CN116376821B - 一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法,将人脐带间充质干细胞接种于可变溶氧条件的3D生物反应器中,溶氧条件为常氧转低氧培养,常氧条件氧分压控制为50%,低氧条件氧分压控制为15%。本发明的有益效果是:在3D生物反应器内常氧转低氧条件下培养的脐带间充质干细胞外泌体表达量较常氧、低氧及低氧转常氧条件明显提高;适于批量生产,易于推动脐带来源间充质干细胞外泌体生物产品的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于人脐带间充质干细胞培养方法的技术领域,它涉及一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法。
背景技术
脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞,其来源于中胚层具有高度自我更新和多向分化能力,因此具有广阔的临床应用前景。
外泌体是指直径在30-150nm之间包含RNA、microRNA、蛋白质、DNA片段等的茶托型结构的小囊泡。人体几乎所有的细胞都可以分泌外泌体,其天然存在于体液中,包括唾液、尿液、脑脊液、血液和乳汁等。脐带间充质干细胞也不例外,在正常及病理状态下脐带间充质干细胞均可分泌外泌体。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。相比于脐带间充质干细胞,外泌体细胞因含有母细胞来源的蛋白质、脂质和核酸,并且因其分子量小、渗透性强等优点可作为信号分子作用于其它细胞。
目前脐带间充质干细胞体外主要是2D培养模式,常氧浓度的完全(血清)培养基中培养,完全培养基通常包含动物血清成分,动物源血清成分可能包含一些未知的过敏原和病原体,使得细胞培养过程中产生的外泌体具有极大的安全隐患,且2D条件下大规模培养具有较大的局限性。然而3D环境中常氧条件下采用无血清培养基培养的脐带间充质干细胞虽然贴壁生长状态较好、细胞活性较高,但是外泌体分泌量较低,限制了脐带来源间充质干细胞外泌体生物产品的推广应用。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法。
本发明采用的技术方案是:一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法,将人脐带间充质干细胞接种于可变溶氧条件的3D生物反应器中,溶氧条件为常氧转低氧培养。
优选地,常氧条件氧分压控制为50%,低氧氧分压在15-25%。
优选地,具体步骤如下:
对原代人脐带间充质干细胞培养扩增;
将人脐带间充质干细胞接种于含有微载体的3D生物反应器中,开始常氧培养48-72h,然后低氧培养48-72h;
培养结束后,收获细胞培养上清液,经分离纯化得到人脐带间充质干细胞外泌体。优选地,原代人脐带间充质干细胞经复苏、传代、扩增步骤。
优选地,3D生物反应器培养载体采用Cytodex 1微载体,接种浓度为2.5g/mL;细胞接种密度为1.6×105 cells/mL。
优选地,3D生物反应器培养,最佳pH值为7.3±0.1,搅拌转速为60-80 rpm,通气量设置为0.03-0.1slpm,灌流进速率为1 mL/min,灌流出速率为1 mL/min。
由提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法制备得到的外泌体。
本发明具有以下有益效果:在3D生物反应器内常氧转低氧条件下培养的脐带间充质干细胞外泌体表达量较常氧、低氧及低氧转常氧条件明显提高;适于批量生产,易于推动脐带来源间充质干细胞外泌体生物产品的工业化生产。
附图说明
图1为hMSCs细胞贴附微载体生长形态图;Scale bar=100μm;
图2为hMSCs细胞生长曲线;
图3为全自动生化分析仪测定细胞生长代谢;
图4为Elisa测定细胞上清中外泌体表面标志物表达量;
图5为外泌体形态特征的鉴定;
图6为纳米流式测定外泌体颗粒数;
图7为BCA法测定外泌体蛋白浓度。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明公开一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法,将间充质干细胞接种于3D环境中,先常氧条件下培养,再低氧条件下培养, 常氧条件氧分压控制为50%,低氧氧分压在15-25%。具体如下:
