CN109845727B - 经血保存液及经血来源间充质干细胞冻存方法 - Google Patents

Abstract

一种经血保存液及经血来源间充质干细胞冻存方法，包括：所述保存液的基础液为0.9％生理盐水，保存液还包括往所述基础液中加入的青霉素、链霉素和氟康唑；其中青霉素的终浓度和链霉素的终浓度为100U/mL～300U/mL，氟康唑的终浓度为质量体积比0.5％～1％。所述青霉素的终浓度和链霉素的终浓度为100U/mL。结合其经血来源间充质干细胞冻存方法采集女性的经血时对女性外阴清洁消毒，使用高压灭菌的月事杯采集经血，保存于保存液中，从采集源头减少污染几率，保持经血中细胞活性；采集到的经血经分离得到的间充质干细胞种子细胞冻存复苏后细胞活性好，经原代培养细胞增殖活性高，传代培养的细胞活率高，污染率低。

Description

经血保存液及经血来源间充质干细胞冻存方法

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种经血保存液及经血来源间充质干细胞冻存方法。

背景技术

经血来源间充质干细胞是从女性月经血中分离培养出的干细胞。最早由美国Musina领导的研究小组从健康女性的月经血中得到。2008年，日本的Hida领导的研究小组也利用女性月经血成功分离培养出具有多重分化功能的该种干细胞。在已知的人体细胞中，经血来源间充质干细胞是自我复制、定向分化能力最强的干细胞，它源于子宫内膜，通过经血排出体外。它的分化潜能与胚胎干细胞相近，又具备免疫原性低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱的特性，可用于治疗多种疾病。经血来源间充质干细胞采集简单，且不需配型，可供无血缘关系的人使用。国外研究表明，经血来源间充质干细胞在治疗女性不孕不育、抗衰老方面也有一定的效果。将经血来源间充质干细胞作为种子细胞长期存储，能够为许多潜在的甚至危及生命的疾病提供全新的治疗方式-细胞治疗。目前不管是文献资料还是专利发明，对于经血来源间充质干细胞的制备存储方法都是将经血间充质干细胞从经血中分离出来经过纯化培养后再冻存。

进一步的，目前所有公开的经血间充质干细胞的分离方法中经血采集时在保存液中都会添加不同种类的抗凝剂，而抗凝剂有细胞毒性作用：肝素过量可引起白细胞聚集和血小板减少；EDTA盐浓度过高，渗透压上升，会造成细胞皱缩；枸橼酸钠细胞毒性较小，也是输血中血液保养液的成分之一，但是，枸橼酸钠6mg才能抗凝1ml血液，碱性强。

另外，对于经血样本的污染问题，由于女性阴道本身自带细菌真菌，经血流经阴道不可避免的会受到污染。目前唯一解决经血样本在后期分离及培养干细胞的过程中细胞污染问题的方法就是在经血保存液，经血洗涤液及培养基中添加抗生素抑制细菌和真菌的生长。广谱抗真菌的两性霉素B对细胞的毒性作用较大，不能直接用于细胞培养，专门用于细胞培养的水溶性两性霉素B大多为国外产品，价格比较昂贵。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种经血保存液及经血来源间充质干细胞冻存方法，采集女性的经血时对女性外阴清洁消毒，使用高压灭菌的月事杯采集经血，保存于保存液中，从采集源头减少污染几率，保持经血中细胞活性；采集到的经血经分离得到的间充质干细胞种子细胞冻存复苏后细胞活性好，经原代培养细胞增殖活性高，传代培养的细胞活率高，污染率低。

为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种经血保存液及经血来源间充质干细胞冻存方法的解决方案，具体如下：

一种经血保存液，包括：

所述保存液的基础液为0.9％生理盐水，所述保存液还包括往所述基础液中加入的青霉素、链霉素和氟康唑；

其中青霉素的终浓度和链霉素的终浓度为100U/mL～300U/mL，氟康唑的终浓度为质量体积比0.5％～1％。

所述青霉素的终浓度和链霉素的终浓度为100U/mL。

所述经血来源间充质干细胞冻存方法，包括如下步骤：

步骤1：配制所述经血保存液；

步骤2：使用月事杯采集女性经期中第二天到第三天的经血；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，将经血和保存液充分混匀，在4℃的温度条件下保存放置12小时；

