CN114304066A - 一种结直肠癌pdx模型构建的方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物科学技术领域，提供了一种结直肠癌PDX模型构建的方法，包括以下步骤：S1：采集人结直肠癌样本，并进行运输和保存；S2：培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代培养；S3：细胞换液和传代冻存，并在人结直肠癌原代细胞进行冻存时对细胞进行计数；S4：细胞鉴定：培养人结直肠癌原代细胞，并对培养的细胞进行免疫荧光鉴定与HE染色鉴定；S5：细胞接种；S6：对肿瘤组织进行取材和固定后，进行人结直肠癌PDX模型构建观察和指标检测，本发明对人结直肠癌原代细胞的培养方法进行优化，并构建结直肠癌PDX模型，分别从体内和体外为结直肠癌患者选择不同的抗肿瘤药物筛选，制定个体化的精准用药方案奠定基础，操作流程简单可靠。

Description

一种结直肠癌PDX模型构建的方法

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，具体是一种结直肠癌PDX模型构建的方法。

背景技术

结直肠癌(CoLorectaL cancer)是排名世界第3位的常见肿瘤，在各种肿瘤所引起的死亡原因中排名第4位，据世界卫生组织统计资料显示，结直肠癌每年全球新发逾百万，因结直肠癌死亡的人数超过50万。中国目前结直肠癌的发生率和病死率分别排名恶性肿瘤的第3位和第5位，近年来随着人们生活方式的改变如饮食结构改变、体力活动减少等，其发病率有明显增高趋势。目前，结直肠癌的治疗包括内窥镜和外科局部切除，降低术前放疗和全身治疗，广泛的手术局部和转移疾病，局部消融治疗转移，化疗，靶向治疗，免疫治疗。但是结直肠癌患者预后仍较差，尤其是结直肠癌晚期。

构建理想的动物模型对于研发新型抗肿瘤药物至关重要。传统的细胞系移植瘤模型是将人体肿瘤细胞系(经过体外筛选、传代培养建立的稳定细胞系)接种到免疫缺陷小鼠体内，其形成的肿瘤缺乏异质性，且失去了肿瘤微环境，包括细胞外基质、微血管等。因此用于评价新型抗肿瘤药物时，不能真实地反映药物在人体的疗效。

近年来，人源性肿瘤组织异种移植模型(Patient-derived Xenograft，PDX)逐步发展成为肿瘤研究的重要工具。而原代培养又称为初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。其又细分为肿瘤细胞原代培养与非肿瘤细胞原代培养。原代培养获取的肿瘤细胞仍具有二倍体遗传性，最接近和反映体内生长特性，适用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。与细胞系移植瘤模型相比，原代细胞构建PDX模型较好地保留了人体肿瘤的异质性及肿瘤的微环境，较好地重现了人体肿瘤发生发展的生物学过程，为肿瘤研究提供了最接近于临床的体内模型。

原代培养肿瘤细胞建立动物移植模型，即是将原代培养的肿瘤细胞接种于裸鼠皮下，从而观察肿瘤细胞的成瘤时间、肿瘤生长情况、移植肿瘤大小及裸鼠摄食、活动状况，并运用分化诱导剂观察其肿瘤细胞分化、增殖与凋亡以及药物敏感性试验等。与建立好的细胞系相比，原代细胞保留了起源组织的关键特征，更能准确地反映供者间的固有变异性。

PDX模型的构建在很大程度上帮助保持了与患者相似的遗传特性和肿瘤异质性，为寻找有效的药物抑制肿瘤提供了接近临床级别的准确性，缩短了研究周期，构建PDX模型可以帮助将少量珍贵的临床样本规模快速扩大，为抗肿瘤药物筛选和新药研发提供帮助。PDX模型还可以帮助预测患者对治疗药物可能产生的反应，包括疗效，毒副作用，吸收程度等，所以国外开始尝试使用这种模型，通过药效结果指导临床的用药。

因此，针对以上现状，迫切需要提供一种结直肠癌PDX模型构建的方法，以克服当前实际应用中的不足。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种结直肠癌PDX模型构建的方法，通过培养稳定的人结直肠癌原代细胞，进而构建结直肠癌患者的PDX模型，为研究结直肠癌抗肿瘤药物的作用机制及关键预后靶点的发现，筛选不同的抗肿瘤药物，制定个体化的精准用药方案奠定基础。

本发明实施例是这样实现的，一种结直肠癌PDX模型构建的方法，包括以下步骤：

S1：采集人结直肠癌样本，并进行运输和保存：无菌条件下自新鲜手术标本采集肿瘤组织块，自浆膜层切开，在肿瘤周边取质软肿瘤组织块，挑选癌细胞集中和细胞活力较好的部位，取材后可将组织块先放入清洗液中清洗，再转移到运输液中，置于冰浴中进行运输和保存；

S2：培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代培养：在超净工作台上将癌组织取出，置于无菌平皿中，去除坏死组织、脂肪组织和血凝块，用4℃预冷的含抗生素和两性霉素B的PBS溶液冲洗组织块3次；剃除组织筋膜；用眼科剪把冲洗好的组织修剪成约1mm³大小。用100μL的枪头把修剪好的组织块转移到培养板，用适量20％FBS液体缓慢浸没组织块，倒扣培养12h后添加培养基正置培养；7-10天后细胞大量爬出后，当组织块周围爬出细胞的密度到达90-100％时进行梯度消化和传代培养。

S3：细胞换液和传代冻存，并在人结直肠癌原代细胞进行冻存时对细胞进行计数：在进行细胞P₀代培养和传代培养过程中，每隔2天采用D-Hanks清洗细胞，然后再进行培养基(培养液II)更换；当人结直肠癌原代细胞的融合度达到75-85％时，对人结直肠癌原代细胞进行传代冻存，去除培养液，PBS洗两次，加入适量0.2％的胰蛋白酶进行梯度消化，部分细胞变圆并开始脱落，收集脱落细胞于15mL离心管中，并向离心管中加入等体积培养液终止消化。每次收集细胞后重新向培养瓶补加适量0.2％的胰蛋白酶继续消化，直至消化过程全部结束；

S4：细胞鉴定：培养人结直肠癌原代细胞，并对培养的细胞进行免疫荧光鉴定与HE染色鉴定；

S5：细胞接种：当人结直肠癌原代细胞传代培养至P₄-P₅代时，将一定量的人结直肠癌原代细胞接种BALB/c裸鼠，其中，在原代细胞接种之前需进行细胞计数，接种数量为1x10⁷个/mL，BALB/c裸鼠为雄性18-22g；接种细胞采用DMEM进行重悬，BALB/c裸鼠腋窝皮下注射200μL/只；

