CN111494420A - 人脐带间充质干细胞注射液、制备方法及其应用 - Google Patents

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CN111494420A CN202010448686.6A CN202010448686A CN111494420A CN 111494420 A CN111494420 A CN 111494420A CN 202010448686 A CN202010448686 A CN 202010448686A CN 111494420 A CN111494420 A CN 111494420A
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Abstract

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞注射液，所述本发明的人脐带间充质干细胞注射液由人脐带间充质干细胞和冻存液组成，所述冻存液由人血白蛋白、临床级二甲基亚砜和复方电解质注射液组成。所述人脐带间充质干细胞注射液的活细胞密度控制为0.5×106‑2×106个/毫升，有利于所述人脐带间充质干细胞注射液在经过冻存和复苏后的细胞活率仍能达90％以上，以有利于治疗效果；控制人血白蛋白和临床级二甲基亚砜的含量分别为3‑20％以及5‑10％，使得所述人脐带间充质干细胞注射液能够直接用于注射，且经至少72小时的冻存后仍能安全使用并有利于取得良好的治疗效果。本发明还提供了所述人脐带间充质干细胞注射液的制备方法以及在肝衰竭治疗方面的应用。

Description

人脐带间充质干细胞注射液、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及人脐带间充质干细胞注射液、制备方法及其应用。
背景技术
肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，导致肝脏合成、代谢、解毒和生物转化等功能严重受损，使体内大量有毒物质蓄积，引起凝血功能障碍、高胆红素血症、肝性脑病和腹水等为主要表现的一组临床症候群，其治疗困难，病死率极高。
与原位肝移植相比，肝细胞移植治疗以其安全可靠、低免疫原性、来源广泛、手术难度小、治疗费用低等优势逐渐成为治疗肝病的新兴手段。人脐带间充质干细胞在体外具有分化为肝干细胞和肝细胞的能力，且来源丰富，可在体外进行分离、培养，扩增迅速且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能，可为实验和临床提供充足的细胞来源。
公开号为CN102228475A的中国发明专利申请公开了一种预防或治疗肝硬化的干细胞复合药物，该药物的活性成分为人脐带间充质干细胞和低抗凝肝素，能够降低患者血清中的谷丙转氨酶、透明质酸、IV型胶原和层粘连蛋白的含量。然而，低抗凝肝素是用于预防血凝块形成的成分，而肝硬化的患者由于肝功能受损而缺乏凝血因子并具有凝血功能障碍，应用低抗凝肝素会加重肝硬化患者出血风险。
因此，有必要开发新型的人脐带间充质干细胞注射液以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用于肝衰竭治疗的人脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用，以直接用于注射并提高使用安全性。
为实现上述目的，本发明的人脐带间充质干细胞注射液由人脐带间充质干细胞和冻存液组成，所述冻存液由人血白蛋白、临床级二甲基亚砜和复方电解质注射液组成；所述人脐带间充质干细胞的活细胞密度为0.5×106-2×106个/毫升；所述冻存液中，所述人血白蛋白占所述冻存液的质量百分比为3-20％，所述临床级二甲基亚砜占所述冻存液的质量百分比为5-10％，余量为所述复方电解质注射液。
