CN110218698A - 一种人经血干细胞的制备方法及应用 - Google Patents

一种人经血干细胞的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人经血干细胞的制备方法及应用。该技术方案首先利用体外共培养技术研究了人经血干细胞对HeLa细胞的干预作用,发现共培养条件下HeLa细胞的增殖作用得到明显抑制,同时,由人经血干细胞所得的条件培养基也对HeLa细胞具有确切的抑制作用;在此基础上,经transwell小室实验表明,人经血干细胞可通过诱导HeLa细胞G0/G1期细胞周期阻滞来抑制其增殖和侵袭,同时可以以旁分泌方式体外抑制HeLa细胞迁移。基于以上有益的发现,本发明确定了利用人经血干细胞对HeLa细胞进行非治疗目的的抑制的新用途,并可利用其制备宫颈癌治疗药物。体内实验验证表明,体内注射人经血干细胞可显著降低异种移植肿瘤的体积和重量,为所述药物的疗效提供了有力支撑。

Description

一种人经血干细胞的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物学技术领域,进一步设计干细胞技术,具体涉及一种人经血干细胞的制备方法及应用。
背景技术
宫颈癌是一种常见的恶性肿瘤,已被列为导致女性因癌症死亡的第二大肿瘤,每年约有52,900例新发病例和275,000例死亡。尽管目前针对宫颈癌的预防、诊断和治疗策略有所改善,但晚期患者的5年生存率仍然低至40%,最后导致大量宫颈癌患者死亡。因此,寻找用于治疗宫颈癌的新方法迫在眉睫。目前,许多研究表明干细胞疗法可以作为一种癌症治疗的可选方法。
间充质干细胞(MSCs)能自我更新,具有低免疫原性,无致瘤性能分化成脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞。有研究表明MSCs通过影响肿瘤细胞的侵袭,迁移或凋亡,在调节肿瘤的发生和发展中发挥关键作用,然而这些影响仍然存在争议。Li等人证明MSCs促进了肝细胞癌的生长。Ding等人发现卵巢间充质干细胞促进卵巢癌细胞的增殖,成球和集落形成以及肿瘤发生。其他几项研究表明, MSCs在体外对多种癌细胞具有致瘤作用,并被募集到肿瘤部位促进体内肿瘤的生长和发展,如乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、头颈部肿瘤和胃癌等。相反,一些报道表明MSC抑制肿瘤生长,并可作为多种肿瘤模型的有效细胞疗法。例如, Ivy等证明骨髓来源的MSCs可以特异性地被募集到肿瘤部位并减少胶质瘤的肿瘤体积。Yulyana等表明在肝癌模型中,来自人胎儿MSCs的条件培养基可以抑制肝癌细胞增殖,减轻肿瘤负荷。Ma等人发现人脐带间充质干细胞在体外和体内均显著抑制乳腺癌细胞的生长,可能与细胞周期阻滞有关。此外,羊水和羊膜来源的MSCs可诱导G0/G1期细胞周期停滞,并显著减少多种癌细胞系的增殖,包括HeLa细胞(人宫颈上皮样癌细胞系),Saos细胞(人骨肉瘤细胞系),Skov-3 细胞(人上皮卵巢癌细胞系),KG1细胞(人急性髓性白血病细胞系),Jurkat 细胞(人T细胞白血病细胞系)和U937细胞(从组织细胞淋巴瘤获得的人单核细胞系)。
虽然不同来源的MSCs的抗癌作用的研究已被广泛报道,但很少有人关注人经血来源的干细胞(hMBSCs)。hMBSCs具有与骨髓(BM)MSCs相似的表型和特性,包括高增殖能力,多谱系分化潜能和表面标志物表达。hMBSCs具有低免疫原性,无致瘤性和显著的再生能力。此外,hMBSCs的分离过程安全、简单,无任何伦理学问题。大量报道证明了hMBSCs在不同疾病中的治疗潜力,如阿尔茨海默病,急性肺损伤,心脏纤维化,急性肝衰竭和糖尿病。然而,hMBSCs 对癌细胞(包括宫颈癌细胞)的影响尚未见报道。此外,即使获得了对某癌细胞具有确切抑制作用的干细胞系,在体外环境下,如何充分发挥其抑制作用,需要围绕该干细胞及癌细胞的性质进行针对性研究。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷,提供一种人经血干细胞的制备方法及应用,以解决现有技术中缺少一种对HeLa细胞增殖具有抑制作用的干细胞的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是如何拓展hMBSCs的生物学用途。
本发明要解决的再一技术问题是如何在体外环境下充分提升hMBSCs对HeLa细胞的抑制效果。
本发明要解决的又一技术问题是hMBSCs对HeLa细胞抑制作用的机理尚不明确。
本发明要解决的又一技术问题是如何更加高效的获得hMBSCs。
为实现以上技术目的,本发明采用以下技术方案:
人经血干细胞用于抑制HeLa细胞增殖的应用。
作为优选,该应用是利用添加有5~20%hMBSC-CM的、含有10%FBS的 DMEM培养基,对HeLa细胞进行体外培养;所述hMBSC-CM是培养hMBSCs 细胞所得的条件培养基。
作为优选,所述hMBSC-CM是通过以下方法制备的:将第3~5代的hMBSCs 细胞接种到培养皿中培养,当细胞生长至汇合度超过80%时,将培养基更换为含 1%双抗的DMEM无血清培养基,继续培养48h后收集细胞培养上清,1000rpm 离心5min,收集上清液用超滤浓缩管浓缩10倍,即得到hMBSC-CM。
作为优选,该应用是将HeLa细胞与hMBSCs细胞按1:1~1:2的细胞数量比混合后共培养。
作为优选,所述共培养是在含10%FBS的DMEM培养基中进行的,其中,HeLa细胞与所述含10%FBS的DMEM培养基的比例为:每1.5×105个HeLa 细胞对应3mL所述含10%FBS的DMEM培养基。
作为优选,用于共培养的HeLa细胞和hMBSCs细胞,是经以下步骤处理后的产物:将HeLa细胞、hMBSCs细胞分别用胰蛋白酶消化,而后以含体积浓度 10%胎牛血清的DMEM培养基分别终止消化,分别离心,所得细胞沉淀分别用 PBS清洗。
