗－爱二氏肌无力综合症；副肿瘤性神经系统疾病、小脑萎缩、副肿瘤性小脑萎缩和僵人综合症；非副肿瘤性僵人综合症、渐进性小脑萎缩、脑炎、罗斯默森症、肌萎缩侧索硬化、西德纳姆舞蹈病、抽动秽语综合征和自身免疫性多内分泌腺疾病；免疫不佳神经病；获得性神经性肌强直、先天性多数关节弯曲、神经炎、视神经炎和神经变性疾病。
自身免疫性肌疾病的实例包括但不限于肌炎、自身免疫性肌炎和原生肖格伦症和平滑肌自身免疫性疾病。
自身免疫性疾病的实例包括但不限于肾炎和自身免疫性间质性肾炎。
与繁殖相关的自身免疫性疾病的实例包括但不限于反复流产。
自身免疫性结缔组织疾病的实例包括但不限于耳疾病、自身免疫性耳疾病和自身免疫性内耳疾病。
自身免疫性疾病的实例包括但不限于系统性红斑狼疮和系统性硬化症。
调理的介质可用于治疗传染病。
传染病的实例包括但不限于慢性传染病、亚急性传染病、急性传染病、病毒疾病、细菌病、原生动物疾病、寄生虫病、霉菌病、霉浆菌病和朊病毒病。
调理的基质可用于治疗移植物排斥。与移植物的移植相关的疾病的实例包括但不限于移植物排斥、慢性移植物排斥、亚急性移植物排斥、过急性移植物排斥、急性移植物排斥和移植物抗宿主疾病。
调理的基质可用于治疗过敏性状况或疾病。过敏性疾病的实例包括但不限于哮喘、寻麻疹、荨麻疹、花粉变态反应、粉尘螨过敏、毒液过敏、化妆品过敏、乳液过敏、化学品过敏、药物过敏、毒虫螫伤、动物皮毛变态反应、螫刺植物过敏、有毒常青藤和食物过敏。
调理的介质可用于治疗癌疾病。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。癌疾病的特别实例不限于：骨髓白血病例如慢性髓性白血病。成熟的急性髓性白血病。急性早幼粒细胞白血病。具有增加的嗜碱粒细胞的急性非淋巴细胞白血病，急性单核细胞性白血病。具有嗜酸性细胞增多症的急性髓单核细胞性白血病；恶性淋巴瘤例如非霍奇金淋巴瘤；淋巴细胞白血病，例如急性淋巴细胞性白血病。慢性淋巴细胞白血病，例如骨髓增生性疾病，例如实体瘤良性脑膜瘤、唾液腺的混合瘤、结肠腺瘤；腺癌，例如小细胞肺癌、肾、子宫、前列腺、膀胱、卵巢、结肠、肉瘤、脂肪肉瘤、安痢生、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤(肺泡)、骨骼外黏液样软骨肉瘤、尤因氏瘤；其它包括睾丸和卵巢无性细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、恶性黑色素瘤、间皮瘤、乳房、皮肤、前列腺和卵巢。
过滤和浓缩调理的基质：可将调理的基质预先过滤以移除大粒料例如细胞碎片，例如使用具有2.5微米等级的液体过滤袋以产生“过滤的基质”。对于某些应用，例如可通过超滤(合适错流中空纤维超滤药筒可从A/G TechnologyCorp.,Needham,Mass.获得)将过滤的基质浓缩。
调理的基质、浓缩的调理的基质、提取物和其分级物可被配置者用于制备包含具有化妆品可接受的、药物化妆品可接受的或药物可接受的载体的化妆品、药物化妆品或药物配制剂。本领域技术人员将理解化妆品可接受的、药物化妆品可接受的或药物可接受的载体可为相同或不同的，这取决于组合物预期的应用。
如本文中使用的，术语“药物化妆品”是指包含至少一种对产品用户具有影响的生物活性成分和至少一种药物化妆品可接受的载体的配制剂或组合物。药物化妆品可视为化妆品，在某些应用中和在合适的条件下可提供医学或类似药物的益处。在一些应用中，例如药物化妆品可影响皮肤下面的组织，降低皱纹深度、或逆转或改善光氧化或老化对皮肤的影响。药物化妆品作为皮肤护理产品、头发护理产品和防晒护理产品是特别有用的。在某些实施方案中，药物化妆品组合物包含递药系统，包括脂质体、环糊精、聚合物系统或透明质酸或相关化合物中的至少一种。药物化妆品组合物包含药物化妆品可接受的载体。本领域技术人员将理解适合用局部施加的药物可接受的载体或配制剂通常将是药物化妆品可接受的载体或配制剂。
局部化妆品或药物化妆品软膏、洗剂或凝胶组合物通常包含有效量的调理的基质或其提取物并且还可在化妆品或药物化妆品可接受的载体中包含其它活性和惰性成分，例如药物膏基底、水包油型乳液、油包水型乳液、凝胶等。用于局部使用的各种化妆和药物化妆品组合物包括包含调理的基质或提取物和合适的载体的滴剂、酊剂、洗剂、乳膏剂、油膏、浆液、溶液和软膏。每个组合物中调理的基质或提取物的优化百分比根据组合物的配方和所需要的治疗效果而改变。
配制剂领域的技术人员将理解本发明的组合物可包含任何多种化妆品、药物化妆品或药物可接受的配制剂，这取决于产品类型、组合物的属性、组合物的使用位置、所需的效果等。
虽然有产权的配制剂在配制剂领域是普通的，但是本领域普通配制员将能够确定或容易选择用于特定应用的合适配制剂而不需要过度的实验。