本发明的所述人脐带间充质干细胞注射液的有益效果在于：所述人脐带间充质干细胞注射液的活细胞密度控制为0.5×106-2×106个/毫升，有利于所述人脐带间充质干细胞注射液在经过冻存和复苏后的细胞活率仍能达90％以上，以有利于治疗效果；控制所述冻存液中的所述人血白蛋白占所述冻存液的质量百分比为3-20％、所述临床级二甲基亚砜占所述冻存液的质量百分比为5-10％，使得所述人脐带间充质干细胞注射液能够直接用于注射，且经至少72小时的冻存后仍能安全使用并有利于取得良好的治疗效果。
优选的，所述人血白蛋白占所述冻存液的质量百分比为3-15％。其有益效果在于：降低人脐带间充质干细胞在冻存过程中的损害，并有助于降低复苏时二甲基亚砜对细胞产生的毒性。
本发明的所述人脐带间充质干细胞注射液在肝衰竭治疗方面的应用包括：使用稀释液对所述人脐带间充质干细胞注射液进行重悬处理，使得到的重悬注射液的活细胞密度为3×106-4×106个/毫升，然后将所述重悬注射液应用于药物诱导的肝衰竭动物模型。其有益效果在于：调节活细胞密度为3×106-4×106个/毫升以达到起效浓度，以利于取得良好的治疗效果。
优选的，所述稀释液为生理盐水和所述冻存液中的任意一种。其有益效果在于：以利于直接注射使用。
进一步优选的，所述注射结束的6小时后，所述药物诱导的肝衰竭动物模型血样中的谷丙转氨酶含量、谷草转氨酶含量以及乳酸脱氢酶均下降至少20％，所述注射结束的5小时内，所述药物诱导的肝衰竭动物模型的生存率不低于90％。
进一步优选的，提供实验动物，向所述实验动物注入D-(+)-半乳糖胺盐酸盐溶液和脂多糖溶液，并控制每公斤所述实验动物注入300毫克D-(+)-半乳糖胺盐酸盐以及20微克所述脂多糖，以建立所述药物诱导的肝衰竭动物模型。
本发明的所述人脐带间充质干细胞注射液的制备方法包括：获取人脐带组织，对所述人脐带组织顺次进行接种培养、传代培养和重组酶解离后，得到人脐带间充质干细胞，然后使用所述冻存液对所述人脐带间充质干细胞进行重悬以调整所述人脐带间充质干细胞的活细胞密度为0.5×106-2×106个/毫升，得到所述人脐带间充质干细胞注射液。
本发明的所述人脐带间充质干细胞注射液的制备方法的有益效果在于：控制所述人脐带间充质干细胞注射液的活细胞密度为0.5×106-2×106个/毫升，有利于所述人脐带间充质干细胞注射液在经过冻存和复苏后的细胞活率仍能达90％以上，以有利于治疗效果；使用所述冻存液重悬以使得所述人脐带间充质干细胞注射液能够直接用于注射，且经一定时间的冻存后仍能安全使用并取得良好的治疗效果。
优选的，将所述人脐带间充质干细胞注射液进行程序降温处理至-80摄氏度后保存至少12小时，然后置于-135摄氏度下冻存，形成冻存注射液。其有益效果在于：利于最大限度维持活细胞的活率以及利于长期储存。
优选的，所述接种培养使用的接种培养基由α-MEM和胎牛血清组成，所述接种培养基中，所述α-MEM的质量百分比为80-95％，所述胎牛血清的质量百分比为5-20％。其有益效果在于：有助于促进人脐带间充质干细胞的增殖。
进一步优选的，所述接种培养的时间为18-21天，以获得细胞融合率不低于60％的初代细胞。
进一步优选的，对所述初代细胞进行至少5次传代扩增，以完成所述传代培养并使获得的细胞的细胞融合率不低于80％。
附图说明
图1为本发明实施例的不同复苏注射液和参比样的细胞活率对比图；
图2为本发明实施例的接种培养过程中的增殖细胞的形态图；
图3为本发明实施例的P5代细胞的形态图；
图4为本发明实施例的冻存注射液在37摄氏度下融化后取出并在室温下静置1小时后进行72小时的接种培养所得到的细胞的形态图；
图5a为本发明实施例的健康小鼠的HE染色病理切片检测结果；
图5b为本发明实施例的注射冻存液的小鼠的HE染色病理切片检测结果；
图5c为本发明实施例的注射人脐带间充质干细胞注射液的小鼠的HE染色病理切片检测结果；