S6：细胞观察和检测指标：采用游标卡尺测量并记录肿瘤长径、短径，按照公式计算肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径²，绘制肿瘤生长曲线，当小鼠肿瘤体积超过1500mm³，按照动物实验伦理予以安乐死，并对肿瘤组织进行取材和固定后，进行HE染色和CEA免疫组化鉴定。

进一步地，步骤S1中所述的采集人结直肠癌样本，并进行运输和保存的具体步骤为：

收集新鲜标本：手术切除的新鲜组织标本进行原代培养，无菌条件下自新鲜手术标本切取肿瘤组织块，自浆膜层切开，在肿瘤周边取质软肿瘤组织块，切取标本应避免切取脂肪组织及坏死组织，应挑选癌细胞集中和细胞活力较好的部位；

将肿瘤组织用清洗液I清洗之后，将肿瘤组织块浸泡在运输液中进行运输和保存；清洗液I的配制：PBS溶液+1％的青霉素/链霉素(P/S)+1％庆大霉素+1％两性霉素+1％甲硝唑；运输液的配制：DMEM基础培养基+1％的青霉素/链霉素(P/S)+1％庆大霉素+1％两性霉素+1％甲硝唑；

将装有肿瘤组织块的样本放在冰盒内进行存储和运输，2小时内完成原代细胞的培养。

进一步地，步骤S2培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代培养的具体步骤为：

采用紫外光对超净台提前照射30min，并将完全培养基和清洗液放置于4℃进行预冷；

在超净工作台上将癌组织取出，置于无菌培养皿中，用无菌眼科弯镊剃除组织筋膜；再用4℃预冷的清洗液II冲洗组织3次；用眼科剪把冲洗好的组织修剪成约1mm³大小，将组织块接种到培养皿上，在每一个组织块周围加上胎牛血清，缓慢浸没组织块后放入培养箱，倒置培养12h左右，再加入适量完全培养基I正置培养；清洗液II的配制：Hanks溶液+1％的青霉素/链霉素(P/S)+1％庆大霉素+1％两性霉素+1％甲硝唑；完全培养基I：20％FBS+1640基础培养基+1％的青霉素/链霉素(P/S)；

观察细胞，并记录细胞生长，7-10天后细胞大量爬出后，当组织块周围爬出细胞的密度到达90-100％时进行梯度消化和传代培养。

梯度消化：步骤1，吸出培养皿中的培养基，采用2-3mL PBS将培养皿清洗三次；吸干PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶置于37℃培养箱进行细胞消化3min；当细胞出现皱缩，变圆时，向培养瓶中加入1mL带血清培养基终止反应，将细胞悬液转移至15mL离心管中；步骤2，重复步骤1一次；步骤3，再重复步骤1一次；

采用离心机对离心管中三次细胞消化得到的细胞悬液分别进行离心操作；

弃去离心管中的上清，分别加入1mL完全培养基II进行细胞重悬，将重悬的细胞液接种到T25中进行传代培养；完全培养基II的配制：10％FBS+1640基础培养基+1％的青霉素/链霉素(P/S)；

进一步地，步骤S3培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代冻存的具体步骤为：

采用紫外光对超净台提前照射30min，并将完全培养基、胎牛血清和0.25％胰蛋白酶放置于37℃恒温水浴锅15min；

吸出培养瓶中的培养基，采用适量(1-2mL)PBS(磷酸盐缓冲液)将其清洗两次；

吸出PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶；

旋紧培养瓶的瓶盖，放入37℃培养箱消化反应2～3min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态(0.25％胰蛋白酶消化时间在2min左右，可通过在显微镜下观察细胞形态变化掌握消化时间，倘若消化不完全时，可以分次消化，先将第一次消化的细胞悬液吸出，加入等量的完全培养基终止消化，再向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶继续消化1-2min，观察，直至细胞消化完全)；

向T25培养瓶中加入1mL带血清培养基终止反应(也可以用胰蛋白酶抑制剂终止反应)，消化结束，进行吹打混合后将消化液吸取至15mL离心管中，加入等量完全培养基终止消化，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作，其中消化分2-3次完成，离心、传代或冻存；

冻存：弃去离心管中的上清，加入1mL胎牛血清，再次进行吹打混合后，吹打混合的次数为15次左右，然后采用移液枪取900μL细胞悬液于冻存管，并加100μLDMSO(二甲基亚砜/冻存保护剂)，再次进行吹打混合，然后进行封口膜封口，并立即放入程序降温盒中，保存温度为-80摄氏度，在程序降温盒中保存24h后，将其放入液氮罐中保存。

表1.结肠癌原代细胞冻存时计数

其中细胞计数的具体步骤为：

a、采用紫外光对超净台提前照射30min，并将完全培养基、血清和0.25％胰蛋白酶放置于37℃培养箱进行预热；

b、吸出培养瓶中的培养基，采用1-2mL PBS将培养瓶清洗两次；

c、吸干PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶置于37℃培养箱进行细胞消化；

d、旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待胰蛋白酶反应1～2min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态；

e、当细胞皱缩，变圆时，向培养瓶中加入1mL带血清培养基终止反应，并进行第一次吹打混合后(10次左右)，将细胞悬液转移至15mL离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作；其中，离心的转速为1000rpm，温度为常温22-24℃，时间为10min；

f、弃去离心管中的上清液，加入1mL培养基，并对其进行吹打混合(15次左右)；

g、在进行吹到混合后，采用移液枪吸取10μL细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数，其中，分别计数4个16小方格的细胞数量，并取其平均数，细胞密度为该平均数乘以10⁴；

在进行细胞计数后，采样适量培养基稀释细胞悬液，并将其重新接种于25T的培养瓶中。对其进行接种的密度为50％左右，避免细胞密度太低不利于细胞的生长。如图2所示，其反应了人结直肠癌原代细胞，接种在25T培养瓶中的生长情况。其结果为：人结直肠癌原代细胞接种后24h可见贴壁细胞，形态为椭圆形细胞样生长。细胞生长速度受接种密度影响。

培养过程中完全培养基为含20％血清、10％血清的DMEM培养基或者RPMI1640培养液(为一种含自制含U/mL青霉素、100U/mL链霉素、10μg/mL胰岛素、生长激素100μg/L的培养基)。

