CN104711220A - 一种新型的制备经血间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的制备经血间充质干细胞的方法。所述方法包括：a.体外收集经血，并保存在经血采集液中，得到经血混合液；b.从经血混合液分离单个核细胞；c.贴壁培养上述单个核细胞，使之细胞扩增，随后通过贴壁纯化，得到经纯化的细胞，即经血间充质干细胞。本发明具有下述优点：对供体无损害、均一性强，细胞活力高，这体现在细胞扩增速度快，传代次数高等特点。

Description

一种新型的制备经血间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种新型的制备经血间充质干细胞的方法。具体而言，本发明涉及一种新型的采集、分离和储存经血间充质干细胞的方法，属于生物医学领域。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞的研究受到越来越多的关注。目前干细胞来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。然而由于胚胎干细胞涉及伦理道德方面的争议，严重限制了其在临床上的运用。成体干细胞分为神经干细胞、血液干细胞、间充质干细胞，表皮干细胞等，其中间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)是目前最受关注的干细胞成员之一,这是因为具有高度自我更新能力和多向分化潜能。MSC最初在骨髓中发现，然而骨髓间充质干细胞的获得具有侵入性从而制约了其在临床中的应用。理想的干细胞应具备无伦理道德的争议、易于获得、高度增殖能力以及多向分化的潜能等特性。

近年来,日本科学家Hida在女性经血中发现了具有多向分化潜能的干细胞,该干细胞可用于修复受损的心肌组织。2008年,美国科学家Patel等发现,从健康女性经血中可分离出来间充质干细胞,这些细胞具有多向分化能力,并将该细胞命名为经血源间充质干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)。经血的获得不具有侵入性不会对供者造成伤害,MenSCs不仅来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题。此外，MenSCs还具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞，因此成为寻找人类间充质干细胞新来源及提高临床应用效果的研究热点。

中国专利申请CN103966162A公开了一经血来源间充质干细胞分离方法，该方法包括：a.收集经血，并保存在作为保存液的特定磷酸盐缓冲液中于4℃下保存；b.加入PBS缓冲液，过滤，将滤液离心，分离，提取到中间白膜层物质；c.将其加入PBS缓冲液中离心，取沉淀细胞；d.将沉淀细胞B培养；和e.收集所培养的细胞。

中国专利申请CN103849944A公开了一种宫膜干细胞库的构建方法，该方法包括：包括月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤，其中月经血采集包括使用月事杯收集月经血，并保存在月经血保存液中，所述月经血保存液为添加肝素钠的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液，其中还可以添加抗菌物质，如两性霉素、青霉素、链霉素等。宫膜干细胞分离除菌包括用密度梯度离心或磁珠分选得到单个核细胞，并在密度梯度离心前后多次用缓冲液冲洗去除残余细菌和杂质。

中国专利申请CN101914494A公开了经血源性间充质干细胞分离培养，该方法包括：收集月经血，加入两性霉素B、青/链霉素、EDTA-Na₂防止病原微生物污染；采用密度梯度离心法分离出单个核细胞；洗涤后离心，并培养传代。

另外，周云帆等人(中国组织工程研究与临床康复，第14卷第32期，5952-5956页；2010年8月)公开了经血源性子宫内膜间充质干细胞的分离、培养与鉴定，其包括：收集经血(约5mL)，将细胞转移到含有0.2mL两性霉素B、0.2mL青/链霉素，0.1mLEDTA-Na2的磷酸盐缓冲液PBS中；以无菌磷酸盐缓冲液(PBS)等体积稀释后，用1.077g/mL的淋巴细胞分层液进行密度梯度离心分离经血单个核细胞；接种、培养、传代，所用培养基为含体积分数为20％的胎牛血清、1％两性霉素、1％青/链霉素的DMEM高糖培养基。

严琰等人(中国细胞生物学学报，2014,36(7):892–899)公开了经血源子宫内膜干细胞培养、鉴定及体外分化潜能的研究，但其仅详细描述间充质干细胞的培养和鉴定，而未公开具体的收集分离方法。

上述专利文献和非专利文献收集经血都是放入体内收集，这是因为现在普遍认为体外采集容易受污染，体外收集时经血与收集容器存在的高度差大于体内收集，细胞与容器之间的冲击会对细胞造成损伤，另外，体内与体外存在温差也可能对细胞产生损伤，这都造成细胞得率低，细胞活性低。因此体内收集是目前的主流手段。