图6a为本发明实施例的健康小鼠的Ki67染色病理切片检测结果；
图6b为本发明实施例的注射冻存液的小鼠的Ki67染色病理切片检测结果；
图6c为本发明实施例的注射人脐带间充质干细胞注射液的小鼠的Ki67染色病理切片检测结果；
图7为本发明实施例的注射人脐带间充质干细胞注射液的不同小鼠以及注射冻存液的小鼠的生存率对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明实施例的主要试剂来源如下：
人血白蛋白来源于德国杰特贝林制药有限公司，临床级二甲基亚砜、胎牛血清、胰酶、脂多糖和D-(+)-半乳糖胺盐酸盐来源于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，复方电解质注射液来源于上海百特医疗用品有限公司，α-MEM来源于上海源培生物科技有限公司，TrypLETM Express Enzyme来源于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
针对现有技术存在的问题，本发明实施例提供了一种应用于肝衰竭治疗的人脐带间充质干细胞注射液。
本发明实施例中，所述人脐带间充质干细胞注射液由人脐带间充质干细胞和冻存液组成，以能够直接应用于注射，或者冻存和复苏后直接应用于注射。
具体的，所述冻存液由人血白蛋白、临床级二甲基亚砜和复方电解质注射液组成。
本发明一些实施例中，所述人脐带间充质干细胞的活细胞密度为0.5×106-2×106个/毫升，所述冻存液中，所述临床级二甲基亚砜占所述冻存液的质量百分比为5-10％，所述人血白蛋白占所述冻存液的质量百分比为3-20％，余量为所述复方电解质注射液。
本发明一些实施例中，所述人血白蛋白占所述冻存液的质量百分比为3-15％。
本发明实施例1-6中，每种人脐带间充质干细胞注射液的活细胞密度ρ1，人血白蛋白占冻存液的质量百分比W1以及临床级二甲基亚砜占冻存液的质量百分比W2请参见表1。
表1
实施例编号 1 2 3 4 5 6
ρ1/个.毫升<sup>-1</sup> 2×10<sup>6</sup> 2×10<sup>6</sup> 0.5×10<sup>6</sup> 1×10<sup>6</sup> 2×10<sup>6</sup> 2×10<sup>6</sup>
W1/％ 1 2 3 5 10 15
W2/％ 10 10 5 8 10 10
具体的，所述复方电解质注射液与哺乳动物的血液以及血液成分相容，有利于所述人脐带间充质干细胞在体内的运输。
更具体的，本发明实施例1-6的复方电解质注射液主要由氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁和水组成，每1000毫升所述复方电解质注射液中含有5.26克所述氯化钠，5.02克所述葡萄糖酸钠、2.22克所述醋酸钠、0.37克所述氯化钾以及0.14克所述氯化镁。
控制所述人脐带间充质干细胞的活细胞密度为0.5×106-2×106个/毫升，一方面有利于在后续的应用过程中通过适当的注射量达到能够实现良好治疗效果的起效浓度；另一方面，在后续对所述人脐带间充质干细胞注射液进行冻存和复苏后，能够使复苏的人脐带间充质干细胞仍能保持90％以上的活率，以利于实现良好的治疗效果。若活细胞密度过低，无法在后续的应用中达到良好的治疗效果。
若活细胞密度过高，冻存的过程中人脐带间充质干细胞之间相互影响，使得复苏后的活率下降，无法满足治疗的需求。本发明一些实施例的人脐带间充质干细胞注射液中的W1为15％，W2为10％，当ρ为3×106个.毫升-1，所述人脐带间充质干细胞注射液经72小时的冻存后复苏，得到的复苏人脐带间充质干细胞注射液的细胞活率低于90％。