对培养的原代结肠癌细胞进行复苏的具体方法如下：

1)37℃水浴锅先预热；

2)采用紫外光对超净台提前照射30min，10％的完全培养基放入37℃孵育箱预热；

3)将细胞冻存管从液氮容器中取出，在37℃水浴锅中快速融化(3-5min)；取15mL离心管，将细胞悬液从冻存管转移至离心管内，按1：5的比例加入培养液，混匀；1000rmp，离心5min；

4)弃上清，用10％血清的RPMI 1640培养液重悬细胞；

5)细胞计数和活力测定：将单细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9：1混合混匀，细胞计数仪进行计数；其细胞计数如表2。

表2.结肠癌原代细胞复苏时计数

0.4％台盼蓝溶液配制：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100mL，用滤纸过滤，4度保存，使用时用PBS稀释至0.4％。

6)将调整密度后的细胞悬液接种T25培养瓶，37℃孵育箱静置培养；次日更换一次培养基，继续培养。

如表2所示，从实验结果能够看出培养人结直肠癌原代细胞复苏时细胞平均粒径在11μm，细胞存活率大于90％。

进一步地，步骤S4中对培养的细胞进行免疫荧光鉴定的具体方法如下：

将培养细胞用胰蛋白酶重悬后按照每孔5000个细胞的密度接种到96孔板；

培养细胞48h后吸去培养基；

用PBS清洗两次后用4％多聚甲醛固定细胞30min；

采用PBS清洗3次每次5min；

每孔加100μL的5％的羊血清和0.3％Triton-X100封闭液，将96孔板放在湿盒中于37℃孵育30min；

加一抗，抗体为CEA，将抗体稀释在2％羊血清中，稀释倍数1：500；

将抗体按照下面的分组每孔30μL加入96孔板中，在湿盒中于4℃孵育18h，其分组对照如下表3；

分组	抗体	孔
			阴性对照	加2％羊血清	3
CEA	30μL(1：500)	3

表3.免疫荧光染色分组

PBS清洗3次每次5min；

孵二抗，抗体分别为G&R 594，将两种抗体一起稀释在2％羊血清中，稀释倍数1：200，每孔加30μL加入96孔板中，在湿盒中于37℃孵育1h；

PBS清洗3次每次5min；

吸干PBS，每孔加10μLDAPI染色液；

在荧光显微镜下拍照，其人结直肠癌原代细胞的免疫荧光鉴定结果如图3所示；

如图3所示，从图3中实验结果能够看出培养人结直肠癌原代细胞表面为表达CEA阳性，符合结直肠癌细胞特征。

进一步地，步骤S4中对培养的细胞进行HE染色鉴定的具体方法如下：

将培养细胞用胰蛋白酶重悬后按照每孔1x10⁵个细胞的密度接种到含有细胞爬片的六孔板中；

培养细胞48h后吸去培养基；

用PBS清洗两次后用4％多聚甲醛固定细胞30min；

采用PBS清洗3次每次5min；

染色：将六孔板中的细胞爬片取出，放置在载玻片上，每张爬片用苏木精染色约2min；

水洗：采用双蒸水清洗5min；

分化：每张爬片采用1％盐酸乙醇液分化约30s，爬片颜色变浅即可；

漂洗：爬片再次用双蒸水清洗5min；

脱水和复染：爬片一次用95％酒精处理1min；伊红染色30s；85％酒精处理1min；95％酒精处理1min；

透明：爬片用二甲苯I和二甲苯II各处理30s；

封面：采用中性树胶和二甲苯1：1进行封片；光学显微镜下观察染色结果，苏木素染成蓝色，伊红染成粉色；

如图4所示，从图4中实验结果能够看出，培养得到的结直肠癌原代细胞-1为梭形非肿瘤细胞，不成瘤；而结直肠癌原代细胞-2为圆形肿瘤细胞，成圆形克隆样生长。

进一步地，步骤S5将人结直肠癌原代细胞接种裸鼠的具体步骤为：

准备裸鼠：选取成年的BALB/c-nude雄性裸鼠，体重18-22g；

细胞消化：吸出培养瓶中的培养基，采用2-3mLPBS将培养瓶清洗三次，吸干PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶置于37℃培养箱进行细胞消化2-3min；在倒置显微镜下观察细胞的形态；当细胞皱缩，变圆时，向培养瓶中加入1mL带血清培养基终止反应，并进行第一次吹打混合后(10次左右)，将细胞悬液转移至15mL离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作；

细胞计数：弃去离心管中的上清液，加入1mL DMEM基础培养基进行细胞重悬；采用移液枪吸取10μL细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数，其中，分别计数4个16小方格的细胞数量，并取其平均数，细胞密度为该平均数乘以10⁴；

原代细胞接种：人结直肠癌细胞接种前将细胞密度调整为1x10⁷个/mL；用异氟烷麻醉BALB/c-nude裸小鼠后，消毒裸鼠腋窝下的皮肤，将人结直肠癌原代细胞接种到裸鼠腋窝，皮下注射200μL/只，待裸鼠苏醒后放回笼中饲养观察。

进一步地，步骤S6中进行人结直肠癌PDX模型构建观察和指标检测的具体步骤为：

肿块大小检测：人结直肠癌原代细胞接种14天后，采用游标卡尺测量并记录肿瘤长径、短径，按照公式计算肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径²，绘制肿瘤生长曲线；

当小鼠肿瘤体积超过1500mm³，按照动物实验伦理予以安乐死，并对肿瘤组织进行取材固定后，进行HE和CEA鉴定；

组织包埋：步骤1，肿瘤组织标本经4％多聚甲醛固定过夜，流水冲洗6-8h；步骤2，脱水依次用70％酒精(1h)→80％酒精(1h)→90％酒精(1h)→95％酒精(1.5h)→100％酒精(1.5h)→100％酒精(1.5h)；步骤3，采用二甲苯Ⅰ15min和二甲苯Ⅱ15min进行透明；步骤4，将组织块放入软蜡浸6-8h；步骤5，组织包埋好后要常温冷却30min后再放置在冷台上；

切片制作：步骤1，将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置和切片厚度，一般为4-5微米后开始切片；步骤2，铺片时用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在40-45℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平；步骤3，待蜡片在水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片的余水进行贴片后，置入60-65℃恒温箱内烤片2h，脱去溶化组织间隙的石蜡；