化妆品和药物化妆品可接受的成分的详细描述可在其它地方找到：FDACosmetics Handbook,U.S.Food and Drug Administration；Handbook of Cosmeticand Personal Care Additives,Ash and Ash,compilers,1994,Chemical Publishing,New York,N.Y.；Bennett's Cosmetic Formulary,1993,Chemical Publishing Co.；Harry's Cosmeticology,7th ed.,Wilkinson&Moore,1982和8th ed.,Rieger,2000,Chemical Publishing；Cosmetic Bench Reference-2001,Allerud Publishing Corp.；CTFA Compendium of Cosmetic Ingredient Composition,Nikitakis and McEwen,eds.,1990,Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association,Washington,D.C.,Surfactant Encyclopedia,2nd revised edition,Rieger,1996,Allured Publishing；TheChemistry and Manufacture of Cosmetics,2nd ed.,De Navarre,Van Nostrand,Princeton,N.J.；Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in Food,Drugs,and Cosmetics,Leung,1996,John Wiley；A Consumer's Dictionary of CosmeticIngredients,5th ed.,Winter,1999,Three Rivers Press,New York,N.Y.；Cosmeceuticals:Active Skin Treatment,1998,Allured Publishing；Handbook ofCosmetic Science and Technology,Knowlton and Pearce,1993,Elsevier AdvancedTechnology,Oxford,UK；Personal-Care Formulas,1997,Allured Publishing；Beginning Cosmetic Chemistry,Scheuller and Romanowski,1999,AlluredPublishing；和Skin Permeation:Fundamentals and Application,Zatz,1993,AlluredPublishing。药物可接受的成分和配制剂可在其它地方找到：Remington'sPharmaceutical Sciences,18th ed.,Gennaro,ed.,1990,Mack Publishing。
本发明的组合物和方法对于化妆品状况具有广泛的适用性。对于化妆品应用的施用模式通常为局部的，但是施用和给药方案将取决于寻找其调节的化妆品状况。本发明提供了用于个体化妆用途的方法、组合物和装备。如本文中使用的术语“个体”是包括人类以及其它哺乳动物。在一些实施方案中，该组合物、方法和/或/装备用于提供对需求和/或需要化妆处理的个体的化妆处理(例如经受烧伤或其它结疤的幼儿可能不需求处理但尽管如此可需要处理)。如本文中使用的术语“处理(treating)”和“处理(treatment)”包括获得化妆益处。化妆益处意指被处理的化妆状况的任何所需的调节。例如在具有皱纹的个体中，化妆益处包括皱纹外观的消灭或减轻。此外，获得与下面状况相关的一种或多种心理症状的消灭或减轻的化妆益处，使得在病人中观察到改善，虽然事实是病人可仍然受到化妆状况的影响。例如，调理的基质提供了化妆益处，不仅是在消灭化妆缺陷时，而且是相对于化妆缺陷及其伴随结果(例如心理结果)在个体中观察到改善时。在一些情况下，本发明的方法和组合物可旨在获得预防益处。“预防的”或“防止的”效果包括防止状况、延缓状况(例如皮肤老化)的进程或降低状况发生的可能性。如本文中使用的，“处理(treating)”或“处理(treatment)”包括预防。
可将本发明的调理的基质、其活性部分或提取物配制在药物可接受的载体、赋形剂或稀释剂中。这样的载体和稀释剂的使用在本领域中是公知的。
如果需要，本发明的组合物可存在于包装或分配设备例如FDA认可的装备中，其可包含一个或多个含有活性成分(例如细胞)的单位剂量形式。包装例如可包含金属或塑料箔，例如罩板包装。包装或分配设备可带有用于施用的说明。包装或分配装置可带有由政府机关规定的调节药物的制造、使用或销售的形式的公告。该公告反映由机关批准的用于人类或兽医施用的组合物的形式。这样的公告例如可包括由美国食品和药物管理局批准的处方药或定型产品插入物的标签。还可制备包含在药物可接受的载体中配制的制剂的组合物，将其置于合适的容器中，并且如上进一步详述的标记用于所指出的状况的处理。
可将本发明的调理的基质或根据本发明的方法制备的调理的基质、其提取物、分离物或部分本身施用于受试者，和/或以其中它与合适的载体和赋形剂混合的药物组合物施用。
如本文中使用的，“药物组合物”是指本文中描述的一种或多种活性成分与其它化学组分例如生理上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是便于向有机体施用化合物。