对于二甲基亚砜而言，由于二甲基亚砜能够快速穿透细胞膜进入细胞中以降低冰点并延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度以减少细胞内冰晶的形成，因此常用于作为细胞的冻存保护剂使用，以减少细胞损伤。
二甲基亚砜具有一定的毒性，在细胞复苏的过程中，浓度过高的二甲基亚砜容易对细胞产生毒性，不利于细胞的活率和使用安全性。若所述临床级二甲基亚砜的含量过低，则达不到良好的冻存效果，同样也会影响细胞的细胞活率。本发明实施例控制所述临床级二甲基亚砜占所述冻存液的质量百分比为5-10％，能够在实现良好冻存效果的同时保证使用安全性。
人血白蛋白有助于避免或最大程度降低冻存过程对所述人脐带间充质干细胞的损害以及复苏过程中二甲基亚砜对细胞产生的毒性。
本发明一些实施例中，将所述人脐带间充质干细胞注射液进行程序降温处理至-80摄氏度后保存至少12小时，然后置于-135摄氏度下冻存，形成冻存注射液。
本发明一些实施例中，所述人脐带间充质干细胞注射液在-135摄氏度下冻存的时间至少为72小时。
本发明一些实施例中，所述人脐带间充质干细胞注射液在-135摄氏度下冻存的时间不超过3年，以保证使用安全性。
本发明实施例1-6中，所述程序降温处理至-80摄氏度后保存12小时，然后置于-135摄氏度下冻存2年，以分别形成六种冻存注射液。
所述程序降温处理在来源于赛默飞世尔科技有限公司的型号为7451TF的CryoMed程序降温仪中进行，具体的操作步骤为本领域技术人员的公知技术手段，在此不做赘述。
将本发明实施例1-6中的六种冻存注射液分别在37摄氏度下融化后取出，然后在室温下静置1小时后，以未经所述程序降温处理和-135摄氏度下冻存的人脐带间充质干细胞注射液作为参比样，统计得到的复苏注射液以及参比样的细胞活率，得到图1所示的六种复苏注射液和参比样的细胞活率对比图。
具体的，通过血球计数板进行计数台盼蓝拒染法测细胞活率，具体的测定和统计方法为本领域技术人员的常规技术手段，在此不作赘述。
参照表1和图1，本发明实施例1和实施例2的人脐带间充质干细胞注射液中的人血白蛋白含量低于3％，形成的复苏注射液的细胞活率均低于90％，无法满足应用的需求。而实施例3-6的人脐带间充质干细胞注射液中，通过调控人血白蛋白和临床级二甲基亚砜含量，形成的复苏注射液的细胞活率均不低于90％，在保证良好治疗效果的同时能够满足批量生产和满足不同供应时间的需求。
本发明实施例还提供了所述人脐带间充质干细胞注射液的制备方法，包括：获取人脐带组织，对所述人脐带组织顺次进行接种培养、传代培养和重组酶解离后，得到人脐带间充质干细胞，然后使用所述冻存液对所述人脐带间充质干细胞进行重悬以调整所述人脐带间充质干细胞的活细胞密度为0.5×106-2×106个/毫升，得到所述人脐带间充质干细胞注射液。
本发明实施例1-6中，所述人脐带组织的供体为健康新生儿，且产妇知悉脐带的用途并签署了知情同意书。对来源于上述健康新生儿的脐带进行人特定病毒检测，以进一步确认作为原料的脐带合格。
具体的，所述人特定病毒检测包括对HBV、HCV、HIV、HTLV、CMV、EB病毒、HPV和梅毒的检测，全部检测结果呈阴性。
具体的，使用无菌缓冲液对检测合格的脐带进行清洗以去除表面污渍，然后去除脐带中的动脉和静脉，再将脐带分割成体积为2-3立方毫米的碎块，以得到所述人脐带组织。
本发明一些实施例中，所述接种培养使用的接种培养基由α-MEM和胎牛血清组成。
具体的，所述接种培养基中，所述α-MEM的质量百分比为80-95％，所述胎牛血清的质量百分比为5-20％。
本发明实施例3-6的每种接种培养基中，α-MEM的质量百分比W3以及胎牛血清的质量百分比W4请参见表2。
表2
实施例编号 3 4 5 6
W3/％ 80 85 90 95
W4％ 20 15 10 5
本发明实施例3-6中的所述接种培养具体包括：将接种于无菌培养皿的若干所述人脐带组织置于温度为37摄氏度，二氧化碳浓度为5％且具有饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行所述接种培养，每48小时更换一次所述接种培养基。