步骤3：将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，在操作台内将浸泡在经血保存液中的经血转移至离心管中，首次2000rpm-2500rpm离心且离心10-15min，除去上清液得到主液一；往主液一中加入清洗液，充分混匀，再次1500-2000rpm离心且离心5-15min，除去上清液得到主液二，往主液二中加入等体积0.9％生理盐水混匀后得到主液三；

步骤4：把主液三加入到室温下装有淋巴细胞分离液的离心管中，所述主液三与淋巴细胞分离液的体积比例为1：1，配平该离心管，2100r/min离心且离心20min，离心完成后，离心管中出现由下至上的明显分层为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、白膜层和血浆层；

步骤5：吸取血浆层至距白膜层5mm处弃之，吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中形成细胞悬液，加生理盐水稀释来与细胞悬液混匀，2000r/min离心且离心15min，离心完成后弃去上清得到主液四，往主液四中加入生理盐水来重悬细胞充分混匀，取样计数，然后1800r/min离心且离心10min，离心完成后弃去上清，即获得经血单个核细胞；

步骤6：每1×10⁷个所述经血单个核细胞中加入1ml冻存液，放入冻存盒，把冻存盒转入-80℃冰箱中，12～24h后再把冻存盒转入-196℃的液氮或气氮中保存备用。

所述步骤6中的经血单个核细胞的冻存液由体积百分比为5％～20％的DMSO、体积百分比为20％～60％的人血白蛋白、体积百分比为40％～70％的间充质干细胞无血清培养基组成，其中DMSO为渗透性冷冻保护剂，人血白蛋白为非渗透性保护剂，间充质干细胞无血清培养基为基础液。

所述清洗液为含有青霉素、链霉素、氟康唑的0.9％生理盐水；其中青霉素和链霉素的终浓度为100U/ml，所述氟康唑的终浓度为质量体积比0.5％～1％。

与现有技术相比，本发明有以下优点和益处：

本发明采集女性的经血时对女性外阴清洁消毒，使用高压灭菌的月事杯采集经血，保存于保存液中，从采集源头减少污染几率，保持经血中细胞活性；采集到的经血经分离得到的间充质干细胞种子细胞冻存复苏后细胞活性好，经原代培养细胞增殖活性高，传代培养的细胞活率高，污染率低。

附图说明

图1为本发明的经血来源间充质干细胞冻存方法流程图。

图2为针对样本2运用实施例1的方法在经血样本冻存复苏后原代培养第2天、第4天及第6天的经血间充质干细胞形态图，A部分表示第2天的经血间充质干细胞形态图，B部分表示第4天的经血间充质干细胞形态图，C部分表示第6天的经血间充质干细胞形态图。

图3为样本2运用现有技术方法二在经血样本冻存复苏后原代培养第2天、第4天及第6天的经血间充质干细胞形态图，A部分表示第2天的经血间充质干细胞形态图，B部分表示第4天的经血间充质干细胞形态图，C部分表示第6天的经血间充质干细胞形态图。

图4为样本2运用实施例1的方法在经血样本冻存复苏后传代培养P1、P2及P3代的经血间充质干细胞形态图。

图5为样本2运用现有技术方法二在经血样本冻存复苏后传代培养P1、P2及P3代的经血间充质干细胞形态图。

图6为样本2运用实施例1的方法在P3代经血间充质干细胞的表面标记检测结果图。

具体实施方式

本发明是将经血单个核作为经血源间充质干细胞的种子细胞直接冻存。该方法节约了建立经血源间充质干细胞细胞库的成本。本发明中所用保存液不添加抗凝剂，最大程度保证经血样本中细胞的活性。本发明中采用市售大扶康(氟康唑Fluconazole,Diflucan,2μg/100ml)进行防控,效果显著，而且价格低廉，获得容易，对细胞毒性作用小。大扶康有广谱抗真菌作用,主要用于治疗念珠菌、隐球菌等,尤其适用于不能耐受两性霉素B毒性作用的细胞。