在下文中，短语“生理上可接受的载体”和“药物可接受的载体”可交换使用，是指不对有机体造成明显的刺激并且不取消所施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。佐药包括在这些短语中。
在本文中，术语“赋形剂”是指向药物组合物添加以进一步方便施用活性成分的惰性物质。赋形剂的实例包括但限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
可在最新版的“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,PA中找到用于药物的配制和施用的技术，通过引用将其完全并入本文。
合适的施用方法例如可包括口服、直肠、转化粘液质、特别是经鼻的、肠内或非口服的传递，包括肌肉注射、皮下和髓内注射，以及鞘内、直接心内、静脉、腹膜内、鼻内或眼内注射。
或者，可以在局部而不是以全身方式施用药物组合物，例如通过将药物组合物注射到患者的组织区域中。
根据本发明使用的药物组合物可以以常规方式使用一种或多种包含赋形剂和辅助物的生理上可接受的载体，其方便将活性成分加工成药物可使用的制剂。合适的配制剂取决于所选择的施用途径。
对于注射，可在水溶液中，优选在生理上可兼容的缓冲液例如Hank溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液配制药物组合物的活性成分。对于转化粘液质施用，在配制剂中施用对于待渗透的阻挡体合适的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通常是已知的。
适用于本发明的上下文的药物组合物包括其中以有效实施预期目的的量包含活性成分的组合物。更具体地，“治疗有效量”意指有效防止、减轻或改善紊乱(例如缺血)的症状或延长被处理的受试者的存活的活性成分(例如核酸组成)。
治疗有效量的确定在本领域技术人员的范围内，特别是考虑到本文中提供的详细公开。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂，可由体内和细胞培养物化验来评价剂量或治疗有效量。例如，在动物模型中配制剂量以获得所需的浓度或效价。这样的信息可用于更准确地确定人类的有用剂量。
本文中描述的活性成分的毒性和治疗效果可通过体外、在细胞培养物或试验动物中的标准制药步骤来确定。由这些在体外和细胞培养物化验和动物研究获得的数据可取决于所采用的剂量形式和所利用的施用途径而变化。精确的配制剂、施用途径和剂量可通过单个内科医生鉴于患者的状况来选择(例如参见Fingl,E.et al.(1975),"The Pharmacological Basis of Therapeutics,"Ch.1,p.1.)。
取决于待处理的状况的严重性和反应性，定量给药可为单次或多次施用，在持续几天至几个星期的的处理过程中，或直到实施治愈或获得疾病状态的减少。
待施用的组合物的量当然将取决于被处理的受试者、痛苦的严重性、施用方式、开处方的内科医生的判断等。如本文中使用的术语“方法”是指用于实现给定的任务的方式、手段、技术和步骤，包括但不限于要么是化学、制药、生物、生物化学和医学领域的从业人员已知的已知方式、手段、技术和步骤要么是其容易从已知方式、手段、技术和步骤开发的那些。
如本文中使用的，术语“处理”包括取消、基本上抑制、减缓或逆转状况的进展，基本上改善状况的临床或美学症状或基本上防止状况的临床外观或美学症状。
如上文描绘和如在下面的权利要求书部分中请求保护的本发明的各个实施方案和方面在以下的实施例中找到实验支持。
在以下并不旨在进行限制的实施例的审查时本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得明显。此外，如上文描绘和如在下面的权利要求书部分中请求保护的本发明的各个实施方案和方面在以下的实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例连同以上描述以非限制性方式说明本发明。
通常，本文中使用的命名法和本发明中利用的实验室步骤包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中得到充分解释。例如参见"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"CurrentProtocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubelet al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific AmericanBooks,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中提出的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites etal.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in CellularImmunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可得到的免疫测定广泛描述于专利和科技文献中，例如参见美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide toMolecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for ProteinPurification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；通过引用将所有这些并入，如同在本文中完整提出。在整个这篇文件中提供其它的通常参考。其中的步骤据认为在本领域是公知的并且被提供来便于读者。通过引用将其中所包含的所有信息并入本文