本发明实施例3-6中，所述接种培养的时间为18-21天，以获得细胞融合率不低于60％的初代细胞，即P0代细胞。
本发明一些实施例中，所述接种培养结束后，对所述初代细胞进行至少5次传代扩增，以完成所述传代培养并使获得的细胞的细胞融合率不低于80％。
本发明实施例3-6中，所述传代培养具体包括：所述接种培养结束后，去除无菌培养皿中的液态物质，用生理盐水对无菌培养皿中的细胞进行洗涤，然后加入10mL浓度0.05w/v％的胰酶，以在温度为37℃，二氧化碳浓度为5％且具有饱和湿度的二氧化碳培养箱进行1分钟的消化处理；所述消化处理完成后，用10ml无血清完全培养基进行消化终止，对得到的消化产物在1000rpm的转速下离心5min，并去除上清液，以完成第一次传代扩增，得到P1代细胞；对所述P1代细胞用无血清完全培养基进行重悬，并按1:3进行传代种瓶，直至获得细胞融合率为80％的P5代细胞。
以本发明实施例6为例，所述接种培养和所述传代培养进行的过程中，分别取少量样品通过倒置荧光显微镜进行观察，得到的图2所示的接种培养中的增殖细胞的形态图和图3所示的P5代细胞的形态图。图2所示的增殖细胞经所述接种培养和所述传代培养后快速增殖和分化，得到的P5代细胞如图3所示呈现梭形且漩涡状分布。
本发明实施例3-6中，所述重组酶解离具体包括：将适量重组酶加入细胞融合率为80％的P5代细胞并在37℃孵育1-10分钟直至大部分细胞呈圆形、透亮且从培养皿底面脱离后，加入所述接种培养基以终止消化；用移液器轻轻吹打并收集全部的细胞悬液以在1000rpm转速下离心5分钟，然后去除上清液得到含有人脐带间充质干细胞的沉淀物。所述重组酶具体为胰蛋白酶和非动物源性的消化酶中的任意一种。
具体的，所述非动物源性的消化酶为TrypLETM Express Enzyme。
本发明一些实施例中，向所述沉淀物中加入所述冻存液重悬至所述人脐带间充质干细胞的活细胞密度为0.5×106-2×106个/毫升，以得到所述人脐带间充质干细胞注射液，对所述人脐带间充质干细胞注射液进行分装，以便后续的使用或冻存。
本发明实施例得到的所述人脐带间充质干细胞注射液在常温下为液态，能够呈现乳白色、半透明白色、无色透明和淡黄色中的任意一种颜色，且在-20摄氏度下呈现为淡黄色凝固态。
本发明实施例对实施例3-6中经所述重组酶解离后得到的不同沉淀物进行流式细胞分析，以考察CD90、CD105、CD73、CD19、CD34、CD45、CD14以及HLA-DR的表达水平。所述流式细胞分析的具体操作步骤请参见CN 110551684A，在此不做赘述。
具体的，以实施例6为例，CD73+、CD90+和CD105+的表达水平分别为94.7％、99.9％和94.1％，而HLA-DR+、CD19+、CD34+、CD45+以及CD14+的表达水平分别为0.036％、0.81％、0.072％、0.19％以及0.075％。实施例3、4和5的CD73+、CD90+和CD105+表达水平均不低于95％，HLA-DR+、CD19+、CD34+、CD45+以及CD14+的表达水平均不高于0.2％。由此可见，本发明实施例3-6提供的人脐带间充质干细胞符合国际细胞治疗协会(ISCT)对于间充质干细胞表面标记物规定的标准。
本发明实施例对实施例3-6中的四种冻存注射液在37摄氏度下融化后取出并在室温下静置1小时后进行72小时的所述接种培养，图4为得到的细胞的形态图。结果发现得到的细胞的细胞融合率均不低于80％，且参见图3和图4可知，即使将解冻后的所述人脐带间充质干细胞注射液室温下静置1小时，细胞仍能贴壁生长并呈梭形漩涡状分布，所述冻存液对细胞的活性和生长特性均无影响，说明本发明实施例的所述人脐带间充质干细胞注射液具有良好的使用安全性。
