CN116171984B - 一种胎盘组织的细胞组织库的构建方法及其相关产品和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胎盘组织的细胞组织库的构建方法及其相关产品和应用，涉及细胞组织库构建的技术领域，所述平衡液和冻存液包括：5~300mM蔗糖，体积分数为0.5%~5%的甘油，2.5~25mM肌酸，2.5~25mM异亮氨酸，25~250mM甘露醇，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，和质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。本发明提供的冻存液和平衡液能有效减少直接冷冻对为胎盘组织块及其细胞的损伤，提高细胞复苏的产量和效能，能有效保护胎盘中的所有细胞类型和胎盘组织中核酸、蛋白分子如激素等各种生物活性物质，最大程度的保存了胎盘中的有用价值资源。

Description

一种胎盘组织的细胞组织库的构建方法及其相关产品和应用
技术领域
本发明涉及细胞组织库构建的技术领域，具体而言，涉及一种胎盘组织的细胞组织库的构建方法及其相关产品和应用。
背景技术
国内外基础和应用研究表明，干细胞对健康和医疗的作用是颠覆性的。干细胞和再生医学的研究为广大肿瘤、糖尿病、心血管疾病、帕金森氏病等神经系统疾病及其它多种损伤性和退行性疾病患者带来了希望。建立干细胞资源储存库并开展相关技术研究和应用，将为临床和科研提供充足的干细胞来源和新技术，为干细胞的临床应用打下坚实的基础，必将为提高人类健康水平做出巨大的贡献。
胎盘，作为一份宝贵的生命资源，是围产组织中干细胞含量最多的，占85%-90%。胎盘组织中含有丰富的MSCs，容易分离，能快速扩增，且具有独特的免疫调节等特性，这使得其成为移植领域和治疗免疫性疾病的理想选择。
现代研究发现，胎盘组织中含有丰富的多种干细胞和各种生物活性物质。胎盘组织中所含有以MSCs为主兼具其它类别的干细胞，比如造血干/祖细胞。这也是一种重要的干细胞生物资源。除去各类活性细胞本身的临床价值外，胎盘组织中的天然组织结构和各类核酸、蛋白分子如激素等重要活性成分，在临床疾病的诊断、治疗及科研上同样具有重要的意义。胎盘还合成多种激素、酶和细胞因子等，从人类胎盘制备的胎盘血清蛋白、胎盘球蛋白、胎盘多肽注射液是抢救病人的重要生物制品。干制的胎盘，在中药称为紫河车，为有名的滋补药物，可用于辅助治疗支气管哮喘、肺结核病。最近，发明专利202011016001.7公布了从胎盘组织中提取热休克蛋白Gp96，可作为多价的肿瘤预防性疫苗。
目前，行业内干细胞库保存胎盘MSCs的做法是：分离胎盘，再经过原代和传代扩增培养到一定数量MSCs，然后进行深低温保存。中国发明专利申请号：202011388141.7（公开号：CN112481203A），中国发明专利申请号：201910750354.0（公开号：CN 110592006A）、CN201210044638.6等公开了胎盘间充质干细胞库的构建方法，包括如下步骤：产妇筛查；样本采集；样本检测；样本预处理；细胞分离制备；原代培养；传代培养；细胞检测；细胞冻存；建立可供检索的细胞信息档案；编码入库并上传细胞信息档案。该方法存在以下几种缺点：（1）需要经过培养操作，时间周期长，制备成本高；（2）胎盘中的其他类型的细胞和其它核酸、蛋白分子如激素等各种生物活性物质都将被作为废弃物丢弃，造成了样本资源浪费；（3）冻存和复苏对MSCs冻存后损伤较大，细胞效能较低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种胎盘组织的细胞组织库的构建方法及其相关产品和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种冻存保护剂，其包括平衡液和/或冻存液。所述平衡液包括的组分及其终浓度如下：5~300mM蔗糖，体积分数为0.5%~5%的甘油，2.5~25mM肌酸，2.5~25mM异亮氨酸，25~250mM甘露醇，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。所述冻存液包括的组分及其终浓度如下：体积分数为5%~10%的DMSO，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
第二方面，本发明实施例提供了一种用于胎盘组织和/或其有核细胞的试剂盒，其包括：前述实施例所述的冻存保护剂。
第三方面，本发明实施例提供了冻存保护剂在制备用于保存胎盘组织和/或其有核细胞的试剂盒中的应用，所述冻存保护剂为前述实施例所述的冻存保护剂。
第四方面，本发明实施例提供了一种胎盘组织或其有核细胞的冻存方法，其包括：采用前述实施例所述的冻存保护剂对胎盘组织块或其有核细胞进行冻存：将胎盘组织块或其分离消化获得的有核细胞置于冻存液中降温保存；或，将胎盘组织块或其分离消化获得的有核细胞置于平衡液中静置后，再置于冻存液中降温保存。
第五方面，本发明实施例提供了一种胎盘组织的细胞组织库的构建方法，其包括：采用前述实施例所述的冻存方法对胎盘组织块和/或其有核细胞进行冻存，并对冻存后的胎盘组织块和/或其有核细胞进行复苏。
本发明具有以下有益效果：
本发明优化了用于冻存胎盘组织或其有核细胞的冻存液和平衡液，在冻存之前使用平衡液预处理或者在复苏过程中使用平衡液预处理能够减少冷冻对MSCs的损伤，提高细胞复苏的产量和效能。
本发明提供的冻存试剂以及方法直接冻存胎盘组织块或者胎盘有核细胞，无需经过培养操作，时间周期短，建库成本低。而且保存了胎盘中的所有细胞类型（包括但也不限于人胎盘间充质干细胞、胎盘亚全能干细胞、滋养层细胞，造血干/祖细胞、内皮祖细胞和免疫细胞等）和胎盘组织中核酸、蛋白分子如激素等各种生物活性物质，最大程度的保存了胎盘中的有用价值资源，避免了样本的资源浪费。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明技术路线图；
图2为三种冻存方式MSCs的细胞形态学特征（×100）；
图3为三种冻存方式下MSCs体外成骨诱导分化染色结果（×200）；
图4为三种冻存方式下MSCs体外成软骨诱导分化染色结果（×200）；
图5为三种冻存方式下MSCs体外成脂诱分化染色结果（×200）。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种冻存保护剂，其包括平衡液和/或冻存液。
所述平衡液包括的组分及其终浓度如下：5~300mM蔗糖，体积分数为0.5%~5%的甘油，2.5~25mM肌酸，2.5~25mM异亮氨酸，25~250mM甘露醇，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；
所述冻存液包括的组分及其终浓度如下：体积分数为5%~10%的DMSO，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
