KR101313535B1

KR101313535B1 - 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지 및 이를 이용한 배양방법

Info

Publication number: KR101313535B1
Application number: KR1020110038838A
Authority: KR
Inventors: 황동연; 김형택
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2011-04-26
Filing date: 2011-04-26
Publication date: 2013-10-01
Also published as: KR20120121084A; WO2012148125A1

Abstract

본 발명은 기본 배지 중에, 줄기세포성 유지제로서 프로틴 키나아제 C 저해제; 히스톤 데아세틸라제 저해제; 및 골 형성 단백질 경로 차단제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 배지를 사용하여 무-이종감염물질 및 무-지지세포 조건하에서, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지 및 이를 이용한 배양방법{Culture media for maintaining stemness of human human embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells and culture method using the same}

본 발명은 기본 배지 중에, 줄기세포성 유지제(stemness-maintaining agent)로서 프로틴 키나아제 C 저해제(protein kinase C inhibitor); 히스톤 데아세틸라제 저해제(histone deacetylase inhibitor); 및 골 형성 단백질 경로 차단제(bone morphogenetic protein (BMP) pathway blocker)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 배지를 사용하여 무-이종감염물질(xenopathogen-free) 및 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.

인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells, hES 세포)는 수정란으로부터 발생한 배아로부터 얻어진 미분화된 세포로서, 신경, 혈액, 연골 등 생물체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 만능분화능(pluripotency)을 가진 세포를 말한다. 역분화 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS 세포)는 분화된 세포(예를 들어, 체세포)로부터 역분화되어 얻어진 만능분화능(pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 각종 장기 세포로 분화 가능하다. iPS 세포는 역분화 유도인자들에 의해 분화된 세포를 재프로그램화(reprogramming)하여 얻어질 수 있으므로, 체세포 핵치환(somatic cell transfer) 없이 환자 면역 적합성 만능 세포주의 생성이 가능하다. 따라서 iPS 세포는 환자의 세포에서 유래될 수 있어 임상에 적용 시 면역 거부반응을 피할 수 있다. 또한, iPS 세포는 난자나 배아를 사용하지 않기 때문에 생명윤리적 논란이나 종교적 비난이 없는 장점이 있다.

인간 배아줄기세포 및 역분화 만능 줄기세포는 모두 우리 몸의 모든 세포를 생성할 수 있는 능력이 있는 만능분화능(pluripotency)를 가졌으며, 자기와 닮은 세포들을 무한정 만들어낼 수 있는 자기재생(self-renewal) 능력이 있다. 이 두 가지 성질을 합하여 "줄기세포성(stemness)"이라고 칭해진다.

현재 인간 배아줄기세포 및 역분화 만능 줄기세포의 줄기세포성 유지에 관여하는 몇 가지의 신호전달체계가 밝혀져 있다. 그 대표적인 것들이 FGF(Fibroblast Growth Factor) 신호전달체계(signaling pathway)와 TGF-Beta(Transforming Growth Factor-Beta)/Activin 신호전달체계라고 할 수 있다. 또한 Oct4(Octamer Binding Transcription Factor-4), Nanog, Sox2(SRY(Sex Determining Region-Y) Box-2)들과 같은 세포질 내에 존재하는 전사인자들도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Biswas A, Hutchins R., Stem Cells Dev. 2007(2), 213-22; Darr H, Benvenisty N., Regen Med. 2006(3), 317-25). 이와 관련하여 이들 신호전달체계의 구성요소들인 SMAD 2/3 [Sma and MAD(Mothers Against Decapentaplegic) Related Protein-2/3], ALK4 (Activin Receptor-Like Kinase-4), ALK5 (Activin Receptor-Like Kinase-5), ALK7 (Activin Receptor-Like Kinase-7), Nodal, Cripto, LEFTY1 (Left-right determination factor-1)과 LEFTY2 (Left-right determination factor-2)도 인간 배아줄기세포 및 역분화 만능 줄기세포의 줄기세포성 유지에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 밝혀져 있다 (Xiao L, Yuan X, Sharkis SJ, Stem Cells. 2006(6), 1476-1486; Besser D, J Biol Chem. 2004(43), 45076-45084; 및 James D, Levine AJ, Besser D, Hemmati-Brivanlou A, Development. 2005, 132(6), 1273-1282).

