CN111378618A - 一种干细胞提取制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种干细胞提取制备方法，涉及干细胞提取技术领域。该提取制备方法包括以下具体步骤：S1、经血采集；S2、经血检测；S3、经血预处理；S4、离心处理；S5、稀释处理；S6、细胞检测；S7、细胞培养与S8、细胞分化。本发明，通过对经血中间充质干细胞的提取方法进行优化，使得在分离过程中最大限度地保证了间充质干细胞的活性，提高经血中间充质干细胞的应用价值，并且使得间充质干细胞的获得率大大提高，有助于临床医学的研究，本发明，使得采集的经血质量，得到的沉淀物细胞质量以及培养的干细胞质量都有效的得到了保障，整个方法操作过程简单，提取成本低。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞提取技术领域，具体为一种干细胞提取制备方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞，根据干细胞的发育潜能分为三类:全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞，干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为"万用细胞"。
目前，干细胞可以从骨髓、外周血、脂肪与经血中分离提取，经血是血液和一些脱落的子宫内膜、子宫颈粘液及阴道分泌物的混杂液体，有研究表明，利用女性月经血可成功分离培养出具有多重分化功能的干细胞，对于临床医学上具有十分重要的意义，但目前，关于经血间充质干细胞的提取制备方法不够成熟，干细胞获得率较低。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种干细胞提取制备方法，解决了现有技术中存在的缺陷与不足。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种干细胞提取制备方法，所述提取制备方法包括以下具体步骤：
S1、经血采集
准备好消毒设备以及经血采集装置，首先利用消毒设备对经血采集装置以及采集部位进行消毒处理，然后再利用经血采集装置采集女性经期血液；
S2、经血检测
将采集之后的经血放入到保温箱中进行储藏，然后将保温箱送至目的地，取少量经血进行血液检测，分析该经血是否健康；
S3、经血预处理
首先取适量的经血于试管中，然后往试管中加入经血体积2-3％的抗生素混合均匀；
S4、离心处理
将上述经血分装至同一规格的离心管中，往离心管中加入Ficoll淋巴细胞分离液,利用离心管对经血进行离心处理，离心处理之后除去离心管中的上清液，留下沉淀物A备用；
S5、稀释处理
往上述制得的沉淀物中A加入等体积的PBS缓冲液，利用PBS缓冲液对沉淀物A进行清洗，然后对加入PBS缓冲液的沉淀物A进行离心处理，除去离心处理后的上清液，重复该操作2-3次，利用密度梯度离心法，制得最终沉淀物B留作备用；
S6、细胞检测
去少量沉淀物B进行检测，检测沉淀物B中细胞的活性是否达标，同时观察沉淀物B中细胞的密度；
S7、细胞培养
将获得的沉淀物B按照一定的密度接种于培养瓶中，同时往培养瓶中加入培养液，然后将培养瓶放入培养箱中，2-3天后将原培养瓶中的培养液弃之，重新更换新鲜的培养液，同时弃去非贴壁细胞，然后每22-26小时更换一次培养液，最后待细胞生长达到80％融合时，在培养瓶中加0.2-0.3％胰酶-EDTA进行处理，即得间充质干细胞；
S8、细胞分化
分别取6-8代的经血间充质干细胞加入不同的细胞诱导分化培养基,诱导其向多种细胞进行分化。
优选的，所述步骤2中保温箱内部的温度控制在5-10℃。
优选的，所述步骤3中抗生素含有80-120U/ml的青霉素和0.05-0.12mg/ml的链霉素。
优选的，所述步骤4中离心处理时间为8-10min，离心处理速度为2000-2800r/min。
优选的，所述步骤5中每一次离心处理时间为5-8min，离心处理速度为2500-2850r/min。
优选的，所述步骤7中培养瓶在37℃、CO2浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养。
优选的，所述步骤7中培养液中添加生物硒溶液、氨基酸、维生素和丙酮酸钠。
(三)有益效果
本发明提供了一种干细胞提取制备方法。具备以下有益效果：
1、本发明，通过对经血中间充质干细胞的提取方法进行优化，使得在分离过程中最大限度地保证了间充质干细胞的活性，提高经血中间充质干细胞的应用价值，并且使得间充质干细胞的获得率大大提高，有助于临床医学的研究。
2、本发明，通过对经血中间充质干细胞的提取方法进行优化，使得采集的经血质量，得到的沉淀物细胞质量以及培养的干细胞质量都有效的得到了保障，整个方法操作过程简单，提取成本低。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
如图1所示，本发明实施例提供一种干细胞提取制备方法，该提取制备方法包括以下具体步骤：