本发明实施例还提供了所述人脐带间充质干细胞注射液在肝衰竭治疗方面的应用，包括：使用稀释液对所述人脐带间充质干细胞注射液进行重悬处理，使得到的重悬注射液的活细胞密度为3×106-4×106个/毫升，然后将所述重悬注射液应用于药物诱导的肝衰竭动物模型。其中调节活细胞密度为3×106-4×106个/毫升以达到起效浓度，以利于取得良好的治疗效果。
本发明一些实施例中，所述人脐带间充质干细胞注射液形成的冻存注射液经解冻后，使用所述稀释液对所述人脐带间充质干细胞注射液进行所述重悬处理，使得到的所述重悬注射液的活细胞密度为3×106-4×106个/毫升。
本发明一些实施例中，所述稀释液为生理盐水和所述冻存液中的任意一种，以利于直接注射使用。
本发明实施例4-6的所述应用中，将所述冻存注射液置于37℃水浴中摇晃解冻至完全融化并混合均匀，然后在400g的离心力下离心10分钟后弃上清，用所述稀释液将沉淀稀释，得到不同的重悬注射液。不同的重悬注射液的活细胞密度ρ2以及使用的稀释液种类请参见表3。
表3
实施例编号 4 5 6
ρ2/个.毫升<sup>-1</sup> 3×10<sup>6</sup> 3.3×10<sup>6</sup> 4×10<sup>6</sup>
稀释液 生理盐水 冻存液 冻存液
本发明一些实施例的所述应用中，提供实验动物，向所述实验动物注入D-(+)-半乳糖胺盐酸盐溶液和脂多糖溶液，并控制每公斤所述实验动物注入300毫克D-(+)-半乳糖胺盐酸盐以及20微克所述脂多糖，以建立所述药物诱导的肝衰竭动物模型。
本发明实施例4-6的所述应用中，所述实验动物为健康的雄性C57/BL/6J小鼠，所述小鼠为SPF级，体重为20-22克，所述小鼠来源于上海灵畅生物科技有限公司，每个实施例使用8只小鼠。
具体的，对每只小鼠腹腔注射D-(+)-半乳糖胺盐酸盐溶液的3小时后再腹腔注射脂多糖溶液。
更具体的，所述D-(+)-半乳糖胺盐酸盐溶液主要由水、D-(+)-半乳糖胺盐酸盐和氯化钠组成，所述脂多糖溶液主要由水、脂多糖和氯化钠组成。使用生理盐水配置D-(+)-半乳糖胺盐酸盐溶液和脂多糖溶液，使得每毫升所述D-(+)-半乳糖胺盐酸盐溶液含有30毫克所述D-(+)-半乳糖胺盐酸盐，每100毫升水中含有0.9克所述氯化钠。每毫升所述脂多糖溶液含有2微克所述脂多糖，每100毫升水中含有0.9克所述氯化钠。
本发明实施例4-6的所述应用中，所述脂多糖溶液注射完毕的30分钟后，向每只小鼠尾静脉注射0.3毫升的重悬注射液。
本发明实施例还提供了对比例1和对比例2，对比例1和对比例2与实施例的所述应用的区别在于：对比例1使用生理盐水作为注射液，对比例2使用冻存液作为注射液。
本发明还提供了空白例，所述空白例的健康实验小鼠不做任何处理。
本发明实施例、对比例和空白例中，小鼠的饲养环境为：室温20～26℃，湿度40％～70％，光照12小时明暗交替。
本发明实施例4-6以及对比例1和2中，所述尾静脉注射结束的4小时和6小时后分别对小鼠进行异氟烷麻醉后眼眶取血，将得到的不同实施例血样和不同对比例血样分别置于抗凝管中并于7000rpm转速下离心5分钟后取上清，然后置于-20℃暂存。
本发明的空白例中，对健康实验小鼠进行异氟烷麻醉后眼眶取血，将得到的空白例血样分别置于抗凝管中并于7000rpm转速下离心5分钟后取上清，然后置于-20℃暂存。
分别检测所述静脉注射结束的4小时和6小时后得到的不同实施例血样、不同对比例血样以及空白例血样中的血液学指标，即乳酸脱氢酶(LD)、谷丙转氨酶(AST)和谷草转氨酶(ALT)含量，具体结果请分别参见表4和表5。具体的检测方法为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
表4
LD(U/L) AST(U/L) ALT(U/L)
对比例1 1457±320 701±165 753±212
对比例2 750±72 236±29 172±28