步骤一:首先取脐带间充质干细胞工作细胞库细胞进行复苏,采用本领域常规的细胞复苏方法即可,2D条件下培养3D生物反应器所需的种子细胞;本发明某些实施例中,具体为将脐带来源的间充质干细胞接种于T175培养瓶中,接种密度为10000~14000Cells/mL,37℃ 5%CO2条件下培养,完全培养基为间充质干细胞基础培养基添加无血清培养基添加剂。
步骤二:再将上述种子细胞接种于3D环境中常氧环境下培养48-72h,48-72h后调整溶氧(DO),在低氧条件下培养48-72h,培养过程中根据生化指标确定灌流体积并收获相应上清,用于超速离心收集外泌体。3D条件由生物反应器提供;生物反应器是全封闭、全自动系统,可控制pH、温度、压力、DO(深层通气)、液位、搅拌速度、消泡等;生物反应器内培养hMSCs日监控从取样口取样,全自动生化分析仪检测葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸等生化指标。
向3D环境中接种种子细胞前,先对其进行检测,检测内容包括表型检测和微生物安全检测;表型检测为对种子细胞进行间充质干性表型检测,CD73、CD90、CD105≥95%,CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR≤2%为合格的脐带间充质干细胞;微生物安全性检测为对种子细胞培养上清进行无菌和支原体微生物安全性检测,符合无菌阴性,支原体阴性。
生物反应器内细胞的贴壁载体为Cytodex 1,Cytodex 1微载体干重时表面积为4400cm2/g,每克约含4.3×106球,膨胀因子20mL/g;Cytodex 1微载体接种浓度为2.5g/L,细胞接种浓度为15 cells/ball。生物反应器内最佳pH值为7.3±0.1,最佳搅拌转速为60-80rpm,培养温度优选的为37℃,通气量设置为0.03-0.1slpm,当生物反应器内生化监控值显示Gluc<1 g/L,Glun<0.1 g/L时,向生物反应器内以1 mL/min的速度自动灌流完全培养基,同时以相同速度将生物反应器内的培养上清灌出收集。
培养过程中,常氧条件DO为50%,低氧条件DO为15-25%;氧分压是通过向生物反应器中的培养基内引入空气、二氧化碳、氧气和氮气来实现的,低氧条件是所述的空气、二氧化碳、氧气和氮气通过气体分布器处理后,生物反应器内的最终氧分压控制在15-25%。上述的氧含量能够为生物反应器内培养的脐带间充质干细胞提供生长繁殖所需的基本条件又能提高其外泌体的表达量。
生物反应器内细胞低氧条件下培养72 h后上清送检无菌、支原体监控微生物安全性,细胞送检表型检测。生物反应器取样口取样进行日监控,分别进行上清生化指标测定,上清离心-80℃保存留样及Tryple消化酶消化细胞计数。
培养后对3D生物反应器中培养的脐带间充质干细胞取样后用Tryple消化酶将细胞从Cytodex 1微载体上消化下来,送检流式测定细胞表型,CD73、CD90、CD105≥95%,CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR≤2%,即为符合标准细胞。收获细胞培养上清倒入离心杯中,2500g离心15min,转移至无菌试剂瓶,-80℃保存,收集得到的上清可用于提取外泌体。
下面结合附图对本发明方案做出说明,其中,未具体说明操作步骤的实验方法,均按照相应商品说明书进行,实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明,均可从商业公司购买得到。本发明具体实施例中使用的生物反应器为武汉赛科成科技有限公司研发的SKC300生物反应器;所使用的生物反应器的容积为2.5L;本发明中生化分析仪为西尔曼科技有限公司的全自动生化分析仪M-900。
实施例1
本实施例1中将人脐带来源间充质干细胞接种于3D生物反应器中,细胞的低氧培养方法,包括以下步骤:
将来源于工作细胞库的原代人脐带间充质干细胞进行复苏,工作库细胞迅速转移到37℃水浴锅中,轻轻晃动融化;洁净工作台内,细胞冻存液转移至加有完全培养基的离心管中;400g离心5min后,弃上清,加入适量完全培养基重悬细胞,充分混匀后细胞计数。
按照每平方厘米1Í104个细胞密度接种于T175细胞培养瓶内,将含有细胞的培养瓶放入37℃,5%CO2培养箱中继续培养,细胞融合度达到80%-90%后,收集细胞并进行细胞传代,在2D条件下将hMSCs传代培养至3D生物反应器所需数量的种子细胞,完全培养基为无血清间充质干细胞培养基。