HE染色：步骤1，石蜡切片经过二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脱蜡各10min；步骤2，将切片置于浓度梯度为100％、95％、90％、80％、70％的酒精溶液中各5min，蒸馏水中5min进行水化；步骤3，切片放入苏木精中染色约2min，用自来水流水冲洗约5min，使切片颜色变蓝(或放入碱性水中也可)，但要注意流水不能过大，以防切片脱落；步骤4，将切片放入1％盐酸乙醇液中褪色，约30s，见切片变红，颜色较浅即可；步骤5，切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色，约10min；步骤6，95％酒精5min→伊红染色2min→85％酒精5min→95％酒精5min进行脱水和复染；步骤7，切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各3min进行透明；步骤8，采用封片剂(封片剂配置：中性树胶：二甲苯＝1：1：1)进行封片；步骤9，光学显微镜下观察组织的形态学改变，细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

CEA免疫组织化学染色：步骤1，石蜡切片经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡各10min；步骤2，将切片置于浓度梯度为100％、95％、90％、80％、70％的酒精溶液中各5min，蒸馏水中5min进行水化；步骤3，将切片置于盛有0.01moL/L(pH6.0)的柠檬酸钠缓冲液的高压蒸汽锅中，在电磁炉上加热，95℃煮沸10-15min进行抗原修复，室温冷却(约1h)；步骤4，用3％过氧化氢(3％H₂O₂)室温孵育封闭10min，PBS冲洗3次，每次3min，向玻片上滴加封闭剂5％-10％的山羊血清(PBS稀释)封闭，37℃低温培养箱中孵育30min，倾去血清；步骤5，用吸水纸擦干载玻片上组织周围的山羊血清后，放入湿盒内并在圈定组织上按要求滴加适当比例的一抗30-40μL(用2％的羊血清配置一抗)，放入37℃烤箱中2h或4℃冰箱中过夜(16-18h，不能超高过21h)，PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3min；步骤6，除去PBS，每张切片滴加二抗(滴加增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，室温孵育20min；PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3min；步骤7，除去PBS，每张切片滴加50μL新配制的DAB溶液，显微镜下观察10min(3-5min)；步骤8，将切片浸泡于苏木精中进行复染，30s，自来水冲洗10min返蓝；步骤9，将复染的片子用自来水冲洗30s(洗至没有紫色)，再置于盐酸乙醇中返蓝20-30s(提起来放下洗2-4次)，先后经浓度梯度(70％、80％、90％、95％、100％)酒精和二甲苯脱水，每个步骤3min，二甲苯中透明5min；步骤10，中性树胶封好后置于通风柜中瞭干。

进一步地，步骤S3中所述的细胞计数的具体方法还包括：

在进行细胞计数后，采样适量培养基稀释细胞悬液，并将其重新接种于25T或者T75的培养瓶中，接种的密度为50％。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果：通过培养人结直肠癌原代细胞的方法构建人结直肠癌PDX模型，利用该方法将培养得到的人结直肠癌原代细胞进行传代培养，并将培养得到的人结直肠癌原代细胞接种BALB/c-nude裸鼠，观察肿瘤生长状态，并采用游标卡尺测量并记录肿瘤长径、短径，按照公式计算肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径²，绘制肿瘤生长曲线，当小鼠肿瘤体积超过1500mm³，按照动物实验伦理予以安乐死，并对肿瘤组织进行取材固定后，进行HE和CEA鉴定；通过稳定培养人结直肠癌原代细胞，构建人结直肠癌PDX模型；此外，本发明对人结直肠癌PDX模型构建进行优化，采用该方法来构建人结直肠癌PDX模型，操作简单，模型构建成功率达到100％，可同时提供药物筛选的体内外模型，操作流程简单可靠。

附图说明

图1为本发明实施例的流程图。

图2是本发明实施例中人结直肠癌原代细胞明场图。

图3是本发明实施例中人结直肠癌原代细胞的免疫荧光鉴定图。

图4是本发明实施例中人结直肠癌原代细胞HE染色示意图。

图5是本发明实施例中人结直肠癌PDX模型构建的裸鼠瘤体生长曲线示意图。

图6是本发明实施例中人结直肠癌PDX模型构建的裸鼠瘤体HE染色结果示意图。

图7是本发明实施例中人结直肠癌PDX模型构建的裸鼠瘤体CEA免疫组织化学染色结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

请参阅图1，本发明实施例提供的一种结直肠癌PDX模型构建的方法，包括以下步骤：

S1：采集人结直肠癌样本，并进行运输和保存：无菌条件下自新鲜手术标本采集肿瘤组织块，自浆膜层切开，在肿瘤周边取质软肿瘤组织块，挑选癌细胞集中和细胞活力较好的部位，取材后可将组织块先放入清洗液中清洗，再转移到运输液中，置于冰浴中进行运输和保存；

S2：培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代培养；

S3：细胞换液和传代冻存，并在人结直肠癌原代细胞进行冻存时对细胞进行计数：在进行细胞P₀代培养和传代培养过程中，每隔2天采用D-Hanks清洗细胞，然后再进行培养基(培养液II)更换；当人结直肠癌原代细胞的融合度达到75-85％时，对人结直肠癌原代细胞进行传代冻存，去除培养液，PBS洗两次，加入适量0.2％的胰蛋白酶进行梯度消化，部分细胞变圆并开始脱落，收集脱落细胞于15mL离心管中，并向离心管中加入等体积培养液终止消化。每次收集细胞后重新向培养瓶补加适量0.2％的胰蛋白酶继续消化，直至消化过程全部结束；

S4：细胞鉴定：培养人结直肠癌原代细胞，并对培养的细胞进行免疫荧光鉴定与HE染色鉴定；

S5：细胞接种：当人结直肠癌原代细胞传代培养至P₄-P₅代时，将一定量的人结直肠癌原代细胞接种BALB/c裸鼠，其中，在原代细胞接种之前需进行细胞计数，接种数量为1x10⁷个/mL，BALB/c裸鼠为雄性18-22g；接种细胞采用DMEM进行重悬，BALB/c裸鼠腋窝皮下注射200μL/只；

S6：细胞观察和检测指标：采用游标卡尺测量并记录肿瘤长径、短径，按照公式计算肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径²，绘制肿瘤生长曲线，当小鼠肿瘤体积超过1500mm³，按照动物实验伦理予以安乐死，并对肿瘤组织进行取材和固定后，进行HE染色和CEA免疫组化鉴定。

在本发明的实施例中，

在本发明的一个实施例中，请参阅图1，步骤S1中所述的采集人结直肠癌样本，并进行运输和保存的具体步骤为：

收集新鲜标本：手术切除的新鲜组织标本进行原代培养，无菌条件下自新鲜手术标本切取肿瘤组织块，自浆膜层切开，在肿瘤周边取质软肿瘤组织块，切取标本应避免切取脂肪组织及坏死组织，应挑选癌细胞集中和细胞活力较好的部位；