이와 더불어 WNTs(Wingless-Type MMTV Integration Site Family Members) 단백질들과 WNT 신호전달체계도 인간 배아줄기세포의 줄기세포성 유지에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 밝혀졌다. 이 신호전달체계의 구성요소인 GSK-3b(Glycogen Synthase Kinase-3b)의 활성 억제와 이에 따른 베타 카테닌(betacatenin)의 증가가 중요한 역할을 하고 있음이 보고되었다 (Miyabayashi T, et. al, Proc Natl Acad Sci USA. 2007, 104(13), 5668-5773).

또한 S1P(Sphingosine-1-Phosphate)도 EDG(Endothelial Differentiation Gene) 수용체 및 이와 연계된 G-단백질을 통하거나, 또는 PDGF(Platelet Derived-Growth Factor)를 통한 신호 전달 체계에 의해서 줄기세포성 유지에 관여함이 보고되었다(Chase LG, Firpo MT., Curr Opin Chem Biol. 2007(4), 367-372; 및 Inniss K, Moore H., Stem Cells Dev. 2006(6), 789-796).

현재 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양하기 위하여 통상적으로 사용하고 있는 방법은, 생쥐의 배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)를 지지세포로 이용하는 공 배양(co-culture)이다. 이 배양 시스템은 인간만능줄기세포의 줄기세포성을 유지하기 위하여 필요한 인자들을 지지세포가 공급해 주는 방식이다. 하지만 지지세포에서 제공되는 어떤 인자들이 인간 만능줄기세포의 줄기세포성 유지에 중요한 지에 대해서는 아직까지 구체적으로 알려진 바가 없다.

생쥐 배아섬유아세포를 이용한 공 배양을 통해 배양된 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 임상에 이용하는 데에는 안전성에 문제가 있다. 왜냐하면 이종 (생쥐와 인간) 간에 감염물질 (예: 바이러스)의 전염 위험성이 존재하기 때문이다. 따라서 이 문제점을 극복하기 위하여 MEF 지지세포가 없는 상태(feeder-free)에서 동물유래물질이 포함되지 않은 무-이종감염(xenopathogen-free) 배지를 이용하여 인간만능줄기세포를 배양하는 것이 매우 중요하다.

따라서, 지지세포를 사용하지 않으면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 장기간 배양할 수 있는 배지를 만들기 위해서는 이들 줄기세포의 줄기세포성에 관여하는 신호전달체계(signal transduction)와 유전자 발현의 후생학적인 조절(epigenetic control) 기작에 대해 깊게 이해하는 것이 중요하다고 할 수 있다.

본 발명자들은 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 장기간 배양(즉, 계대배양)할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 특정 물질 즉, 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제가 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성을 안정적으로 유지시킬 수 있어, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 줄기세포성을 유지시키면서 장기간 동안 배양(즉, 계대배양)할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제를 사용할 경우, 무-이종감염물질(xenopathogen-free) 및 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제를 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제의 존재하에서, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포; 혹은 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 콜로니를 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 기본 배지 중에, 줄기세포성 유지제(stemness-maintaining agent)로서 프로틴 키나아제 C 저해제; 히스톤 데아세틸라제 저해제; 및 골 형성 단백질 경로 차단제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지가 제공된다.

본 발명에 따른 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지에 있어서, 상기 줄기세포성 유지제의 농도는 0.001 내지 1000 μM의 범위가 바람직하며, 상기 기본 배지는 무-이종감염물질 배지(xenopathogen-free medium)인 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 배지 중에서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포; 혹은 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 콜로니를 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 배양 방법에 있어서, 상기 배양은 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 바람직하게 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포 배양용 배지는 줄기세포성 유지제(stemness-maintaining agent)로서 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제를 함유함으로써, 줄기세포성을 유지시키면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 장기간 동안 배양(즉, 계대배양)할 수 있다. 또한, 상기 배지를 사용할 경우, 무-이종감염물질(xenopathogen-free) 및 무-지지세포(feeder cell-free) 조건 하에서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 배양을 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 배지 및 이를 이용한 배양방법은 임상에 사용하기에 적합한, 즉 우수한 안전성을 갖는 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 장기간 동안 효율적으로 배양할 수 있다.