下面将结合附图和实施例对本发明做进一步地说明。

实施例1：

如图1-图6所示，经血保存液，包括：

所述保存液的基础液为0.9％生理盐水，所述保存液还包括往所述基础液中加入的青霉素、链霉素和氟康唑；

其中青霉素的终浓度和链霉素的终浓度为100U/mL，氟康唑的终浓度为质量体积比0.5％。

该经血保存液中不添加抗凝剂，避免抗凝剂对细胞的损伤，最大程度保证经血样本中细胞的活性。同时在经血保存液中添加抗生素抑制阴道细菌真菌的生长，采集时尽量做到无菌，从源头降低细菌真菌的污染几率。

而本实施例的经血来源间充质干细胞冻存方法，该方法是将经血单个核作为经血来源间充质干细胞的种子细胞，加入冻存液冻存。直接将经血单个核作为种子细胞建立经血来源间充质干细胞库，节约了存储的成本，操作简便，冻存复苏后细胞活性高。

所述经血来源间充质干细胞冻存方法，包括如下步骤：

步骤1：配制所述经血保存液；

步骤2：在志愿者经期经血采集时，首先使用双氧水对作为志愿者的女性外阴擦拭清洗消毒，清洁后使用高压灭菌过的月事杯采集作为志愿者的女性经期中第二天到第三天的经血；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，将经血和保存液充分混匀，在4℃的温度条件下保存放置12小时；

步骤3：将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，在操作台内将浸泡在经血保存液中的经血转移至干净的离心管中，首次2000rpm离心且离心10min，除去上清液得到主液一；往主液一中等体积加入清洗液，充分混匀，再次1500rpm离心且离心5min，除去上清液得到主液二，往主液二中加入等体积0.9％生理盐水混匀后得到主液三，取样计白细胞数，计算细胞活率；

步骤4：把主液三缓慢加入到室温下装有淋巴细胞分离液的离心管中，所述主液三与淋巴细胞分离液的体积比例为1：1，配平该离心管，2100r/min离心且离心20min，慢升慢降。离心完成后，离心管中出现由下至上的明显分层为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、白膜层和血浆层；

步骤5：吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之，小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中形成细胞悬液，加等体积的0.9％生理盐水稀释来与细胞悬液混匀，2000r/min离心且离心15min，离心完成后弃去上清得到主液四，往主液四中加入与其等体积的0.9％生理盐水来重悬细胞充分混匀，取样计数，然后1800r/min离心且离心10min，离心完成后弃去上清，即获得经血单个核细胞；

步骤6：每1×10⁷个所述核细胞中加入1ml冻存液，放入冻存盒，把冻存盒转入-80℃冰箱中，12h后再把冻存盒转入-196℃的液氮或气氮中保存备用。

所述步骤6中的经血单个核细胞的冻存液由体积百分比为10％的DMSO、体积百分比为20％的人血白蛋白、体积百分比为70％的间充质干细胞无血清培养基组成，其中DMSO为渗透性冷冻保护剂，人血白蛋白为非渗透性保护剂，间充质干细胞无血清培养基为基础液。该方法中的冻存液避免了引入动源性的物质，提高了以后临床应用的安全性。

所述清洗液为含有青霉素、链霉素、氟康唑的0.9％生理盐水；其中青霉素和链霉素的终浓度为100U/ml，所述氟康唑的终浓度为质量体积比0.5％。

实施例2：

经血保存液，包括：

所述保存液的基础液为0.9％生理盐水，所述保存液还包括往所述基础液中加入的青霉素、链霉素和氟康唑；

其中青霉素的终浓度和链霉素的终浓度为200U/mL，氟康唑的终浓度为质量体积比0.75％。

该经血保存液中不添加抗凝剂，避免抗凝剂对细胞的损伤，最大程度保证经血样本中细胞的活性。同时在经血保存液中添加抗生素抑制阴道细菌真菌的生长，采集时尽量做到无菌，从源头降低细菌真菌的污染几率。

而本实施例的经血来源间充质干细胞冻存方法，该方法是将经血单个核作为经血来源间充质干细胞的种子细胞，加入冻存液冻存。直接将经血单个核作为种子细胞建立经血来源间充质干细胞库，节约了存储的成本，操作简便，冻存复苏后细胞活性高。

