CN108220231A - 一种干细胞培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养的技术领域，尤其涉及一种干细胞培养基及其制备方法和应用。本发明提供的一种干细胞培养基，包括：间充质干细胞无血清培养基、血小板裂解液、谷氨酰胺、非必需氨基酸和肝细胞因子，其中，间充质干细胞无血清培养基和血小板裂解液使得经血干细胞快速生长，谷氨酰胺和非必需氨基酸提供了经血干细胞所需营养，肝细胞因子能刺激经血干细胞的增值。该发明解决有效解决现有技术的干细胞培养基不适合培养经血干细胞的技术缺陷。

Description

一种干细胞培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞培养的技术领域，尤其涉及一种干细胞培养基及其制备方法和应用。本申请要求2018年1月23日提交的中国专利(专利申请号为 201810065267.7)的权益，在此将上述申请的全部内容引用并入本文。
背景技术
干细胞是指一类具有高度增殖潜能、自我更新能力以及高度分化能力的早期未分化细胞。间充质干细胞是目前最受关注的干细胞成员，具有高度自我更新能力和多向分化潜能。人体子宫是一个具有高度再生及分化能力的组织，子宫内膜中含有具有高度增殖能力的干细胞，科学家把这些干细胞从健康女性经血中可分离出来，命名为经血间充质干细胞。
经血间充质干细胞治疗疾病的临床前研究和临床试验，己经被大量的研究，如治疗心肌梗死、中风、糖尿病、肝纤维化、肺纤维化、卵巢早衰、慢性缺血性疼痛、肌肉萎缩、骨关节炎。
但目前的培养体系不能适应经血干细胞，经血干细胞使用现有的干细胞培养基后，其增值效率低，细胞质量差；细胞在有限代增值后，便出现分化，不能保持经血干细胞的干性；不能满足临床细胞用量需求。
综上所述，传统的干细胞培养基不适用于经血干细胞的培养。因此，开发一种适用于经血干细胞大规模、高质量扩增新型的培养体系是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种干细胞培养基及其制备方法和应用，能有效解决现有技术的干细胞培养基不适合培养经血干细胞的技术缺陷。
本发明还提供了一种干细胞培养基，包括：间充质干细胞无血清培养基、血小板裂解液、谷氨酰胺、非必需氨基酸和肝细胞因子。
作为优选，所述的干细胞培养基，包括：
作为优选，所述的干细胞培养基，包括
作为优选，所述的干细胞培养基，包括
本发明还提供了一种干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
将间充质干细胞无血清培养基、血小板裂解液、谷氨酰胺、非必需氨基酸和干细胞因子混合后低温保存。
本发明还公开了干细胞培养基在培养经血干细胞中的应用。
作为优选，包括以下步骤：
S101：获得经血，收集经血单个核细胞；
S102：将干细胞培养基培养收集得到的经血单个核细胞。
作为优选，所述经血为第二天的经血。
作为优选，所述S101具体为获得经血，裂解经血的红细胞后，收集经血单个核细胞。
更为优选，所述干细胞为人源的经血干细胞。
本发明的干细胞培养基包括：间充质干细胞无血清培养基、血小板裂解液、谷氨酰胺、非必需氨基酸和肝细胞因子。本发明选用的间充质干细胞无血清培养基和血小板裂解液使得经血干细胞快速生长，其中，间充质干细胞无血清培养基是专用于培养间充质干细胞，使得经血来源的血管内皮细胞和纤维细胞不能生长，保证经血干细胞的纯度，血小板裂解液内含有经血干细胞增值分裂所需的因子，谷氨酰胺和非必需氨基酸提供了经血干细胞所需营养，肝细胞因子是一种多肽生长因子，具有促进细胞生长的作用，能与细胞表面的受体结合并激活酪氨酸酶活性，具有较强的促有丝分裂作用；本发明发现使用肝细胞因子能刺激经血干细胞的增值。具体的说，本发明采用的多组分能显著提高经血干细胞培养的纯度和增殖能力。
本发明还公开了本发明的干细胞培养基的应用，在应用时，特定选用了非第一天的经血，第一天的血液可冲刷阴道内的细真菌，非第一天时段的经血质量较好，同时也可以减少污染。
具体实施方式
本发明提供了一种干细胞培养基及其制备方法和应用，用于解决现有技术的干细胞培养基不适合培养经血干细胞的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，间充质干细胞无血清培养基，由CellGenix公司提供，货号为 24803-0500；人血小板裂解物(MSC Qualified-PLUSTM Cell Culture Supplement)，由CoMPassBiomedical公司提供，货号：PLS2；谷氨酰胺为glutamine，Gln；NEAA，non-essential aminoacid非必需氨基酸；HGF为 hepatocyte growth factor，肝细胞因子。
