CN103374760A

CN103374760A - 人宫内膜(经血)干细胞库的构建

Info

Publication number: CN103374760A
Application number: CN2012101162377A
Authority: CN
Inventors: 孙勇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-04-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2013-10-30

Abstract

利用女性月经进行人宫内膜(经血)干细胞库的构建，其操作步序如下：1、干细胞的采集和运输。2、干细胞信息记录。3、干细胞的制备。4、干细胞的质检。5、干细胞的冻存。6、干细胞的复苏培养及发送。7、库的信息化管理。宫内膜(经血)干细胞储存相比较其它干细胞具有诸多优势：变废为宝、干细胞含量多、采集安全无痛、适应人群广、来源丰富、高度的分化潜能、移植无伦理争议、易快速生长。同时储存的干细胞不仅可以用来移植治疗疾病、抗衰老美容，还可用于干细胞研发如干细胞药物、干细胞培养基、保健品和化妆品的研究与开发。干细胞库的建立具有巨大的经济效益和社会效益。

Description

人宫内膜(经血)干细胞库的构建

技术领域

本发明是利用育龄期女性月经宫内膜脱落的组织制备干细胞并储存构建干细胞库，涉及生物医药技术、基础医学领域。

背景技术

一直以来，疾病治疗的新方法和新技术都是医学界所追求的。疾病发生的根本是细胞的病变。世界卫生组织对疾病康复的新定义是：“疾病治愈最根本的途径是细胞修复、改善细胞代谢和激活细胞功能”。干细胞(Stem Cell，SC)是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，干细胞技术具有器官再生和替代、组织修复、功能恢复等特点。目前，干细胞移植不仅在血液病、实体瘤、遗传性疾病方面取得了良好的临床疗效，而且在神经系统疾病、骨关节疾病、心血管疾病、代谢性疾病如糖尿病、自身免疫性疾病，以及在亚健康治疗、抗衰老、美容等方面都有很好的应用。美国《科学》杂志1999年和2000年连续两次将干细胞生物学和干细胞生物工程评为世界十大科学成就之首以来，干细胞(stemcells)领域就持续成为国内外医学和生物学研究的热点。预测数字显示，未来20年内，干细胞医疗市场的全球规模将迅速增长，2020年将达到4000亿美元。面对巨大商机，许多高风险投资金融机构纷纷介入，短短几年，各发达国家投入大量研究经费，建立各种基础与临床紧密结合的专门研究机构。2009年中国科学家在世界上首次用iPS细胞“育”出活小鼠，入选了《时代周刊》公布的2009年十大医学突破之首；中国的干细胞临床治疗也走在世界之巅。2009年有超过4000人接受各种类型的干细胞治疗，其中从欧美地区来中国接受干细胞治疗的人数也在1000人以上，取得了突破性的疗效；在这一年，中国也将干细胞技术纳入到了第三类医疗技术进行管理。

女性子宫内膜在每个月经期都会有组织和血管的大量增长，这一增长过程会随着月经周期的结束而停止。研究显示，在随女性经血脱落的子宫内膜组织中，具有相当数量的宫内膜干细胞(基质干细胞)-宫内膜(经血)干细胞。这些干细胞数量为骨髓来源的30倍，活力更强，自我更新和增殖能力也更强，分化潜能更接近胚胎干细胞。在女性生育期储存一份宫内膜干细胞，未来一旦发生肿瘤等疾病及意外严重伤害等，就可立即做自体干细胞的移植，恢复健康，减轻自己及家人经济负担；应用自存的干细胞，还有可能实现梦寐以求的“保存美丽”“青春永驻”的美好愿望，拥有高品质人生。女性的宫内膜(经血)自体干细胞不但可用于她本人，还可为她的子女、相关亲属(如堂表弟妹，甚至父母)等人的临床应用。同时还可供全国和全世界患者选择作干细胞移植用，并逐步替代价格昂贵、以及难以找到配型相合的骨髓干细胞。全世界等待干细胞移植的患者数以亿计，仅白血病在我国的发病率就达十万分之三、四，即每年新增四万名左右的患者，而累计的白血病患者约有上百万，其中大部分是儿童，他们都急需通过干细胞移植来救治。