作为优选,所述hMBSCs细胞是通过以下方法制备的:
1)收集健康的月经期妇女的月经血样,用抗生素处理1~2h;
2)将8mL经血与4mL Ficoll-Paque混合,1800rpm离心20min;
3)离心结束后,样品分成三层,移除上层,收集中间层细胞用PBS洗涤,离心去上清,加入7~8mL经血干细胞培养基,接种于细胞培养皿中,置于5%CO2、 95%湿度、37℃培养箱中培养;所述经血干细胞培养基的配置方法如下:在无菌容器中加入340mLα-MEM、50mL胎牛血清、5mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺、5mL含10000U/mL苄青霉素纳和10000μg/mL链霉素的双抗、90mL Chang Medium B、10mL Chang Medium C、10ug人源bFGF;充分混匀,4℃保存备用, 2周内用完;
4)当细胞生长至70~80%汇合度时,去除培养基,然后用不含钙镁离子的 PBS进行洗涤;加入1~2mL胰酶,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中孵育 2~3min;而后加入2~4mL含体积浓度为10%胎牛血清的DMEM培养基使胰酶失活;吹打,使贴壁细胞脱落成单细胞状态,离心去上清;加入3mL经血干细胞通用培养基,按1:3的比例传代;在每1mL的细胞悬液中加入7~8mL的经血干细胞通用培养基,接种于细胞培养皿中,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养,即得到所述hMBSCs细胞。
同时,本发明进一步提供了人经血干细胞用于制备宫颈癌治疗药物的应用。
作为优选,所述药物通过诱导HeLa细胞G0/G1期细胞周期阻滞来抑制其增殖和侵袭。
同时,本发明进一步提供了一种人经血干细胞的制备方法,包括以下步骤:
1)收集健康的月经期妇女的月经血样,用抗生素处理1~2h;
2)将8mL经血与4mL Ficoll-Paque混合,1800rpm离心20min;
3)离心结束后,样品分成三层,移除上层,收集中间层细胞用PBS洗涤,离心去上清,加入7~8mL经血干细胞培养基,接种于细胞培养皿中,置于5%CO2、 95%湿度、37℃培养箱中培养;所述经血干细胞培养基的配置方法如下:在无菌容器中加入340mLα-MEM、50mL胎牛血清、5mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺、5mL含10000U/mL苄青霉素纳和10000μg/mL链霉素的双抗、90mL Chang Medium B、10mL Chang Medium C、10ug人源bFGF;充分混匀,4℃保存备用, 2周内用完;
4)当细胞生长至70~80%汇合度时,去除培养基,然后用不含钙镁离子的 PBS进行洗涤;加入1~2mL胰酶,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中孵育 2~3min;而后加入2~4mL含体积浓度为10%胎牛血清的DMEM培养基使胰酶失活;吹打,使贴壁细胞脱落成单细胞状态,离心去上清;加入3mL经血干细胞通用培养基,按1:3的比例传代;在每1mL的细胞悬液中加入7~8mL的经血干细胞通用培养基,接种于细胞培养皿中,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养,即得到所述人经血干细胞。
在以上技术方案中,利用人经血干细胞对HeLa细胞增殖的抑制,明确限定为非治疗目的应用。
本发明提供了一种人经血干细胞的制备方法及应用。该技术方案首先利用体外共培养技术研究了人经血干细胞对HeLa细胞的干预作用,发现共培养条件下 HeLa细胞的增殖作用得到明显抑制,同时,由人经血干细胞所得的条件培养基也对HeLa细胞具有确切的抑制作用;在此基础上,经transwell小室实验表明,人经血干细胞可通过诱导HeLa细胞G0/G1期细胞周期阻滞来抑制其增殖和侵袭,同时可以以旁分泌方式体外抑制HeLa细胞迁移。基于以上有益的发现,本发明获得了利用人经血干细胞对HeLa细胞进行非治疗目的的抑制的新用途,并可利用其制备宫颈癌治疗药物。体内实验验证表明,体内注射人经血干细胞可显著降低异种移植肿瘤的体积和重量,为所述药物的疗效提供了有力支撑。在此基础上,本发明进一步探究了制备人经血干细胞的新方法,为高效获得人经血干细胞奠定了技术基础。
本发明的技术优势集中体现在以下方面:
1、细胞来源丰富,分离过程安全简单且培养技术已掌握,提供了一种新型的成体干细胞来源。
2、通过体外共培养技术抑制HeLa细胞增殖,有望成为治疗宫颈癌的新药物。
3、通过尾静脉移植,发现经血干细胞可明显降低肿瘤的体积和体重,抑制肿瘤增殖,为临床宫颈癌的药物提供了一种新的选择。
综上所述,本发明采用分离培养的人经血干细胞,利用体外共培养技术,研究人经血干细胞抑制HeLa细胞增殖的潜能,并通过尾静脉移植将hMBSCs输入异体皮下移植的BALB/c荷瘤小鼠体内,证实其抑制HeLa细胞增殖,作为宫颈癌治疗药物的可行性,为宫颈癌的干细胞治疗提供了一种新的途径。
附图说明
图1是人经血干细胞分离和鉴定的结果图:
(A)培养的hMBSCs显微成像;
(B)流式细胞术检测hMBSCs表面标志物,结果表明hMBSCs表达间充质干细胞标志蛋白CD29,CD73,CD105,CD90和组织相容性Ⅰ类抗原HLA-ABC,不表达造血干细胞标志蛋白CD34,CD45和主要组织相容性Ⅱ类抗原HLA-DR;
(C)流式细胞术检测表明hMBSCs不表达HLA-ABC共刺激分子CD80, CD86和CD40;