但是，体内采集方法不仅对志愿者有一定的要求比如必须是已婚女性，还对志愿者的身体有一定的损害。

此外，尽管女性阴道从解剖学来看是体外结构，一般女性都不希望在阴道中植入漏斗状的采集杯来收集经血，未婚女性更不愿外来物损坏处女膜，已婚妇女也担心插入采集杯会伤害阴道结构，特别是顾虑因扩松阴道而影响性生活。其二，不同女性因体型大小和年龄高低，很难选择到合适的采集杯，导致许多女性采集失败。其三，体内植入采集杯，很难判断是否已收集足够的经血样品，往往因植入时间过长影响细胞活性。其四，初步研究发现，从年龄越轻女性经血样品中分离的经血间充质干细胞，其活力更好。但是如上所述，越是年轻女孩，对介入性的体内采集就越心存顾虑，因此有活力的经血干细胞的来源成为问题。

因此现在急需一种操作简便且不影响细胞活性的经血干细胞采集培养方法。

发明内容

本发明人通过深入研究，克服了上述缺点，提供了一种操作简单、对供体无损害、细胞活性高的新型的制备经血间充质干细胞的方法。

具体而言，在第一方面，本发明提供一种新型的制备经血间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

a.体外采集经血，并保存在经血采集液中，得到经血混合液；

b.从经血混合液分离单个核细胞；

c.贴壁培养所述单个核细胞，使之细胞扩增，随后进行贴壁纯化，得到经纯化的细胞，即经血间充质干细胞。

优选地，体外采集经血是通过尿液采集器(例如尿杯)进行的。示例性的尿杯如图1所示。

本发明所采用的制备经血间充质干细胞的方法对受试者而言具有良好的顺从性，这是因为，与体内采集经血的途径相比，本发明的方法不会对受试者的身体产生任何的损害。

具体而言，本发明的方法对于未婚女性的受试者而言，不存在损坏处女膜的风险；对已婚妇女而言，不会导致因插入采集杯而产生的阴道结构破损，因此也无需顾虑因扩松阴道而影响性生活。

另外，由于不同女性因体型大小和年龄高低，很难选择到合适的体内的经血采集杯，导致许多女性采集失败；另一方面，体内植入采集杯，很难判断是否已收集足够的经血样品，往往因植入时间过长影响细胞活性。而本发明的方法所选择的经血采集方法是体外的，可以适用于各种年龄段、体形各异的女性；另外，在体外采集由于可视性较强，不会产生因植入时间过长而导致的影响细胞活性的后果。

再者，初步研究发现，从年龄越轻女性经血样品中分离的经血间充质干细胞，其活力更好。但是如上所述，越是年轻女孩，对介入性的体内采集就越心存顾虑。本发明的方法对于从年轻女性(尤其是未婚女性)采集和分离经血间充质干细胞而言提供了便利，因此解决了有活力的经血干细胞的来源问题。

更重要的，本发明的制备经血间充质干细胞的方法能产生均一性强，细胞活力高，体现在细胞扩增速度快，传代次数高等特点，并且比体内采集方法所获取的细胞密度更高。此外，体外采集方法从年轻女性经血中分离的细胞更具有间充质干细胞的特征。

因此，本发明还涉及尿液采集器(例如尿杯)在体外采集经血并进而用于制备经血干细胞中的用途。

在第二方面，所述方法还包括：

d.将步骤c中经纯化的细胞冻存在冻存液中得到冻存样品。

优选的是，所述方法还进一步包括：

e.将步骤d中的冻存样品放入液氮中以长期保存。

在第三方面，步骤a中使用尿杯体外收集经血。

在第四方面，经血采集液为：在装有100ml Hank's平衡盐溶液中，添加以下成分：万古霉素约80μg/mL、头孢氨苄约300μg/mL、卡那霉素约120μg/mL、庆大霉素约150μg/mL、两性霉素B约3μg/mL及约450单位肝素，置4℃冰箱备用。