实施例4 802±102 330±57 266±64
实施例5 1003±56 240±25 166±33
实施例6 1494±65 354±52 90±15
空白例 255±42 81±15 86±15
表5
LDH(U/L) AST(U/L) ALT(U/L)
对比例1 3509±160 2314±36 2060±7
对比例2 1503±607 829±335 803±385
实施例4 802±102 330±57 266±64
实施例5 908±107 369±86 270±74
实施例6 908.4±227 290.2±54.6 430.8±135.2
参照表4和表5，实施例4-6中，注射所述人脐带间充质干细胞注射液的小鼠的ALT和AST水平在所述尾静脉注射结束的4小时后就有显著的下降，且所述尾静脉注射结束的6小时后，注射所述人脐带间充质干细胞注射液的小鼠的ALT、AST和LDH水平在对比例1和对比例2的相应血液学指标与空白例的相应血液学指标之间，且ALT、AST以及LD的含量相比对比例而言均下降至少20％，说明本发明实施例的所述人脐带间充质干细胞注射液有利于辅助肝脏功能的恢复。
本发明实施例5、实施例6和对比例2的小鼠在经所述尾静脉注射结束的6小时进行眼眶取血后安乐死，取肝脏组织进行HE染色病理切片检测和Ki67染色病理切片检测，另外对空白例的健康小鼠直接安乐死后取肝脏组织进行HE染色病理切片检测和Ki67染色病理切片检测。具体的染色和检测过程为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
具体的，图5a至图5c分别为对空白例的健康小鼠的肝脏组织、对比例2的注射所述冻存液的小鼠的肝脏组织和实施例5的注射所述人脐带间充质干细胞注射液的小鼠的肝脏组织的HE染色病理切片检测结果。参照图5a至图5c，与图5a的正常肝脏组织相比，实施例5和对比例2的小鼠肝脏组织均出现了肝索出血，图5b中黑色圆圈圈定的区域表明对比例2的小鼠的肝脏组织出现了较大范围的炎症细胞聚集，而图5c的黑色圆圈圈定的区域表明实施例5的小鼠的肝脏组织尽管出现了炎症细胞聚集，但炎症细胞的聚集程度低于对比例2，且主要聚集在血管周围，实施例5的实验小鼠经注射所述人脐带间充质干细胞注射液后肝脏组织的炎症细胞浸润程度要明显轻于对比例2的实验小鼠。
具体的，图6a至图6c分别为对空白例的健康小鼠的肝脏组织、对比例2的注射所述冻存液的小鼠的肝脏组织和实施例6的注射所述人脐带间充质干细胞注射液的小鼠肝脏组织的Ki67染色病理切片检测结果。参照图6a至图6c，与图6a的正常肝脏组织相比，对比例2的黑色箭头所示的分泌的增殖细胞核抗原明显少于图6a的黑色箭头所示的分泌的增殖细胞核抗原，实施例6和对比例2的小鼠肝脏组织均出现了肝索出血，而图6c的黑色箭头所示的分泌的增殖细胞核抗原要明显多于图6a的黑色箭头所示的分泌的增殖细胞核抗原，可见实施例6的实验小鼠经注射所述人脐带间充质干细胞注射液后肝脏组织的炎症细胞浸润程度要明显轻于对比例2的实验小鼠。
本发明实施例还使用卡普兰-迈尔(Kaplan-meier)法对实施例4-6、对比例1以及对比例2的小鼠在所述应用过程中的生存率进行了分析，具体的分析方法为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
以实施例5、实施例6和对比例2为例，图7为所述尾静脉注射结束后不同小鼠的生存率对比图。参照图7，所述尾静脉注射结束后的5小时内，实施例5和实施例6的经尾静脉注射所述人脐带间充质干细胞注射液的小鼠的生存率不低于90％，所述尾静脉注射结束后的5-7小时内，实施例5的小鼠的生存率没有变化，实施例6的小鼠的生存率略有下降，在所述尾静脉注射结束后的第6小时下降至略低于90％，而对比例2的注射生理盐水的小鼠的生存率在注射结束后的1小时内就下降至低于80％，所述尾静脉注射结束后的第6小时的生存率低于60％，说明本发明实施例的所人脐带间充质干细胞注射液应用于急性肝衰竭动物模型后，有助于缓解肝脏的损伤，以提高生存率。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (11)