实施例1
本实施例为经血干细胞的分离，分离方法参考文献：王雪丽，经血源性子宫内膜干细胞的生物学特性及多向分化潜能的实验研究，安徽医科大学硕士学位论文[M]，2016。
实施例2
本实施例为经血干细胞的培养，培养步骤如下：
a.加入0.01％多聚赖氨酸到培养皿中，使液体浸润皿底，并置于37℃下进行孵育，1h后，吸弃多聚赖氨酸。
b.按照表1配置组分1至组分5的干细胞培养基。
c.用组分1至组分5的干细胞培养基重悬经血干细胞，调整密度为8× 104～1×105个/mL，接种至多聚赖氨酸孵育过的培养皿中。
d.把细胞转移至37℃、5％CO2、95％湿度的环境中培养，48h后进行换液。
e.待细胞融合率达80％左右，进行细胞传代培养。
表1组别1至组别5的组分表
实施例3
本实施例为经血干细胞的表面抗原检测，具体实验步骤如下：
取实施例2中组别1至组别5培养的经血干细胞，制成1×106的细胞悬液，分别取抗人CD34、CD45、CD19、CD73、CD90、CD105、CD11b、HLA-DR 的单克隆抗体各5μL，加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL PBS重悬后上机检测。
CD73 CD90 CD105 CD34 CD45 CD19 CD11b HLA-DR
1 95.3％ 96.4％ 95.0％ 1.0％ 1.1％ 1.9％ 1.7％ 1.3％
2 96.4％ 95.8％ 98.8％ 1.3％ 0.5％ 0.9％ 0.8％ 1.2％
3 97.5％ 99.7％ 98.6％ 2.0％ 1.5％ 0.3％ 0.7％ 1.4％
间充质干细胞的CD73、CD90、CD105的表达率在95.0％以上，CD34、CD45、 CD19、CD11b、HLA-DR的表达率在2.0％以下。本发明获得的经血干细胞，符合间充质干细胞的鉴定标准，说明本培养体系能扩增出质量一致的细胞。
实施例4
本实施例为经血干细胞的生长曲线的测定，具体步骤如下：
取P2～P3代经血干细胞重悬接种至6孔板中，细胞接种密度为5×104个 /mL，2mL/孔。每隔2天取一孔细胞来计算细胞总数，记录下细胞的生长曲线。
表2组别1至组别5的经血干细胞的生长曲线
从表2可知，组别1的细胞增值曲线较为平缓，4d后才进入指数生长期，第6天仍处于细胞分裂期，组别2～组别5则均在第2天进入了指数生长期，第4天达到平台期。说明血小板裂解液对细胞的分裂增值具有明显的促进作用；此外，从组别2与组别3～5相比可知，肝细胞因子(HGF)浓度只有5ng/mL 时，细胞增值率稍低于10～15ng/mL时，说明了，肝细胞因子具有促进经血干细胞的增值能力，其最优浓度在5～20ng/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种干细胞培养基，其特征在于，包括：间充质干细胞无血清培养基、血小板裂解液、谷氨酰胺和肝细胞因子。
2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的干细胞培养基，其特征在于，包括
4.根据权利要求3所述的干细胞培养基，其特征在于，包括
5.一种干细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将间充质干细胞无血清培养基、血小板裂解液、谷氨酰胺、非必需氨基酸和干细胞因子混合后制备得到。
6.权利要求1至4任意一项所述的干细胞培养基在培养经血干细胞中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S101：获得经血，收集经血单个核细胞；
S102：将干细胞培养基培养经血单个核细胞。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述经血为第二天经血。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述S101具体为：获得经血，裂解经血的红细胞，收集经血单个核细胞。
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