도 1은 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go), 히스톤 데아세틸라제 저해제(트리코스타틴 에이, TSA) 및 골 형성 단백질 경로 차단제(도르소몰핀, DM)을 각각 혹은 조합하여 처리된 배지를 사용하여 인간 배아줄기세포를 배양하였을 때, 각 계대(passage) 별로 미분화 콜로니의 비율(미분화콜로니의 수/전체 콜로니의 수 x 100)을 평가한 결과이다.
도 2는 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go), 히스톤 데아세틸라제 저해제(트리코스타틴 에이, TSA) 및 골 형성 단백질 경로 차단제(도르소몰핀, DM)을 각각 혹은 조합하여 처리된 배지를 사용하여 역분화 만능 줄기세포를 배양하였을 때, 각 계대(passage) 별로 미분화 콜로니의 비율(미분화콜로니의 수/전체 콜로니의 수 x 100)을 평가한 결과이다.
도 3은 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go) 및 히스톤 데아세틸라제 저해제(트리코스타틴 에이, TSA)를 조합하여 처리된 배지를 사용하여 인간 배아줄기세포를 18 계대 배양하였을 때, 미분화 표지 마커인 Oct4, Sox2, SSEA4, Tra1-60 및 Tra1-81의 발현을 측정한 결과이다.
도 4는 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go), 히스톤 데아세틸라제 저해제(트리코스타틴 에이, TSA) 및 골 형성 단백질 경로 차단제(도르소몰핀, DM)를 조합하여 처리된 배지를 사용하여 인 간배아줄기세포를 13 계대 배양하였을 때, 미분화 표지 마커인 Oct4, Sox2, SSEA4, Tra1-60 및 Tra1-81의 발현을 측정한 결과이다.
도 5는 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go) 및 히스톤 데아세틸라제 저해제(트리코스타틴 에이, TSA)를 조합하여 처리된 배지를 사용하여 인간 배아줄기세포를 20 계대 배양하였을 때, 혹은 역분화 만능 줄기세포를 22 계대 배양하였을 때 염색체의 이상 유무를 관찰한 결과이다.

본 명세서에서, "인간배아줄기세포 (embryonic stem cells, ESCs)"라 함은 태아 발생 초기 배반포(blastocyst)에서 유래된 만능줄기세포를 지칭하며, 자기재생능 (self-renewal)과 만능분화능 (pluripotency)을 가지고 있다.

본 명세서에서, "역분화 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPS 세포)"라 함은 "reprogrammed pluripotent stem cells"로도 지칭되며, 분화된 세포를 재프로그램하여(즉, 역분화시켜) 만능분화능(pluripotency)을 갖도록 유도된 세포를 말하며 역시 자기재생능 (self-renewal)과 만능분화능 (pluripotency)을 가지고 있다.

본 발명은 기본 배지 중에, 줄기세포성 유지제(stemness-maintaining agent)로서 프로틴 키나아제 C 저해제; 히스톤 데아세틸라제 저해제; 및 골 형성 단백질 경로 차단제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지를 제공한다.