实施例
方法和实验步骤
分离：基于衍生自骨髓和衍生自脂肪组织的间充质干细胞在扩充基质中的塑料粘附潜力将它们分离，该扩充基质包含补充有0.05mg/ml庆大霉素(Sigma)和2mM L-谷氨酰胺(Biological Industries,Israel)的高葡萄糖DMEM和10％胎牛血清(FBS,Hyclone,Logan,UT,USA)。使细胞粘附3-4天并且洗涤掉非粘附细胞并改变基质。每3-4天进一步采用新鲜基质交换基质。
维护和扩充：一旦粘附细胞达到约80-90％融合，就采用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Sigma)将它们分离，在DMEM和10％胎牛血清中洗涤两次，伴随离心400g 5分钟，并且在相同的培养条件下以1：2至1：1000的稀释度重新成板。
细胞大小的测量：使用Cedex自动化细胞计数器(Innovatis)测量细胞大小。在Trypan Blue(Sigma)中以1：2稀释该细胞并且在显微镜下自动测量细胞大小。
粒度的测量：在胰蛋白酶处理之后，通过边散射FACS分析细胞的粒度(granularicity)。
培养物中细胞数目的测量：使用Cedex自动化细胞计数器(Innovatis)测量细胞数目。在台盼蓝(Trypan Blue)(Sigma)中以1：2稀释该细胞并且在显微镜下自动测量细胞数目。
表面抗原分析：在不同的时间点采用0.25％胰蛋白酶-EDTA将细胞分离。采用包含1％BSA的PBS溶液洗涤细胞，并且采用异硫氰酸荧光素(FITC)或结合枣红蛋白(PE)的抗体：105PE,105FITC(Serotec),45FITC,14FITC,HLA-DR FITC,106PE,31PE(BD),34PE(Dako),73PE,HLA class1PE,49b PE(Phamingen),29PE,44PE,54FITC,59PE,90PE(BioLegend)将其染色(在4℃下持续30分钟)。然后在上述的缓冲液中洗涤该细胞并且使用FACScaliburR流式细胞器(Becton Dickinson)进行分析。使用488nm氩激光束作为用于激发的光源，使细胞以最高至1000个细胞/秒通过。使用对数放大测量10000个细胞的发射，并且使用CellQuest软件(Becton Dickinson)进行分析。使用采用结合FITC和PE同型对照物抗体染色的细胞来确定背景荧光。
CFU-F化验：以50-100个细胞/cm2将培养的MSC播种在6套管(well)板上并且采用DMEM和10％FBS进行维护。在14天后使用10％冷甲醛(Sigma)将该细胞固定并采用苏木(Hematoxylin)(Sigma)染色。将克隆细胞(多于50个具有明显震中的细胞簇)染蓝紫色并且使用显微镜进行计数。
变老评价化验：使用变老β-半乳糖苷酶染色法装备(细胞信号传导)将培养的MSC染色。将细胞固定和染色，用于使用X-Gal在pH6下检测β-半乳糖苷酶活性和在干燥的孵卵器中在37℃中孵化过夜。
体外伤口愈合化验：使用200μl或1000μl尖端(tip)在～70％融合下在MSC培养物中进行创伤。四天以后使用10％冷甲醛(Sigma)将细胞固定并且采用哈里斯苏木(Harris Hematoxylin)(Sigma)染色。使用显微镜评价体外伤口愈合过程。
采用烟酰胺处理间充质培养物：如上所述开始间充质培养物，并且采用烟酰胺1-15mM单独或与生长因子组合或生长因子单独进行补充，在空气中5％CO2的潮湿气氛中在37℃下孵化。在每个传代处和在每个基质交换处，采用间充质基质、烟酰胺和生长因子补充培养物。
体外迁移化验：将RPMI加上含10％FCS(0.6ml)的100ng/ml CXCL12(R&D Systems)置于Costar 24-套管“transwell”培养物板(Corning,Inc,Corning,NY)的下室中。将100-μl基质中的细胞(2x105)在多孔膜(孔隙尺寸，5μm)上方引入上室中。在4小时后，从两个室收集细胞并且通过流式细胞计(FACSsort,Becton Dickinson and Co,San Jose,CA,USA)进行计数。进行自发迁移作为在下室中不具有CXCL 12的对照物。