将肿瘤组织用清洗液I清洗之后，将肿瘤组织块浸泡在运输液中进行运输和保存；

将装有肿瘤组织块的样本放在冰盒内进行存储和运输，2小时内完成原代细胞的培养。

在本实施例中，清洗液I的配制：PBS溶液+1％的青霉素/链霉素(P/S)+1％庆大霉素+1％两性霉素+1％甲硝唑；运输液的配制：DMEM基础培养基+1％的青霉素/链霉素(P/S)+1％庆大霉素+1％两性霉素+1％甲硝唑；

在本发明的一个实施例中，请参阅图1，步骤S2培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代培养的具体步骤为：

采用紫外光对超净台提前照射30min，并将完全培养基和清洗液放置于4℃进行预冷；

在超净工作台上将癌组织取出，置于无菌培养皿中，用无菌眼科弯镊剃除组织筋膜；再用4℃预冷的清洗液II冲洗组织3次；用眼科剪把冲洗好的组织修剪成约1mm³大小，将组织块接种到培养皿上，在每一个组织块周围加上胎牛血清，缓慢浸没组织块后放入培养箱，倒置培养12h左右，再加入适量完全培养基I正置培养；

观察细胞，并记录细胞生长，7-10天后细胞大量爬出后，当组织块周围爬出细胞的密度到达90-100％时进行梯度消化和传代培养。

梯度消化：步骤1，吸出培养皿中的培养基，采用2-3mL PBS将培养皿清洗三次；吸干PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶置于37℃培养箱进行细胞消化3min；当细胞出现皱缩，变圆时，向培养瓶中加入1mL带血清培养基终止反应，将细胞悬液转移至15mL离心管中；步骤2，重复步骤1一次；步骤3，再重复步骤1一次；

采用离心机对离心管中三次细胞消化得到的细胞悬液分别进行离心操作；

弃去离心管中的上清，分别加入1mL完全培养基II进行细胞重悬，将重悬的细胞液接种到T25中进行传代培养。

在本实施例中，清洗液II的配制：Hanks溶液+1％的青霉素/链霉素(P/S)+1％庆大霉素+1％两性霉素+1％甲硝唑；完全培养基I：20％FBS+1640基础培养基+1％的青霉素/链霉素(P/S)；完全培养基II的配制：10％FBS+1640基础培养基+1％的青霉素/链霉素(P/S)。

在本发明的一个实施例中，请参阅图1-图3，步骤S3培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代冻存的具体步骤为：

采用紫外光对超净台提前照射30min，并将完全培养基、胎牛血清和0.25％胰蛋白酶放置于37℃恒温水浴锅15min；

吸出培养瓶中的培养基，采用适量(1-2mL)PBS(磷酸盐缓冲液)将其清洗两次；

吸出PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶；

旋紧培养瓶的瓶盖，放入37℃培养箱消化反应2～3min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态(0.25％胰蛋白酶消化时间在2min左右，可通过在显微镜下观察细胞形态变化掌握消化时间，倘若消化不完全时，可以分次消化，先将第一次消化的细胞悬液吸出，加入等量的完全培养基终止消化，再向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶继续消化1-2min，观察，直至细胞消化完全)；

向T25培养瓶中加入1mL带血清培养基终止反应(也可以用胰蛋白酶抑制剂终止反应)，消化结束，进行吹打混合后将消化液吸取至15mL离心管中，加入等量完全培养基终止消化，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作，其中消化分2-3次完成，离心、传代或冻存；

冻存：弃去离心管中的上清，加入1mL胎牛血清，再次进行吹打混合后，吹打混合的次数为15次左右，然后采用移液枪取900μL细胞悬液于冻存管，并加100μLDMSO(二甲基亚砜/冻存保护剂)，再次进行吹打混合，然后进行封口膜封口，并立即放入程序降温盒中，保存温度为-80摄氏度，在程序降温盒中保存24h后，将其放入液氮罐中保存。细胞冻存是的细胞密度见表1。

表1.结肠癌原代细胞冻存时计数

其中细胞计数的具体步骤为：

a、采用紫外光对超净台提前照射30min，并将完全培养基、血清和0.25％胰蛋白酶放置于37℃培养箱进行预热；

b、吸出培养瓶中的培养基，采用1-2mL PBS将培养瓶清洗两次；

c、吸干PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶置于37℃培养箱进行细胞消化；

d、旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待胰蛋白酶反应1～2min后，在倒置显微镜下观察细胞的形态；

e、当细胞皱缩，变圆时，向培养瓶中加入1mL带血清培养基终止反应，并进行第一次吹打混合后(10次左右)，将细胞悬液转移至15mL离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作；其中，离心的转速为1000rpm，温度为常温22-24℃，时间为10min；

f、弃去离心管中的上清液，加入1mL培养基，并对其进行吹打混合(15次左右)；

g、在进行吹到混合后，采用移液枪吸取10μL细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数，其中，分别计数4个16小方格的细胞数量，并取其平均数，细胞密度为该平均数乘以10⁴；

在进行细胞计数后，采样适量培养基稀释细胞悬液，并将其重新接种于25T的培养瓶中。对其进行接种的密度为50％左右，避免细胞密度太低不利于细胞的生长。如图2所示，其反应了人结直肠癌原代细胞，接种在25T培养瓶中的生长情况。其结果为：人结直肠癌原代细胞接种后24h可见贴壁细胞，形态为椭圆形细胞样生长。细胞生长速度受接种密度影响。

培养过程中完全培养基为含20％血清、10％血清的DMEM培养基或者RPMI1640培养液(为一种含自制含U/mL青霉素、100U/mL链霉素、10μg/mL胰岛素、生长激素100μg/L的培养基)。

对培养的原代结肠癌细胞进行复苏的具体方法如下：

1)37℃水浴锅先预热；

2)采用紫外光对超净台提前照射30min，10％的完全培养基放入37℃孵育箱预热；

3)将细胞冻存管从液氮容器中取出，在37℃水浴锅中快速融化(3-5min)；取15mL离心管，将细胞悬液从冻存管转移至离心管内，按1：5的比例加入培养液，混匀；1000rmp，离心5min；

4)弃上清，用10％血清的RPMI 1640培养液重悬细胞；

5)细胞计数和活力测定：将单细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9：1混合混匀，细胞计数仪进行计数；其细胞计数如下表2。