(D)免疫荧光染色结果表明几乎所有hMBSCs均表达胚胎干细胞表面标志物Oct4,SSEA-4和Nanog;
(E)通过油红O染色结果表明hMBSCs具有成脂分化潜能,通过中期的 ALP染色和晚期的茜素红染色结果表明hMBSCs具有成骨分化潜能。
图2是hMBSCs和hMBSC-CM体外抑制HeLa细胞增殖的结果图:
(A)PBS对照组,hMBSC-CM组和hMBSC共培养组示意图;
(B)用PBS,hMBSC-CM(10%)和hMBSC(1:1)处理的不同时间点细胞增殖情况代表性图像;
(C)通过细胞计数测定(n=3)PBS,hMBSC-CM和hMBSC共培养对 HeLa细胞增殖的影响;
(D)通过CCK-8法测定PBS,hMBSC-CM和hMBSC共培养处理24h,48h 和72h后细胞活力。结果显示hMBSC-CM和hMBSC共培养显著抑制HeLa细胞增殖;
(E)用不同浓度(2.5%,5%,10%或20%)的hMBSC-CM(10X)处理 48h后测量HeLa细胞的数量;
(F)用不同浓度的hMBSCs共培养48h后测量HeLa细胞存活率(HeLa细胞:hMBSCs的比例为4:1,2:1,1:1或1:2)。(n=3;*,与hMBSC-CM 组相比;#,与hMBSC共培养组相比。)
图3是hMBSCs和hMBSC-CM以旁分泌方式体外抑制HeLa细胞的迁移和侵袭的结果图:
(A)划痕实验检测PBS组,hMBSC-CM和hMBSC共培养组中HeLa细胞迁移情况。红线表示没有迁移时的起始区域。
(B)迁移区域的定量分析,如图A所示。
(C)Matrigel胶细胞侵袭实验检测PBS组,hMBSC-CM和hMBSC处理组中HeLa细胞侵袭情况。侵袭的HeLa细胞用结晶紫染色。
(D)图C所示的侵袭细胞的定量分析。使用双向ANOVA测量显着性。
*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图4是hMBSCs和hMBSC-CM在体外诱导HeLa细胞的细胞周期阻滞的结果图:
(A)流式细胞术进行细胞周期分析结果表明hMBSC-CM和hMBSC共培养诱导HeLa细胞G0/G1期细胞周期停滞。
(B)如A(n=3)所示,细胞周期的G0/G1期和S期细胞百分比的定量分析。
(C)PBS组,hMBSC-CM和hMBSC共培养处理HeLa细胞48h,流式细胞术分析(n=3)HeLa细胞凋亡情况。
(D)如C(n=3)所示的凋亡细胞和活细胞百分比的定量分析。
(E)用PBS,hMBSC-CM和hMBSC共培养48h后,HeLa细胞中Ki67, PCNA,caspase-3和Bax蛋白表达情况。
(F)如图E中所示的HeLa细胞的相对蛋白质水平的定量分析。使用双因素ANOVA测量显著性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图5是hMBSCs体内抑制HeLa细胞增殖的结果图:
(A)HeLa细胞单独注射组、HeLa/hMBSCs尾静脉移植组(n=4)异体皮下移植肿瘤形态图;
(B)如图A所示的肿瘤体积定量分析,在移植21天后,HeLa/hMBSCs组的肿瘤体积显著小于HeLa单独注射组;
(C)如图A所示的肿瘤重量定量分析,在移植21天后,HeLa/hMBSCs组的肿瘤重量显著小于HeLa单独注射组;
(D)通过免疫组化检测HeLa组、HeLa/hMBSCs组肿瘤PCNA表达情况以观察HeLa细胞增殖情况;
(E)如图D所示的PCNA染色阳性的HeLa细胞定量分析;
(F)使用TUNEL染色评估HeLa组、HeLa/hMBSCs组肿瘤组织中细胞凋亡情况;
(G)如图F所示的TUNEL染色阳性的HeLa细胞定量分析;
*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节,在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述,表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外,以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1人经血干细胞的分离、培养、扩增及CM的收集
在获得志愿捐赠者知情同意的情况下,用月经杯收集经血。经抗生素处理 1-2h后,进行微生物检测及传染病病原体安全检测。经血经Ficoll-Paque密度梯度离心后,收集中间层细胞,PBS清洗后去上清,用经血干细胞培养基置于5%CO2、 95%湿度、37℃培养箱中培养。2-3天后换液去除未贴壁细胞,随后每2天换液。当细胞汇合度达到80%时,采用胰酶/EDTA消化传代。取第3-5代经血干细胞进行培养并收集CM。同时利用RT-PCR、免疫荧光和流式细胞技术对经血干细胞进行OCT4、Nanog、SSEA-4、CD29、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR、CD34、CD45等分子表型鉴定。
具体操作规程如下:
一、人经血干细胞的分离、培养和扩增及CM的收集:
招募不同年龄段的月经期女性,在完全自愿的前提下捐献经血。
具体操作规程如下:
1、经血样品收集(细胞分离)
将月经杯分发给志愿者收集月经期第2-3天经血,并立即用抗生素处理1-2h,其中含有万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素B 2-3μg/m及300-500单位肝素钠;以此作为含抗生素的杀菌液。
在得到经血捐赠者知会同意的情况下对细胞进行培养。
1)收集到经血后,立刻加入上述含有抗生素的杀菌液,室温下处理1-2h。
2)将8ml经血缓慢加到装有4ml Ficoll-Paque的15ml离心管中,1800rpm 离心20min。