본 발명의 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지에 있어서, 상기 프로틴 키나아제 C 저해제(protein kinase C inhibitor)는 프로틴 키나아제 C 저해 활성을 갖는 모든 물질을 포함한다. 상기 프로틴 키나아제 C 저해제는 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온(3-[1-[3-(dimethylamino)propyl]-5-methoxy-1H-indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione, Go6983); 3-(1H-인돌-3-일)-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)퀴나졸린-4-일]피롤-2,5-디온(3-(1H-indol-3-yl)-4-[2-(4-methylpiperazin-1-yl)quinazolin-4-yl]pyrrole-2,5-dione, Sotrastaurin, AEB 071); 3-{1-[3-(아미디노티오)프로필]-1H-인돌-3-일}-3-(1-메틸-1H-인돌-3-일)말레이미드 메탄 술포네이트(3-{1-[3-(amidinothio)propyl]-1H-indol-3-yl}-3-(1-methyl-1H-indol-3-yl)maleimide methane sulfonate, Ro-31-8220); 13-히드록시옥타데카디에논산(13-hydroxyoctadecadienoic acid); 2-[1-(3-디메틸아미노프로필)인돌-3-일]-3-(인돌-3-일) 말레이미드(2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) maleimide, GF 109203X, Go6850); 13-((디메틸아미노)메틸)-10,11,14,15-테트라히드로-4,9:16,21-디메테노-1H,13H-디벤조(E,K)피롤(3,4-H)(1,4,13)옥사디아자시클로헥사데센-1,3(2H)-디온(13-((dimethylamino)methyl)-10,11,14,15-tetrahydro-4,9:16,21-dimetheno-1H,13H-dibenzo(E,K)pyrrolo(3,4-H)(1,4,13)oxadiazacyclohexadecene-1,3(2H)-dione, LY-333531, Ruboxistaurin, PKC beta inhinitor); 2,6-디아미노-N-([1-(1-옥소트리데실)-2-피페리딘일]메틸)헥산아미드(2,6-diamino-N-([1-(1-oxotridecyl)-2-piperidinyl]methyl)hexanamide, NPC 15437); 및 4'-데메틸아미노-4'-히드록시스타우로스포린(4'-demethylamino-4'-hydroxystaurosporine, RK-286C)으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 히스톤 데아세틸라제 저해제(histone deacetylase inhibitor)는 N-히드록시-3-(3-페닐설파모일페닐)아크릴아미드(N-Hydroxy-3-(3-phenylsulfamoylphenyl)acrylamide, Belinostat, PXD101, PX105684); 7-(4-(3-에티닐페닐아미노)-7-메톡시퀴나졸린-6-일옥시)-N-히드록시헵탄아미드(7-(4-(3-ethynylphenylamino)-7-methoxyquinazolin-6-yloxy)-N-hydroxyheptanamide, CUDC-101); [R-(E,E)]-7-[4-(디메틸아미노)페닐]-N-히드록시-4,6-디메틸-7-옥소-2,4-헵타디엔아미드([R-(E,E)]-7-[4-(dimethylamino)phenyl]-N-hydroxy-4,6-dimethyl-7-oxo-2,4-heptadienamide, Trichostatin A, TSA); N-히드록시-N'-페닐옥탄디아미드(N-hydroxy-N'-phenyloctanediamide, Vorinostat, SAHA, Zolinza, MK-0683); 발프로익산 또는 그의 염(valproic acid or its salt); 소듐 부티레이트(Sodium butyrate); 3-(2-부틸-1-(2-(디에틸아미노)에틸)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)-N-히드록시아크릴아미드(3-(2-butyl-1-(2-(diethylamino)ethyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)-N-hydroxyacrylamide, SB939); N-히드록시-N'-3-피리디닐옥탄디아미드(N-hydroxy-N'-3-pyridinyloctanediamide, Pyroxamide, NSC 696085); 3-(디메틸아미노메틸)-N-[2-[4-(히드록시카바모일)페녹시]에틸]-1-벤조퓨란-2-카르복사미드(3-(dimethylaminomethyl)-N-[2-[4-(hydroxycarbamoyl)phenoxy]ethyl]-1-benzofuran-2-carboxamide, PCI-24781, CRA-02478); N-[[4-[[(2-아미노페닐)아미노]카르보닐]페닐]메틸]카르바믹산 3-피리디닐메틸 에스테르(N-[[4-[[(2-aminophenyl)amino]carbonyl]phenyl]methyl]carbamic acid 3-pyridinylmethyl ester, Entinostat, MS-275, SNDX-275, MS-27-275); N-(2-아미노페닐)-4-[[(4-피리딘-3-일피리미딘-2-일)아미노]메틸]벤젠아미드(N-(2-aminophenyl)-4-[[(4-pyridin-3-ylpyrimidin-2-yl)amino]methyl]benzamide, Mocetinostat, MGCD0103); 3-[5-(3-(3-플루오로페닐)-3-옥소프로펜-1-일)-1-메틸-1H-피롤-2-일]-N-히드록시-2-프로펜아미드(3-[5-(3-(3-Fluorophenyl)-3-oxopropen-1-yl)-1-methyl-1H-pyrrol-2-yl]-N-hydroxy-2-propenamide, MC1568); N-히드록시-3-[4-[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에틸아미노메틸]페닐]-2(E)-프로펜아미드(N-hydroxy-3-[4-[2-(2-methyl-1H-indol-3-yl)ethylaminomethyl]phenyl]-2(E)-propenamide, Panobinostat, LBH-589, NVP-LBH589, LBH589); 3-[4-[N-(2-히드록시에틸)-N-[2-(1H-indol-3-일)에틸]아미노메틸]페닐]-2(E)-프로페노히드록사믹산(3-[4-[N-(2-hydroxyethyl)-N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]aminomethyl]phenyl]-2(E)-propenohydroxamic acid, Dacinostat, LAQ824, NVP-LAQ824); N-히드록시-2-(4-((((1-메틸-1H-인돌-3-일)메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-일)피리미딘-5-카르복사미드(N-hydroxy-2-(4-((((1-methyl-1H-indol-3-yl)methyl)amino)methyl)piperidin-1-yl)pyrimidine-5-carboxamide, JNJ-26481585); {6-[(디에틸아미노)메틸]나프탈렌-2-일}메틸 [4-(히드록시카르바모일)페닐]카르바메이트({6-[(diethylamino)methyl]naphthalen-2-yl}methyl [4-(hydroxycarbamoyl)phenyl]carbamate, Givinostat, Gavinostat, ITF2357, ITF 2357); 및 4-(4-클로로-2-메틸페녹시)-N-히드록시부탄아미드(4-(4-Chloro-2-methylphenoxy)-N-hydroxybutanamide, Droxinostat)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 골 형성 단백질 경로 차단제제(bone morphogenetic protein (BMP) pathway blocker)는 노긴(noggin); 코르딘(chordin); 폴리스타틴(follistatin); 및 6-(4-(2-피페리딘-1-일에톡시)페닐))-3-피리딘-4-일피라졸로(1,5-a)피리미딘(6-(4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl))-3-pyridin-4-ylpyrazolo(1,5-a)pyrimidine, dorsomorphin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지에 있어서, 상기 줄기세포성 유지제는 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 골 형성 단백질 경로 차단제를 각각 단독으로 사용하거나, 혹은 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및 골 형성 단백질 경로 차단제를 조합하여 사용하는 것이 높은 효율로 역분화 만능 줄기세포를 제조할 수 있다.

