CN105816481A - 具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液及其制备方法，其包含如下数量或浓度的组分：脐血干细胞：5×10⁵～10×10⁵/ml；人血白蛋白：2wt％；脐血自体血浆：10～20v％；复方电解质溶液：78～88v％。本发明所用干细胞是血液类相关的干细胞，具有扩增和定向分化的特性，细胞接收到受损部位信号会归巢到受损部位，在受损部位扩增并诱导分化及促进自身干细胞恢复功能，快速的修复和替换受损细胞和组织；及时迅速的分泌细胞因子、生长因子和组织相关因子，从而改善机体血液循环，增强代谢功能，提高组织修复能力、提高免疫力，从而到达抗衰老目的。

Description

具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液及其制备方法，属于细胞生物学技术领域。

背景技术

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是形成生命机体各种组织器官的起源细胞。干细胞技术是生命科学技术领域最重要的技术之一，能够将细胞衍生成各种不同类型的细胞及其组织，从而产生一些全新的治疗技术，如干细胞移植、组织器官再造和基因治疗等，使人们能用自身或他人的健康干细胞及其衍生组织器官，来替代病变或衰老的组织器官。

根据其发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonicstemcell)和成体干细胞(Adultstemcell)。后者可来自骨髓、外周血、脐血等，但脐血中干细胞含量较丰富，也最容易获得。随着科学技术的发展进步，脐血干细胞可在特定的条件下经刺激诱导分化为特化的细胞，应用于科研和临床。(“人脐血干细胞的研究现状”，胃肠病学和肝病学杂志，2003，Vol,12,No.1)。

衰老从细胞层面上可以解释为：所有个体都将发生的器官和功能衰退的渐进过程。人体是由具有不同功能的组织和器官构成，而不同的组织和器官又由多种不同的细胞组成。细胞更新换代和发育分化是生命发生、发展的关键因素。抗衰老最根本的途径是修复细胞、改善细胞代谢、激活潜在的人体干细胞的功能；及时对受损细胞、衰老细胞进行有效更新，使受损细胞得到修复，潜在的干细胞得到激活，生理功能才能由病态和亚健康状态完全恢复正常，人体才能保持健康和年轻。

干细胞是人体内具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是同种的起源细胞，是形成人体内各种组织、器官的原始细胞。随着年龄的增长，体内细胞的数量和质量也在逐渐下降，无法按照机体的需求新生出年轻健康细胞，并替换组织中衰老病变的细胞，导致人的衰老和疾病发生。所以增加、修复和替换体内的干细胞和提高细胞的活性，是抑制衰老、预防各种疾病和延长生命的关键。

脐带血干细胞是存在于脐血组织结构中，具有高度自我更新的增殖和分化能力，在一定条件下可分化为造血干细胞、神经细胞等，修复和替换受损细胞，增强代谢功能；具有修复造血微环境，促进造血干细胞分化，分泌多种造血生长因子支持造血，改善贫血，促进外周血液循环，使四肢温暖、面色红润；而且脐带血干细胞取材广泛，易于分离和体外扩增；由于它具有免疫调节作用和较低的免疫原性，因此不仅促进细胞的免疫功能，又不会引起同种异体免疫排斥反应，这些优势使它成为组织工程再生医学最理想的种子细胞。

目前最常用的抗衰老方法仅是针对抗衰老护肤，如羊胎素注射、肉毒素注射、激素使用、护肤精华素的使用等手段，都仅是局部的作用，而不是全身性的，不能预防和控制器官的衰老。而我们的方法，即一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，通过输注脐带血干细胞，不仅可以增加体内干细胞数量，而且可以激活处于休眠状态的干细胞，参与受到过氧化和代谢累积损伤的组织和器官的修复，干预自由基应激损伤使其恢复正常功能。脐带血干细胞分泌的因子也具有多重作用，分泌营养因子促进损伤组织内细胞增殖分化，恢复组织器官生理功能；分泌可溶性因子和直接接触调节免疫细胞增殖，降低机体的炎性反应；从而发挥抗衰老的作用。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液及其制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，其包含如下数量或浓度的组分：

作为优选方案，每1000ml所述复方电解质溶液中包含按重量计的如下主要组分：氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠2.22g、氯化钾0.37g、氯化镁0.14g。

作为优选方案，所述脐血干细胞来自足月生产的、健康的脐血。

作为优选方案，所述脐血干细胞提取方法包括如下步骤：

步骤A，取适量分娩获得的脐带血，置于脐血保存袋中冷藏保存；

步骤B，脐血分离：将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细胞，(即第一步提出大部分血浆，第二步分离出有核细胞，分离出的有核细胞里有少量红细胞再用超纯水裂解)，以及保留分离出的血浆；采用高温消毒灭菌的超纯水去除红细胞，可以避免回输时红细胞引起的负面作用；

