CN105920042A - 具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液及其制备方法 - Google Patents

具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液及其制备方法，其包含如下数量或浓度的组分：脐带间充质干细胞：5×105～10×105/ml；人血白蛋白：2wt％；复方电解质溶液：98wt％。本发明生产出的脐带间充质干细胞可以快速地修复和替换受损的细胞和组织，具有扩增和定向分化的特性，细胞接收到受损部位信号会归巢到受损部位，在受损部位扩增并诱导分化及促进自身干细胞恢复功能，快速的修复和替换受损细胞和组织；及时迅速的分泌细胞因子、生长因子和组织相关因子，从而改善机体血液循环，增强代谢功能，提高组织修复能力、提高免疫力，从而到达抗衰老目的。

Description

具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液及其制备方法，属于细胞生物学技术领域。
背景技术
干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是形成生命机体各种组织器官的起源细胞。干细胞技术是生命科学技术领域最重要的技术之一，能够将细胞衍生成各种不同类型的细胞及其组织，从而产生一些全新的治疗技术，如干细胞移植、组织器官再造和基因治疗等，使人们能用自身或他人的健康干细胞及其衍生组织器官，来替代病变或衰老的组织器官。
根据其发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell)和成体干细胞(Adult stem cell)。后者可来自骨髓、外周血、脐血、脐带等，但脐带中的干细胞含量较丰富，也最容易获得。随着科学技术的发展进步，脐带间充质干细胞可在特定的条件下经刺激诱导分化为特化的细胞，应用于科研和临床。
衰老从细胞层面上可以解释为：所有个体都将发生的器官和功能衰退的渐进过程。人体是由具有不同功能的组织和器官构成，而不同的组织和器官又由多种不同的细胞组成。细胞更新换代和发育分化是生命发生、发展的关键因素。抗衰老最根本的途径是修复细胞、改善细胞代谢、激活潜在的人体干细胞的功能；及时对受损细胞、衰老细胞进行有效更新，使受损细胞得到修复，潜在的干细胞得到激活，生理功能才能由病态和亚健康状态完全恢复正常，人体才能保持健康和年轻。
干细胞是人体内具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是同种的起源细胞，是形成人体内各种组织、器官的原始细胞。随着年龄的增长，体内细胞的数量和质量也在逐渐下降，无法按照机体的需求新生出年轻健康细胞，并替换组织中衰老病变的细胞，导致人的衰老和疾病发生。所以增加、修复和替换体内的干细胞和提高细胞的活性，是抑制衰老、预防各种疾病和延长生命的关键。
脐带间充质干细胞是存在于脐带组织中的干细胞，具有高度自我更新的增殖和分化能力，在一定条件下可分化为心肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞等，修复和替换受损细胞，增强代谢功能；具有修复造血微环境，促进自身干细胞分化，分泌多种细胞生长因子支持组织结构修复，促进外周血液循环，使面色红润；而且脐带间充质干细胞取材广泛，易于分离和体外扩增；由于它具有免疫调节作用和较低的免疫原性，因此不仅抑制细胞的免疫功能，又不会引起同种异体免疫排斥反应，这些优势使它成为组织工程再生医学最理想的种子细胞。
目前最常用的抗衰老方法仅是针对抗衰老护肤，如羊胎素注射、肉毒素注射、激素使用、护肤精华素的使用等手段，都仅是局部的作用，而不是全身性的，不能预防和控制器官的衰老。而我们的方法，即具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，通过输注脐带间充质干细胞，不仅可以增加体内干细胞数量，而且可以激活处于休眠状态的干细胞，参与受到过氧化和代谢累积损伤的组织和器官的修复，干预自由基应激损伤使其恢复正常功能。骨髓多潜能干细胞分泌的因子也具有多重作用，分泌营养因子促进损伤组织内细胞增殖分化，恢复组织器官生理功能；分泌可溶性因子和直接接触调节免疫细胞增殖，降低机体的炎性反应；从而发挥抗衰老的作用。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其包含如下数量或浓度的组分：
脐带间充质干细胞： 5×105～10×105/ml；
人血白蛋白： 1～3wt％；
复方电解质溶液： 97～99wt％。
作为优选方案，每1000ml所述复方电解质溶液包含按重量计的如下主要组份：氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠2.22g、氯化钾0.37g、氯化镁0.14g。
作为优选方案，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
步骤一、脐带筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带，置于脐带保存液中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；
步骤二、脐带分离：将脐带转移到培养皿中，生理盐水清洗；去除两端结扎部位，剥除脐静脉和两条脐动脉；展平，撕下华通氏胶，去除羊膜；将撕下的华通氏胶置于离心管中剪碎至1～4mm3小块；
步骤三、间充质细胞原代培养：将剪碎的华通氏胶转至装有完全培养基的透气盖培养瓶中，在37℃、5v/v％CO2、饱和湿度环境中培养；细胞密度达约1g/T75瓶，第5天首次换液，此后每3天换液一次，至第14天左右；细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；
步骤四、传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为6000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，细胞数约为3×109～5×109，收集细胞并计数和活率，按2×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取1×107细胞做细胞表面标志检测；