寻靶的体外分析：不致命地辐照(在375cGy下以67cGy/分钟)NOD/SCID老鼠(8-10个星期大)(Harlan Ltd.,Israel)并且在24小时后经由尾部静脉接种在烟酰胺的存在下培养的标记有CFSE的间充质干细胞或在烟酰胺的不存在下培养的标记有CFSE的间充质干细胞。在注射24小时后老鼠牺牲并且获得骨髓或其它组织样品。通过流式细胞计经由CFSE染色的细胞相对于未标记的鼠细胞的背景的显影来检测人类细胞的寻靶。CFSE的明亮荧光足以将标记的人类细胞与未标记的鼠细胞分离至少一个对数。为了对人类祖细胞的寻靶进行定性，采用结合APC的抗人细胞标记单克隆抗体将骨髓细胞染色并且对CFSE+/细胞标记细胞进行计算。对于每个样品记录和分析100000个事件。
将间充质细胞移植到NOD/SCID老鼠中：使NOD/SCID老鼠繁殖并且保持在消毒的内通风的笼子(Techniplast,Bugugiatte,Italy)中。如上所述不致命地辐照八个星期大的老鼠。经由尾部静脉使老鼠接种在烟酰胺的存在或不存在下培养的间充质干细胞。为了避免供体可变性，混合来自几个装置的间充质干细胞并且将其用于扩充培养物以及集体注射。老鼠在第4个星期牺牲，通过采用在4℃下的IMDM冲洗它们的股骨和胫骨来获得骨髓样品。如上文描述的进行NOD/SCID骨髓细胞的流动细胞术分析，使用抵抗人类细胞表面分化抗原的单克隆抗体以识别人类细胞移植物。
统计－施加非参数的Wilcoxon Rank测试用于测试研究组之间的差异。施加的所有测试是两次定制的(two-tailed)，并且认为≤5％的p值是统计学上明显的。使用SAS软件(SAS Institute,Cary,NC)分析数据。
实施例1
烟酰胺对在生长因子的存在下培养的间充质干细胞的分析
材料和方法
选择间充质干细胞并且将其在特别的生长因子(碱性成纤维细胞生长因子-bFGF，肝素结合的表皮生长因子-HB-EGF，成纤维细胞生长因子4-FGF-4和衍生自血小板的生长因子、二体、子单元B、PDGF-BB)存在下在烟酰胺的存在或不存在下培养三次或四次传代并且计算细胞的数目和大小。
检查了两种浓度(10和50ng/ml)的以下因子中的每个因子。
实验组如下：
1组：对照物
2组：10ng/ml生长因子
3组：50ng/ml生长因子
4组：5mM NAM
5组：5mM NAM+10ng/ml生长因子
6组：5mM NAM+50ng/ml生长因子
此外，与单个补充物相比检查了组合：5mM NAM+50ng/ml FGF4+50ng/ml PDGF-BB的影响。
结果
图1说明了碱性FGF对烟酰胺增加间充质干细胞的增殖的能力具有负面影响。
图2A-B说明了肝素结合的类EGF生长因子(HB-EGF)对于烟酰胺增加间充质干细胞的增殖的能力具有负面影响。
图3A-3E、4A-4B和5A-5D说明了烟酰胺对FGF4增加不同来源的间充质干细胞的增殖的能力的潜在影响。
图6A-D说明了PDGF-BB对烟酰胺增加间充质干细胞的增殖的能力的不一致的影响。
图7A-D说明了与没有采用PDGF-BB处理的培养物相比，采用PDGF-BB或PDGF-BB+NAM的组合处理的MSC培养物受到除了MSC以外较高分数的细胞污染。
图8A-B、9A-B和10A-H说明了与在PDGF-BB的不存在下FGF4和烟酰胺的影响相比三种因子–FGF4、烟酰胺和PDGF-BB的组合对间充质干细胞的增殖具有不利的影响。
实施例2
烟酰胺对源自骨髓的间充质干细胞培养物的影响
本发明人示出烟酰胺增加了衍生自骨髓的MSC的播种效率(选择)。在图11和13中显示了在烟酰胺中一次传代后这些细胞的表型表征。图3E、15、21说明了烟酰胺对衍生自骨髓的MSC的扩充速率的影响。较低浓度的烟酰胺(例如0.1mM)对于衍生自骨髓的MSC的扩充速率具有不明显的影响(未示出图)。图18A-18C和19A-B说明了在烟酰胺的存在下生长的间充质干细胞比在相同条件下在烟酰胺的不存在下生长的间充质干细胞更小并且较少粒状。
实施例3
烟酰胺增加了衍生自脂肪组织的间充质干细胞的扩充
在图12A-12C中显示了衍生自脂肪组织的MSC的表型表征。如图14-17所示，烟酰胺实质上改进培养物中衍生自脂肪的间充质干细胞扩充。当在烟酰胺和FGF4的存在下培养衍生自脂肪的间充质干细胞(图15-17)时，观察到培养物中的完整细胞(图15)和培养物中的有核细胞(图16)两者的增殖的协同增强。扩充的衍生自脂肪的间充质干细胞大小的测量表明烟酰胺增强了较小(较少分化)的细胞群的生长(图17)，并且在FGF4和烟酰胺的组合下培养导致甚至更小的细胞群的增加的增殖。
实施例4
烟酰胺对间充质干细胞的影响的进一步分析
材料和方法
如上所述采用塑料粘附方法将间充质干细胞分离，并且采用肽牛血清,±NAM培养几次传代。在NAM的存在下选择细胞。
在约80％的融合下，在胰蛋白酶处理后收集粘附细胞、对其进行计数、表征和在1x103个细胞/cm2的浓度下重新播种。
VCAM1/CD106的测量：在胰蛋白酶处理后使用抗人类CD106PE抗体针对FACS中的CD106表达分析来分析细胞。
CD54的测量：在胰蛋白酶处理后使用抗人类CD54抗体针对FACS中的CD54表达分析来分析细胞。
结果
采用烟酰胺培养的大批间充质干细胞还显示增强的增殖能力，这表明可以采用较少传代制造大批商业MSC，因而确保因通过烟酰胺保存干细胞特性所致的较短的培育时间和较高品质的治疗细胞。此外还有，在烟酰胺中培养之后减少了衰老细胞的数目。烟酰胺的这种效果不取决于任何特定批次的血清(没有示出数据)。