상기 줄기세포성 유지제의 사용량 즉, 배지 중의 농도는 바람직하게는 0.001 내지 1000 μM, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10 μM의 범위일 수 있다. 물론, 필요에 따라 상기 농도 범위를 초과하여 사용될 수도 있다.

상기 기본 배지(basal medium)은 통상의 세포배양용 배지일 수 있으며, 예를 들어, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA); MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA); RPMI 1640 (GIBCO, USA); DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12; GIBCO, USA); α-MEM(α-Minimal essential Medium; GIBCO, USA); G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA); KnockOut DMEM (GIBCO, USA) 등일 수 있다. 바람직하게는, 상기 기본 배지는, 동물유래의 물질에 의한 안전성 문제를 회피하기 위하여, 무-이종감염물질 배지(xenopathogen-free medium)일 수 있다. 즉, 상기 기본 배지는 소혈청알부민(bovine serum albumin), 동물세포 유래의 재조합 단백질과 같은 이종물질(xenopathogen)을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 상기 기본 배지는 넉아웃 제노프리 혈청 대체물, 글루타맥스, 비필수 아미노산, 베타-머캅토에탄올, 항생제, 및 bfgf(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM/F-12 배지일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 배지 중에서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포; 혹은 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 콜로니를 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양(계대배양을 포함한다)하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 배양방법은 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 각각 배양하거나; 혹은 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 콜로니를 배양함으로써 수행될 수 있다. 상기 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 콜로니는 핵이 상대적으로 크면서 세포질은 적은 작고 둥근 세포들이 뭉쳐있는 형태의 형태학적으로 구분되는 모양을 가지고 있으므로, 계대배양 시 통상의 방법 예를 들어 알콜램프로 끝을 구부린 파스퇴르 파이펫을 이용한 물리적인 방법으로 이들을 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 배양 방법에 있어서, 상기 배양은 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 바람직하게 수행될 수 있다. 즉, 상기 배양은 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)을 배양용기에 코팅하고 상기한 본 발명에 따른 배지(즉, 상기 줄기세포성 유지제를 함유하는 배지) 중에서 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 세포외기질 단백질로는 세포 배양에 통상적으로 사용되는 코팅용 단백질, 예를 들어 비트로넥틴(vitronectin), 매트리젤(Matrigel, BD Biosciences, USA), 셀스타트(CellStart, Invitrogen, USA), 젤라틴(gelatin) 등을 제한없이 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 배양방법은, 상기한 바와 같은 배지를 사용하여, 무-이종감염물질(xenopathogen-free) 및 무-지지세포(feeder cell-free) 조건 하에서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 배양을 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 배지 및 이를 이용한 배양방법은 임상에 사용하기에 특히 적합하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 배아줄기세포의 배양