步骤五、间充质干细胞表面标志、分化检测：按照ISCT间充质干细胞标准检测阳性指标以及阴性指标；对第三代细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；间充质干细胞表面标志、分化检测后，冷冻保存；
步骤六、临床用间干细胞使用：取冷冻细胞，复苏后用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
作为优选方案，步骤一中，所述脐带保存液为无血清培养基，不含抗生素。
作为优选方案，步骤一中，所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。
作为优选方案，步骤三中，所述胰蛋白酶的浓度为0.05wt％，是由0.25wt％成品胰酶稀释5倍得到的。
作为优选方案，步骤三中，所述完全培养基由基础培养基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例为10wt％；谷氨酰胺比例0.02mmol/ml。
作为优选方案，步骤四中，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
作为优选方案，步骤四中，所述冷冻保存所用细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度10v/v％。
第二方面，本发明还提供了一种如前述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液的制备方法，其包括如下步骤：
S1、取冷冻的脐带间充质干细胞，37℃水浴锅恒温解冻；
S2、用生理盐水洗涤两遍；
S3、统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按5×105～10×105/ml将细胞和复方电解质溶液、人血白蛋白、脐血血浆混匀待用本发明生产出的脐带间充质干细胞可以快速地修复和替换受损的细胞和组织，所用干细胞具有扩增和定向分化的独特功能；
以及迅速分泌细胞因子、生长因子和组织因子，改善机体血液循环，增强代谢功能，提高人体免疫力，从而达到抗衰老的目的。
本发明公开一种具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液及其制备方法，相比目前公开的各类具有抗衰老干细胞注射液制备方法中，我们采用不同来源和种类的干细胞，我们的材料来自于围产期附属物-脐带血。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级监控，以实现注射液符合临床标准产品。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、产品原材料选自围产期附属物，不存在骨髓来源的负面影响；
2、全过程全面质量监控，从脐带采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控；
3、无培养基，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏风险；
4、避免回输时红细胞引起的负面作用；
5、保持细胞的活性及干细胞的干性；
6、脐带间充质干细胞分化特性好，间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复；
7、活性强，能分泌很多分泌细胞因子、生长因子和组织因子，改善机体血液循环，增强代谢功能，提高人体免疫力，从而达到抗衰老的目的。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例2中衰老模型的建立及分组对比实验图；
图2为本发明中充质干细胞注射液对大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响结果；
图3为本发明中充质干细胞注射液对大鼠血清中丙二醛(MDA)含量的影响结果图；
图4为本发明中充质干细胞注射液对大鼠胸腺和脾脏中IL-2含量的影响结果图；
图5为本发明中充质干细胞注射液对大鼠胸腺和脾脏中IL-10含量的影响结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞提取方法，具体包括如下步骤：
步骤一、脐带筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带，置于脐带保存液中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；所述脐带保存液为无血清培养基，不含抗生素；所述筛选的检测项目包括携带病毒、遗传家族史等；所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等；
同时采集一管母血留作复检，复检项目为乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒免疫学检测及基因检测。
步骤二、脐带分离：将脐带转移到培养皿中，生理盐水清洗；去除两端结扎部位，剥除脐静脉和两条脐动脉；展平，撕下华通氏胶，去除羊膜；将撕下的华通氏胶置于离心管中剪碎至1～4mm3小块；脐带分离过程中的清洗液上清进行无菌检测，用血培养仪进行细菌和真菌检测，用PCR法进行支原体检测。
步骤三、间充质细胞原代培养：将剪碎的华通氏胶转至装有完全培养基的透气盖培养瓶中，在37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养；细胞密度达约1g/T75瓶，第5天首次换液，此后每3天换液一次，至第14天左右；细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；所述胰蛋白酶的浓度为0.05％，由0.25％成品胰酶稀释5倍；用于细胞消化过程，低浓度消化保持细胞活性和干细胞干性；所述完全培养基由基础培养基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例10％；谷氨酰胺比例0.02mmol/ml。