3)离心结束后,样品分成三层,上层含有血浆,底层包含大量红细胞,小心移除上层,收集中间层细胞并用PBS洗3次,离心去除上清。
上述上清液可按照常规方式进行微生物检测及传染病病原体安全检测,一般对常见病毒如艾滋病病毒(HIV,human immunodeficiency virus)、乙肝病毒(HBV, hepatitisB virus)、丙肝病毒(HCV,hepatitis C virus)和梅毒病原体(Syphilis pathogen)进行检测。若为阳性结果,则结束整个经血干细胞的分离培养和扩增。检测目的是为了保证所得的经血干细胞的使用安全性。
2、原代培养
培养基配置-经血干细胞通用培养基的成分如下:
1)340mlα-MEM培养基;
2)50ml胎牛血清(10%v/v);
3)5ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺(1%v/v);
4)5ml双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素),(1%v/v);
5)90mlChang Medium B(18%v/v);
6)10ml Chang Medium C(2%v/v);
7)10ug人源bFGF(终浓度为20ng/ml);
按如上配方配置人经血干细胞培养基,充分混匀,4℃保存待用。
1)取7ml经血干细胞通用培养基,加入到已经去除上清的经血干细胞样品 (即步骤1的所得物)中,轻柔吹打混匀,得细胞悬液;
2)取一个10cm皿,将步骤1)所得的全部细胞悬液转移到该培养皿中;
3)放入到5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养;
4)培养2-3天后,全量换液(即换7ml经血干细胞通用培养基);
5)取5mlPBS,慢慢在培养皿侧壁滴入,轻柔摇晃,润洗细胞层,用移液管将PBS去除;
6)取7ml经血干细胞通用培养基,慢慢在培养皿侧壁滴入;
7)镜下观察,有较多贴壁细胞。放入到5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中继续培养。在培养过程中,每3天换液一次,继续培养。待细胞汇合度达到70-80%时,进行传代。
3、细胞传代培养
1)去除上述原代培养步骤7)所得物中的培养液;
2)用无钙镁的PBS洗涤液进行洗涤;
上述无钙镁离子的PBS洗涤液的配制如下:NaCl 8.00g,KCl 0.2g, Na2HPO4.H2O1.56g,KH2PO4 0.2g,定容至1L。于高压蒸汽灭菌(常规程序) 后放入4℃冰箱保存待用。
3)加入1ml胰酶,37℃孵育(5%CO2、95%湿度)2分钟;
4)加入2ml经血干细胞通用培养基使胰酶失活;
5)轻柔吹打,使贴壁细胞脱落并形成单细胞状态;
6)按1:3的比例传代:从3ml的细胞悬液中取1ml至一新的10cm培养皿中,再加入6ml的经血干细胞通用培养基,摇匀;
7)放入到5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养;
8)每3-4天传代细胞一次(即从步骤1)至步骤7))。
4、hAMSCs-CM的收集
1)将5×105个第3-5代的hMBSCs接种到10cm皿中正常培养;
2)一旦细胞生长至80%的汇合度,将培养基更换为含1%双抗的DMEM无血清培养基;
50ml无血清培养基配方如下:
1)49.5ml DMEM培养基
2)500ul双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素),(1%v/v);
按如上配方配置无血清培养基,充分混匀,4℃保存待用。
3)48h后收集细胞培养上清,1000rpm离心5min,收集上清液并用超滤浓缩管(MilliporeSigma,UFC900396)浓缩10倍,收集备用。
二、经血干细胞表面分子标志鉴定:
1、流式细胞术检测细胞表面抗原
1)细胞传至第3代时收集细胞,胰酶/EDTA消化液(0.25%)消化细胞,制成细胞悬液,调整细胞密度至1×106个/ml;
2)分别取所需数量的1.5ml EP管,分别加入小鼠抗人单克隆抗体(CD29、 CD90、CD73、CD105、CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、HLA-ABC 及同型对照)20μl;
3)管内分别加入细胞样本(上述步骤1)所得)50μl,避光4℃孵育30min;
4)1000rpm离心5分钟;
5)弃上清,加入含1%(质量浓度)人血清的PBS 1ml,充分混匀,1000rpm 离心5分钟;
6)弃上清,加入PBS调整样本量至400μl,上流式细胞仪进行分析。
结果如图1(B、C)所示:CD29、CD105、CD73、CD90、HLA-ABC为阳性,CD40、CD80、CD86、CD34、CD45及HLA-DR为阴性。
2、免疫荧光检测细胞标志蛋白
1)细胞传至第3代时收集细胞,胰酶/EDTA消化液(0.25%)消化细胞,制成细胞悬液,调整细胞密度至1×106个/ml;
2)将共聚焦玻片放入12孔板中,将细胞样品接种在玻片上,贴壁24h后进行免疫荧光检测;
3)4%多聚甲醛固定细胞15分钟,预冷PBS清洗细胞两遍;
4)含0.25%Triton-X 100的PBS处理10分钟对细胞进行破膜处理,PBS清洗3遍,每遍5分钟;
5)再经含1%BSA的PBST(含0.1%Tween-20的PBS)孵育30分钟来封闭非特异性蛋白结合位点;
6)用含1%BSA的PBST稀释一抗(OCT-4、SSEA-4、Nanog),4℃湿盒中孵育细胞过夜;
7)PBS清洗3遍,每遍5分钟;用含1%BSA的PBS稀释二抗,室温下孵育细胞1小时;
8)吸出二抗,PBS多次清洗细胞后加入DAPI复染1分钟,激光共聚焦显微镜下观察。
结果如图1(D)所示:OCT-4、SSEA-4、Nanog均为阳性。