1.一种人脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，应用于肝衰竭治疗，所述人脐带间充质干细胞注射液由人脐带间充质干细胞和冻存液组成，所述冻存液由人血白蛋白、临床级二甲基亚砜和复方电解质注射液组成；
所述人脐带间充质干细胞注射液的活细胞密度为0.5×106-2×106个/毫升；
所述冻存液中，所述人血白蛋白占所述冻存液的质量百分比为3-20％，所述临床级二甲基亚砜占所述冻存液的质量百分比为5-10％，余量为所述复方电解质注射液。
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，所述人血白蛋白占所述冻存液的质量百分比为3-15％。
3.一种如权利要求1-2中任一项所述的人脐带间充质干细胞注射液在肝衰竭治疗方面的应用，其特征在于，包括：
使用稀释液对所述人脐带间充质干细胞注射液进行重悬处理，使得到的重悬注射液中的人脐带间充质干细胞的活细胞密度为3×106-4×106个/毫升，然后将所述重悬注射液应用于药物诱导的肝衰竭动物模型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述稀释液为生理盐水和所述冻存液中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述注射结束的6小时后，所述药物诱导的肝衰竭动物模型血样中的谷丙转氨酶含量、谷草转氨酶含量以及乳酸脱氢酶均下降至少20％，所述注射结束的5小时内，所述药物诱导的肝衰竭动物模型的生存率不低于90％。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，提供实验动物，向所述实验动物注入D-(+)-半乳糖胺盐酸盐溶液和脂多糖溶液，并控制每公斤所述实验动物注入300毫克D-(+)-半乳糖胺盐酸盐以及20微克所述脂多糖，以建立所述药物诱导的肝衰竭动物模型。
7.一种如权利要求1-2中任一项所述的人脐带间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括：
获取人脐带组织，对所述人脐带组织顺次进行接种培养、传代培养和重组酶解离后，得到人脐带间充质干细胞，然后使用所述冻存液对所述人脐带间充质干细胞进行重悬以调整所述人脐带间充质干细胞的活细胞密度为0.5×106-2×106个/毫升，得到所述人脐带间充质干细胞注射液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将所述人脐带间充质干细胞注射液进行程序降温处理至-80摄氏度后保存至少12小时，然后置于-135摄氏度下冻存，形成冻存注射液。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述接种培养使用的接种培养基由α-MEM和胎牛血清组成，所述接种培养基中，所述α-MEM的质量百分比为80-95％，所述胎牛血清的质量百分比为5-20％。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述接种培养的时间为18-21天，以获得细胞融合率不低于60％的初代细胞。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，对所述初代细胞进行至少5次传代扩增，以完成所述传代培养并使获得的细胞的细胞融合率不低于80％。
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