表2.结肠癌原代细胞复苏时计数

0.4％台盼蓝溶液配制：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100mL，用滤纸过滤，4度保存，使用时用PBS稀释至0.4％。

6)将调整密度后的细胞悬液接种T25培养瓶，37℃孵育箱静置培养；次日更换一次培养基，继续培养。

如表2所示，从实验结果能够看出培养人结直肠癌原代细胞复苏时细胞平均粒径在11μm，细胞存活率大于90％。

在本发明的一个实施例中，请参阅图1和图3，步骤S4中对培养的细胞进行免疫荧光鉴定的具体方法如下：

将培养细胞用胰蛋白酶重悬后按照每孔5000个细胞的密度接种到96孔板；

培养细胞48h后吸去培养基；

用PBS清洗两次后用4％多聚甲醛固定细胞30min；

采用PBS清洗3次每次5min；

每孔加100μL的5％的羊血清和0.3％Triton-X100封闭液，将96孔板放在湿盒中于37℃孵育30min；

加一抗，抗体为CEA，将抗体稀释在2％羊血清中，稀释倍数1：500；

将抗体按照下面的分组每孔30μL加入96孔板中，在湿盒中于4℃孵育18h，其分组对照如下表3；

分组	抗体	孔
			阴性对照	加2％羊血清	3
CEA	30μL(1：500)	3

表3.免疫荧光染色分组

PBS清洗3次每次5min；

孵二抗，抗体分别为G&R 594，将两种抗体一起稀释在2％羊血清中，稀释倍数1：200，每孔加30μL加入96孔板中，在湿盒中于37℃孵育1h；

PBS清洗3次每次5min；

吸干PBS，每孔加10μLDAPI染色液；

在荧光显微镜下拍照，其人结直肠癌原代细胞的免疫荧光鉴定结果如图3所示；

如图4所示，从图4中实验结果能够看出培养人结直肠癌原代细胞表面为表达CEA阳性，符合结直肠癌细胞特征。

在本发明的一个实施例中，请参阅图1和图5，步骤S4中对培养的细胞进行HE染色鉴定的具体方法如下：

将培养细胞用胰蛋白酶重悬后按照每孔1x10⁵个细胞的密度接种到含有细胞爬片的六孔板中；

培养细胞48h后吸去培养基；

用PBS清洗两次后用4％多聚甲醛固定细胞30min；

采用PBS清洗3次每次5min；

染色：将六孔板中的细胞爬片取出，放置在载玻片上，每张爬片用苏木精染色约2min；

水洗：采用双蒸水清洗5min；

分化：每张爬片采用1％盐酸乙醇液分化约30s，爬片颜色变浅即可；

漂洗：爬片再次用双蒸水清洗5min；

脱水和复染：爬片一次用95％酒精处理1min；伊红染色30s；85％酒精处理1min；95％酒精处理1min；

透明：爬片用二甲苯I和二甲苯II各处理30s；

封面：采用中性树胶和二甲苯1：1进行封片；光学显微镜下观察染色结果，苏木素染成蓝色，伊红染成粉色；

如图4所示，从图4中实验结果能够看出，培养得到的结直肠原代细胞-1为梭形非肿瘤细胞，不成瘤；而结直肠原代细胞-2为圆形肿瘤细胞，成圆形克隆样生长。

在本发明的一个实施例中，请参阅图1，步骤S5将人结直肠癌原代细胞接种裸鼠的具体步骤为：

准备裸鼠：选取成年的BALB/c-nude雄性裸鼠，体重18-22g；

细胞消化：吸出培养瓶中的培养基，采用2-3mLPBS将培养瓶清洗三次，吸干PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶置于37℃培养箱进行细胞消化2-3min；在倒置显微镜下观察细胞的形态；当细胞皱缩，变圆时，向培养瓶中加入1mL带血清培养基终止反应，并进行第一次吹打混合后(10次左右)，将细胞悬液转移至15mL离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作；

细胞计数：弃去离心管中的上清液，加入1mL DMEM基础培养基进行细胞重悬；采用移液枪吸取10μL细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数，其中，分别计数4个16小方格的细胞数量，并取其平均数，细胞密度为该平均数乘以10⁴；

原代细胞接种：人结直肠癌细胞接种前将细胞密度调整为1x10⁷个/mL；用异氟烷麻醉BALB/c-nude裸小鼠后，消毒裸鼠腋窝下的皮肤，将人结直肠癌原代细胞接种到裸鼠腋窝，皮下注射200μL/只，待裸鼠苏醒后放回笼中饲养观察。

在本发明的一个实施例中，请参阅图1以及图6-图7，步骤S6中进行人结直肠癌PDX模型构建观察和指标检测的具体步骤为：

肿块大小检测：人结直肠癌原代细胞接种14后，采用游标卡尺测量并记录肿瘤长径、短径，按照公式计算肿瘤体积：V＝1/2×长径×短径²，绘制肿瘤生长曲线；

当小鼠肿瘤体积超过1500mm³，按照动物实验伦理予以安乐死，并对肿瘤组织进行取材固定后，进行HE和CEA鉴定；

组织包埋：步骤1，肿瘤组织标本经4％多聚甲醛固定过夜，流水冲洗6-8h；步骤2，脱水依次用70％酒精(1h)→80％酒精(1h)→90％酒精(1h)→95％酒精(1.5h)→100％酒精(1.5h)→100％酒精(1.5h)；步骤3，采用二甲苯Ⅰ15min和二甲苯Ⅱ15min进行透明；步骤4，将组织块放入软蜡浸6-8h；步骤5，组织包埋好后要常温冷却30min后再放置在冷台上；

切片制作：步骤1，将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置和切片厚度，一般为4-5微米后开始切片；步骤2，铺片时用眼科镊子镊起蜡带轻轻平铺在40-45℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平；步骤3，待蜡片在水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片的余水进行贴片后，置入60-65℃恒温箱内烤片2h，脱去溶化组织间隙的石蜡；

HE染色：步骤1，石蜡切片经过二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脱蜡各10min；步骤2，将切片置于浓度梯度为100％、95％、90％、80％、70％的酒精溶液中各5min，蒸馏水中5min进行水化；步骤3，切片放入苏木精中染色约2min，用自来水流水冲洗约5min，使切片颜色变蓝(或放入碱性水中也可)，但要注意流水不能过大，以防切片脱落；步骤4，将切片放入1％盐酸乙醇液中褪色，约30s，见切片变红，颜色较浅即可；步骤5，切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色，约10min；步骤6，95％酒精5min→伊红染色2min→85％酒精5min→95％酒精5min进行脱水和复染；步骤7，切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各3min进行透明；步骤8，采用封片剂(封片剂配置：中性树胶：二甲苯＝1：1：1)进行封片；步骤9，光学显微镜下观察组织的形态学改变，细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