发明人经一系列创造性劳动提出并验证了上述平衡液和冻存液对冻存胎盘组织及其细胞的优势，若采用本发明的冻存液可以提高干细胞的增殖能力和免疫调节功能（免疫调节功能是干细胞发挥治疗作用的主要功能），结合使用平衡液后可以进一步提高冻存细胞收获总数。在上述特定的组分及其配比的限定范围内，调配获得的冻存液和平衡液能够更好地保护冷冻对MSCs的损伤，提高细胞复苏的产量、提高MSCs的增殖和免疫调节功能，能应用于直接冻存胎盘组织或其细胞的方案（可参照图1）中，为胎盘组织的细胞组织库的构建提供了途径。
在所述冻存试剂包括所述平衡液时，所述冻存液可以选择现有的其他冷冻液。在冻存液相同的情况下，相比不采用平衡液的方案而言，采用平衡液的方案对胎盘组织和其有核细胞的具有更好的保存效果。在均采用平衡液的情况下，本发明提供的冻存液比现有的冻存液能在冷冻过程中更好的保护细胞。
在一些实施例中，所述冻存液包括的组分及其终浓度如下：体积分数为5%~10%的DMSO，5~300mM蔗糖，体积分数为0.5%~5%的甘油，2.5~25mM肌酸，2.5~25mM异亮氨酸，25~250mM甘露醇，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
具体地，在平衡液或冻存液中，蔗糖的终浓度可以为5mM、10 mM、15 mM、20 mM、25mM、30 mM、35 mM、40 mM、45 mM、50 mM、100 mM、150 mM、200 mM、250 mM、300 mM中的任意一种或任意两种之间的范围。甘油的终浓度可以为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%中的任意一种或任意两种之间的范围。肌酸和/或异亮氨酸的终浓度可以为2.5mM、5 mM、7.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5 mM、20 mM、22.5 mM、25 mM中的任意一种或任意两种之间的范围。甘露醇的终浓度可以为25 mM、30 mM、40 mM、50 mM、55 mM、60 mM、65mM、70 mM、75 mM、80 mM、85 mM、90 mM、100 mM、120 mM、140 mM、160 mM、180 mM、200 mM、220 mM、240 mM、250 mM中的任意一种或任意两种之间的范围。白蛋白注射液或血清的质量分数可以为5%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%中的任意一种或任意两种之间的范围。右旋糖酐40氯化钠注射液的质量分数可以为30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%中的任意一种或任意两种之间的范围。
在冻存液中，DMSO的体积分数为5%、6%、7%、8%、9%和10%中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述平衡液包括的组分及其终浓度如下：25~35mM蔗糖，体积分数为1%~1.5%的甘油，5~7mM肌酸，6~8mM异亮氨酸，60~65mM甘露醇，质量分数为8%~12%的白蛋白或血清，以及质量分数为55%~65%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
在一些实施例中，所述冻存液包括的组分及其终浓度如下：体积分数为3%~5%的DMSO，25~35mM蔗糖，体积分数为1%~1.5%的甘油，5~7mM肌酸，6~8mM异亮氨酸，60~65mM甘露醇，质量分数为8%~12%的白蛋白或血清，以及质量分数为55%~65%的右旋糖酐40氯化钠注射液。限定的范围内的平衡液均可达到相同或相似的技术效果。
在一些实施例中，白蛋白可以为血清来源的人血白蛋白或重组人白蛋白。可选地，人血白蛋白可以为人血白蛋白注射液。所述血清可选自人血清和/或脐带血血清。在一些实施例中，所述冻存保护剂还包括消化液。消化液可选自现有公开的用于消化胎盘组织的消化液。
可选地，所述消化液包括的组分及其终浓度如下：1U/mL～10U/mL透明质酸酶，2.5U/mL～250U/mL胶原酶，10 U/mL～100U/mL分散酶，5mM～300 mM蔗糖，0.50%～5%甘油，2.5mM～25 mM肌酸，2.5 mM～25 mM异亮氨酸，25 mM～250 mM甘露醇。
具体地，在消化液中，透明质酸酶的终浓度可以为1U/mL、2 U/mL、4 U/mL、6 U/mL、8 U/mL和10 U/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。胶原酶的终浓度可以为2.5 U/mL、10 U/mL、25 U/mL、50 U/mL、75 U/mL、100 U/mL、115 U/mL、120 U/mL、125 U/mL、130 U/mL、135 U/mL、140 U/mL、150 U/mL、170 U/mL、200 U/mL、225 U/mL、250 U/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。分散酶的终浓度可以为10 U/mL、20 U/mL、30 U/mL、40 U/mL、50 U/mL、60 U/mL、70 U/mL、80 U/mL、90 U/mL、100 U/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。蔗糖的终浓度可以为5mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM、35 mM、40 mM、45 mM、50 mM、100 mM、150 mM、200 mM、250 mM、300 mM中的任意一种或任意两种之间的范围。甘油的终浓度可以为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%中的任意一种或任意两种之间的范围。肌酸和/或异亮氨酸的终浓度可以为2.5 mM、5 mM、7.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、17.5mM、20 mM、22.5 mM、25 mM中的任意一种或任意两种之间的范围。甘露醇的终浓度可以为25mM、30 mM、40 mM、50 mM、55 mM、60 mM、65 mM、70 mM、75 mM、80 mM、85 mM、90 mM、100 mM、120 mM、140 mM、160 mM、180 mM、200 mM、220 mM、240 mM、250 mM中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述消化液包括的组分及其终浓度如下：3U/mL～7U/mL透明质酸酶，120U/mL～130U/mL胶原酶，40 U/mL～60U/mL分散酶，25~35mM蔗糖，体积分数为1%~1.5%的甘油，5~7mM肌酸，6~8mM异亮氨酸，60~65mM甘露醇。
另一方面，本发明实施例还提供了一种用于胎盘组织和/或其有核细胞的试剂盒，其包括：前述任意实施例所述的冻存保护剂。
另一方面，本发明实施例还提供了冻存保护剂在制备用于保存胎盘组织和/或其有核细胞的试剂盒中的应用，所述冻存保护剂为前述任意实施例所述的冻存保护剂。