所述经血来源间充质干细胞冻存方法，包括如下步骤：

步骤1：配制所述经血保存液；

步骤2：在志愿者经期经血采集时，首先使用双氧水对作为志愿者的女性外阴擦拭清洗消毒，清洁后使用高压灭菌过的月事杯采集作为志愿者的女性经期中第二天到第三天的经血；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，将经血和保存液充分混匀，在4℃的温度条件下保存放置12小时；

步骤3：将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，在操作台内将浸泡在经血保存液中的经血转移至干净的离心管中，首次2250rpm离心且离心13min，除去上清液得到主液一；往主液一中等体积加入清洗液，充分混匀，再次1750rpm离心且离心10min，除去上清液得到主液二，往主液二中加入等体积0.9％生理盐水混匀后得到主液三，取样计白细胞数，计算细胞活率；

步骤4：把主液三缓慢加入到室温下装有淋巴细胞分离液的离心管中，所述主液三与淋巴细胞分离液的体积比例为1：1，配平该离心管，2100r/min离心且离心20min，慢升慢降。离心完成后，离心管中出现由下至上的明显分层为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、白膜层和血浆层；

步骤5：吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之，小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中形成细胞悬液，加等体积的0.9％生理盐水稀释来与细胞悬液混匀，2000r/min离心且离心15min，离心完成后弃去上清得到主液四，往主液四中加入与其等体积的0.9％生理盐水来重悬细胞充分混匀，取样计数，然后1800r/min离心且离心10min，离心完成后弃去上清，即获得经血单个核细胞；

步骤6：每1×10⁷个所述核细胞中加入1ml冻存液，放入冻存盒，把冻存盒转入-80℃冰箱中，18h后再把冻存盒转入-196℃的液氮或气氮中保存备用。

所述步骤6中的经血单个核细胞的冻存液由体积百分比为15％的DMSO、体积百分比为40％的人血白蛋白、体积百分比为45％的间充质干细胞无血清培养基组成，其中DMSO为渗透性冷冻保护剂，人血白蛋白为非渗透性保护剂，间充质干细胞无血清培养基为基础液。该方法中的冻存液避免了引入动源性的物质，提高了以后临床应用的安全性。

所述清洗液为含有青霉素、链霉素、氟康唑的0.9％生理盐水；其中青霉素和链霉素的终浓度为100U/ml，所述氟康唑的终浓度为质量体积比0.75％。

实施例3：

经血保存液，包括：

所述保存液的基础液为0.9％生理盐水，所述保存液还包括往所述基础液中加入的青霉素、链霉素和氟康唑；

其中青霉素的终浓度和链霉素的终浓度为300U/mL，氟康唑的终浓度为质量体积比1％。

该经血保存液中不添加抗凝剂，避免抗凝剂对细胞的损伤，最大程度保证经血样本中细胞的活性。同时在经血保存液中添加抗生素抑制阴道细菌真菌的生长，采集时尽量做到无菌，从源头降低细菌真菌的污染几率。

而本实施例的经血来源间充质干细胞冻存方法，该方法是将经血单个核作为经血来源间充质干细胞的种子细胞，加入冻存液冻存。直接将经血单个核作为种子细胞建立经血来源间充质干细胞库，节约了存储的成本，操作简便，冻存复苏后细胞活性高。

所述经血来源间充质干细胞冻存方法，包括如下步骤：

步骤1：配制所述经血保存液；

步骤2：在志愿者经期经血采集时，首先使用双氧水对作为志愿者的女性外阴擦拭清洗消毒，清洁后使用高压灭菌过的月事杯采集作为志愿者的女性经期中第二天到第三天的经血；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，将经血和保存液充分混匀，在4℃的温度条件下保存放置12小时；

步骤3：将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，在操作台内将浸泡在经血保存液中的经血转移至干净的离心管中，首次2500rpm离心且离心15min，除去上清液得到主液一；往主液一中等体积加入清洗液，充分混匀，再次2000rpm离心且离心15min，除去上清液得到主液二，往主液二中加入等体积0.9％生理盐水混匀后得到主液三，取样计白细胞数，计算细胞活率；