S1、经血采集
准备好消毒设备以及经血采集装置，首先利用消毒设备对经血采集装置以及采集部位进行消毒处理，然后再利用经血采集装置采集女性经期血液；
S2、经血检测
将采集之后的经血放入到保温箱中进行储藏，保温箱内部的温度控制在5-10℃，然后将保温箱送至目的地，取少量经血进行血液检测，分析该经血是否健康；
S3、经血预处理
首先取适量的经血于试管中，然后往试管中加入经血体积2-3％的抗生素混合均匀，其中抗生素含有80-120U/ml的青霉素和0.05-0.12mg/ml的链霉素；
S4、离心处理
将上述经血分装至同一规格的离心管中，往离心管中加入Ficoll淋巴细胞分离液,利用离心管对经血进行离心处理，离心处理时间为8min，离心处理速度为2800r/min，离心处理之后除去离心管中的上清液，留下沉淀物A备用；
S5、稀释处理
往上述制得的沉淀物中A加入等体积的PBS缓冲液，利用PBS缓冲液对沉淀物A进行清洗，然后对加入PBS缓冲液的沉淀物A进行离心处理，除去离心处理后的上清液，重复该操作2-3次，其中每一次离心处理时间为5min，离心处理速度为2850r/min，利用密度梯度离心法，制得最终沉淀物B留作备用；
S6、细胞检测
去少量沉淀物B进行检测，检测沉淀物B中细胞的活性是否达标，同时观察沉淀物B中细胞的密度；
S7、细胞培养
将获得的沉淀物B按照一定的密度接种于培养瓶中，同时往培养瓶中加入培养液，其中培养液中添加生物硒溶液、氨基酸、维生素和丙酮酸钠，然后将培养瓶在37℃、CO2浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养，2天后将原培养瓶中的培养液弃之，重新更换新鲜的培养液，同时弃去非贴壁细胞，然后每26小时更换一次培养液，最后待细胞生长达到80％融合时，在培养瓶中加0.2-0.3％胰酶-EDTA进行处理，即得间充质干细胞；
S8、细胞分化
分别取6-8代的经血间充质干细胞加入不同的细胞诱导分化培养基,诱导其向多种细胞进行分化。
本发明，通过对经血中间充质干细胞的提取方法进行优化，使得在分离过程中最大限度地保证了间充质干细胞的活性，提高经血中间充质干细胞的应用价值，并且使得间充质干细胞的获得率大大提高，有助于临床医学的研究；通过对经血中间充质干细胞的提取方法进行优化，使得采集的经血质量，得到的沉淀物细胞质量以及培养的干细胞质量都有效的得到了保障，整个方法操作过程简单，提取成本低。
实施例二：
本发明实施例提供一种干细胞提取制备方法，该提取制备方法包括以下具体步骤：
S1、经血采集
准备好消毒设备以及经血采集装置，首先利用消毒设备对经血采集装置以及采集部位进行消毒处理，然后再利用经血采集装置采集女性经期血液；
S2、经血检测
将采集之后的经血放入到保温箱中进行储藏，保温箱内部的温度控制在5-10℃，然后将保温箱送至目的地，取少量经血进行血液检测，分析该经血是否健康；
S3、经血预处理
首先取适量的经血于试管中，然后往试管中加入经血体积2-3％的抗生素混合均匀，其中抗生素含有80-120U/ml的青霉素和0.05-0.12mg/ml的链霉素；
S4、离心处理
将上述经血分装至同一规格的离心管中，往离心管中加入Ficoll淋巴细胞分离液,利用离心管对经血进行离心处理，离心处理时间为9min，离心处理速度为2400r/min，离心处理之后除去离心管中的上清液，留下沉淀物A备用；
S5、稀释处理
往上述制得的沉淀物中A加入等体积的PBS缓冲液，利用PBS缓冲液对沉淀物A进行清洗，然后对加入PBS缓冲液的沉淀物A进行离心处理，除去离心处理后的上清液，重复该操作2-3次，其中每一次离心处理时间为6.5min，离心处理速度为2680r/min，利用密度梯度离心法，制得最终沉淀物B留作备用；
S6、细胞检测
去少量沉淀物B进行检测，检测沉淀物B中细胞的活性是否达标，同时观察沉淀物B中细胞的密度；
S7、细胞培养
将获得的沉淀物B按照一定的密度接种于培养瓶中，同时往培养瓶中加入培养液，其中培养液中添加生物硒溶液、氨基酸、维生素和丙酮酸钠，然后将培养瓶在37℃、CO2浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养，2.5天后将原培养瓶中的培养液弃之，重新更换新鲜的培养液，同时弃去非贴壁细胞，然后每24小时更换一次培养液，最后待细胞生长达到80％融合时，在培养瓶中加0.2-0.3％胰酶-EDTA进行处理，即得间充质干细胞；
S8、细胞分化
分别取6-8代的经血间充质干细胞加入不同的细胞诱导分化培养基,诱导其向多种细胞进行分化。
实施例三：
本发明实施例提供一种干细胞提取制备方法，该提取制备方法包括以下具体步骤：
S1、经血采集
准备好消毒设备以及经血采集装置，首先利用消毒设备对经血采集装置以及采集部位进行消毒处理，然后再利用经血采集装置采集女性经期血液；
S2、经血检测
将采集之后的经血放入到保温箱中进行储藏，保温箱内部的温度控制在5-10℃，然后将保温箱送至目的地，取少量经血进行血液检测，分析该经血是否健康；
S3、经血预处理