种子细胞接种于3D生物反应器培养,以Cytodex 1微载体2.5g/L,15 cells/ball的接种浓度,细胞接种至2.5L生物反应器中,以1.5L培养体系进行培养。先常氧培养48h,再低氧培养72h,常氧条件DO为50%,低氧条件DO为15%。
本实施例中生物反应器内最佳pH值为7.3±0.1,最佳搅拌转速为80 rpm,培养温度优选为37℃,通气量设置为0.03-0.1slpm,常氧条件氧分压控制为50%,细胞培养48h,低氧条件氧分压控制为15%,细胞培养72h。上述氧分压调节是通过向生物反应器中的培养基内引入空气、二氧化碳、氧气和氮气来实现的,低氧条件是所述的空气、二氧化碳、氧气和氮气通过气体分布器处理后,生物反应器内的最终氧分压分别控制在50%和15%。细胞培养日监测样品取自生物反应器单向取样口,样品经全自动生化分析仪检测葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺等生化指标,当生物反应器内生化监控值显示Gluc<1 g/L,Gln<0.1 g/L时,向生物反应器内以1 mL/min的速度自动灌流完全培养基,同时以相同速度将生物反应器内的培养上清灌出收集,灌流培养结束后取样检测细胞培养上清中外泌体含量。
对比例
对比例包括3个,种子细胞接种于3D生物反应器中,与实施例1 的不同之处在于培养条件,3个对比例分别为:细胞常氧培养120h,常氧条件氧分压控制为50%;细胞低氧培养120h,低氧条件氧分压控制为15%;细胞低氧培养48h后转常氧继续培养72h,低氧条件氧分压控制为15%,常氧条件氧分压控制为50%。
实施例与对比例培养条件如表1所示;
表1
3个对比例灌流培养结束后,分别取样检测细胞培养上清中外泌体含量。
实施例2:性能检测实验
种子细胞接种3D生物反应器前,对其进行检测,检测内容包括表型检测和微生物安全检测:P8细胞进行间充质干细胞表型检测,CD73、CD90、CD105均≥95%,CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR均≤2%为合格的脐带间充质干细胞;微生物安全性检测为对P8细胞培养上清进行无菌和支原体检测,符合无菌阴性,支原体阴性。
生物反应器细胞培养日监测样品取自单向取样口,分别进行细胞上清液生化指标测定,细胞上清液300g离心5min后-80℃保存留样Elisa测定外泌体表面标志物表达量,倒置显微镜下观察hMSCs细胞贴附Cytodex 1微载体生长情况,Tryple消化酶消化贴附hMSCs细胞的Cytodex 1微载体并进行细胞计数。
3D生物反应器培养120h后终止细胞培养,需对细胞样本进行细胞表型检测,样本检测结果符合国际标准后收获细胞培养上清液,细胞表面抗原分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR,其中CD73、CD90、CD105均≥95%,CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR均≤2%,即为符合标准细胞。细胞培养上清液分离纯化前,需对细胞上清液样本进行无菌和支原体微生物安全性检测,样本检测结果均为无菌阴性和支原体阴性后开始分离纯化细胞培养上清液。分离纯化获得hMSCs-exo,分别通过透射电镜测定hMSCs-exo形态,纳米流式测定hMSCs-exo颗粒数及BCA测定hMSCs-exo蛋白浓度。
如图1为3D生物反应器培养hMSC细胞形态,A为常氧细胞组(对比例1)、B为常氧转低氧细胞组(实施例1)、C为低氧细胞组(对比例2)、D为低氧转常氧细胞组(对比例3),A-B组hMSCs细胞贴壁生长状态良好,细胞均匀贴附在微载体球表面,细胞呈长梭形,两组间细胞生长状态无明显差异;证明常氧转低氧培养过程与对细胞形状无影响;C-D组hMSCs细胞部分贴附在微载体球表面呈长梭形生长,但大部分细胞游离在细胞悬液中。
图2为3D生物反应器培养hMSCs细胞生长曲线,50%为常氧细胞组、50%-15%为常氧转低氧细胞组、15%为低氧细胞组、15%-50%为低氧转常氧细胞组。由图可知,50%和50%-15%组在0-48h细胞生长速率相似,48-120h两组间细胞生长趋势相似,但50%-15%组细胞密度略高于50%组;15%和15%-50%组在0-48h细胞生长速率相似,48-120h两组间细胞生长趋势相似,但15%组细胞密度略高于15%-50%组,其中50%-15%组细胞密度明显高于50%、15%和15%-50%组。