另一方面，本发明实施例还提供了一种胎盘组织或其有核细胞的冻存方法，其包括：采用前述任意实施例所述的冻存保护剂对胎盘组织块或其有核细胞进行冻存：将胎盘组织块或其分离消化获得的有核细胞置于冻存液中降温保存；或，将胎盘组织块或其分离消化获得的有核细胞置于平衡液中静置后，再置于冻存液中降温保存。
在一些实施例中，在所述平衡液中静置的条件包括：室温放置30~50min，0~8℃放置1~20min。
本文中的“室温”可以理解为5~30℃之间，具体可以指5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃中的任意一种或任意两种之间的范围。室温放置的时间具体可以为30min、32 min、34min、36 min、38 min、40 min、42 min、44 min、46 min、48 min、50 min中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述0~8℃可以理解为0℃、2℃、4℃、6℃、8℃中的任意一种或任意两种之间的范围。0~8℃的放置时间具体可以为1 min、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min、14min、16 min、18 min、20 min中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述冻存液和/或平衡液的体积为胎盘组织块或其分离消化获得的有核细胞体积的0.5~2倍，具体可以为0.5倍、1倍、1.5倍、2倍中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，消化胎盘组织的有核细胞的消化液为前述任意实施例所述的消化液。消化液的添加体积为胎盘组织体积的1~3倍，具体可以为1倍、1.5倍、2倍、2.5倍和3倍中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，胎盘组织块是经过清理后获得的。清理的步骤可基于现有技术获得。具体可参照如下：剪切胎盘的绒毛膜组织和底蜕膜组织，用10%聚维酮碘擦拭消毒，分别用含1%青链霉素PBS液重复漂洗2～3次，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，直至清洗液中无血污。然后用手术剪刀将胎盘组织剪碎至1～2mm3组织块。
胎盘组织的获取途径和方式也可以基于现有常规技术知识获得，例如：待新生儿生产后，由医护人员将脐带血收集至无菌采血袋中。收集胎盘组织，用生理盐水冲洗胎盘组织样本，放入装有采集液的采集袋。采集10mL母体供者外周血，记录组织供者详细健康信息，贴上写有供者姓名及生产日期时间的标签，4℃运输至实验室。对采集合格的组织样本进行登记，编号，信息录入，系统根据组织编号编写相应的条形码，然后将条形码分别贴在胎盘组织样品及组织供者血液的外包装上，所有样品统一暂存放指定4℃冰箱。取脐带血进行ABO/Rh 血型检测、HLA分型检测、微生物免疫检测。
在一些实施例中，所述降温的程序包括：第一步：以-15~-5°C /min的速率，从室温降低至0~4 °C；第二步：以-5~5°C /min的速率，从0~4°C降低至-12~-4 °C；第三步：以-30~-20°C /min的速率，从-12~-4 °C降低至-55~-45 °C；第四步：以5~15°C /min的速率，从-55~-45 °C调控至-18~-10 °C；第五步：以-5~5°C /min的速率，从-18~-10 °C调控至-50~-40°C；第六步：以-15~-5°C /min的速率，从-50~-40 °C调控至-95~-80 °C。生物样品在降温冷冻过程中，当由液态向固态变化的相变期内会释放一定热量，使其温度回升，不控制降温速率的冷冻过程将会导致组织细胞死亡。程序降温方法是把准确地测定生物样品的相变点，用微机编制降温程序，以便在样品相变时加大液氮输入量，克服相变样品温度的回升，使细胞安全而迅速地度过相变期，这是提高被冻样品成活率的关键环节。常规胎盘间充质干细胞的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。该降温程序优于常规的降温，能更有效地避免或降低冷冻导致的细胞死亡。
可选地，所述降温的程序包括：第一步：以-10°C /min的速率，从室温降低至4 °C；第二步：以-1°C /min的速率，从4°C降低至-8 °C；第三步：以-25°C /min的速率，从-8 °C降低至-50 °C；第四步：以10°C /min的速率，从-50 °C调控至-14 °C；第五步：以-1°C /min的速率，从-14 °C调控至-45 °C；第六步：以-10°C /min的速率，从-45°C调控至-90 °C。
此外，本发明实施例还提供了一种胎盘组织的细胞组织库的构建方法，其包括：采用前述任意实施例所述的冻存方法对胎盘组织块和/或其有核细胞进行冻存，并对冻存后的胎盘组织块和/或其有核细胞进行复苏。
在一些实施例中，对冻存后的胎盘组织块的复苏的步骤包括：将冻存的胎盘组织块解冻溶解，离心去除上清；在离心后的产物中添加0.5~2倍体积的前述任意实施例所述的平衡液，放置10~40min后，添加0.5~2倍体积的平衡液和完全培养基的混合物，再放置10~40min；在再放置后的产物中添加完全培养基洗涤，离心去上清后，对胎盘组织块中的细胞进行培养，扩增获得细胞。可以理解的是，所述胎盘组织块中的细胞可以包括任意胎盘中可提取的细胞，包括但也不限于：人胎盘间充质干细胞、胎盘亚全能干细胞、滋养层细胞，造血干/祖细胞、内皮祖细胞和免疫细胞中的至少一种。
可选地，所述解冻溶解的步骤可以包括：对冻存物置于30~40°C中恒温水浴1~5min。
所述对胎盘组织块中的细胞进行培养，扩增获得细胞的步骤可基于现有常规技术知识获取。在一些实施例中，该步骤包括：将组织块转移至培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，4~5天后移去组织块，每3天更换新鲜完全培养基。当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养，扩增后获得大量人胎盘间充质干细胞，备用。
在一些实施例中，对冻存后的胎盘组织块的有核细胞的复苏的步骤包括：将冻存的胎盘组织块的有核细胞解冻溶解，离心去除上清；在离心后的产物中添加0.5~2倍体积的前述任意实施例所述的平衡液，放置10~40min，离心后添加0.5~2倍体积的平衡液和完全培养基的混合物，再放置10~40min；在再放置后的产物中添加完全培养基洗涤，离心去上清后，对有核细胞进行培养，扩增获得细胞。
所述的对有核细胞进行培养，扩增获得细胞的步骤可基于现有常规技术知识获取。在一些实施例中，该步骤包括：将细胞悬液2×104/cm2接种于培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，每3天更换新鲜完全培养基，当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养，扩增后获得大量人胎盘间充质干细胞。