步骤4：把主液三缓慢加入到室温下装有淋巴细胞分离液的离心管中，所述主液三与淋巴细胞分离液的体积比例为1：1，配平该离心管，2100r/min离心且离心20min，慢升慢降。离心完成后，离心管中出现由下至上的明显分层为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、白膜层和血浆层；

步骤5：吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之，小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中形成细胞悬液，加等体积的0.9％生理盐水稀释来与细胞悬液混匀，2000r/min离心且离心15min，离心完成后弃去上清得到主液四，往主液四中加入与其等体积的0.9％生理盐水来重悬细胞充分混匀，取样计数，然后1800r/min离心且离心10min，离心完成后弃去上清，即获得经血单个核细胞；

步骤6：每1×10⁷个所述核细胞中加入1ml冻存液，放入冻存盒，把冻存盒转入-80℃冰箱中，24h后再把冻存盒转入-196℃的液氮或气氮中保存备用。

所述步骤6中的经血单个核细胞的冻存液由体积百分比为20％的DMSO、体积百分比为60％的人血白蛋白、体积百分比为20％的间充质干细胞无血清培养基组成，其中DMSO为渗透性冷冻保护剂，人血白蛋白为非渗透性保护剂，间充质干细胞无血清培养基为基础液。该方法中的冻存液避免了引入动源性的物质，提高了以后临床应用的安全性。

所述清洗液为含有青霉素、链霉素、氟康唑的0.9％生理盐水；其中青霉素和链霉素的终浓度为100U/ml，所述氟康唑的终浓度为质量体积比1％。

用所述采集作为志愿者的女性经期中第二天到第三天的经血的方法分别采集三人的经血分别作为三份经血样本，该三份经血样本分别为样本1、样本2和样本3，把样本1、样本2和样本3都均分为两份，把一份样本1、一份样本2和一份样本3用实施例1的方法来处理，把另一份样本1、另一份样本2和另一份样本3用现有技术的方法一来处理，所有处理后得到的冻存盒中的经血单个核细胞在液氮中分别冻存4周后复苏培养，即在37℃水浴中解冻细胞，将细胞转入装有0.9％生理盐水的离心管，1500rpm离心且离心5min，弃上清，再加入0.9％生理盐水离心洗涤两次后，用培养基重悬，取样计数，测定活性，所述现有技术的方法一除了经血保存液中多添加了抗凝剂外，其它方法同实施例1相同，该抗凝剂为终浓度为质量体积比10％的枸橼酸钠抗凝剂，表1显示利用实施例1的方法和现有技术的方法一分别表示经血保存液不添加抗凝剂与传统的添加抗凝剂的保存液相比较处理后的细胞的情况：

表1

实施例1的方法和现有技术的方法一相比，细胞活性明显增强。

用所述采集作为志愿者的女性经期中第二天到第三天的经血的方法分别采集三人的经血分别作为三份经血样本，该三份经血样本分别为样本1、样本2和样本3，把样本1、样本2和样本3都均分为三份，把一份样本1、一份样本2和一份样本3用实施例1的方法来处理，把剩下的两份中的一份样本1、把剩下的两份中的一份样本2和把剩下的两份中的一份样本3用现有技术的方法二来处理，把剩下的两份中的另一份样本1、把剩下的两份中的另一份样本2和把剩下的两份中的另一份样本3用现有技术的方法三来处理，现有技术的方法二除了冻存液为友康恒业生物科技(北京)有限公司的无血清细胞冻存液外，其它的方法都和实施例1相同，现有技术的方法三除了冻存液为质量百分比为90％的胎牛血清和质量百分比为10％的DMSO外，其它的方法都和实施例1相同，所有处理后得到的冻存盒中的经血单个核细胞在液氮中分别冻存4周后复苏培养，即用37℃水浴解冻细胞，将细胞转入装有生理盐水的离心管，1500rpm离心且离心5min，弃上清，加0.9％生理盐水离心洗涤两次后，用培养基重悬，取样计数，测定活性。根据细胞量接种于培养皿中培养。48h后观察细胞贴壁生长情况，并全换液，之后每隔三天半换液一次，直至细胞融合度达70％以上进行传代，这样就得到表2显示的应用实施例1、现有技术的方法二和现有技术的方法三得到的所述冻存液冻存经血单个细胞核比较细胞冻存复苏后的情况：