CEA免疫组织化学染色：步骤1，石蜡切片经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡各10min；步骤2，将切片置于浓度梯度为100％、95％、90％、80％、70％的酒精溶液中各5min，蒸馏水中5min进行水化；步骤3，将切片置于盛有0.01moL/L(pH6.0)的柠檬酸钠缓冲液的高压蒸汽锅中，在电磁炉上加热，95℃煮沸10-15min进行抗原修复，室温冷却(约1h)；步骤4，用3％过氧化氢(3％H₂O₂)室温孵育封闭10min，PBS冲洗3次，每次3min，向玻片上滴加封闭剂5％-10％的山羊血清(PBS稀释)封闭，37℃低温培养箱中孵育30min，倾去血清；步骤5，用吸水纸擦干载玻片上组织周围的山羊血清后，放入湿盒内并在圈定组织上按要求滴加适当比例的一抗30-40μL(用2％的羊血清配置一抗)，放入37℃烤箱中2h或4℃冰箱中过夜(16-18h，不能超高过21h)，PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3min；步骤6，除去PBS，每张切片滴加二抗(滴加增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，室温孵育20min；PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3min；步骤7，除去PBS，每张切片滴加50μL新配制的DAB溶液，显微镜下观察10min(3-5min)；步骤8，将切片浸泡于苏木精中进行复染，30s，自来水冲洗10min返蓝；步骤9，将复染的片子用自来水冲洗30s(洗至没有紫色)，再置于盐酸乙醇中返蓝20-30s(提起来放下洗2-4次)，先后经浓度梯度(70％、80％、90％、95％、100％)酒精和二甲苯脱水，每个步骤3min，二甲苯中透明5min；步骤10，中性树胶封好后置于通风柜中瞭干。

在本发明的一个实施例中，请参阅图1，步骤S3中所述的细胞计数的具体方法还包括：

在进行细胞计数后，采样适量培养基稀释细胞悬液，并将其重新接种于25T或者T75的培养瓶中，接种的密度为50％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：采集人结直肠癌样本，并进行运输和保存；

S2：培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代培养；

S3：细胞换液和传代冻存，并在人结直肠癌原代细胞进行冻存时对细胞进行计数；

S4：细胞鉴定：培养人结直肠癌原代细胞，并对培养的细胞进行免疫荧光鉴定与HE染色鉴定；

S5：细胞接种：将培养得到的人结直肠癌原代细胞按1×10⁷个/ml接种至BALB/c-nude裸鼠；

S6：瘤体观察和检测指标：观察人直肠癌PDX模型构建情况，测量瘤体大小并计算肿瘤体积，对肿瘤组织进行取材和固定后，进行形态学指标检测。

2.根据权利要求1所述的结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述采集人结直肠癌样本，并进行运输和保存的具体步骤为：

S1.1：收集新鲜肿瘤组织标本；

S1.2：将肿瘤组织用清洗液I清洗，并将清洗后的肿瘤组织块浸泡在运输液中进行运输和保存；清洗液I的配制：PBS溶液+1％的青霉素/链霉素(P/S)+1％庆大霉素+1％两性霉素+1％甲硝唑；运输液的配制：DMEM基础培养基+1％的青霉素/链霉素(P/S)+1％庆大霉素+1％两性霉素+1％甲硝唑；

S1.3：将装有肿瘤组织块的样本放在冰盒内进行存储和运输，2小时内完成原代细胞的培养。

3.根据权利要求1所述的结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代培养的具体步骤为：

S2.1：采用紫外光对超净台提前照射，并将完全培养基和清洗液进行预冷；

S2.2：在超净工作台上将癌组织取出，置于无菌培养皿中，剃除组织筋膜；再用4℃预冷的清洗液II冲洗组织3次；用眼科剪把冲洗好的组织修剪成约1mm³大小，将组织块接种到培养皿上，在每一个组织块周围加上适量胎牛血清FBS，缓慢浸没组织块后放入培养箱，倒置培养12h左右，再加入适量完全培养基I正置培养；清洗液II的配制：Hanks溶液+1％的青霉素/链霉素(P/S)+1％庆大霉素+1％两性霉素+1％甲硝唑；完全培养基I：20％FBS+1640基础培养基+1％的青霉素/链霉素(P/S)；

S2.3：观察细胞，并记录细胞生长，7-10天后细胞大量爬出后，当组织块周围爬出细胞密度到达90-100％时进行梯度消化处理、离心处理以及传代培养处理。

S2.4：梯度消化：步骤1，吸出培养皿中的培养基，采用2-3ml PBS将培养皿清洗三次；吸干PBS，并向培养瓶中加入1ml 0.25％胰蛋白酶置于37℃培养箱进行细胞消化3min；当细胞出现皱缩，变圆时，向培养瓶中加入1ml带血清培养基终止反应，将细胞悬液转移至15ml离心管中；步骤2，重复步骤1一次；步骤3，再重复步骤1一次；采用离心机对离心管中三次细胞消化得到的细胞悬液分别进行离心操作；

S2.5：弃去离心管中的上清，分别加入1ml完全培养基II进行细胞重悬，将重悬的细胞液接种到T25中进行传代培养；完全培养基II的配制：10％FBS+1640基础培养基+1％的青霉素/链霉素(P/S)。

4.根据权利要求1所述的结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述细胞计数的具体步骤为：

S3.1：采用紫外光对超净台提前照射，并将完全培养基、血清和0.25％胰蛋白酶放置于培养箱进行预热；

S3.2：吸出培养瓶中的培养基，采用1-2mL PBS对培养瓶进行清洗；

S3.3：吸干PBS，向培养瓶中加入胰蛋白酶并置于培养箱进行细胞消化；

S3.4：旋紧培养瓶的瓶盖，摇晃培养瓶，并用掌心拍打瓶身，待胰蛋白酶反应后，在倒置显微镜下观察细胞的形态；

S3.5：当细胞皱缩，变圆时，向培养瓶中加入1mL带血清培养基终止反应，并进行第一次吹打混合后，将细胞悬液转移至15mL离心管中，采用离心机对离心管中的细胞悬液进行离心操作；其中，离心的转速为1000rpm，温度为常温22-24℃，时间为10min；

S3.6：弃去离心管中的上清液，加入1mL培养基，并对其进行吹打混合；

S3.7：在进行吹到混合后，采用移液枪吸取10μL细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数。