在一些实施例中，所述混合物中，平衡液和完全培养基的体积比为（0.5~1.5）：1该体积比可以为0.5:1、0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.4:1、1.5:1中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述离心的条件包括：1400~1600rpm，5~15min。离心的转速具体可以为1400 rpm、1500 rpm或1600 rpm，离心的时间具体可以为5min、6 min、8 min、10min、12 min、14 min、15 min中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，添加完全培养基洗涤的次数为1~3次。
在一些实施例中，所述完全培养基可选择现有适用于培养围产期细胞的培养基。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
（1）标本的采集
人胎盘标本来自北京友谊医院产科足月妊娠产妇，排除胎儿畸形、产妇先天性遗传病及传染病史，且签署知情同意书。供者应经过人源性特定病毒（包括 HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）、梅毒螺旋体、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶的项目检查，具体要求见表1。在手术室无菌条件下采集胎盘组织，用生理盐水洗涤胎盘组织2～3次，放入采集袋中，12小时内运输到实验室进行组织处理。
表1.供者要求
（2）胎盘样本的冻存、复苏和培养：
剪切胎盘绒毛膜组织，10%聚维酮碘擦拭消毒，用含1%青链霉素PBS液重复漂洗2～3次，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，直至清洗液中无血污。将胎盘组织剪碎至1～2mm3组织块，按照重量平均分为三份，实验分为三组，分别进行不同的操作：
第一组（胎盘组织块冻存）：取胎盘组织放入含有2ml冻存液（DMSO：体积浓度10%，人血白蛋白：质量浓度10%，右旋糖酐40氯化钠注射液：质量浓度60%）的5ml的冷冻管中，每个冻存管可以放入大约2-2.5g组织。使用程序降温仪降温后（降温程序：Step 1: -10°C /min to 4.0 °C, Step 2: -1.0 °C/min to −8.0 °C, Step 3: -25.0 °C/min to −50 °C, Step 4: +10.0 °C/min to −14.0 °C, Step 5: -1.0 °C/min to −45 °C, Step 6: -10.0 °C/min to −90 °C, Step 7: End），放入液氮中保存3个月后，取出冻存管，37℃快速融化，快速转移组织悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液+2IU/mL肝素钠）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，将组织块转移至培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，5天后移去组织块，每3天更换新鲜培养基，当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。
第二组（胎盘有核细胞冻存）：取胎盘组织，加入2倍体积的消化液（透明质酸酶：5U/mL，胶原酶：125U/mL，分散酶：50 U/mL），37℃消化60分钟，2500r/min离心10min，弃上清，用PBS洗涤2次，1200r/min离心5min，过200目筛网，收集细胞。即获得人胎盘有核细胞。将胎盘有核细胞放入含有4ml冻存液（DMSO：体积浓度10%，人血白蛋白：质量浓度10%，右旋糖酐40氯化钠注射液：质量浓度60%）的5ml的冷冻管中，每个冻存管可以放入大约8×106有核细胞。使用程序降温仪降温后（降温程序：Step 1: -10°C /min to 4.0 °C，Step 2: -1.0 °C/min to −8.0 °C，Step 3: -25.0 °C/min to −50 °C，Step 4: +10.0 °C/min to−14.0 °C，Step 5: -1.0 °C/min to −45 °C，Step 6: -10.0 °C/min to −90 °C，Step 7:End），放入液氮中保存3个月后，取出冻存管，37℃快速融化，快速转移细胞悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液+2IU/mL肝素钠）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，以5×104/cm2密度将细胞接种于无菌的培养瓶中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，72h后移去未贴壁细胞，每3天更换新鲜培养基。当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。
第三组（胎盘间充质干细胞冻存）：取胎盘组织，将组织块转移至培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，5天后移去组织块，每3天更换新鲜培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液+2IU/mL肝素钠），当细胞生长至约80%融合时，即获得人胎盘间充质干细胞：收集胎盘间充质干细胞放入含有4ml冻存液（DMSO：体积浓度10%，人血白蛋白：质量浓度10%，右旋糖酐40氯化钠注射液：质量浓度60%）的5ml的冷冻管中，每个冻存管可以放入大约8×106胎盘间充质干细胞。使用程序降温仪降温后（降温程序：Step 1: -10°C /min to4.0 °C，Step 2: -1.0 °C/min to −8.0 °C，Step 3: -25.0 °C/min to −50 °C，Step 4:+10.0 °C/min to −14.0 °C，Step 5: -1.0 °C/min to −45 °C，Step 6: -10.0 °C/minto −90 °C，Step 7: End.），放入液氮中保存3个月后，取出冻存管，37℃快速融化，快速转移细胞悬液至含有培养基的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，以2×103/cm2密度将细胞接种于无菌的培养瓶中，置于CO2培养箱培养。每3天更换新鲜培养基。
（3）胎盘间充质干细胞的质量检测：
MSCs在培养完成后需要进行各项质量控制点的质量检测，对每批MSCs进行质量评价。一般包括细胞形态、纯度、倍增时间、细胞存活率、克隆形成、免疫抑制功能和安全检测等。MSCs质量检测如下：
1、细胞形态