宫内膜(经血)干细胞储存相比较其他干细胞(脐带血干细胞、脐带干或胎盘干等)所具有的优势：1、变废为宝、干细胞含量多。从女性经血中收集干细胞的方法完全是废物利用，变废为宝，对储存者没有任何伤害，安全无痛-这是人类首次用无痛苦、非侵入性和简便省事(不需要药物诱导)的方式获取成体干细胞，且适应人群广，来源丰富，而且高效率(目前所应用的其他干细胞来源都有一定的局限性：它们数量少并且分化能力低，其干细胞数量为骨髓来源的30倍，而自经血采集的干细胞成功率比骨髓干细胞高了100倍)；2、高度的分化潜能。宫内膜(经血)干细胞在体外直接分化成来源于外胚层和中胚层的多种不同的细胞系，具有自我增殖和分化能力，与胚胎干细胞和骨髓干细胞相近，它与骨髓干细胞的不同之处在于它可以表达某些与人类胚胎干细胞相同的标记，能力更接近于胚胎干细胞；可以分化为更多不同的细胞类型，包括骨组织、血管、脂肪、脑、肺、肝、胰腺和心脏等，超过其他成体干细胞；3、无排除、无伦理争议。宫内膜(经血)干细胞的使用不存在伦理学上的争议；在临床应用时免疫排斥作用小甚至无排斥，有研究表明，该种细胞可能具有抑制免疫系统的效果，从而使其可以移植到其他人身上而无排斥反应；4、宫内膜(经血)干细胞在体外培养时，可根据需要大量扩增，且易快速生长，而有些类型的成体干细胞在体外很难获得足够的数量来发挥医用价值；5、宫内膜(经血)干细胞在经过处理后，可妥善地保存在液氮中，保存期限长达22年。同时，宫内膜(经血)干细胞的储存可为企业带来巨大收益。

发明内容

本发明采用医用级硅胶杯收集月经，24小时内送至100级GMP干细胞制备室，完成信息记录后通过差异粘附等方法分离纯化宫内膜干细胞，经培养扩增后质检并冻存。宫内膜干细胞的收集无痛苦、无毒性、简单方便，更重要的是其超强的增殖能力和分化潜能，为疾病的治疗提供了丰富的细胞材料。

具体实施方式

1、干细胞的采集和运输。签订“月经干储存服务协议书”，并让储户了解如何收集和发送样本。月经干采集运输医用级泡沫盒，内含有：两块无菌消毒布块、医用级硅胶杯、含有肝素抗凝剂和青链霉素的收集瓶、两个小冰袋、干燥剂、“月经干采集运输信息表”包括储户信息和收集情况记录等。在月经第二天，经无菌布消毒相关用具及外阴后，将医用级硅胶杯插入阴道收集月经干2-4小时(通常能收集到10-20毫升样本)，并倒入含有青链霉素和肝素抗凝剂的无菌瓶轻摇，做好“月经干采集运输信息表”的记录(包括储户的肝炎检验如HAV、HBV、HCV、HDV和HEV，及病毒如HIV-1/2、梅毒螺旋体、巨细胞病毒及寄生虫等，储户如无此项检验报告，则另行检查)。样本保持在1-10°范围内，收集完24小时内发送至干细胞制备室(注意安全运输！)。采集和运输情况输入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”。

2、干细胞信息记录。样本运至干细胞制备室后，首先进行“月经干采集运输信息表”信息输入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”：储户基本信息、基本体检信息和/或疾病史等、样本收集信息、样本运输信息、样本外观等信息、样本至干细胞接收室交接信息、干细胞制备信息、干细胞质检信息、干细胞冻存信息、干细胞复苏(培养)信息、干细胞发送信息等，留存“月经干采集运输信息表”。