图20说明了在烟酰胺的存在下生长的间充质干细胞比在相同的条件下在烟酰胺的不存在下生长的间充质干细胞具有更高的伤口闭合能力。
实施例5
组合的烟酰胺和FGF4对培养物中源自脂肪的间充质干细胞的影响
在至多4次传代的培养物中评价采用烟酰胺并且采用或不采用额外的FGF4培养的衍生自脂肪的间充质干细胞中的增殖和细胞大小分布。
图15-16说明了与对照物以及经烟酰胺处理的培养物相比组合的烟酰胺和FGF4对衍生自脂肪的粘附细胞增殖(以培养物中完整有核细胞的数目表示)的显著影响。
培养物中间充质干细胞的大小经常用作MSC的分化程度的指示，未分化的状态在较小大小的细胞中更普遍。图17说明了在暴露于烟酰胺的衍生自脂肪的MSC的培养物中较小大小的细胞提高的普遍性，而在暴露于烟酰胺和FGF4的衍生自脂肪的MSC中较小大小的细胞更高的普遍性。
因此，这些结果表明烟酰胺和FGF4的组合协同增加了衍生自脂肪的间充质细胞的增殖速率，同时有效地保持细胞处于未分化状态。
实施例6
采用烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质中的生物活性分子
与在未补充的基质中培养的间充质干细胞或采用仅添加烟酰胺培养的间充质干细胞相比，采用烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞具有增强的扩充潜力并保持未分化状态。为了评价采用烟酰胺或烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞是否以独特的方式对间充质干细胞进行改性，在从基质耗尽FGF4之后通过ELISA测量生物活性分子分泌成培养基。
如通过ELISA化验的，来自采用烟酰胺或烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质表现出生物活性因子的独特曲线。图22-25说明了与仅烟酰胺相比，肝细胞生长因子(HGF，图22)、转化生长因子β(TGF-β，图23)和角质形成细胞生长因子(KGF，图24)与结合的FGF4和烟酰胺的明显增加。图25显示所分泌的促炎白细胞介素6(IL-6)中烟酰胺的减少和采用添加FGF4的IL6中的进一步减少。
因此，采用烟酰胺或烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞制备了通过提高浓度的生长因子和减少的促炎因子表征的调理的基质。
实施例7
采用烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质对发炎过程的影响
在从基质耗尽FGF4之后，对于在体内和体外化验两者中的抗发炎活性化验来自采用烟酰胺或烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质。
体内迟发型超敏反应化验：体内迟发型超敏反应化验测量对变应原激发的皮肤发炎反应并且涉及巨噬细胞、嗜碱粒细胞和T细胞的快速募集。当在体内迟发型超敏反应测试中化验来自采用烟酰胺培养的间充质肝细胞的基质时，清楚地观察到对采用敏化变应原(恶唑酮)激发的发炎反应的减少。施加来自采用FGF4不采用烟酰胺生长的间充质干细胞的调理的基质导致迟发型超敏反应的适度抑制。采用来自采用烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质观察到甚至更大的协同抑制(图28和图29)。
发现调理的基质的生物活性随着与培养的间充质干细胞接触的时间长度而增加。当在血清耗尽和基质更换24或48小时之后收集来自采用烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质并在迟发型超敏反应化验中进行测试时，清楚地观察到培养物中24-48小时的调理的基质(图30)的免疫调节能力的增加，这表明随着培养物延长的时间的增强的抗发炎能力。因此，尽管在培养物中24小时后调理的基质清楚地具有生物活性，但是任选地在大于24小时后收集的调理的基质可具有更大或额外有利的活性。
体外混合的类淋巴细胞化验：体外混合的类淋巴细胞化验测量了外周血单核细胞(>50％T细胞)对活化的发炎反应，并且允许评价外源性添加的因子对发炎过程的影响。当采用来自没有采用烟酰胺或FGF4培养的间充质干细胞的培养基对单核细胞基质进行补充，以剂量依赖性的方式明显提升了响应PHA活化的TNFα的分泌(参见图32A，第3-5栏)。采用来自采用烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的培养基进行补充以剂量依赖性的方式明显抑制了TNFα在活化的细胞中的分泌(参见图32A，第6-8栏)。
在3天时期内采用调理的基质重复对单核细胞基质进行补充时，采用来自没有采用烟酰胺或FGF4培养的间充质细胞的调理的基质观察到对PHA活化的发炎响应的甚至更大的提高(参见图32B，第3-5栏)。采用来自采用烟酰胺和FGF4培养的间充质细胞的调理的基质进行重复的补充再次以剂量依赖性的方式强烈地抑制了单核细胞的发炎响应。因此，虽然来自没有采用烟酰胺和FGF4的间充质干细胞培养物的调理的基质并不固有地包含抗炎潜力(至少如由混合淋巴细胞反应所测量的)，但是来自采用烟酰胺和FGF4培养的MSC的间充质干细胞培养的调理的基质具有独特、可定性的生物性质(例如抗发炎)，这源自于采用烟酰胺和FGF4的培养。