取第3代对数生长期细胞在倒置显微镜下检测贴壁细胞形态。
2、细胞活率
取第3代对数生长期的细胞悬液，加入0.4%台盼蓝溶液，在三分钟内按《全国临床检验操作规程》（第四版）白细胞计数方法分别计数活细胞和死细胞，计算细胞活率。
3、细胞表面标志物
取第3代对数生长期细胞进行免疫表型分析，鉴定所培养的细胞为MSCs，用0.05%胰酶消化并收集细胞，制成1×106/ml的单细胞悬液，分别向预先加入抗体CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLA-ABC-FITC的Falcon管各加100μl细胞悬液，以大鼠IgG1-FITC、IgG1-APC、IgG1-PE、IgG1-PercP为阴性对照。4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，重悬后进行流式细胞仪检测。采用CellQuest Pro对数据进行分析。
4、细胞诱导分化能力鉴定
成脂分化：取第3代对数生长期细胞，按照2×104/cm2密度接种，每孔加入完全培养基2ml，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞完全融合后更换成脂分化完全培养基A液，72h后更换成脂分化诱导完全培养基B液，如此循环3~5次后，用成脂分化诱导完全培养基B液继续维持7d，B液维持期间，每3d换液1次；分化诱导完成后10%多聚甲醛固定，油红O染色，显微镜下观察并拍照。
成骨分化：取第3代对数生长期细胞，按照2×104/cm2的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入2ml完全培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，直至细胞融合度达到60%~70%，然后更换成成骨诱导分化培养基，每3d换液1次；分化诱导完成后10%多聚甲醛固定，茜素红染色，显微镜下观察并拍照。
成软骨诱导分化：取第3代对数生长期细胞，调整细胞浓度为1.6×107/ml。取10μl细胞悬液，缓慢滴加至6孔板中间部位，培养2h，弃掉生长培养液及未贴壁细胞，加入成软骨诱导分化培养基。每3d换液1次，诱导分化21d后，10%多聚甲醛固定，阿利新蓝染色，显微镜下观察并拍照。
5、群体倍增时间
取第3代对数生长期细胞，以5000个/孔（6孔板）的密度接种培养6天，用以下公式计算细胞倍增时间：PDT=(ΔT×lg 2)/(lg Nt-lg N0)式中，PDT：群体倍增时间；ΔT：培养时间；Nt：t时间后的细胞数；N0：对数生长期理论初始值。
6、细胞克隆形成率检测
取第3代对数生长期细胞，以100个/孔密度接种于6孔板，轻轻转动，使细胞均匀，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养2-3周，经常观察，当出现肉眼可见的克隆团时，终止培养，弃上清，PBS小心洗2次，加入4%多聚甲醛5ml固定细胞15min，去固定液，加适量GIMSA应用染色液30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥，计数大于40个细胞的克隆数。
7、抑制淋巴细胞增殖实验
取健康供者外周血30mL，用Ficoll分离获取（peripheral blood mononuclearcells, PBMCs）。取第3代对数生长期MSCs，以2×104/cm2接种到96孔板12h；50μg/mL丝裂霉素C处理60 min，加入1×104PBMCs，加入1 μg/mL anti-CD3单抗、1 μg/mL anti-CD28单抗和200U/mL IL-2；以不添加anti-CD3单抗、anti-CD28单抗和IL-2的PBMCs作为空白组；共培养72h的PBMCs，加入CCK-8，将培养板在培养箱内孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度（OD）。以公式计算PBMCs的增殖率：OD（实验组）/OD（不加刺激物的PBMCs）×100%。取不同组PBMCs，调整细胞密度1×106/mL；分别加入CD25和CD69抗体10 µL；同型对照管加入鼠IgG-FITC，IgG-PE；在4℃下孵育30 min；用PBS洗涤1次，1000 rpm离心5 min；用500µL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪进行检测。
8、吲哚胺2, 3-双加氧酶（IDO）活性的检测
取第3代对数生长期细胞，调整细胞浓度为 1×105/cm2；用15ng/mL IFN-γ或15ng/mL IFN-γ+15ng/mL TNF-α处理48h；收集细胞上清各100µl，加至25µl 30%三氯乙酸，50℃水浴箱培养30min，9000g离心5min，收集100µl上清加至96孔板；与100µl爱尔希试剂室温下孵育10min；酶标仪测OD值，计算犬尿氨酸含量。使用犬尿氨酸水平评估免疫调节介质IDO 的活性。
9、安全性检测
1）无菌检测
将离心上清液或细胞培养上清接种于胰酪大豆胨琼脂平板培养基、沙氏葡萄糖琼脂平板培养基，胰酪大豆胨琼脂平板培养基倒置于 30℃-35℃培养箱中培养 3-5 天，沙氏葡萄糖琼脂平板培养基倒置于 20℃-25℃培养箱中培养 3-5 天，观察平板上的菌落。
2）支原体检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按《中华人民共和国药典》 2015版第三部，支原体检查法（通则3301）进行检测。
3）外源病毒因子检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按《中华人民共和国药典》 2015版，第三部，外源病毒因子检测（通则3302）进行检测。
4）内毒素检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按《中华人民共和国药典》 2015版，第三部，细菌内毒素检查法（通则1143）进行检测。
5）核型异常率检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按GB15193.6-2014进行检测。
6）致瘤性检测
取第3代对数生长期的细胞悬液，按软琼脂克隆形成率检测方法进行检测，具体步骤如下：1）将1.2％低熔点琼脂糖与 2×细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6％的底层琼脂， 6孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml；2）将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加 1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液(约1000cell/well)，混匀，室温凝固；3）将6孔板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养2～3周，显微镜下计数50个细胞以上的克隆。