步骤四、传代培养：传代细胞接种密度约为6000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，细胞数约为3×109～5×109，收集细胞并计数和活率，按2×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测；所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
步骤五、间充质干细胞表面标志、分化检测：取1×107的细胞进行干细胞表面标志检测，按照ISCT间充质干细胞标准检测CD90、CD105、CD73三个阳性指标以及CD79-a、CD14、CD34、CD45、HLA-DR五个阴性指标，检测结果如表1所示；对第三代细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；间充质干细胞表面标志、分化检测后，冷冻保存。
表1
实施例2
本实施提供了一种具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤一、复苏检测合格的脐带间充质干细胞，37℃水浴锅2分钟；
步骤二、用临床注射级别盐水洗涤两遍；
步骤三、将2wt％的人血白蛋白溶解于复方电解质溶液；
步骤四、细胞计数、活率保持95％，按5×105～10×105/ml重悬于步骤三的复合液中。
本方法制备的脐带间充质干细胞注射液包含如下数量或浓度的组分：
脐带间充质干细胞： 5×105～10×105/ml；
人血白蛋白： 2wt％；
复方电解质溶液： 98wt％。
实施例3
本实施例涉及本发明的脐带间充质干细胞注射液对衰老模型大鼠输注的动物实验：
抗衰老指标测定包括：一、外观特征：体重，毛色，行动，和活跃度，二、生化指标：超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)的含量、胸腺和脾脏中IL-2、IL-10的含量、肝脏和肾脏比例。具体步骤如下：
步骤一，衰老模型建立及分组对比实验；
取6～8周龄SD大鼠24只，随机分8只为正常组，其余16只大鼠建立衰老模型。正常组的8只大鼠皮下注射生理盐水，每日一次，连续8周；其他16只大鼠进行致衰老注射，每日一次，皮下注射D-半乳糖120mg/kg，连续注射8周；
从第9周开始正常组尾静脉注射复方电解质溶液0.6ml，每日一次连续6周，作为空白对照；衰老模型里取8只作为治疗组，具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，每日0.6ml连续6周；余下的衰老组8只尾静脉注射复方电解质溶液0.6ml，每日一次连续6周，作为阳性对照，如图1所示。
步骤二，具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液
衰老模型制备成功后，治疗组的8只大鼠，在尾静脉注射0.6ml多潜能干细胞注射液，含3×105个细胞，每周一次，连续6周。同时，正常组、衰老模型组大鼠尾静脉注射0.6ml生理盐水，每周一次，连续6周。
步骤三，衰老指标的观测如表2所示：
表2三组小鼠治疗6周后外观特征
对照组 衰老组 实验组
体重(8只平均值) 349g 326g 353g
毛色 正常 枯黄 正常
行动 正常 迟缓 正常
活跃度 正常 低 正常
步骤四，衰老指标检测选择
目前应用于抗衰老评定的指标主要有抗氧化类物质和免疫功能的检测。细胞代谢产生的自由基，在衰老中起到重要作用。超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)是体内自由基防御体系中最重要的酶类抗氧化剂，它可直接清除超氧阴离子自由基，阻断自由基连锁反应，保护组织免受超氧阴离子自由基的损伤。SOD活力的高低间接反应机体抗氧化的能力，即反应机体抗衰老能力。氧自由基通过生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化作用引起细胞损伤，而且能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因此，检测丙二醛的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，IL-2活性水平直接反应T细胞的功能。IL-10是一种多能性的免疫调节因子，通过抑制其它细胞产生细胞因子和破坏Th1/Th2淋巴细胞的平衡来行使免疫抑制效应，体内半乳糖及其代谢物浓度异常升高会导致大鼠的肝脏、肾脏、脑组织、晶状体受累损伤，可以引发白内障、肝肿大、肝硬化。
本发明的抗衰老检测指标定为超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)的含量、胸腺和脾脏中IL-2、IL-10的含量、肝肿大、肝硬化。
步骤五，衰老指标检测
治疗6周后，取所有的三组的24只SD大鼠血清，测定各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量。方法如下：
1、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定用黄嘌呤氧化酶法，按照试剂盒说明进行。
原理：通过使用黄嘌呤(Xanthine)/黄嘌呤氧化酶(XOD)体系生成超氧化物阴离子。加入发色基团，发色基团可被由上述体系产生的氧化物阴离子还原成为水溶性的黄色甲染料，这样SOD活性通过抑制发生基团的还原来测定。
2、丙二醛(MDA)含量测定用硫代巴比妥酸比色法。
原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰，根据测定的OD值计算MDA的含量。
3、检测胸腺和脾脏中细胞因子IL-2、IL-10的含量用ELISA法。
原理：使用双抗体夹心ELISA法测定大鼠胸腺及脾脏中细胞因子的含量，取组织匀浆液，以3000rpm离心10min，取上清，如不立即检测，放入-80℃保存。操作按试剂盒说明书要求进行。
4、肝肿大、肝硬化。
方法：动物称重后，水合氯醛麻醉处死。无菌解剖取肝脏，无菌生理盐水洗去血迹，去掉多余的组织，用吸水纸吸干，看看有无明显的肿大和硬化现象。
步骤六、注射液的抗衰老效果