上述检测确定所得细胞符合经血干细胞的一般表型标准(即确定所得为经血干细胞)。
3、hMBSCs成脂、成骨分化
1)细胞传至第3代时收集细胞,胰酶/EDTA消化液(0.25%)消化细胞,制成细胞悬液,调整细胞密度至1×106个/ml;
2)将hMBSCs以1.5×10 5个细胞/孔的密度接种在六孔板中。
3)当细胞达到100%汇合时,根据制造商的说明将OriCellTM人间充质干细胞成脂分化培养基(Cyagen Biosciences,Shanghai,China)加入孔中进行诱导分化。诱导28天后,进行油红O(Cyagen Biosciences)染色以评估hMBSCs成脂分化潜能。
4)对于成骨分化,将hMBSCs与OriCellTM人间充质干细胞成骨分化培养基(CyagenBiosciences)一起培养10天和21天以分析成骨分化的中期和晚期。通过中期的碱性磷酸酶(ALP)(Cyagen Biosciences)染色和晚期的茜素红(pH 4.2,40mM)(Cyagen Biosciences)染色评估成骨的分化潜能。
结果如图1(E)所示:hMBSCs成功被诱导为脂肪细胞、骨细胞;表明hMBSCs 具有多向分化潜能。
实施例2体外共培养实验
一、体外共培养体系的建立
1)将HeLa、hMBSCs细胞用胰蛋白酶消化,当显微镜下见细胞为单个圆形时即以含体积浓度10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化,离心,所得细胞沉淀用PBS清洗1次。
2)将上述步骤A中得到的HeLa细胞以1.5×105个细胞/孔的密度接种到6 孔板中。PBS组将细胞用3ml的含10%FBS的DMEM培养基培养;对于 hMBSC-CM组,将HeLa细胞用3ml的补充有10%hMBSC-CM(10X)的含 10%FBS的DMEM培养基培养;对于transwell共培养组,下层小室接种1.5×105个HeLa细胞并用2ml含10%FBS的DMEM培养基重悬,上层小室接种1.5×105个hMBSCs并用1ml培养基重悬进行共培养。24,48和72h后收集样品。
二、共培养对HeLa细胞增殖的影响检测
1、HeLa细胞增殖检测
1)步骤同“一、体外共培养体系的建立”建立共培养体系;
2)分别于共培养24h、48h、72h时对三组细胞进行拍照以观察细胞密度,并对细胞数量进行统计学分析(n=3);
3)使用CCK-8试剂盒(Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)检测三组于24h、48h、72h时的细胞增殖情况,按照试剂盒说明书,在每个孔中加入 10%的CCK-8溶液3小时,然后使用微孔板分光光度计(Biorad)测量每孔于 450nm处的吸光度(n=3)。
结果如图2(B-D)所示:hMBSC-CM(10%)和hMBSC共培养(HeLa细胞:hMBSCs比例为1:1)在48h和72h显着降低HeLa细胞的数量;且HeLa 细胞活力被显著抑制。
2、不同浓度CM对HeLa细胞增殖的影响检测
1)用添加有不同浓度hMBSCs-CM(0%、2.5%、5%、10%、20%)的3ml 的HeLa细胞完全培养基培养HeLa细胞48h;
2)使用CCK-8试剂盒检测各浓度CM条件下HeLa细胞增殖情况,按照试剂盒说明书,在每个孔中加入10%的CCK-8溶液3小时,然后使用微孔板分光光度计(Biorad)测量每孔于450nm处的吸光度(n=3)。
结果如图2(E)所示:与CM浓度为0%组的HeLa细胞相比,hMBSC-CM 浓度为5%,10%和20%时,HeLa细胞的增殖显著降低(P<0.05)。相反,2.5%的hMBSC-CM(10X)对HeLa细胞的生长抑制不明显。当与10%的hMBSC-CM 处理组相比时,20%hMBSC-CM处理组中HeLa细胞的增殖有轻微而不显著的降低。
3、不同浓度hMBSCs对HeLa细胞增殖的影响检测
1)以不同浓度的hMBSCs(HeLa:hMBSCs=1:0,4:1,2:1,1:1或1: 2)与HeLa细胞transwell共培养;
2)使用CCK-8试剂盒检测不同浓度hMBSCs条件下HeLa细胞增殖情况,按照试剂盒说明书,在每个孔中加入10%的CCK-8溶液3小时,然后使用微孔板分光光度计(Biorad)测量每孔于450nm处的吸光度(n=3)。
结果如图2(F)所示:与对照组(HeLa:hMBSCs=1:0)相比,当HeLa: hMBSCs的比例为1:1和1:2时,HeLa细胞增殖显著降低。然而,在浓度比例为1:1和1:2时,HeLa细胞增殖没有发现显著差异。
三、共培养对HeLa细胞迁移、侵袭的影响检测
1、hMBSCs/hMBSCs-CM对HeLa细胞迁移的影响
1)细胞传至第3代时收集细胞,胰酶/EDTA消化液(0.25%)消化细胞,制成细胞悬液,调整细胞密度至1×106个/ml;
2)将HeLa细胞以1.5×10 5个细胞/孔的浓度接种在6孔板中。
3)当细胞达到100%汇合度时,使用无菌的200ul移液管尖端在细胞单层上产生划痕。
4)用PBS轻轻洗除细胞碎片,用PBS,hMBSC-CM或hMBSC与HeLa细胞共培养。
5)将培养皿在37℃,5%CO2培养箱中培养24h和48h。分别在两个时间点收集划痕处图像并使用Image Pro Plus 6.0软件测量。
结果如图3(A、B)所示:与PBS组相比,hMBSC-CM组和hMBSC组在与HeLa细胞共培养24h和48h后显著抑制HeLa细胞向划痕的迁移。然而 hMBSC-CM组和hMBSC共培养组之间没有显著差异。表明hMBSCs可以以旁分泌方式体外抑制HeLa细胞迁移。
2、hMBSCs/hMBSCs-CM对HeLa细胞侵袭的影响检测
1)将Matrigel胶置于4℃冰箱过夜融化。用预冷的枪头吸取100μl Matrigel加入预冷的300μl无血清培养基中,充分混匀。