10、统计学处理
采用SPSS21.0软件进行统计分析，计量资料以 x ̅ ±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
（4）检测结果
1、细胞形态观察
三组冻存方式的MSCs传至第3代，显微镜下观察，均表现为均一的长梭形，并呈漩涡状生长（图2）。
2、细胞表型分析结果
流式细胞仪检测结果显示，三组冻存方式的MSCs均阳性表达CD90、CD73、CD105、CD29、CD13、CD44、CD166和HLA-ABC（＞95%），阴性表达CD14、CD19、CD45、CD34和HLA-DR（＜2%，表2）。且三组之间免疫表型表达均无统计学差异（所有P＜0.05，表2）。
表2 三种冻存方式MSCs的细胞表型检测结果
3、细胞诱导分化能力检测结果
三种不同冻存方式下MSCs经成骨诱导分化21d后，采用茜素红进行钙化结节染色，可见致密生长的细胞中散在出现大量橘红色矿化结节（图3）。
三种不同冻存方式下MSCs经成软骨诱导分化21d后，采用阿利辛蓝对细胞团进行染色，可见大小不一的蓝色结节（图4）。
三种不同冻存方式下MSCs经成脂诱导分化21d后，采用油红O进行染色，在倒置显微镜下观察可见大量脂质沉积，即脂滴（图5）。
4、细胞活率检测结果：
三组不同冻存方式下MSCs进行细胞活率检测，结果显示三组之间的细胞活率均无统计学差异（P＞0.05，表3）。
表3 三个组MSCs的细胞活率检测结果
5、细胞倍增时间检测结果：
三种不同冻存方式下MSCs进行细胞倍增时间计算，结果显示第一组细胞倍增时间少于第三组，且两组之间的细胞倍增时间有统计学差异（P＜0.05，表4），第二组细胞倍增时间也少于第三组，且两组之间的细胞倍增时间也有统计学差异（P＜0.05，表4）。这个结果表明第一组和第二组的MSCs与第三组相比，具有更快的细胞倍增能力。
表4 三个组MSCs的细胞倍增时间检测结果
6、克隆形成实验检测结果：
三种不同冻存方式下MSCs进行细胞克隆检测，结果显示第一组细胞克隆个数高于第三组，且两组之间的细胞克隆数有统计学差异（P＜0.05，表5），第二组细胞克隆个数高于第三组，且两组之间的细胞克隆数也有统计学差异（P＜0.05，表5）。这个结果表明第一组和第二组的MSCs与第三组相比，具有更快的细胞倍增能力。
表5 三个组MSCs的细胞克隆检测结果
7、抑制淋巴细胞增殖和活化实验检测结果：
三种不同冻存方式下MSCs进行抑制淋巴细胞增殖检测，结果显示第一组的淋巴细胞的增殖率低于第三组，且两组之间有统计学差异（P＜0.05，表6），第二组的淋巴细胞的增殖率低于第三组，且两组之间有统计学差异（P＜0.05，表6）。这个结果表明第一组和第二组MSCs抑制淋巴细胞增殖的能力优于第三组。
三种不同冻存方式下MSCs进行抑制淋巴细胞活化检测，结果显示第一组淋巴细胞的CD25和CD69表达率均低于第三组，且两组之间有统计学差异（P＜0.05，表6），第二组淋巴细胞的CD25和CD69表达率均低于第三组，且两组之间均有统计学差异（P＜0.05，表6）。这个结果表明第一组和第二组MSCs抑制淋巴细胞活化的能力优于第三组。
表6 三个组MSCs抑制淋巴细胞增殖和活化实验检测结果
8、IDO检测结果：
IDO检测结果显示，在IFN-γ或IFN-γ+TNF-α处理48h后，三种不同冻存方式下MSCs均表达一定浓度的IDO。且第一组和第二组中MSCs的IDO活性均高于第三组（P<0.05）。这些结果表明，本发明的组织块和有核细胞冻存方式下，MSCs具有更强的免疫调节功能（表7）。
表7 三个组IDO活性的检测结果（pg/ml）
9、安全性检测结果：
三种不同冻存方式下MSCs进行安全检测，结果显示本发明的组织块和有核细胞冻存方式下，MSCs没有致瘤性和异常核型，具有非常高的生物安全性，且符合临床应用的微生物学安全性要求。
表8 安全性能检测结果
实施例2
验证不同冻存液对冻存效果的影响。
取检测合格的胎盘组织，剪切胎盘绒毛膜组织，10%聚维酮碘擦拭消毒，用含1%青链霉素PBS液重复漂洗2～3次，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，直至清洗液中无血污。将胎盘组织剪碎至1～2mm3组织块，按照重量平均分为两份，实验分为两组：
第一组：实施例1中使用的冻存液（DMSO：体积浓度10%，人血白蛋白：质量浓度10%，右旋糖酐40氯化钠注射液：质量浓度60%）。
第二组：优化的冻存液（DMSO：5%，蔗糖：30mM，甘油：1.25%，肌酸：6.5mM，异亮氨酸：7.5 mM，甘露醇：60 mM，人血白蛋白：10%，右旋糖酐40氯化钠注射液：60%）。
分别加入不同的冻存液，每个5ml的冻存管可以放入大约2-2.5g组织。使用程序降温仪降温后（降温程序：Step 1: -10°C /min to 4.0 °C，Step 2: -1.0 °C/min to −8.0°C，Step 3: -25.0 °C/min to −50 °C，Step 4: +10.0 °C/min to −14.0 °C，Step 5: -1.0 °C/min to −45 °C，Step 6: -10.0 °C/min to −90 °C，Step 7: End.），放入液氮中保存3个月后，取出冻存管，37℃快速融化，快速转移组织悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液+2IU/mL肝素钠）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，将组织块转移至培养瓶，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，5天后移去组织块，每3天更换新鲜培养基，当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。收集第1代和第5代的细胞悬液，加入0.4%台盼蓝溶液，在三分钟内按《全国临床检验操作规程》（第四版）白细胞计数方法分别计数活细胞和死细胞，计算细胞活率。分别计算第1代和第5代收获的胎盘MSCs细胞总数。
表9 两个组在第1代和第5代时收获MSCs的细胞总数（×106）
结果显示，在第1代（15天）时，第二组收获胎盘MSCs的细胞总数多于第一组（P<0.05），且第5代（28天）时，第二组收获胎盘MSCs的细胞总数也多于第一组（P<0.05）。这些结果表明，实施例2中优化的冻存液冻存胎盘样本的效果优于实施例1中使用的冻存液（表9）。
细胞冻存剂DMSO是目前最好的细胞冻存保护剂，但又有一定的毒性。一般使用时浓度控制在终体积10%，降低DMSO会影响细胞的冻存效果，本发明通过优化冻存液，降低DMSO的浓度，同时也提高了冻存效果。
实施例3
平衡液对冻存的影响。
取检测合格的胎盘组织，剪切胎盘绒毛膜组织，10%聚维酮碘擦拭消毒，用含1%青链霉素PBS液重复漂洗2～3次，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，直至清洗液中无血污。将胎盘组织剪碎至1～2mm3组织块，按照重量平均分为两份，实验分为两组，分别进行不同操作：