表2

由表2中的实验结果看出，经血样本之间因为个体原因本身存在的较大的差异，经过实施例1、现有技术的方法二和现有技术的方法三的冻存液冻存复苏后细胞活性观察发现，实施例1采用的所述冻存液与现有技术的方法二所述的冻存液差异不大，而采用无血清冻存液冻存细胞后，细胞活性降低。

另外还进行细胞形态观察：

分别实施例1与现有技术的方法二冻存复苏后细胞培养的样本2的各代次细胞形态观察，即分别于原代培养2天、4天、6天后在显微镜下拍照观察，如图2、图3所示，传代培养分别于细胞融合度达80％以上时拍照观察，如图4，图5所示；原代培养过程中现有技术的方法二中细胞培养48h后，细胞贴壁较少，后期增值缓慢。实施例1中的细胞传代观察P1、P2及P3细胞：P1代细胞不均一，细胞形状有梭形，铺路石样；P2代细胞形态趋于均一，仍有少量杂细胞，P3代细胞形状为梭形，大小均一，细胞排列成旋涡状而如图4所示，现有技术的方法二中细胞传代培养发现杂细胞较多，细胞形态多数为上皮细胞样，传代至P3代上皮样细胞仍较多而如图5所示。

还运用细胞表面标志流式检测方法来检测，即：

将实施例1、现有技术的方法二和现有技术的方法三所得的细胞传代至P3代再收集细胞，以生理盐水洗涤两遍后调整浓度至1×10⁵/ml，流式细胞仪检测细胞表面标记阳性指标CD90、CD73和CD105，阴性指标CD14、CD34、CD45、HLA-DR，结果如表3和图6所示：

表3

在4℃的温度条件下保存放置12小时，为了安全起见常在执行过程中需要进行对该温度条件下的现场温度进行监测，这样就在4℃的温度条件下保存放置12小时的温度条件下的环境中设置温度传感器，所述温度传感器与微控制器连接，微控制器与无线通信模块连接，无线通信模块能与无线网中的监控平台连接，所述微控制器能够是单片机、处理器、PLC、FPGA芯片或者DSP处理芯片，所述无线通信模块能够是WIFI模块，无线网能够是WLAN网，所述监控平台能够是PC机或者笔记本电脑，这样温度传感器就能把所述温度条件下的环境中的温度信息传递至微控制器中，再由微控制器传递到所述监控平台里，目前的监控平台与微控制器执行温度信息传递之际，为经微控制器传递要求信息链接的指令就像connect到监控平台，并在监控平台接收时建立双方的信息链路保持相连，在建立信息链路后，微控制器方可把温度信息顺利传递到监控平台，目前，微控制器各次传递温度信息均须传递要求信息链接的指令到监控平台，且于构造信息链路后方传递温度信息到监控平台里，而各次均须传递要求信息链接的指令会增大监控平台的工作量，另外会使得无线网的软硬件设施的耗损。

经过改进，提出如下的技术方案解决上述问题：

在4℃的温度条件下保存放置12小时的温度条件下的环境中设置温度传感器，所述温度传感器与微控制器连接，微控制器与无线通信模块连接，无线通信模块能与无线网中的监控平台连接，所述微控制器能够是单片机、处理器、FPGA芯片或者DSP处理芯片，所述无线通信模块能够是WI F I模块，无线网能够是WLAN网，所述监控平台能够是PC机或者笔记本电脑，这样温度传感器就能把所述各温度条件下的环境中的温度信息传递到微控制器中，再由微控制器传递到所述监控平台里；

所述微控制器把温度信息传递到所述监控平台里的方法，包括：

A-1：微控制器在同监控平台构造信息链路之际，获得所述监控平台回传的信息链路时间大小；

微控制器先传递要求信息链接的命令到监控平台，所述要求信息链接的命令为要求握手链接的命令，亦为connect这样的要求链接的命令，监控平台获得到所述要求信息链接的命令后，构造同所述微控制器的信息链路，还获得事先设定的信息链路时间大小，把所述信息链路时间大小回传到所述微控制器；所述信息链路时间大小是监控平台同所述微控制器维持信息链路保持相连的时段大小；能清楚的是，所述监控平台在获得到所述要求信息链接的命令且构造同所述微控制器的信息链路之际，就能把所述信息链路时间大小回传到所述微控制器，而所述微控制器获得所述监控平台回传的信息链路时间大小。