其中，Hank’s平衡盐溶液是常用的用于清洗或短时间保存新鲜采集的细胞和组织样品的平衡盐溶液。在该溶液中加入以上适当浓度的抗生素用于清除所采集经血样品中的常见微生物(主要是细菌和真菌)。万古霉素通过抑制细菌的生长和繁殖来杀死细菌，可抑制细菌细胞壁的合成，对金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌等作用强，对难辨校状芽孢杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌等也有良好作用。头孢氨苄通过抑制细胞壁的合成，使细胞内容物膨胀至破裂溶解，从而达到杀菌作用。该品为广谱抗生素。对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌作用。卡那霉素一种蛋白质生物合成抑制剂，对该抗生素敏感的细菌包括大肠杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌属、变形杆菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌的一些菌株。庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，与细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成。是一类广谱性热稳定性的抗生素，因而广泛应用于培养基配置。两性霉素B为多烯类抗真菌抗生素，通过影响细胞膜通透性发挥抑制真菌生长的作用。

Hank's平衡盐的配制是本领域公知的，例如可以参见司徒镇强主编的《细胞培养》(P41页)

NaCL 8.00g

KCL 0.40g

CaCL₂0.14g

MgSO₄.7H₂00.20g

Na₂HP0₄.H₂O 0.06g

KH₂PO₄0.06g

NaHCO₃0.35g

葡萄糖1.00g

酚红0.02g

加水至1L，用NaHCO₃调PH至7.2～7.4。

优选的，本发明的经血采集液体还含有0.5-1.0mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和低于0.8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E－64以及0.3-0.75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA。更优选的是，所述经血采集液还含有0.8mM的AEBSF和0.5mM的E－64以及0.5mM金属蛋白酶抑制剂EDTA。

出乎意料的，上述蛋白酶抑制剂的添加使得通过本发明的方法获得的经血间充质干细胞增殖能力明显增强。

在第五方面，步骤a中的经血混合液保存在冷冻状态，并在72小时之内送往实验室进行细胞分离。需要指出的是，经血样品与采集液混合后在冷冻状态下应保存至少24小时，但应在72小时内完成样品处理。

在第六方面，步骤b如下进行：将采集管中的经血混合液充分混匀后用100μm细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞。例如，细胞滤网可以采用美国BD公司的货号352360的细胞滤网。

优选的是，步骤b如下进行：

(1)、过滤后的经血样品通过密度梯度离心法来获取单个核细胞：将样本缓缓加入人淋巴细胞分离液之上，样本与TBD分离液的体积比为2:1，室温或5－12℃条件下用台式离心机800g离心15分钟；

(2)、吸取中央白膜层细胞即单个核细胞至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤2-3次；

(3)、去除上清液，留下最后洗涤所获得的单个核细胞，用完全培养基重悬细胞并计数，以1×10⁶细胞/ml的密度接种至T75(75cm2)培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，以获取经血间充质干细胞；

(4)、在细胞培养3-4天后，更换完全培养基以弃除未贴壁细胞。初次换液后每天观察细胞的生长情况，每3-4天全量换液一次。

其中，人淋巴细胞分离液可以采用市售产品，例如TBD淋巴细胞分离液。

在第七方面，步骤c中的培养所述单个核细胞是将步骤b(4)中获得的间充质干细胞培养基进行重悬，放入T75的培养瓶中进行培养，培养条件为37℃，5％CO₂。

优选的是，步骤c中的细胞扩增和纯化过程为：将步骤b中获得的单个核细胞培养的4～5天后，更换完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每3～4天全量换液一次；待细胞生长达到80％～90％融合时，用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，可选地进一步按5000-6000个/cm²密度传代接种培养，并记为P1代，从而得到纯化的经血间充质干细胞。

在第八方面，步骤d如下进行：消化前用PBS洗3遍，用质量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为1～2*10⁶/ml；用细胞计数仪计数，将上述被冻存液重悬的细胞冻存。

在第九方面，将被冻存液重悬的细胞用程序降温仪进行冻存，冻存步骤如下：

第一步：4℃，等待；

第二步1.0℃/分钟降至-3.0℃；

第三步5.0℃/分钟降至-20.0℃；

第四步1.0℃/分钟降至-40.0℃；

第五步5.0℃/分钟降至-90.0℃；

第六步结束。

需要说明的是，因经血来源的间充质干细胞形态较其他来源的间充质干细胞要大，为避免速冻过程中对细胞的损伤，因此发明人将逐渐降温的速度减慢，第三步和第五步由常用的10.0℃/分钟改为5.0℃/分钟。