第一组：
1、加入2倍体积的消化液，在37℃温和搅拌消化60分钟，2500r/min离心10min，弃上清，用PBS洗涤2次，1200r/min离心5min，过200目筛网，收集细胞，即获得人胎盘有核细胞。
消化液：透明质酸酶：2U/mL，胶原酶：200U/mL，分散酶：80 U/mL。
2、将胎盘有核细胞放入含有4ml冻存液的5ml的冷冻管中，每个冻存管可以放入大约8×106有核细胞。
冻存液：DMSO：8%，蔗糖：100mM，甘油：0.5%，肌酸：20mM，异亮氨酸：2.5 mM，甘露醇：200 mM，人血白蛋白：5%，右旋糖酐40氯化钠注射液：80%。
第二组：
1、加入2倍体积的消化液，在37℃温和搅拌消化60分钟，2500r/min离心10min，弃上清，用PBS洗涤2次，1200r/min离心5min，过200目筛网，收集细胞，即获得人胎盘有核细胞。
消化液：透明质酸酶：2U/mL，胶原酶：200U/mL，分散酶：80 U/mL。
2、将胎盘有核细胞放入含有4ml平衡液的5ml的冷冻管中，每个冻存管可以放入大约8×106有核细胞。在室温放置45分钟，然后4°C放置15分钟。
平衡液：蔗糖：100mM，甘油：0.5%，肌酸：20mM，异亮氨酸：2.5 mM，甘露醇：200 mM，人血白蛋白：5%，右旋糖酐40氯化钠注射液：80%。
3、加入1倍体积的冻存液。
冻存液：DMSO：8%，蔗糖：100mM，甘油：0.5%，肌酸：20mM，异亮氨酸：2.5 mM，甘露醇：200 mM，人血白蛋白：5%，右旋糖酐40氯化钠注射液：80%。
使用程序降温仪降温后（降温程序：Step 1: -10°C /min to 4.0 °C, Step 2: -1.0 °C/min to −8.0 °C, Step 3: -25.0 °C/min to −50 °C, Step 4: +10.0 °C/minto −14.0 °C, Step 5: -1.0 °C/min to −45 °C, Step 6: -10.0 °C/min to −90 °C,Step 7: End.），放入液氮中保存3个月后，取出冻存管，37℃快速融化，快速转移细胞悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液+2IU/mL肝素钠）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，以5×104/cm2密度将细胞接种于无菌的培养瓶中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，72h后移去未贴壁细胞，每3天更换新鲜培养基。当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。收集第1代和第5代的细胞悬液，加入0.4%台盼蓝溶液，在三分钟内按《全国临床检验操作规程》（第四版）白细胞计数方法分别计数活细胞和死细胞，计算细胞活率。分别计算第1代和第5代收获的胎盘MSCs细胞总数。
表10 两个组不同代数收获MSCs的细胞总数（×106）
结果显示，在第1代（10天）时，第二组收获胎盘MSCs的细胞总数多于第一组（P<0.05），且第5代（25天）时，第二组收获胎盘MSCs的细胞总数也多于第一组（P<0.05）。这些结果表明，实施例3中在冻存胎盘有核细胞之前加入平衡液的效果优于直接冻存的效果（表10）。
实施例4
不同的复苏方法的影响。
取检测合格的胎盘组织，剪切胎盘绒毛膜组织，10%聚维酮碘擦拭消毒，用含1%青链霉素PBS液重复漂洗2～3次，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，直至清洗液中无血污。将胎盘组织剪碎至1～2mm3组织块。
1、加入2倍体积的消化液，在37℃温和搅拌消化60分钟，2500r/min离心10min，弃上清，用PBS洗涤2次，1200r/min离心5min，过200目筛网，收集细胞，即获得人胎盘有核细胞。
消化液：透明质酸酶：8U/mL，胶原酶：20U/mL，分散酶：20 U/mL。
2、将胎盘有核细胞放入含有4ml平衡液的5ml的冷冻管中，每个冻存管可以放入大约8×106有核细胞。在室温放置45分钟，然后4°C放置15分钟。
平衡液：蔗糖：10mM，甘油：4 %，肌酸：3 mM，异亮氨酸：20 mM，甘露醇：30 mM，人血白蛋白：20%，右旋糖酐40氯化钠注射液：30%。
3、加入4ml的冻存液。
冻存液： DMSO：6%，蔗糖：10mM，甘油：4 %，肌酸：3 mM，异亮氨酸：20 mM，甘露醇：30mM，人血白蛋白：20%，右旋糖酐40氯化钠注射液：30%。
使用程序降温仪降温后（降温程序：Step 1: -10°C /min to 4.0 °C, Step 2: -1.0 °C/min to −8.0 °C, Step 3: -25.0 °C/min to −50 °C, Step 4: +10.0 °C/minto −14.0 °C, Step 5: -1.0 °C/min to −45 °C, Step 6: -10.0 °C/min to −90 °C,Step 7: End.），放入液氮中保存3个月后，采用不同的复苏方法进行细胞复苏：
第一组：取出冻存管，37℃快速融化，快速转移细胞悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液+2IU/mL肝素钠）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，以5×104/cm2密度将细胞接种于无菌的培养瓶中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，72h后移去未贴壁细胞，每3天更换新鲜培养基。当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。
第二组：取出冻存管，放于37℃恒温水浴箱中3分钟，1500r/min离心5min，除去冻存液后，加入4ml的平衡液（蔗糖：10mM，甘油：4 %，肌酸：3 mM，异亮氨酸：20 mM，甘露醇：30mM，人血白蛋白：20%，右旋糖酐40氯化钠注射液：30%），在室温放置30分钟，1500r/min离心5min，除去上清。然后加入1倍体积的平衡液和完全培养基的混合物（体积比为1：1），在室温放置30分钟，1500r/min离心5min，除去上清。快速转移细胞悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液+2IU/mL肝素钠）的无菌离心管内，离心洗涤2～3次，以5×104/cm2密度将细胞接种于无菌的培养瓶中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱内培养，72h后移去未贴壁细胞，每3天更换新鲜培养基。当细胞生长至约80%融合时，以2×103/cm2密度进行传代培养。