步骤C，脐血有核冻存：收集细胞并计数和活率，按3×10⁷/ml/管进行冷冻保存；并将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5×10⁶细胞做细胞表面标志检测；

步骤D，脐血单核细胞成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养；

步骤E，临床用脐血单核细胞使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。该冻存细胞复苏后红细胞会全部破碎，可以避免回输时红细胞引起的负面作用。

优选地，步骤A中，所述分离获得的脐带血通过筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带获得，所述筛选的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。所述病毒如乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等。

优选地，步骤A中，所述脐血保存袋只有标准量的血液抗凝剂，不含有血清培养基，不含抗生素。可维持脐血活性长达24小时，避免了临床应用时的抗生素过敏问题。

优选地，步骤A中，所述脐带血置于脐血保存袋中4℃冷藏保存，并在24小时内进行分离处理，这样做可有效的保证细胞活率。

优选地，步骤B中，所述两步离心法采用医用级别淋巴分离液。所述分离液成分明确，符合临床级别。

优选地，步骤C中，所述冷冻处理采用的细胞冷冻保护液由90％血浆和10％的二甲基亚砜(体积百分比)配制而成，保护细胞活性。所述血浆为自体血浆。我们采用脐血本身血浆作为冻存防护剂，可以避免其他动物源蛋白的影响，更符合临床标准。

优选地，步骤C中，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测；所述支原体检测包括用PCR法进行支原体检测。

第二方面，本发明还提供了一种如前述的具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液的制备方法，其包括如下步骤：

S1、取冷冻的脐血干细胞，37℃水浴锅恒温解冻；

S2、用生理盐水进行洗涤；

S3、统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按5×10⁵～10×10⁵/ml将细胞和复方电解质溶液、人血白蛋白和脐血自体血浆混匀，得到所述脐血干细胞注射液。

本发明公开一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液及其制备方法，相比目前公开的各类具有抗衰老干细胞注射液制备方法中，我们采用不同来源和种类的干细胞，我们的材料来自于围产期附属物-脐带血。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级监控，以实现注射液符合临床标准产品。

本发明生产出的脐血干细胞可以快速地修复和替换受损的细胞和组织，所用干细胞具有扩增和定向分化的独特功能；

以及迅速分泌细胞因子、生长因子和组织因子，改善机体血液循环，增强代谢功能，提高人体免疫力，从而达到抗衰老的目的。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、产品原材料选自围产期附属物，不存在骨髓来源的负面影响；

2、全过程全面质量监控，从脐带采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控；

3、无培养基，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏风险；

4、避免回输时红细胞引起的负面作用；

5、保持细胞的活性及干细胞的干性；

6、活性强，能分泌很多分泌细胞因子、生长因子和组织因子，改善机体血液循环，增强代谢功能，提高人体免疫力，从而达到抗衰老的目的。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明实施例3中衰老模型的建立及分组对比实验图；

图2为本发明中充质干细胞注射液对大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响结果；

图3为本发明中充质干细胞注射液对大鼠血清中丙二醛(MDA)含量的影响结果图；

图4为本发明中充质干细胞注射液对大鼠胸腺和脾脏中IL-2含量的影响结果图；

图5为本发明中充质干细胞注射液对大鼠胸腺和脾脏中IL-10含量的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液的制备。

具体包括如下步骤：

步骤一、脐血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带，置于脐血保存袋中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；

步骤二、脐血分离：将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出我们要的单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血浆。

步骤三、脐血有核冻存：收集细胞并计数和活率(细胞仪计数)，细胞计数结果如表1所示，按3×10⁷/ml/管进行冷冻保存，采用90％的血浆和10％的中二甲基亚砜作为冷冻保护剂；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5×10⁶细胞做细胞表面标志检测，检测结果如表2所示。

步骤四、一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液成分鉴定：脐血单个核细胞CD34/CD45抗原表达及HSC-CFU培养。细胞CD34表达和CFU集落形成结果如表3所示。

步骤五、一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液制作：取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。复苏后的细菌、内毒素检测以及细胞数和活率结果如表4所示。

表1冷冻前细胞计数仪计数结果

表2冻存前细胞无菌检测、支原体检测及细胞表面标志检测结果

检测指标	无菌检测	支原体检测	CD34/CD45的百分率	CFU-集落数
					样本1	合格	合格	0.90％	61个/105

表3细胞CD34表达和CFU集落形成结果

检测指标	CD34/CD45的百分率	CFU-集落数
			样本1	0.95％	56个/105

表4复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞数和活率

从表1和4的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的细胞总数(10.8×10⁷)和活率(95％)无明显下降。