首先取适量的经血于试管中，然后往试管中加入经血体积2-3％的抗生素混合均匀，其中抗生素含有80-120U/ml的青霉素和0.05-0.12mg/ml的链霉素；
S4、离心处理
将上述经血分装至同一规格的离心管中，往离心管中加入Ficoll淋巴细胞分离液,利用离心管对经血进行离心处理，离心处理时间为10min，离心处理速度为2000r/min，离心处理之后除去离心管中的上清液，留下沉淀物A备用；
S5、稀释处理
往上述制得的沉淀物中A加入等体积的PBS缓冲液，利用PBS缓冲液对沉淀物A进行清洗，然后对加入PBS缓冲液的沉淀物A进行离心处理，除去离心处理后的上清液，重复该操作2-3次，其中每一次离心处理时间为8min，离心处理速度为2500r/min，利用密度梯度离心法，制得最终沉淀物B留作备用；
S6、细胞检测
去少量沉淀物B进行检测，检测沉淀物B中细胞的活性是否达标，同时观察沉淀物B中细胞的密度；
S7、细胞培养
将获得的沉淀物B按照一定的密度接种于培养瓶中，同时往培养瓶中加入培养液，其中培养液中添加生物硒溶液、氨基酸、维生素和丙酮酸钠，然后将培养瓶在37℃、CO2浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养，3天后将原培养瓶中的培养液弃之，重新更换新鲜的培养液，同时弃去非贴壁细胞，然后每22小时更换一次培养液，最后待细胞生长达到80％融合时，在培养瓶中加0.2-0.3％胰酶-EDTA进行处理，即得间充质干细胞；
S8、细胞分化
分别取6-8代的经血间充质干细胞加入不同的细胞诱导分化培养基,诱导其向多种细胞进行分化。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种干细胞提取制备方法，其特征在于：所述提取制备方法包括以下具体步骤：
S1、经血采集
准备好消毒设备以及经血采集装置，首先利用消毒设备对经血采集装置以及采集部位进行消毒处理，然后再利用经血采集装置采集女性经期血液；
S2、经血检测
将采集之后的经血放入到保温箱中进行储藏，然后将保温箱送至目的地，取少量经血进行血液检测，分析该经血是否健康；
S3、经血预处理
首先取适量的经血于试管中，然后往试管中加入经血体积2-3％的抗生素混合均匀；
S4、离心处理
将上述经血分装至同一规格的离心管中，往离心管中加入Ficoll淋巴细胞分离液,利用离心管对经血进行离心处理，离心处理之后除去离心管中的上清液，留下沉淀物A备用；
S5、稀释处理
往上述制得的沉淀物中A加入等体积的PBS缓冲液，利用PBS缓冲液对沉淀物A进行清洗，然后对加入PBS缓冲液的沉淀物A进行离心处理，除去离心处理后的上清液，重复该操作2-3次，利用密度梯度离心法，制得最终沉淀物B留作备用；
S6、细胞检测
去少量沉淀物B进行检测，检测沉淀物B中细胞的活性是否达标，同时观察沉淀物B中细胞的密度；
S7、细胞培养
将获得的沉淀物B按照一定的密度接种于培养瓶中，同时往培养瓶中加入培养液，然后将培养瓶放入培养箱中，2-3天后将原培养瓶中的培养液弃之，重新更换新鲜的培养液，同时弃去非贴壁细胞，然后每22-26小时更换一次培养液，最后待细胞生长达到80％融合时，在培养瓶中加0.2-0.3％胰酶-EDTA进行处理，即得间充质干细胞；
S8、细胞分化
分别取6-8代的经血间充质干细胞加入不同的细胞诱导分化培养基,诱导其向多种细胞进行分化。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞提取制备方法，其特征在于：所述步骤2中保温箱内部的温度控制在5-10℃。
3.根据权利要求1所述的一种干细胞提取制备方法，其特征在于：所述步骤3中抗生素含有80-120U/ml的青霉素和0.05-0.12mg/ml的链霉素。
4.根据权利要求1所述的一种干细胞提取制备方法，其特征在于：所述步骤4中离心处理时间为8-10min，离心处理速度为2000-2800r/min。
5.根据权利要求1所述的一种干细胞提取制备方法，其特征在于：所述步骤5中每一次离心处理时间为5-8min，离心处理速度为2500-2850r/min。
6.根据权利要求1所述的一种干细胞提取制备方法，其特征在于：所述步骤7中培养瓶在37℃、CO2浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养。
7.根据权利要求1所述的一种干细胞提取制备方法，其特征在于：所述步骤7中培养液中添加生物硒溶液、氨基酸、维生素和丙酮酸钠。
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Citations (7)
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2020
- 2020-03-26 CN CN202010226017.4A patent/CN111378618A/zh active Pending
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