收集第1代和第5代的细胞悬液，加入0.4%台盼蓝溶液，在三分钟内按《全国临床检验操作规程》（第四版）白细胞计数方法分别计数活细胞和死细胞，计算细胞活率。分别计算第1代和第5代收获的胎盘MSCs细胞总数。
表11 两个组不同代数收获MSCs的细胞总数（×106）
结果显示，在第1代（10天）时，第二组收获胎盘MSCs的细胞总数多于第一组（P<0.05），且第5代（25天）时，第二组收获胎盘MSCs的细胞总数也多于第一组（P<0.05）。这些结果表明，实施例四中细胞复苏方法的效果优于直接快融的效果（表11）。
实施例5
按照下表的浓度配制平衡液和冻存液，DMSO、甘油为体积分数，白蛋白和右旋糖酐40氯化钠注射液为质量分数。
表12 不同组平衡液和冻存液的配制浓度
1、取检测合格的胎盘组织，剪切胎盘绒毛膜组织，10%聚维酮碘擦拭消毒，用含1%青链霉素PBS液重复漂洗2～3次，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，直至清洗液中无血污。将胎盘组织剪碎至1～2mm3组织块，加入2倍体积的消化液（透明质酸酶：2U/mL，胶原酶：200U/mL，分散酶：80 U/mL），在37℃温和搅拌消化60分钟，2500r/min离心10min，弃上清，用PBS洗涤2次，1200r/min离心5min，过200目筛网，收集细胞，即获得人胎盘有核细胞。
2、将胎盘有核细胞放入含有4ml平衡液的5ml的冷冻管中，每个冻存管可以放入8×106有核细胞。在室温放置45分钟，然后4°C放置15分钟。
3、加入1倍体积的冻存液。
4、使用程序降温仪降温后（降温程序：Step 1: -10°C /min to 4.0 °C, Step 2:-1.0 °C/min to −8.0 °C, Step 3: -25.0 °C/min to −50 °C, Step 4: +10.0 °C/minto −14.0 °C, Step 5: -1.0 °C/min to −45 °C, Step 6: -10.0 °C/min to −90 °C,Step 7: End.），放入液氮保存3个月；
5、取出冻存管，放于37℃恒温水浴箱中3分钟，1500r/min离心5min，除去冻存液后，加入4ml的平衡液，在室温放置30分钟，1500r/min离心5min，除去上清。然后加入1倍体积的平衡液和完全培养基的混合物（体积比为1：1），在室温放置30分钟，1500r/min离心5min，除去上清。快速转移细胞悬液至含有培养基（IMDM基础培养基+5%血小板裂解液+2IU/mL肝素钠）的无菌离心管内，加入0.4%台盼蓝溶液，在三分钟内按《全国临床检验操作规程》（第四版）白细胞计数方法分别计数细胞数量和活率。细胞得率为冻存后细胞数量/冻存前细胞数量。
表13 不同组的细胞活率（%）和细胞得率（%）
结果显示，每组的细胞活率均大于80%。这些结果表明，实施例5中不同配比的平衡液和冻存液均可用于冻存胎盘有核细胞（表13）。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种冻存保护剂，其特征在于，其包括平衡液和冻存液；
所述平衡液由以下组分组成，组分的终浓度如下：5~300mM蔗糖，体积分数为0.5%~5%的甘油，2.5~25mM肌酸，2.5~25mM异亮氨酸，25~250mM甘露醇，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；
所述冻存液由以下组分组成，组分的终浓度如下：体积分数为5%~10%的DMSO，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
2.冻存保护剂，其特征在于，其包括平衡液和冻存液；
所述平衡液由以下组分组成，组分的终浓度如下：5~300mM蔗糖，体积分数为0.5%~5%的甘油，2.5~25mM肌酸，2.5~25mM异亮氨酸，25~250mM甘露醇，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液；
所述冻存液由以下组分组成，组分的终浓度如下：体积分数为5%~10%的DMSO，5~300mM蔗糖，体积分数为0.5%~5%的甘油，2.5~25mM肌酸，2.5~25mM异亮氨酸，25~250mM甘露醇，质量分数为5%~20%的白蛋白或血清，以及质量分数为30%~80%的右旋糖酐40氯化钠注射液。
3. 根据权利要求1或2所述的冻存保护剂，其特征在于，所述冻存保护剂还包括消化液，所述消化液包括的组分及其终浓度如下：1U/mL～10U/mL透明质酸酶，2.5U/mL～250U/mL胶原酶，10 U/mL～100U/mL分散酶，5mM～300 mM蔗糖，0.50%～5%甘油，2.5mM～25 mM肌酸，2.5 mM～25 mM异亮氨酸，25 mM～250 mM甘露醇。
4.一种用于胎盘组织和/或其有核细胞的试剂盒，其特征在于，其包括：权利要求1~3任一项所述的冻存保护剂。
5.一种胎盘组织或其有核细胞的冻存方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1~3任一项所述的冻存保护剂对胎盘组织块或其有核细胞进行冻存：将胎盘组织块或其分离消化获得的有核细胞置于冻存液中降温保存；或，将胎盘组织块或其分离消化获得的有核细胞置于平衡液中静置后，再置于冻存液中降温保存。
6.根据权利要求5所述的胎盘组织或其有核细胞的冻存方法，其特征在于，在所述平衡液中静置的条件包括：室温放置30~50min，0~8℃放置1~20min；
所述冻存液和/或平衡液的体积为胎盘组织块或其分离消化获得的有核细胞体积的0.5~2倍。
7.根据权利要求5或6所述的胎盘组织或其有核细胞的冻存方法，其特征在于，消化胎盘组织的有核细胞的消化液为权利要求3中所述的消化液。
8.一种胎盘组织的细胞组织库的构建方法，其特征在于，其包括：采用权利要求5~7任一项所述的冻存方法对胎盘组织块和/或其有核细胞进行冻存，并对冻存后的胎盘组织块和/或其有核细胞进行复苏。
9.根据权利要求8所述的胎盘组织的细胞组织库的构建方法，其特征在于，对冻存后的胎盘组织块的复苏的步骤包括：将冻存的胎盘组织块解冻溶解，离心去除上清；在离心后的产物中添加0.5~2倍体积的权利要求1中所述的平衡液，放置10~40min后，添加0.5~2倍体积的平衡液和完全培养基的混合物，放置10~40min；添加完全培养基洗涤，离心去上清后，对胎盘组织块中的细胞进行培养，扩增获得细胞；
对冻存后的胎盘组织块的有核细胞的复苏的步骤包括：将冻存的胎盘组织块的有核细胞解冻溶解，离心去除上清；在离心后的产物中添加0.5~2倍体积的权利要求1中所述的平衡液，放置10~40min，离心后添加0.5~2倍体积的平衡液和完全培养基的混合物，放置10~40min；添加完全培养基洗涤，离心去上清后，对有核细胞进行培养，扩增获得细胞。
10.根据权利要求9所述的胎盘组织的细胞组织库的构建方法，其特征在于，所述混合物中，平衡液和完全培养基的体积比为（0.5~1.5）：1。
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