A-2：所述微控制器在侦听到温度信息的传递命令之际，获得现时的时点和信息链路构造完成的起始时点，还运算出所述现时的时点同所述信息链路构造完成的起始时点间的时段大小；

所述温度信息传递命令的激活方式是：使用者在运用微控制器和监控平台执行信息传递之际，经由按压微控制器事先设定的与微控制器连接的开关来激活温度信息传递命令，在侦听到温度信息的传递命令之际，所述微控制器获得现时的时点和所述信息链路构造完成的起始时点之间的时段大小，能明白的为，所述现时的时点是在侦听到温度信息的传递命令获得的，而所述信息链路构造完成的起始时点是在微控制器和监控平台顺利完成构造信息链路之际获得的，且在获得到所述起始时点之际贮存所述起始时点，接着在侦听到温度信息的传递命令之际，获得现时的时点，接着凭借获得的所述现时的时点和贮存的所述起始时点，运算出所述现时的时点和贮存的所述起始时点间的时段大小，还获得所述时段大小。

A-3：判定所述时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小；

在获得到所述时段大小，把所述时段大小和所述信息链路时间大小执行比较，来判定所述时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小。

A-4：如果所述时段大小不大于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器传递温度信息到所述监控平台；

如果所述时段大小不大于所述信息链路时间大小，表示所述微控制器和所述监控平台现下还维持信息链路保持相连，这时，所述微控制器能够传递温度信息到所述监控平台里，所以，所述微控制器把温度信息传递到所述监控平台里。

这样的温度信息传递方法，微控制器在同监控平台构造信息链路之际，先获得所述监控平台回传的信息链路时间大小，接着在侦听到温度信息的传递命令之际，获得现时的时点和信息链路构造完成的起始时点，还运算出所述现时的时点与所述信息链路构造完成的起始时点间的时段大小，还判定所述时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小，如果所述时段大小不大于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器传递温度信息到所述监控平台，而非在温度信息传递旗舰中，各次传递温度信息均须先传递要求信息链接的命令到监控平台，且在构造信息链路后方传递温度信息到监控平台里，本发明在侦听到温度信息的传递命令之际，先判定现时的时点和所述信息链路构造完成的起始时点之间的时段大小是不是不大于所述信息链路时间大小，如果是，径直传递温度信息至所述监控平台，无须再次构造信息链路，以此降低了无线网的软硬件设备的耗损。

要改善温度信息传递的机动性，在A-3后，所述微控制器把温度信息传递到所述监控平台里的方法还包括：

B-1，如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器再次同所述监控平台构造信息链路；

在所述时段大小高于所述信息链路时间大小之际，表示所述监控平台和所述微控制器的信息链路已中断了，这时所述微控制器纵然传递温度信息到所述监控平台，亦是传递不成的，所以，所述微控制器在认定所述时段大小高于所述信息链路时间大小之际，再次同所述监控平台构造信息链路，即所述微控制器再次传递要求信息链接的命令到所述监控平台，来再次构造和所述监控平台的信息链路，并基于构造的信息链路来传递温度信息。

经由判定所述时段大小和所述信息链路时间大小的大小关系，来认定是不是须再次构造信息链路，如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，就再次传递要求信息链接的命令到所述监控平台来构造信息链路，还凭借再次构造的信息链路传递温度信息，以此改善了温度信息传递的机动性。

要改善温度信息传递的机动性，如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器再次同所述监控平台构造信息链路之际，执行如下方式：

所述微控制器重建信息链路次数；在事先设定时段大小里重建的信息链路次数抵达事先设定次数之际，所述微控制器传递要求加大信息链路时间大小的消息到所述监控平台，来让所述监控平台加大所述微控制器当前的信息链路时间大小。

要改善温度信息传递的机动性，如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，这里所述微控制器与显示屏连接，那么所述微控制器对显示屏发送通告消息进行显示，来让使用者激活要求信息链接的命令；且在侦听到使用者激活的要求信息链接的命令之际，所述微控制器再次传递要求信息链接的命令至所述监控平台。