具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液对大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响结果如图2所示：与正常组比较，衰老模型组血清中SOD活性显著降低；治疗组与衰老模型组相比，血清中SOD活性显著升高。
2、本发明的脐带间充质干细胞注射液对大鼠血清中丙二醛(MDA)含量的影响结果如图3所示：与正常组比较，衰老模型组血清中MDA含量显著升高；治疗组与衰老模型组相比，血清MDA含量显著降低。
3、本发明的脐带间充质干细胞注射液对胸腺和脾脏中IL-2、IL-10含量的影响结果如图4和图5所示：治疗组与衰老模型组比较，胸腺和脾脏中IL-2含量显著升高，胸腺和脾脏中IL-10含量显著降低。
4、本发明的脐带间充质干细胞注射液对肝脏的影响如图表3所示，
表3脐带间充质干细胞注射液对肝脏的影响
对照组 衰老组 实验组
肝脏重量/小鼠重 0.00024 0.00034 0.000023
肝脏硬化程度 正常 硬化、有大量晶状体 正常、有小许晶状体
综上所述及检测结果显示，具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液能显著改善大鼠的衰老状态。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，包含如下数量或浓度的组分：
脐带间充质干细胞： 5×105～10×105/ml；
人血白蛋白： 1～3wt％；
复方电解质溶液： 97～99wt％。
2.如权利要求1所述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，每1000ml所述复方电解质溶液包含按重量计的如下主要组份：氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠2.22g、氯化钾0.37g、氯化镁0.14g。
3.如权利要求1所述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
步骤一、脐带筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带，置于脐带保存液中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；
步骤二、脐带分离：将脐带转移到培养皿中，生理盐水清洗；去除两端结扎部位，剥除脐静脉和两条脐动脉；展平，撕下华通氏胶，去除羊膜；将撕下的华通氏胶置于离心管中剪碎至1～4mm3小块；
步骤三、间充质细胞原代培养：将剪碎的华通氏胶转至装有完全培养基的透气盖培养瓶中，在37℃、5v/v％CO2、饱和湿度环境中培养；细胞密度达约1g/T75瓶，第5天首次换液，此后每3天换液一次，至第14天左右；细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；
步骤四、传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为6000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，细胞数约为3×109～5×109，收集细胞并计数和活率，按2×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取1×107细胞做细胞表面标志检测；
步骤五、间充质干细胞表面标志、分化检测：按照ISCT间充质干细胞标准检测阳性指标以及阴性指标；对第三代细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；间充质干细胞表面标志、分化检测后，冷冻保存；
步骤六、临床用间干细胞使用：取冷冻细胞，复苏后用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。
4.根据权利要求3所述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，步骤一中，所述脐带保存液为无血清培养基，不含抗生素。
5.根据权利要求3所述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，步骤一中，所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。
6.根据权利要求3所述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，步骤三中，所述胰蛋白酶的浓度为0.05wt％。
7.根据权利要求3所述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，步骤三中，所述完全培养基由基础培养基和血清替代物以及谷氨酰胺配比而成，血清替代物比例为10wt％；谷氨酰胺比例0.02mmol/ml。
8.根据权利要求3所述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，步骤四中，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。
9.根据权利要求3所述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液，其特征在于，步骤四中，所述冷冻保存所用细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中，所述二甲基亚砜的终浓度10v/v％。
10.一种如权利要求1～9中任意一项所述的具有抗衰老功效的脐带间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取冷冻的脐带间充质干细胞，37℃水浴锅恒温解冻；
S2、用生理盐水洗涤两遍；
S3、统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按5×105～10×105/ml将细胞和复方电解质溶液、人血白蛋白混匀，得到所述脐带间充质干细胞注射液。
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