2)取上述稀释的Matrigel 30μl加入transwell板上室覆盖整个膜,37℃处理30min使Matrigel聚合成胶。
3)细胞传至第3代时收集细胞,胰酶/EDTA消化液(0.25%)消化细胞,用无血清培养基制成单细胞悬液,调整细胞密度至1×106个/ml;
4)将HeLa细胞(1×105个)加入上室,并将hMBSCs或hMBSCs-CM加入到底部孔中。对照的底部孔中仅包含含有10%FBS的DMEM。
5)在37℃温育48h后,取出上室,用湿棉签轻轻擦去上层小室未侵袭的细胞和Matrigel胶,4%PFA固定30min,用0.1%结晶紫染色20min,PBS洗3×5min。使用显微镜拍摄图像。
结果如图3(C、D)所示:在hMBSC-CM和hMBSC与HeLa共培养48h 后,HeLa细胞的侵袭显著降低至对照组的45±6.3%和50±5.8%。表明hMBSCs 可以以旁分泌方式体外抑制HeLa细胞侵袭。
四、共培养对HeLa细胞周期及凋亡的影响检测
1、hMBSCs/hMBSCs-CM对HeLa细胞周期的影响检测
1)步骤同“一、体外共培养体系的建立”建立共培养体系;
2)共培养48h后,胰酶/EDTA消化液(0.25%)消化细胞,离心并去上清;
3)将细胞在预冷的70%乙醇中固定2小时,1000rpm离心5分钟,并用400ulPI 和100ulRNaseA重悬。
4)在4℃温育30分钟后,洗涤细胞并用PBS重悬。使用BD Jazz进行细胞周期测定并进行分析。
结果如图4(A、B)所示:hMBSC-CM处理组和hMBSC共培养组的HeLa 细胞在G0/G1期的细胞百分比(P<0.01)(66±4%和68±5%)显著高于正常培养基组(43±5%)。与此相一致,FACS分析还显示,与PBS处理组(37± 3%)相比,hMBSC-CM和hMBSC共培养组中处于S期的HeLa细胞的比例较低(分别为19±2%和17±2%)。表明hMBSCs可诱导HeLa细胞G0/G1期细胞周期阻滞。
2、hMBSCs/hMBSCs-CM对HeLa细胞凋亡的影响检测
1)步骤同“一、体外共培养体系的建立”建立共培养体系;
2)共培养48h后,胰酶/EDTA消化液(0.25%)消化细胞,离心并去上清,用1×AnnexinV Binding Solution重悬细胞,调整细胞密度至1×106个/ml;
3)分别取4份100ul 2)中细胞悬液,1份加入5ulAnnexin V-FITC和5ul propidiumiodide(PI)solution、1份加入5ulAnnexin V-FITC、1份加入5ul propidium iodide(PI)solution,第4份不做任何处理;
4)室温避光孵育15min;
5)将细胞在PBS中洗涤,以1000rpm离心5分钟,并重悬于400ul1×AnnexinVBinding Solution中,上流式细胞仪进行检测。
结果如图4(C、D)所示:与PBS组相比,hMBSC-CM处理组和hMBSC 共培养组的HeLa细胞中凋亡细胞的比率没有显著性差异。
3、hMBSCs/hMBSCs-CM诱导HeLa细胞周期阻滞的检测
1)步骤同“一、体外共培养体系的建立”建立共培养体系;
2)共培养48h后,PBS洗涤HeLa细胞,加入200ul RIPA(含有蛋白酶抑制剂),用细胞刮刮取细胞,随后装入1.5mlEP管中并置于冰上,每5min震荡 30s,重复3次;
3)于冷冻离心机4℃、13000rpm,离心10分钟,小心取上清于新的1.5ml EP 管中,加入4×loading buffer,100℃煮10min,随后用于Western Blot检测;
4)选取1.5mm的玻璃板夹装置,清洗干净,固定夹紧并进行检漏。参照分离胶的配方配置下层分离胶,异丙醇封胶,放置1h使胶凝固;弃去异丙醇,用蒸馏水清洗干净,用滤纸擦去多余水分。按配方配置上层浓缩胶,确定无气泡后插入梳子,等待上层胶凝固;
5)将4)中配好的凝胶电泳板夹好放入装有1×running buffer的电泳槽中,用10ul枪上样煮好的蛋白。先40V电泳60min,待marker分离后,改成100V;当溴酚蓝到达玻璃板底端时,停止电泳;
6)从电泳槽中取出电泳板,撬开板子,小心的取出聚丙烯酰胺凝胶,切除浓缩胶;将PVDF膜在甲醇中活化,然后按黑板、海绵、滤纸、胶、滤纸、海绵、白板的顺序制备“三明治”结构(要确保胶和膜之间没有气泡),放入转膜槽中,加入预冷的1×transferbuffer,恒压100V,70min;
7)转膜完成后,取出转好的膜,按照所需蛋白的大小进行裁剪,将剪下的膜用TBST冲洗1遍,之后加入5%BSA或5%脱脂牛奶,并置于摇床上慢速摇动封闭1h;
8)封闭结束后,用1×TBST清洗一遍,加入一抗GAPDH(1:1000,兔单克隆,SantaCruz)孵育,Bax(1:1000,兔多克隆,Cell Signaling Technology), caspase-3(1:1000,兔多克隆,Abacm),PCNA(1:1000,小鼠单克隆,Abcam) 和BCL2(1:1000,兔单克隆,Abcam),于摇床上慢速摇动4℃孵育过夜;
9)回收一抗,PVDF膜用1×TBST洗3×10min,加入山羊抗兔或兔抗小鼠二抗(Invitrogen),室温摇床慢速孵育1h,1×TBST洗5×10min;
10)按1:1的比例加入化学发光液A液和B液,将PVDF膜放在凝胶成像仪上,滴上显色液进行拍照。
结果如图4(E、F)所示:与PBS组细胞相比,hMBSC-CM和hMBSC共培养组显着降低了HeLa细胞中PCNA和KI67的蛋白质水平,而两种凋亡相关蛋白caspase-3和Bax的表达没有显著性差异。
综合以上结果表明hMBSC-CM和hMBSC共培养可通过诱导细胞周期停滞在G0/G1期来抑制HeLa细胞的增殖。