2개의 4 웰 플레이트의 각 웰을 비트로넥틴(vitronectin)(5 ㎍/ml, BD Biosciences, USA)으로 코팅하고, 15% (v/v) 넉아웃 제노프리 혈청 대체물(KnockOut SR XenoFree; GIBCO, USA), 1x 글루타맥스(GIBCO, USA), 1% (v/v) 비필수 아미노산(GIBCO, USA), 0.1mM 베타-머캅토에탄올(GIBCO), 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO, USA), 8 ng/ml bfgf(basic fibroblast growth factor)(차바이오앤디오스텍, Korea)로 보충된 DMEM/F-12 (GIBCO, USA) 500 ㎕ 및 줄기세포성-유지제(표 1 참조)를 각각 첨가하였다. 5-6일간 배양해 온 인간 배아줄기세포(H9-hESCs, WiCell, Madison, WI, USA)의 콜로니들을 끝이 구부러진 파스퇴르 파이펫을 이용하여 4-5 조각을 낸 뒤 총 10개 정도의 콜로니 조각들을 상기 4웰 플레이드의 각 웰에 접종하였다. 약 2일 정도 인큐베이터에서 배양하여 콜로니들이 비트로넥틴(vitronectin)이 코팅된 배양용기에 잘 붙게 한 뒤, 3일 째부터는 매일, 동일한 조성의 새로운 배지로 교체하여주면서 2-3일간 더 배양하였다. 계대배양한지 5-6일 째 되는 날 다시 새로운 배양용기로 계대 배양하였다.

처리군	줄기세포성-유지제
제1군	무처리(대조군)
제2군	Go 5 μM
제3군	TSA 10 nM
제4군	DM 1 μM
제5군	Go 5 μM + TSA 10 nM
제6군	Go 5 μM + DM 1 μM
제7군	TSA 10 nM + DM 1 μM
제7군	Go 5 μM + TSA 10 nM + DM 1 μM

- Go: 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온)(Go6983)

- TSA: 트리코스타틴 에이(Trichostatin A)

- DM: 도르소몰핀(dorsomorphin)

각기 다른 줄기세포성-유지제를 첨가한 배지를 이용하여 배양하였을 때, 인간 배아줄기세포(H9-hESCs)의 미분화 유지정도를 각 계대배양시 마다 측정하여 도 1에 나타내었다. 미분화 줄기세포의 콜로니는 배양물 중에서 핵이 상대적으로 크면서 세포질은 적은 작고 둥근 세포들이 뭉쳐있는 형태의 형태학적으로 구분되는 모양을 가지고 있어, 전체 콜로니들 중에서 미분화를 유지하고 있는 콜로니들을 계수하여 전체 콜로니들 중 미분화 상태를 유지하는 콜로니의 비율을 계산하였다.

도 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 디아세틸라제 저해제, 또는 BMP 경로 저해제를 처리한 군은 대조군에 비해 훨씬 콜로니들의 미분화율이 높았다. 대조군인 경우에는 5 계대(passage)가 지나면서 거의 모든 콜로니들이 분화되어 버렸다. 그러나, 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 디아세틸라제 저해제, 또는 BMP 경로 저해제를 단독, 혹은 2-3개 조합하여 첨가하였을 때, 미분화 상태를 잘 유지하였다. 특히, 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 디아세틸라제 저해제, 및 BMP 경로 저해제를 모두 첨가해준 경우 인간 배아줄기세포의 미분화를 가장 잘 유지하였다(도 1 참조).

실시예 2. 역분화 만능 줄기세포의 배양

인간 배아줄기세포(H9-hESCs)의 콜로니 대신 역분화 만능 줄기세포(iPSCs, Home-made)의 콜로니를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 계대배양을 수행하였으며, 또한, 전체 콜로니들 중 미분화 상태를 유지하는 콜로니의 비율을 계산하여 역분화 만능 줄기세포(iPSCs)의 미분화 유지정도를 각 계대배양시 마다 측정한 결과는 도 2와 같다. 도 2의 결과로부터, 대조군의 경우 4 계대가 지나면서 모두 분화되어 버린 반면, 프로틴 키나아제 C 저해제와 히스톤 디아세틸라제 저해제를 단독으로, 혹은 조합하여 첨가한 경우에는 미분화 상태를 잘 유지하고 있음을 알 수 있다.