5.根据权利要求1所述的结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述对培养的原代细胞进行免疫荧光鉴定的具体方法如下：

S4.1.1：将培养细胞用胰蛋白酶重悬后按照每孔5000个细胞的密度接种到96孔板；

S4.1.2：培养细胞48h后吸去培养基；

S4.1.3：用PBS清洗两次后用多聚甲醛固定细胞30min；

S4.1.4：采用PBS清洗3次；

S4.1.5：每孔加羊血清和封闭液，将96孔板放在湿盒中孵育；

S4.1.6：加一抗，将抗体稀释在羊血清中；

S4.1.7：将抗体按比例加入96孔板中，在湿盒中孵育；

S4.1.8：PBS清洗3次；

S4.1.9：孵二抗，将两种抗体一起稀释在羊血清中，并按比例加入96孔板中，在湿盒中孵育；

S4.1.10：PBS清洗3次；

S4.1.11：吸干PBS，每孔加DAPI染色液；

S4.1.12：在荧光显微镜下拍照并观察。

6.根据权利要求1所述的结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述对培养的原代细胞进行HE染色鉴定的具体方法如下：

S4.2.1：将培养细胞用胰蛋白酶重悬后按照每孔1x10⁵个细胞的密度接种到含有细胞爬片的六孔板中；

S4.2.2：培养细胞48h后吸去培养基；

S4.2.3：用PBS清洗两次后用多聚甲醛固定细胞30min；

S4.2.4：采用PBS清洗；

S4.2.5：染色：将六孔板中的细胞爬片取出，放置在载玻片上，每张爬片用苏木精染色；

S4.2.6：水洗：采用双蒸水清洗；

S4.2.7：分化：每张爬片采用盐酸乙醇液分化，直至爬片颜色变浅；

S4.2.8：漂洗：爬片再次用双蒸水清洗；

S4.2.9：脱水和复染：爬片一次用95％酒精处理；伊红染色；85％酒精处理；95％酒精处理；

S4.2.10：透明：爬片用二甲苯I和二甲苯II单独处理；

S4.2.11：封面：采用中性树胶和二甲苯1：1进行封片；

S4.2.12：光学显微镜下观察颜色。

7.根据权利要求1所述的结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，在步骤S5中，所述将人结直肠癌原代细胞接种裸鼠的具体步骤为：

S5.1：准备BALB/c-nude裸鼠18-22g；

S5.2：细胞消化：吸出培养瓶中的培养基，采用2-3mLPBS将培养瓶清洗3次，吸干PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25％胰蛋白酶置于培养箱进行细胞消化；在倒置显微镜下观察细胞的形态；

S5.3：细胞计数：弃去离心管中的上清液，加入1mL DMEM基础培养基进行细胞重悬；采用移液枪吸取10μL细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数；

S5.4：原代细胞接种：人结直肠癌原代细胞接种前将细胞密度调整为1x10⁷个/mL；用异氟烷麻醉BALB/c-nude裸鼠后，消毒裸鼠腋窝下的皮肤，将人结直肠癌原代细胞接种到裸鼠腋窝，皮下注射200μL/只，待裸鼠苏醒后放回笼中饲养观察。

8.根据权利要求1所述的结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，在步骤S6中，所述进行人结直肠癌PDX模型构建观察和指标检测的具体步骤为：

S6.1：肿块大小检测；

S6.2：对肿瘤组织进行取材固定后，进行HE和CEA鉴定；

S6.3：组织包埋：S6.3.1，肿瘤组织标本经多聚甲醛固定，流水冲洗；S6.3.2，脱水依次用70％酒精、80％酒精、90％酒精、95％酒精、100％酒精、100％酒精；S6.3.3，采用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ进行透明处理；S6.3.4，将组织块放入软蜡浸；S6.3.5，组织包埋好后常温冷却并放置在冷台上；

S6.4：切片制作：S6.4.1，将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置和切片厚度，开始切片；S6.4.2，铺片时用眼科镊子镊起蜡带平铺在水面上并展平；S6.4.3，蜡片在水面展平后，将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片的余水进行贴片，置入恒温箱内烤片，脱去溶化组织间隙的石蜡；

S6.5：HE染色：S6.5.1，石蜡切片经过二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脱蜡单独处理；S6.5.2，将切片置于浓度梯度为100％、95％、90％、80％、70％的酒精溶液中，再放入蒸馏水中进行水化；S6.5.3，切片放入苏木精中染色，用自来水流水冲洗，使切片颜色变蓝；S6.5.4，将切片放入1％盐酸乙醇液中褪色；S6.5.5，切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色；S6.5.6，95％酒精、伊红染色、85％酒精、95％酒精进行脱水和复染；S6.5.7，切片放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中单独进行透明处理；S6.5.8，采用封片剂进行封片；S6.5.9，光学显微镜下观察组织的形态学改变。

S6.7：CEA免疫组织化学染色：S6.7.1，石蜡切片经过二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脱蜡；S6.7.2，将切片置于浓度梯度为100％、95％、90％、80％、70％的酒精溶液中，蒸馏水中进行水化；S6.7.3，将切片置于盛有浓度为0.01moL/L且pH为6.0的柠檬酸钠缓冲液的高压蒸汽锅中，加热进行抗原修复，室温冷却；S6.7.4，用3％过氧化氢室温孵育，PBS冲洗，向玻片上滴加封闭剂5％-10％的山羊血清封闭，低温培养箱中孵育并倾去血清；S6.7.5，用吸水纸擦干载玻片上组织周围的山羊血清后，放入湿盒内并在圈定组织上按要求滴加一抗，放入烤箱，PBS冲洗；S6.7.6，除去PBS，每张切片滴加二抗，室温孵育20min，PBS冲洗；S6.7.7，除去PBS，每张切片滴加50μL新配制的DAB溶液，显微镜下观察；S6.7.8，将切片浸泡于苏木精中进行复染，自来水冲洗返蓝；

S6.7.9，将复染的片子用自来水冲洗，再置于盐酸乙醇中返蓝，先后经浓度梯度酒精和二甲苯脱水；S6.7.10，中性树胶封好后置于通风柜中瞭干。

9.根据权利要求1所述的结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述细胞计数的具体方法还包括：

细胞计数后，采样适量培养基稀释细胞悬液，并将其细胞重新接种于T75的培养瓶中进行传代培养。

10.根据权利要求1所述的结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，在步骤S5中，所述人结直肠癌原代细胞接种的密度为50％。

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