实施例3体内移植实验
1、HeLa异种移植荷瘤小鼠模型的构建
1)取生长状态良好的HeLa细胞,以胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)消化,显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含10%(体积浓度)胎牛血清的DMEM 培养基终止消化,轻柔吹打后离心,获得细胞沉淀,PBS(无钙镁离子的PBS洗涤液)洗2遍(目的是为了洗去胰蛋白酶、胎牛血清等物质);
2)用PBS稀释步骤1)中的HeLa细胞,调整细胞密度为5×107/ml,取100ul (细胞数目为5×106个)注射到BALB/c裸鼠背部皮下。
结果为4天左右BALB/c裸鼠背部皮下长出肿瘤。
2、hMBSCs体内移植对HeLa异体移植瘤的影响检测
1)将1中的荷瘤小鼠分为2组,取其中一组对其尾静脉移植1×106个 hMBSCs,每3天注射1次,共注射3次;
2)于注射完hMBSCs后观察肿瘤生长情况,并于第21天解剖肿瘤进行拍照,并称量肿瘤体积和重量。
结果如图5(A-C)所示:与单独的HeLa细胞组相比,hMBSCs注射组显著降低了异种移植肿瘤的平均体积和平均重量。
3、肿瘤组织PCNA染色
1)注射21天后,用戊巴比妥对小鼠实施安乐死,分离肿瘤组织并在4%多聚甲醛中固定过夜;
2)取出1)中固定好的组织,PBS洗3×5min,将组织放入全自动脱水机中进行脱水浸蜡;
3)用包埋机进行组织包埋,并置于冷冻台上固定石蜡。(样品可在4℃长期保存);
4)用石蜡切片机进行组织切片,切片厚度为5μm,将切片置于载玻片上,于38℃条件下,烤片过夜。
5)挑选好的玻片,用二甲苯浸泡3×5mim,依次在梯度酒精中(100%酒精 3min,95%酒精 3min,80%酒精 3min,70%酒精 3min)进行脱蜡,然后水洗 2min;
6)将玻片置于1×枸橼酸钠修复液中并微波煮沸20min,自然冷却至室温;
1×枸橼酸钠修复液配置方法如下:
A液:柠檬酸三钠·2H2O 2.941g溶于100ml双蒸水中
B液:枸橼酸2.1g溶于100ml双蒸水中
1×枸橼酸钠修复液(PH=6.0):分别取A液82ml、B液18ml,并加入900ml 双蒸水;
7)加入3%的H2O2中处理10min,然后用蒸馏水水洗3min,再用PBS (0.01mol/L,PH=7.5)清洗切片3×5mim;
8)用滤纸吸去切片背面及组织周围的水分。保持组织呈温润状态。用油笔在样品周围画圈,然后滴加5%的BSA室温避光1h。
9)吸去封闭液,滴加PCNA一抗(1:1000,小鼠单克隆,Abcam),置在湿盒中4℃孵育过夜;
10)PBS洗3×5mim,随后滴加HRP结合的抗鼠IgG二抗,室温孵育60min;
11)PBS洗3×5mim,然后加入DAB显色液,蒸馏水洗2-3min终止显色;
12)用苏木精染核30s,然后用蒸馏水清洗切片10min;
13)依次在梯度酒精中(100%酒精 3min,95%酒精 3min,80%酒精 3 min,70%酒精 3min)处理,二甲苯透明,最后用中性树脂封片;
14)晾干,在显微镜下观察并拍照。
结果如图5(D、E)所示:与HeLa细胞组相比,hMBSCs显著降低hMBSC 尾静脉移植组肿瘤组织中PCNA的阳性率,这与体外结果一致。
4、肿瘤组织TUNEL染色
1)步骤同“3、肿瘤组织PCNA染色1)—4)”;
2)每只小鼠选择3个切片,并按照制造商的说明书使用TUNEL染色试剂盒;
3)在显微镜下拍照,将具有深棕色细胞核的细胞标记为阳性,并在每个裸鼠中随机选择10个视野进行计数(n=4)。
结果如图5(F、G)所示:与单独的HeLa细胞组相比,在HeLa/hMBSC 组中未观察到细胞凋亡显著变化,表明hMBSCs不会加速体内HeLa细胞的凋亡。
有报道显示,来自经血的人子宫内膜间充质干细胞通过在体外和体内诱导细胞周期停滞和促进EOC细胞凋亡而抑制上皮卵巢癌(EOC)生长。但hMBSCs 对癌细胞,尤其是宫颈癌是否具有抗肿瘤特性,从未有过报道。在本专利中,我们检测了hMBSCs在体外和体内对宫颈癌细胞的抗肿瘤特性。在最近的报道中,发现源自脂肪MSC和人胚胎干细胞的CM在肝细胞癌(HCC),卵巢癌和前列腺癌中抑制增殖但不抑制细胞死亡。为了阐明hMBSCs是否通过旁分泌信号通路抑制肿瘤增殖,将hMBSC用于transwell共培养体系以检测hMBSC分泌因子对HeLa细胞增殖的影响。首先,细胞用PBS处理或与NIH 3T3共培养。与PBS 组相比,我们发现NIH 3T3共培养不影响HeLa细胞的增殖,迁移和侵袭。因此,为了减少实验组的数量,我们仅使用PBS组作为体外实验的阴性对照。我们发现hMBSC-CM和hMBSC共培养均可在体外抑制HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭,对细胞凋亡无影响。我们还发现hMBSC-CM处理或与hMBSCs共培养的 HeLa细胞中PCNA和KI67的表达显著降低。此外,流式细胞术分析显示 hMBSC-CM和hMBSC共培养显著诱导HeLa细胞G0/G1期细胞周期停滞,并且S期细胞显著减少。hMBSC-CM处理组与hMBSC共培养组的HeLa细胞间没有观察到显著性差异。另外还证明了hMBSCs在体内可抑制HeLa细胞增殖。我们首先构建了HeLa细胞异体移植荷瘤鼠模型,通过尾静脉将hMBSCs移植入荷瘤小鼠体内,结果表明与单独的HeLa细胞组相比,HeLa/hMBSC组中肿瘤的平均体积和平均重量显著减少。我们首次在体内和体外发现并验证了hMBSCs 的内在抗宫颈癌特性,为宫颈癌的治疗提供了新的方案。