실시예 3. 면역염색을 통한 미분화 마커의 확인

실시예 1의 제5군(Go6983 와 TSA가 첨가된 배양배지)에서 18 계대에 배양된 인간 배아줄기세포의 콜로니들에 있어서의 미분화 마커 즉 Oct4, Sox2, SSEA4, Tra1-60 및 Tra1-81의 발현을 면역염색으로 확인하였다. 즉, 18 계대 째의 계대배양 중 5일째에 콜로니들을 인산완충식염수로 세척한 후 4% 포름알데하이드 용액을 10분간 처리하여 고정하였다. 이를 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후, 10% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum) 용액으로 상온에서 1시간 블록킹 (blocking)하였다. 일차항체들인 mouse anti-Oct4 항체(Santa Cruz, USA), mouse anti-SSEA4 항체(Millipore, USA), mouse anti-Tra1-60 항체(Millipore, USA), mouse anti-Sox2 항체(Millipore, USA) 및 mouse anti-Tra1-81 항체(Millipore, USA)를 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후 이차항체인 Alexa-594 goat anti-mouse IgG (1:200, Invitrogen, USA)와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후, 30 nM 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Invitrogen, USA)를 이용하여 핵을 염색하였다. 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과는 각각 도 3과 같다.

또한, 실시예 1의 제7군(Go6983, TSA, 및 도르소몰핀이 첨가된 배양배지)에서 13 계대에 배양된 인간 배아줄기세포의 콜로니들에 있어서의 미분화 마커 즉 Oct4, Sox2, SSEA4, Tra1-60 및 Tra1-81의 발현을 상기와 동일한 방법으로 면역염색으로 확인하였으며, 그 결과는 도 4와 같다.

도 3 및 도 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 배양된 인간 배아줄기세포들은 뚜렷한 미분화형태의 콜로니를 형성하고 있었으며 Oct4, Sox2, SSEA4, Tra1-60 및 Tra1-81의 미분화 마커들을 잘 발현하고 있었다.

실시예 4. 염색체 변이 확인

실시예 1의 제5군(Go6983 와 TSA가 첨가된 배양배지 중에서의 H9-hESCs 배양)의 20계대 배양에 의해 얻어진 세포, 실시예 2의 제5군(Go6983 와 TSA가 첨가된 배양배지 중에서의 iPSCs 배양)의 22계대 배양에 의한 세포을 염색체 변이를 분석하였다. 상기 염색체 변이 분석은 삼광의료재단(Seoul, Korea)에 의뢰하여 수행하였으며 그 결과는 도 5와 같다. 도 5의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 계대배양하여 얻어진 세포들 모두 정상적인 염색체 핵형을 유지하고 있었다.