实施例8
采用烟酰胺和FGF4作为生长补充物培养的间充质干细胞的调理的基质
采用烟酰胺或烟酰胺和FGF4培养间充质干细胞导致一些生长因子增加的分泌成基质(参见上面的实施例6)。对于其对体外角质形成细胞增殖的影响，化验了来自采用烟酰胺或烟酰胺和FGF4培养的间充质干细胞的调理的基质。
图31A显示了采用添加10％v/v的来自采用5mM烟酰胺培养的间充质干细胞的调理的基质的体外正常人类表皮角质形成细胞增殖的明显增强，其显著高于没有采用烟酰胺培养的间充质干细胞的调理的基质的影响。从采用+NAM+FGF4调理的基质的增强的角质形成细胞增殖清楚的是向间充质干细胞采用烟酰胺和FGF4两者生长的间充质干细胞制备了比来自仅采用烟酰胺培养的间充质干细胞的调理的基质甚至更大的促有丝分裂潜力(参见图31B)。
这些结果显示，由用烟酰胺或烟酰胺与FGF4培养的附着的间充质干细胞调理的培养基质包含生物有效因子，包括抗炎和增殖诱导(致有丝分裂的)活性。
实施例9
来自经烟酰胺处理的间充质干细胞培养物的调理的基质增加了趋化因子受体和粘附分子的功能性
为了确定来自经烟酰胺和经烟酰胺-FGF4处理的间充质干细胞培养物的经调理基质的影响中粘附和相关分子的作用，可测试调理的基质对粘附分子的体外迁移和功能性的影响。
使用变化套管(trans-well)迁移化验，测试了暴露于调理的基质(例如间充质干细胞)的细胞的CXCL-12诱发的迁移，评价了调理的基质对整联蛋白和粘附分子功能的影响。与来自没有采用烟酰胺培养的细胞或非培养的细胞的调理的基质相比，迁移受来自烟酰胺的调理的基质和/或经烟酰胺处理的FGF4细胞的增强刺激暗示采用来自经烟酰胺处理的细胞来处理间充质细胞可潜在地增加粘附分子对它们的配体的响应，导致经调理基质处理的细胞的增强植入和寻靶潜力。
还使用剪切流动分析调查了与粘附细胞结合的细胞的功能品质。经烟酰胺和/或经烟酰胺和FGF4处理的细胞的调理的基质对粘附细胞调节的结合和基材粘附分子上的保留的强烈影响可由抵抗移除的初始沉降细胞明显增强的百分比所表明：暴露于来自采用烟酰胺或烟酰胺和FGF4处理的间充质细胞的调理的基质的细胞中可见的剪切应力。
实施例10
来自经烟酰胺处理的间充质干细胞培养物的培养基质增加了培养细胞的SCID再繁殖能力
针对通过NOD/SCID老鼠的再繁殖增强移植细胞的寻靶和移植，测试来自经烟酰胺和经烟酰胺-FGF4处理的间充质干细胞培养物的调理的基质。为了评价再繁殖能力，采用暴露于来自经烟酰胺和经烟酰胺-FGF4处理的间充质干细胞培养物以及未处理的未培养的间充质干细胞和在假的调理的基质(来自仅在细胞因子中培养的细胞的调理的基质)。移植旨在实现次优移植的一定范围内的剂量的细胞，并且随后在一部分老鼠中不移植。在移植4个星期后评价人类细胞移植。如果0.5％的受体骨髓细胞表达人类CD45细胞抗原(CD+45)，那么将老鼠评分为积极移植。在暴露于来自经烟酰胺和经烟酰胺-FGF-4处理的间充质干细胞培养物的调理的基质导致间充质细胞以预定的剂量范围在老鼠中的优异和明显的移植的情况下，虽然未处理的细胞没有移植或移植差，可得出结论：调理的基质对于增强移植的间充质细胞的移植和寻靶是有效的。
实施例11
烟酰胺增加了培养的间充质细胞的组织寻靶
为了评价来自经烟酰胺和经烟酰胺-FGF4-处理的间充质干细胞培养的调理的基质对培养的间充质干细胞的寻靶的影响，采用暴露于来自经烟酰胺和经烟酰胺-FGF4-处理的间充质干细胞培养物以及未处理的非培养的间充质干细胞和在假的调理的基质中培养的间充质干细胞的调理的基质(来自仅在细胞因子中培养的细胞的经调理基质)不同的时间段。在移植之前，采用CFSE标记细胞。通过FACS对寻靶到受体老鼠的老鼠骨髓的移植24小时后的总的标记CFSE的细胞和标记CFSE的间充质细胞进行定量。
结果表明调理的基质对间充质细胞的组织寻靶的影响，如果经调理的基质处理的间充质细胞的寻靶明显高于没有暴露于调理的基质的间充质细胞的寻靶。
理解本发明的某些特征，出于清楚的目的而在分别的实施方案中描述，还可以以在单一实施方案中组合提供。相反地，本发明的某些特征，出于简洁的目的而在单一实施方案中描述，还可分别或以任何合适的组合提供。
尽管已结合其特定实施方案描述了本发明，但是可见的而是许多替代、改变和变化对于本领域技术人员将是明显的。因此，旨在包括所有这样落入所附的权利要求的精神和宽泛范围的替代、改变和变化。通过引用将在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以及基因库登录号以其全部并入本文，其程度如同通过引用具体和分别指出将每个单独的出版物、专利和专利申请或基因库登录号纳入本文中。此外，本申请中任何参考文献的引用或确定不应视为承认这样的参考文献作为本发明的现有技术而可获得。

Claims (36)

1.一种制备调理的细胞培养基的方法，该方法包括(a)在包含烟酰胺的基质中培养间充质干细胞群，和(b)收集该调理的细胞培养基。
2.权利要求1的方法，其中在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的基质中实施所述培养所述间充质干细胞群。