以上对本发明的实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.人经血干细胞用于抑制HeLa细胞增殖的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,该应用是利用添加有5~20%hMBSC-CM的、含有10%FBS的DMEM培养基,对HeLa细胞进行体外培养;所述hMBSC-CM是培养hMBSCs细胞所得的条件培养基。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述hMBSC-CM是通过以下方法制备的:将第3~5代的hMBSCs细胞接种到培养皿中培养,当细胞生长至汇合度超过80%时,将培养基更换为含1%双抗的DMEM无血清培养基,继续培养48h后收集细胞培养上清,1000rpm离心5min,收集上清液用超滤浓缩管浓缩10倍,即得到hMBSC-CM。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,该应用是将HeLa细胞与hMBSCs细胞按1:1~1:2的细胞数量比混合后共培养。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述共培养是在含10%FBS的DMEM培养基中进行的,其中,HeLa细胞与所述含10%FBS的DMEM培养基的比例为:每1.5×105个HeLa细胞对应3mL所述含10%FBS的DMEM培养基。
6.根据权利要求4或5所述的应用,其特征在于,用于共培养的HeLa细胞和hMBSCs细胞,是经以下步骤处理后的产物:将HeLa细胞、hMBSCs细胞分别用胰蛋白酶消化,而后以含体积浓度10%胎牛血清的DMEM培养基分别终止消化,分别离心,所得细胞沉淀分别用PBS清洗。
7.根据权利要求2~5任一项所述的应用,其特征在于,所述hMBSCs细胞是通过以下方法制备的:
1)收集健康的月经期妇女的月经血样,用抗生素处理1~2h;
2)将8mL经血与4mL Ficoll-Paque混合,1800rpm离心20min;
3)离心结束后,样品分成三层,移除上层,收集中间层细胞用PBS洗涤,离心去上清,加入7~8mL经血干细胞培养基,接种于细胞培养皿中,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养;所述经血干细胞培养基的配置方法如下:在无菌容器中加入340mLα-MEM、50mL胎牛血清、5mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺、5mL含10000 U/mL苄青霉素纳和10000μg/mL链霉素的双抗、90mL Chang Medium B、10mL Chang Medium C、10ug人源bFGF;充分混匀,4℃保存备用,2周内用完;
4)当细胞生长至70~80%汇合度时,去除培养基,然后用不含钙镁离子的PBS进行洗涤;加入1~2mL胰酶,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中孵育2~3min;而后加入2~4mL含体积浓度为10%胎牛血清的DMEM培养基使胰酶失活;吹打,使贴壁细胞脱落成单细胞状态,离心去上清;加入3mL经血干细胞通用培养基,按1:3的比例传代;在每1mL的细胞悬液中加入7~8mL的经血干细胞通用培养基,接种于细胞培养皿中,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养,即得到所述hMBSCs细胞。
8.人经血干细胞用于制备宫颈癌治疗药物的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述药物通过诱导HeLa细胞G0/G1期细胞周期阻滞来抑制其增殖和侵袭。
10.一种人经血干细胞的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)收集健康的月经期妇女的月经血样,用抗生素处理1~2h;
2)将8mL经血与4mL Ficoll-Paque混合,1800rpm离心20min;
3)离心结束后,样品分成三层,移除上层,收集中间层细胞用PBS洗涤,离心去上清,加入7~8mL经血干细胞培养基,接种于细胞培养皿中,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养;所述经血干细胞培养基的配置方法如下:在无菌容器中加入340mLα-MEM、50mL胎牛血清、5mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺、5mL含10000 U/mL苄青霉素纳和10000μg/mL链霉素的双抗、90mL Chang Medium B、10mL Chang Medium C、10ug人源bFGF;充分混匀,4℃保存备用,2周内用完;
4)当细胞生长至70~80%汇合度时,去除培养基,然后用不含钙镁离子的PBS进行洗涤;加入1~2mL胰酶,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中孵育2~3min;而后加入2~4mL含体积浓度为10%胎牛血清的DMEM培养基使胰酶失活;吹打,使贴壁细胞脱落成单细胞状态,离心去上清;加入3mL经血干细胞通用培养基,按1:3的比例传代;在每1mL的细胞悬液中加入7~8mL的经血干细胞通用培养基,接种于细胞培养皿中,置于5%CO2、95%湿度、37℃培养箱中培养,即得到所述人经血干细胞。
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CN109692184A (zh) * 2019-01-31 2019-04-30 武汉汉密顿生物科技股份有限公司 一种经血干细胞制剂及其制备方法和应用

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