在第十方面，所述冻存液为：7份完全培养基、2份血清/血清替代物和1份DMSO。

在上述方面中，所述完全培养基为：在无菌条件下，在无菌容器中加入65mLMEM-alpha培养基、20mL Chang B基液、1～3mL Chang C基液、1～3mL青霉素或者链霉素、1～3mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺、10～20mL的胎牛血清，充分混匀，置4℃冰箱待用。

有益效果

本发明的方法克服了现有技术的缺点，通过在体外进行收集，对志愿者供体没有严格的要求，并且避免了对志愿者供体可能带来的损害。因此，本发明的方法能让更多，特别是年轻女性有机会收集经血，从年轻女性经血中获得的间充质干细胞更有活力和优势。

另外，本发明人惊奇地发现，与现有技术的主流体内采集方法相比，通过本发明方法分离得到的经血间充质干细胞具有均一性强，细胞活力高，体现在细胞扩增速度快，传代次数高等特点，并且比体内采集方法所获取的细胞密度更高。此外，体外采集方法从年轻女性经血中分离的细胞更具有间充质干细胞的特征。

附图说明

图1：体外采集经血所用的容器的示例性实例，尿液采集杯，即尿杯。

图2：用于放置经血采集液的容器的示例性实例，螺旋盖采集管。

图3：经血间充质干细胞形态学。图3(A)：细胞培养传代P1代的经血干细胞，体内采集方法。图3(B)：细胞培养传代P1代的经血干细胞，体外采集方法。图3(C)：细胞培养传代P5代的经血干细胞，体内采集方法。图3(D)：细胞培养传代P5代的经血干细胞，体外采集方法。P1：细胞培养传代1代的经血干细胞，P5：细胞培养传代5代的经血干细胞；体内采集方法(A、C)，体外采集方法(B、D)。体外采集所获取的经血干细胞形态均一性好，比体内采集方法所获取的细胞密度更高。

图4：经血干细胞核型分析。(左)体内采集方法，(右)体外采集方法。核型无异常变化。

图5：致瘤性分析：(上)经血干细胞(5×10⁶细胞)；(下)胃癌BGC823细胞株(5×10⁶细胞)。

具体实施方式

以下通过实施例更为详细地说明本发明，但这并不意味着本发明的保护范围受这些实施例限制。

实施例1经血体外采集

用尿杯进行体外经血的收集，主要流程如下：

在此之前收集经血都是放入体内收集，此方法不仅对志愿者有一定的要求比如必须是已婚女性，还对志愿者的身体有一定的损害，我们这个方法是在体外进行收集，即对志愿者没有严格的要求。此方法要求志愿者在月经血流量比较多的情况下收集，月经期间，志愿者在活动较少的情况下，积蓄一段时间后进行，用一次性尿液采集杯(如图1所示)于室温下进行收集，将收集的经血倒入一管壁上有刻度并含有25ml经血采集液的螺旋盖采集管(容量的为50ml，图2)中，每次大概需要收集20ml左右的月经血，倒入后立即旋紧盖子，并晃动管子进行混合，目的是为了保存新鲜的经血，用于后续的干细胞的分离和培养。采集的经血样品应保存在冷冻(4℃)状态,并在72小时之内进行细胞分离。

经血采集液配制：在装有100ml Hank's平衡盐溶液中，添加以下成分：万古霉素80μg/mL、头孢氨苄300μg/mL、卡那霉素120μg/mL、庆大霉素150μg/mL、两性霉素B 3μg/mL及450单位肝素，置4℃冰箱备用。

实施例2从经血中分离间充质干细胞(离心法)

经血样品和采集液混合液用100μm细胞滤网(品牌：BD；货号：352360)进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞。用血细胞计数仪对单个核细胞进行计数。

收集单个核细胞，并进行细胞扩增、纯化和冻存。

1、过滤后的经血样品通过密度梯度离心法来获取单个核细胞：将样本缓缓加入人淋巴细胞分离液(TBD)之上，样本与TBD分离液的体积比为2:1，室温条件下用台式离心机800g离心15分钟。