图3为3D生物反应器培养hMSCs细胞生长代谢曲线,实验组别同上述。50%和50%-15%组在0-48h细胞生长代谢情况相似,48-120h两组间生长代谢趋势相似,与50%组相比,50%-15%组葡萄糖消耗速率及乳酸代谢速率均明显加快,但谷氨酰胺摄取速率随着培养时间的延长会有所降低,主要原因是细胞在低氧条件下能够通过无氧呼吸满足自身能量需求;15%和15%-50%组在0-48h细胞生长代谢情况相似,48-120h两组间生长代谢趋势相似,与15%-50%组相比,15%组葡萄糖消耗速率及乳酸代谢速率均明显加快,且谷氨酰胺摄取速率随着培养时间的延长会有所降低,其中50%-15%组萄糖消耗速率及乳酸代谢速率均明显高于50%、15%和15%-50%组。
Elisa测定细胞上清液中外泌体表面标志物表达量,如图4所示,50%-15%组样品中外泌体表面标志物CD81、CD9、CD63的表达量高于50%组;15%组样品中外泌体表面标志物CD81、CD9、CD63的表达量高于15%-50%组;其中, 50%-15%组样品中外泌体表面标志物CD81、CD9、CD63的表达量均明显高于50%、15%和15%-50%组。
透射电镜观察纯化样品的形态,如图5所示,A-D组样品形态图均呈中间略凹陷的杯托状颗粒,符合外泌体形态特征。
纳米流式对样品中外泌体颗粒数进行统计分析,结果如表2和图6所示。
表2 样品外泌体颗粒数
由表2可知,相同起始培养条件,48h后调整氧分压,低氧条件下外泌体颗粒数明显较相同起始培养条件组高,且具有统计学意义。纳米流式测定结果显示,50%-15%组较50%组高出47%,50%-15%组较15%组高出178%,50%-15%组较15%-50%组高出232%,15%组较15%-50%组高出20%。相较于其它组别,常氧转低氧组能够促进细胞外泌体的分泌。
另外,分别在不同培养条件下收获的细胞上清,使用超离分离纯化方法制备高纯度外泌体,BCA法测定样品中外泌体蛋白浓度结果如表3和图7所示,50%-15%组较50%组高出39%,50%-15%组较15%组高出114%,50%-15%组较15%-50%组高出178%,15%组较15%-50%组高出30%。相较于其它组别,常氧转低氧组外泌体蛋白浓度最高,进一步表明降低氧分压能够促进细胞外泌体的分泌,提高细胞上清液中细胞外泌体的表达量。
表3 样品外泌体蛋白浓度
以上对本发明的实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的较佳实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等,均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (5)
1.一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法,其特征在于:将人脐带间充质干细胞接种于可变溶氧条件的3D生物反应器中,溶氧条件为常氧转低氧培养,常氧条件氧分压控制为50%,低氧氧分压为15%;开始常氧培养48-72h,然后低氧培养48-72h;培养结束后,收获细胞培养上清液,经分离纯化得到人脐带间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法,其特征在于:具体步骤如下:
对原代人脐带间充质干细胞培养扩增;
将人脐带间充质干细胞接种于含有微载体的3D生物反应器中,开始常氧培养48-72h,然后低氧培养48-72h;
培养结束后,收获细胞培养上清液,经分离纯化得到人脐带间充质干细胞外泌体。
3.根据权利要求2所述的提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法,其特征在于:原代人脐带间充质干细胞经复苏、传代、扩增步骤。
4.根据权利要求2所述的提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法,其特征在于:3D生物反应器培养载体采用Cytodex 1微载体,接种浓度为2.5g/mL;细胞接种密度为1.6×105 cells/mL。
5.根据权利要求2所述的提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法,其特征在于:3D生物反应器培养, pH值为7.3±0.1,搅拌转速为60-80 rpm,通气量设置为0.03-0.1slpm,灌流进速率为1 mL/min,灌流出速率为1 mL/min。
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