3、干细胞的制备。月经干样本在GMP100级车间用混合抗菌素包括万古霉素、头孢噻肟钠、氨基羟丁基卡那霉素A(即：抗菌素BBK8)、庆大霉素和两性霉素B处理防止污染，用100目滤网过滤以去除组织块，并用PBS洗涤，重悬于DMEM/F12完全培养基，以1X10⁵/ml接种于经10ug/ml多聚赖氨酸包被的T-25细胞培养瓶，并添加：5ng/ml ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素，2％人AB型血清，10ng/ml of rEGF，10ng/ml ofrPDGF-bb，15ng/ml of LIF，20ng/ml of bFGF，放置于37℃、5％CO2培养箱中饱和湿度培养。8小时后，去除上清液过滤除去杂质细胞，同时用0.25％胰酶边消化边观察，带大部分细胞脱落瓶底便终止消化，吸出细胞(除去贴壁较紧密的杂细胞)离心并用原滤过的培养液重悬细胞，接种于10ug/ml多聚赖氨酸包被的T-25细胞培养瓶继续培养，每3-4天半量换液并增补营养因子，之后的传代按照1∶3比例传。将整个干细胞制备的情况填入实验记录表，并将此信息也填入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”。

4、干细胞的质检。将培养扩增的干细胞进行质检：经体外处理的P2代干细胞上清液收集做质检(革兰氏菌涂片、厌氧菌、需氧菌培养、真菌和霉菌)，细胞经0.25％胰酶消化后800r/min离心6min重悬，用DMEM/F12完全培养液洗二次，并进一步做有核细胞计数及活力观察、流式检测(CD44，CD73和CD34)、克隆集落形成实验。干细胞质检结果输入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”。

5、干细胞的冻存。将需要冻存的细胞在冻存管上编号(低温储存条码)，准备冻存液：10％的DMSO、30％PBS、10％人血清白蛋白(25％)、50％细胞悬液。冻存液及细胞在加入冻存管前冷却至2-8℃，细胞加入冻存液后以1-2X10⁶/ml浓度冻存。装有干细胞的冻存管在-86℃冰箱冻存2-4小时后移至-196℃液氮罐中保存，做好干细胞冻存信息记录。细胞复苏前查找“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”，做好信息记录。

6、干细胞的复苏培养及发送。将干细胞从液氮罐中取出放入37-40℃水浴摇动，以加速细胞化融。细胞一旦融化便放入完全培养基洗涤两次，并接种于T-25组织培养瓶，加入相关营养因子，放置于37℃、5％CO2培养箱中饱和湿度增殖培养，每三天半量换液，细胞汇合度达70-80％时传代。干细胞培养达到临床需求时消化的干细胞，并做质检：细胞活力、数量、革兰氏染色。按照临床要求填写“宫内膜干细胞发放报告单”，中心主任签字认可备案并发放细胞，相关结果或信息输入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”。

7、库的信息化管理。检查步骤1至6各个实验步骤信息有无完全记录入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”，同时保留原始的实验记录簿(两人签字)。做好废弃样本或细胞的信息记录以及医用废弃物处理。注意：质检报告需要加入厂房维护、车间消毒、仪器设备的验证、物料批次、工艺、人员培训等相关质检内容也应输入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”。

Claims

1.人宫内膜(经血)干细胞库的构建，其特征在于：

(1)干细胞的采集和运输，用医用级硅胶杯收集月经干送至干细胞制备室。

(2)干细胞信息记录，将运送至干细胞制备室的样本信息输入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”。