2、吸取中央白膜层细胞即单个核细胞至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤2-3次。

3、去除上清液，留下最后洗涤所获得的单个核细胞，用完全培养基重悬细胞并计数，以1×10⁶细胞/ml的密度接种至T75(75cm2)培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行培养，以获取经血间充质干细胞。

4、细胞扩增和纯化，待上述步骤单个核细胞培养的4～5天后，更换完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每3～4天全量换液一次；待细胞生长达到80％～90％融合时，用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，进行细胞的冻存，或按5000-6000个/cm2密度传代接种培养，并记为P1代。

5、鉴于经血干细胞比较大，比其他来源的间充质干细胞大，所以冻存的数目为100万以上每管。具体步骤：消化前用PBS洗3遍，用质量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为1～2*10⁶/ml；用细胞计数仪计数。将上述被冻存液重悬的细胞用程序降温仪进行冻存，冻存步骤如下：

第一步：4℃，等待；

第二步1.0℃/分钟降至-3.0℃；

第三步5.0℃/分钟降至-20.0℃；

第四步1.0℃/分钟降至-40.0℃；

第五步5.0℃/分钟降至-90.0℃；

第六步结束；

取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。

完全培养基配制：在无菌条件下，在无菌容器中加入65mL MEM-alpha培养基、20mL Chang B基液、1～3mL Chang C基液、1～3mL青霉素或者链霉素、1～3mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺、10～20mL的胎牛血清，充分混匀，置4℃冰箱待用。

冻存液配制：7份完全培养基、2份血清/血清替代物、1份DMSO。

实施例3实施例2中获得的间充质干细胞鉴定、表征和特异性标志物分析

取实施例2中P5代的间充质干细胞，用相应的抗体标记，用流式细胞仪分析,鉴定间充质干细胞表面标志物，结果如表1和表2所示。

此外，除了用月事杯体内采集经血之外，以与实施例2相同的步骤进行采集、分离和储存经血间充质干细胞。并取P5代的间充质干细胞进行相同的鉴定、表征和分析。

经血间充质干细胞形态学可参见图3。P1：细胞培养传代1代的经血干细胞，P5：细胞培养传代5代的经血干细胞；体内采集方法(A、C)，体外采集方法(B、D)。体外采集所获取的经血干细胞形态均一性好，比体内采集方法所获取的细胞密度更高。

经血干细胞核型分析可参见图4。(左)体内采集方法，(右)体外采集方法。核型无异常变化。

以下表一示出了两种采集方法(从50岁女性)所获得的经血干细胞表面标志物比较。

表一.两种采集方法(从50岁女性)所获得的经血干细胞表面标志物比较

由表一可知，对于体外采集方法，细胞表面标志物CD29、CD73都高于常规的体内采集方法，而细胞表面标志物CD105与常规的体内采集方法相当，表明本发明体外采集方法的效果优于常规的体内采集方法。

表二.两种采集方法(从22岁女性)所获得的经血干细胞表面标志物比较体外采集方法(从22岁女性)所获得的经血干细胞表面标志物

表二进一步证明了本发明体外采集方法的效果优于常规的体内采集方法。

此外，从表一和表二的比较可知，从年轻女性(如22岁志愿者)经血样品中所分离的经血间充质干细胞更有活力，其细胞表面标志物CD29、CD73和CD105的表达量均高于上述表一(从50岁女性)所获得的经血干细胞。CD34和CD45是造血干细胞表面标志物，年轻女性干细胞表达量都比较低。说明用体外采集方法从年轻女性经血中分离的细胞更具有间充质干细胞的特征。特别是CD117和SSEA-4被认为是经血间充质干细胞特有的表面分子标志物，两者在年轻女性(22岁)的经血间充质干细胞中表达量都明显高于较大年龄女性(50岁)。这些也说明年轻女性的经血间充质干细胞具有较高的干性和活性。