Claims

기본 배지 중에, 줄기세포성 유지제(stemness-maintaining agent)로서 히스톤 데아세틸라제 저해제를 포함하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지.
삭제
제1항에 있어서, 상기 히스톤 데아세틸라제 저해제가 N-히드록시-3-(3-페닐설파모일페닐)아크릴아미드; 7-(4-(3-에티닐페닐아미노)-7-메톡시퀴나졸린-6-일옥시)-N-히드록시헵탄아미드; [R-(E,E)]-7-[4-(디메틸아미노)페닐]-N-히드록시-4,6-디메틸-7-옥소-2,4-헵타디엔아미드; N-히드록시-N'-페닐옥탄디아미드; 발프로익산 또는 그의 염; 소듐 부티레이트; 3-(2-부틸-1-(2-(디에틸아미노)에틸)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)-N-히드록시아크릴아미드; N-히드록시-N'-3-피리디닐옥탄디아미드; 3-(디메틸아미노메틸)-N-[2-[4-(히드록시카바모일)페녹시]에틸]-1-벤조퓨란-2-카르복사미드; N-[[4-[[(2-아미노페닐)아미노]카르보닐]페닐]메틸]카르바믹산 3-피리디닐메틸 에스테르; N-(2-아미노페닐)-4-[[(4-피리딘-3-일피리미딘-2-일)아미노]메틸]벤젠아미드; 3-[5-(3-(3-플루오로페닐)-3-옥소프로펜-1-일)-1-메틸-1H-피롤-2-일]-N-히드록시-2-프로펜아미드; N-히드록시-3-[4-[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에틸아미노메틸]페닐]-2(E)-프로펜아미드; 3-[4-[N-(2-히드록시에틸)-N-[2-(1H-indol-3-일)에틸]아미노메틸]페닐]-2(E)-프로페노히드록사믹산; N-히드록시-2-(4-((((1-메틸-1H-인돌-3-일)메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-일)피리미딘-5-카르복사미드; {6-[(디에틸아미노)메틸]나프탈렌-2-일}메틸 [4-(히드록시카르바모일)페닐]카르바메이트; 및 4-(4-클로로-2-메틸페녹시)-N-히드록시부탄아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지.
삭제
제1항에 있어서, 상기 줄기세포성 유지제의 농도가 0.001 내지 1000 μM의 범위인 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지.
제1항에 있어서, 상기 기본 배지가 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); MEM (Minimal Essential Medium); BME (Basal Medium Eagle); RPMI 1640; DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12); a-MEM(a-Minimal essential Medium); G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium); IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium); 및 KnockOut DMEM (GIBCO, USA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지.
제1항에 있어서, 상기 기본 배지가 무-이종감염물질 배지(xenopathogen-free medium)인 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지.
제1항에 있어서, 상기 기본 배지가 넉아웃 제노프리 혈청 대체물, 글루타맥스, 비필수 아미노산, 베타-머캅토에탄올, 항생제, 및 bfgf(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM/F-12 배지인 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지.
제1항, 제3항, 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 배지 중에서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포; 혹은 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 콜로니를 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 배양이 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
제1항, 제3항, 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 프로틴 키나아제 C 저해제 및 골 형성 단백질 경로 차단제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 물질을 추가로 포함하는 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지.
제11항에 있어서, 상기 프로틴 키나아제 C 저해제가 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온; 3-(1H-인돌-3-일)-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)퀴나졸린-4-일]피롤-2,5-디온; 3-{1-[3-(아미디노티오)프로필]-1H-인돌-3-일}-3-(1-메틸-1H-인돌-3-일)말레이미드 메탄 술포네이트; 13-히드록시옥타데카디에논산; 2-[1-(3-디메틸아미노프로필)인돌-3-일]-3-(인돌-3-일) 말레이미드; 13-((디메틸아미노)메틸)-10,11,14,15-테트라히드로-4,9:16,21-디메테노-1H,13H-디벤조(E,K)피롤(3,4-H)(1,4,13)옥사디아자시클로헥사데센-1,3(2H)-디온; 2,6-디아미노-N-([1-(1-옥소트리데실)-2-피페리딘일]메틸)헥산아미드; 및 4'-데메틸아미노-4'-히드록시스타우로스포린으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지.
제11항에 있어서, 상기 골 형성 단백질 경로 차단제가 노긴; 코르딘; 폴리스타틴; 및 6-(4-(2-피페리딘-1-일에톡시)페닐))-3-피리딘-4-일피라졸로(1,5-a)피리미딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 줄기세포성 유지용 배지.
제11항에 따른 배지 중에서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포; 혹은 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포의 콜로니를 배양하는 것을 포함하는, 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 프로틴 키나아제 C 저해제가 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온; 3-(1H-인돌-3-일)-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)퀴나졸린-4-일]피롤-2,5-디온; 3-{1-[3-(아미디노티오)프로필]-1H-인돌-3-일}-3-(1-메틸-1H-인돌-3-일)말레이미드 메탄 술포네이트; 13-히드록시옥타데카디에논산; 2-[1-(3-디메틸아미노프로필)인돌-3-일]-3-(인돌-3-일) 말레이미드; 13-((디메틸아미노)메틸)-10,11,14,15-테트라히드로-4,9:16,21-디메테노-1H,13H-디벤조(E,K)피롤(3,4-H)(1,4,13)옥사디아자시클로헥사데센-1,3(2H)-디온; 2,6-디아미노-N-([1-(1-옥소트리데실)-2-피페리딘일]메틸)헥산아미드; 및 4'-데메틸아미노-4'-히드록시스타우로스포린으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 골 형성 단백질 경로 차단제가 노긴; 코르딘; 폴리스타틴; 및 6-(4-(2-피페리딘-1-일에톡시)페닐))-3-피리딘-4-일피라졸로(1,5-a)피리미딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포성을 유지하면서 인간 배아줄기세포 또는 역분화 만능줄기세포를 배양하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 배양이 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 배양 방법.