如果所述时段大小高于所述信息链路时间大小，那么所述微控制器对显示屏发送通告消息进行显示，来让使用者激活要求信息链接的命令，亦即在所述时段大小高于所述信息链路时间大小，所述微控制器能明了现时同监控平台已经中断了信息链路，那么所述微控制器对显示屏发送通告消息进行显示给使用者，让使用者选取是不是再次激活要求信息链接的命令，如果在侦听到使用者激活的要求信息链接的命令之际，所述微控制器再次传递要求信息链接的命令到所述监控平台。而使用者能在观察到所述通告消息后，另外获知现时的无线网带宽占用率高，不能链接监控平台之际，就能不再激活要求信息链接的命令，降低了无线网的工作量。

经由传递通告消息，来让使用者激活要求信息链接的命令，让使用者在温度信息传递期间，能高效获知现时的温度信息传递条件，改善了使用者运用的实用性。

以上以用实施例说明的方式对本发明作了描述，本领域的技术人员应当理解，本公开不限于以上描述的实施例，在不偏离本发明的范围的情况下，可以做出各种变化、改变和替换。

Claims (2)

1.一种经血来源间充质干细胞冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：配制经血保存液；所述保存液的基础液为0.9％生理盐水，所述保存液还包括往所述基础液中加入的青霉素、链霉素和氟康唑；其中，氟康唑的终浓度为质量体积比0.5％；所述青霉素的终浓度和链霉素的终浓度为100U/m L；

步骤2：使用月事杯采集女性经期中第二天到第三天的经血；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，将经血和保存液充分混匀，在4℃的温度条件下保存放置12小时，其中，4℃的温度条件下保存放置12小时的温度条件下的环境中设置温度传感器，所述温度传感器与微控制器连接，微控制器与无线通信模块连接，无线通信模块能与无线网中的监控平台连接，所述微控制器能够是单片机、处理器、FPGA芯片或者DSP处理芯片，所述无线通信模块能够是WIFI模块，无线网能够是WLAN网，所述监控平台能够是PC机或者笔记本电脑，这样温度传感器就能把所述各温度条件下的环境中的温度信息传递到微控制器中，再由微控制器传递到所述监控平台里；

步骤3：将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，在操作台内将浸泡在经血保存液中的经血转移至离心管中，首次2000-2500rpm离心且离心10-15min，除去上清液得到主液一；往主液一中加入清洗液，充分混匀，再次1500-2000rpm离心且离心5-15min，除去上清液得到主液二，往主液二中加入等体积0.9％生理盐水混匀后得到主液三；

步骤4：把主液三加入到室温下装有淋巴细胞分离液的离心管中，所述主液三与淋巴细胞分离液的体积比例为1：1，配平该离心管，2100r/min离心且离心20min，离心完成后，离心管中出现由下至上的明显分层为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、白膜层和血浆层；

步骤5：吸取血浆层至距白膜层5mm处弃之，吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中形成细胞悬液，加生理盐水稀释来与细胞悬液混匀，2000r/min离心且离心15min，离心完成后弃去上清得到主液四，往主液四中加入生理盐水来重悬细胞充分混匀，取样计数，然后于1800r/min离心10min，离心完成后弃去上清，即获得经血单个核细胞；

步骤6：每1×10⁷个所述经血单个核细胞中加入1ml冻存液，放入冻存盒，把冻存盒转入-80℃冰箱中，12～24h后再把冻存盒转入-196℃的液氮或气氮中保存备用，其中经血单个核细胞的冻存液由体积百分比为10％的DMSO、体积百分比为20％的人血白蛋白、体积百分比为70％的间充质干细胞无血清培养基组成，其中DMSO为渗透性冷冻保护剂，人血白蛋白为非渗透性保护剂，间充质干细胞无血清培养基为基础液。

2.根据权利要求1所述的经血来源间充质干细胞冻存方法，其特征在于，所述清洗液为含有青霉素、链霉素、氟康唑的0.9％生理盐水；其中青霉素和链霉素的终浓度为100U/ml，所述氟康唑的终浓度为质量体积比0.5％～1％。

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