实施例4本发明所分离的经血间充质干细胞的致瘤性

64只裸鼠分为阳性对照组和实施例2中获得的间充质干细胞组,每组32只,雌雄各半。将传代第5代的实施例2中获得的间充质干细胞接种至裸鼠皮下,分别于注射5×10⁶经血干细胞和胃癌BGC823细胞株。实验观察时间为2周至2个月，接种本发明经血干细胞的试验组均不具有致瘤性。示例性结果如图5所示(接种四周后观察结果)，其中上图是经血干细胞(5×10⁶细胞)；下图是胃癌BGC823细胞株(5×10⁶细胞)。

实施例5经血采集液体中添加丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E－64以及金属蛋白酶抑制剂EDTA后使得经血干细胞的增殖能力显著提高

通过向经血采集液中添加0.8mM的AEBSF和0.5mM的E－64以及0.5mM金属蛋白酶抑制剂EDTA，采取实施例1和2的采集和提取步骤来获得经血干细胞。将两组经血干细胞的悬浮液以每孔1x10⁴细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μl，在37℃5％CO₂孵箱中继续培养，每天经血干细胞的增殖情况，连续计数7天，发现到第7天时，通过添加蛋白酶的实施例2的经血干细胞扩增数量是未添加蛋白酶的实施例2的经血干细胞扩增数量的1.21倍。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员可以对本发明进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新型的制备经血间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：

a.体外收集经血，并保存在经血采集液中，得到经血混合液；

b.从经血混合液分离单个核细胞；

c.贴壁培养上述单个核细胞，使之细胞扩增，随后通过贴壁纯化，得到经纯化的细胞，即经血间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

d.将步骤c中经纯化的细胞冻存在冻存液中得到冻存样品；

优选的是，所述方法还包括：

e.将步骤d中的冻存样品放入液氮中以长期保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中使用尿液采集器例如尿杯进行体外收集经血。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经血采集液为：每100ml Hank's平衡盐溶液中，含有以下成分：万古霉素80μg/mL、头孢氨苄300μg/mL、卡那霉素120μg/mL、庆大霉素150μg/mL、两性霉素B 3μg/mL及450单位肝素；

优选的是，所述经血采集液还含有0.5-1.0mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和低于0.8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E－64以及0.3-0.75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA；

更优选的是，所述经血采集液还含有0.8mM的AEBSF和0.5mM的E－64以及0.5mM金属蛋白酶抑制剂EDTA。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中的经血混合液保存在冷冻状态，并在72小时之内送往实验室进行细胞分离。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b如下进行：将采集管中的经血混合液充分混匀后用100μm细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞；

优选的是，步骤b如下进行：

(1)、过滤后的经血样品通过密度梯度离心法来获取单个核细胞：将样本缓缓加入人淋巴细胞分离液(TBD)之上，样本与TBD分离液的体积比为2:1，室温条件下用台式离心机800g离心15分钟；

(2)、吸取中央白膜层细胞即单个核细胞至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤2-3次；

(3)、去除上清液，留下最后洗涤所获得的单个核细胞，用完全培养基重悬细胞并计数，以1×10⁶细胞/ml的密度接种至T75(75cm²)培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，以获取经血间充质干细胞；

(4)、在细胞培养3-4天后，更换完全培养基以弃除未贴壁细胞；初次换液后每天观察细胞的生长情况，每3-4天全量换液一次。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c中的培养所述单个核细胞是将步骤b(4)中获得的间充质干细胞培养基进行重悬，放入T75的培养瓶中进行培养，培养条件为37℃，5％CO2；

优选的是，步骤c中的细胞扩增和纯化过程为：将步骤b中获得的单个核细胞培养的4～5天后，更换完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每3～4天全量换液一次；待细胞生长达到80％～90％融合时，用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞，可选地进一步按5000-6000个/cm2密度传代接种培养，并记为P1代，从而得到纯化的经血间充质干细胞。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤d如下进行：消化前用PBS洗3遍，用质量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为1～2*106/ml；用细胞计数仪计数，将上述被冻存液重悬的细胞冻存。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将被冻存液重悬的细胞用程序降温仪进行冻存，冻存步骤如下：

第一步：4℃，等待；

第二步1.0℃/分钟降至-3.0℃；

第三步5.0℃/分钟降至-20.0℃；

第四步1.0℃/分钟降至-40.0℃；

第五步5.0℃/分钟降至-90.0℃；

第六步结束。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冻存液为：7份完全培养基、2份血清/血清替代物和1份DMSO。