3.制备调理的细胞培养基的方法，该方法包括(a)在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的基质中培养间充质干细胞群和(b)收集该调理的细胞培养基。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在包含DMEM中的基质中实施所述培养。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在包含血清或血小板裂解物的基质中实施所述培养。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中该间充质干细胞由选自骨髓、脂肪组织、胎盘和脐带血的所组成的组的组织取得。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述烟酰胺选自由烟酰胺、烟酰胺类似物、烟酰胺代谢产物、烟酰胺类似物代谢产物及其衍生物所组成的组。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其中在塑料表面上实施所述培养。
9.权利要求8的方法，其中所述间充质干细胞为粘附塑料的细胞。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述MSC群包含于异质细胞群中。
11.权利要求10的方法，其中所述异质细胞群的至少70％为MSC。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述基质的钙浓度大于1.8mM。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中实施所述培养至少1个星期。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中实施所述培养至少3次传代。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述烟酰胺的浓度为1-20mM。
16.权利要求2-15中任一项的方法，其中所述FGF4的浓度为10-100ng/ml。
17.权利要求1-15中任一项的方法，其中在没有血小板衍生的生长因子(PDGF)或成纤维细胞生长因子2(FGF2)或两者的介质中实施所述培养。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述培养所述间充质干细胞群包括在没有烟酰胺的基质中培养间充质干细胞群第一时间段；然后在包含烟酰胺和FGF4的基质中培养所述群第二时间段。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中在不诱发所述间充质干细胞的分化的条件下实施所述培养。
20.权利要求18的方法，其中所述没有烟酰胺的基质没有FGF4。
21.权利要求18的方法，其中所述没有烟酰胺的基质包含FGF4。
22.权利要求18的方法，其中实施所述在所述没有烟酰胺的基质中的培养至少一天。
23.权利要求22的方法，其中实施所述的在所述没有烟酰胺的基质中的培养至少一个星期。
24.权利要求1-23的方法，还包括浓缩所述调理的基质。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中将所述间充质干细胞在包含血清的培养基中培养第一时间段，然后在不含血清的培养物中培养第二时间段，并且其中从所述第二时间段的培养物收集所述调理的基质。
26.权利要求25的方法，其中所述第二时间段为24-48小时。
27.间充质干细胞调理的基质，其通过权利要求1-26中任一项的方法生产。
28.间充质干细胞调理的基质，其包含1-20mM烟酰胺、降低水平的IL-6，并且其中所述调理的基质具有抗发炎和促有丝分裂的活性。
29.权利要求27或28的调理的基质，其中所述调理的基质的特征在于：与来自在没有添加烟酰胺而培养的间充质干细胞的调理的基质中所述至少一种因子的水平相比，提高水平的至少一种选自由HGF、KGF和TGFβ所组成的组中的生物活性因子。
30.药物组合物，其包含权利要求27-29中任一项的调理的基质或其生物活性部分，和药物可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
31.药物化妆品组合物，其包含权利要求27-29中任一项的调理的基质或其生物活性部分，和化妆品可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
32.权利要求27-29中任一项的调理的基质在处理需要其的受试者的发炎性疾病中的用途。
33.权利要求32的调理的基质，其中所述抗发炎疾病为迟发型超敏反应。
34.培养细胞的方法，该方法包括在包含权利要求27-29中任一项的调理的基质的培养基中培养细胞。
35.权利要求34的方法，其中所述细胞为角质形成细胞。
36.细胞培养物，其包含细胞和培养基，该基质包含权利要求27-29中任一项的调理的基质。
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