(3)干细胞的制备，月经在GMP车间处理后在特殊的培养基中培养扩增。

(4)干细胞的质检，将培养扩增的干细胞进行质量检验。

(5)干细胞的冻存，质检合格的干细胞储存于-196℃液氮罐中以备用。

(6)干细胞的复苏培养及发送，从液氮罐中取出的干细胞快速复苏后，在扩增培养基中培养并质检和发放。

(7)库的信息化管理，将干细胞从采集到发放的完整过程记录备案。

2.根据权利要求1所述的人宫内膜(经血)干细胞库的构建，其特征是：(1)干细胞的采集和运输。签订“月经干储存服务协议书”，储户取出“月经干采集运输医用级泡沫盒”内的医用级硅胶杯，外阴经无菌消毒布块消毒后，在月经第二天收集，所收集的样本装入抗菌素和抗凝剂，并按照要求包装好“月经干采集运输医用级泡沫盒”(放好小冰块和干燥剂等)，填写好“月经干采集运输信息表”(包括储户的肝炎检验如HAV、HBV、HCV、HDV和HEV，及病毒如HIV-1/2、梅毒螺旋体、巨细胞病毒及寄生虫等)。样本保持在1-10°范围内，收集完24小时内发送至干细胞制备室。

3.根据权利要求1所述的人宫内膜(经血)干细胞库的构建，其特征是：(2)干细胞信息记录。样本运至干细胞接收室后，将储户基本信息、基本体检信息和/或疾病史等、样本收集信息、样本运输信息、样本外观等信息、样本至干细胞接收室交接信息等输入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”，并留存“月经干采集运输信息表”。

4.根据权利要求1所述的人宫内膜(经血)干细胞库的构建，其特征是：(3)干细胞的制备。月经干样本在GMP100级车间用混合抗菌素包括万古霉素、头孢噻肟钠、氨基羟丁基卡那霉素A(即：抗菌素BBK8)、庆大霉素和两性霉素B处理防止污染，用100目滤网过滤以去除组织块，并用PBS洗涤，重悬于DMEM/F12完全培养基，以1X10⁵/ml接种于经10ug/ml多聚赖氨酸包被的T25细胞培养瓶，并添加：5ng/ml ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素，2％人血清，10ng/ml of rEGF，10ng/ml of rPDGF-bb，15ng/ml ofLIF，20ng/ml of bFGF，常规培养8小时后，去除上清液(过滤除去杂质细胞以备后用)。同时用0.25％胰酶边消化、离心，并接种于多聚赖氨酸包被的T25细胞培养瓶继续培养。

5.根据权利要求1所述的人宫内膜(经血)干细胞库的构建，其特征是：(4)干细胞的质检。P2代干细胞上清液质检：革兰氏菌涂片、厌氧菌、需氧菌培养、真菌和霉菌，干细胞经0.25％胰酶消化后800r/min离心6min重悬，用DMEM/F12完全培养液洗二次，并进一步做有核细胞计数及活力观察、流式检测(CD44，CD73和CD34)、克隆集落形成实验。

6.根据权利要求1所述的人宫内膜(经血)干细胞库的构建，其特征是：(5)干细胞的冻存。需冻存的干细胞用低温储存条码编号，并按比例冻存：10％的DMSO、30％PBS、10％人血清白蛋白(25％)、50％干细胞悬液。冻存液及干细胞在加入冻存管前冷却至2-8℃，细胞加入冻存液后以(1-2)X10⁶/ml浓度冻存。冻存管在-86℃冰箱冻存2-4小时后移至-196℃液氮罐中保存。

7.根据权利要求1所述的人宫内膜(经血)干细胞库的构建，其特征是：(6)干细胞的复苏培养及发送。从液氮罐中取出的干细胞放入37-40℃水浴，融化的细胞经完全培养基洗涤接种于T-25组织培养瓶，并加入相关营养因子，常规培养。干细胞培养达到临床需求时消化干细胞，并做质检：细胞活力、数量、革兰氏染色。按照临床要求填写“宫内膜干细胞发放报告单”，中心主任签字认可发放。

8.根据权利要求1所述的人宫内膜(经血)干细胞库的构建，其特征是：(7)库的信息化管理。将干细胞从采集、运输、交接、制备、质检、冻存、复苏、培养、发送等实验步骤的详细信息完整地输入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”，同时保留原始的实验记录簿(两人签字)。做好废弃样本或干细胞的信息记录以及医用废弃物处理。注意：质检报告需要加入厂房维护、车间消毒、仪器设备的验证、物料批次、工艺、人员培训等相关质检内容也应输入“宫内膜(经血)干细胞储存信息表”。