实施例2一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液终产品制备

步骤一、复苏检测合格的脐血干细胞，37℃水浴锅2分钟，

步骤二、用临床注射级别盐水洗涤两遍，

步骤三、将2wt％的人血白蛋白和脐血自体血浆10～20v％溶解于复方电解质溶液，

步骤四、细胞计数、活率保持在95％，按5×10⁵～10×10⁵/ml重悬于步骤三的复合液中。

本方法制备的脐血干细胞注射液包含如下数量或浓度的组分：

脐血干细胞：5×10⁵～10×10⁵/ml；

人血白蛋白：2wt％；

脐血自体血浆：10～20v％；

复方电解质溶液：78～88v％。

实施例3：本实施例涉及本发明的脐带间充质干细胞注射液对衰老模型大鼠输注的动物实验：

抗衰老指标测定包括：一、外观特征：体重，毛色，行动，和活跃度，二、生化指标：超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)的含量、胸腺和脾脏中IL-2、IL-10的含量、肝脏和肾脏比例。具体步骤如下：

步骤一，衰老模型建立及分组对比实验

取6-8周龄SD大鼠24只，随机分8只为正常组，其余16只大鼠建立衰老模型。正常组的8只大鼠皮下注射生理盐水，每日一次，连续8周；其他16只大鼠进行致衰老注射，每日一次，皮下注射D-半乳糖120mg/kg，连续注射8周。

从第9周开始正常组尾静脉注射复方电解质溶液0.6ml，每日一次连续6周，作为空白对照；衰老模型里取8只作为治疗组，注射注具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，每日0.6ml连续6周；余下的衰老组8只尾静脉注射复方电解质溶液0.6ml，每日一次连续6周，作为阳性对照。构建的衰老模型如图1所示。

步骤二，注射具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液

衰老模型制备成功后，治疗组的8只大鼠，在尾静脉注射0.6ml多潜能干细胞注射液，含3×10⁵个细胞，每周一次，连续6周。同时，正常组、衰老模型组大鼠尾静脉注射0.6ml生理盐水，每周一次，连续6周。

步骤三，衰老指标的观测，结果如表5所示。

表5三组小鼠治疗6周后外观特征

	对照组	衰老组	实验组
				体重(8只平均值)	360g	326g	356g
毛色	正常	枯黄	正常
				行动	正常	迟缓	正常
活跃度	正常	低	正常

步骤四，衰老指标检测选择

目前应用于抗衰老评定的指标主要有抗氧化类物质和免疫功能的检测。细胞代谢产生的自由基，在衰老中起到重要作用。超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)是体内自由基防御体系中最重要的酶类抗氧化剂，它可直接清除超氧阴离子自由基，阻断自由基连锁反应，保护组织免受超氧阴离子自由基的损伤。SOD活力的高低间接反应机体抗氧化的能力，即反应机体抗衰老能力。氧自由基通过生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化作用引起细胞损伤，而且能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因此，检测丙二醛的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，IL-2活性水平直接反应T细胞的功能。IL-10是一种多能性的免疫调节因子，通过抑制其它细胞产生细胞因子和破坏Th1/Th2淋巴细胞的平衡来行使免疫抑制效应，体内半乳糖及其代谢物浓度异常升高会导致大鼠的肝脏、肾脏、脑组织、晶状体受累损伤，可以引发白内障、肝肿大、肝硬化。

本发明的抗衰老检测指标定为超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)的含量、胸腺和脾脏中IL-2、IL-10的含量、肝肿大、肝硬化。

步骤五，衰老指标检测

治疗6周后，取所有的三组的24只SD大鼠血清，测定各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量。方法如下：

1、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定用黄嘌呤氧化酶法，按照试剂盒说明进行。

原理：通过使用黄嘌呤(Xanthine)/黄嘌呤氧化酶(XOD)体系生成超氧化物阴离子。加入发色基团，发色基团可被由上述体系产生的氧化物阴离子还原成为水溶性的黄色甲染料，这样SOD活性通过抑制发生基团的还原来测定。

2、丙二醛(MDA)含量测定用硫代巴比妥酸比色法。

原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰，根据测定的OD值计算MDA的含量。

3、检测胸腺和脾脏中细胞因子IL-2、IL-10的含量用ELISA法。

原理：使用双抗体夹心ELISA法测定大鼠胸腺及脾脏中细胞因子的含量，取组织匀浆液，以3000rpm离心10min，取上清，如不立即检测，放入-80℃保存。操作按试剂盒说明书要求进行。

4、肝肿大、肝硬化。

方法：动物称重后，水合氯醛麻醉处死。无菌解剖取肝脏，无菌生理盐水洗去血迹，去掉多余的组织，用吸水纸吸干，看看有无明显的肿大和硬化现象。

步骤六、注射液的抗衰老效果

1、具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液对大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响结果如图2所示：与正常组比较，衰老模型组血清中SOD活性显著降低；治疗组与衰老模型组相比，血清中SOD活性显著升高。

2、具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液对大鼠血清中丙二醛(MDA)含量的影响结果如图3所示：与正常组比较，衰老模型组血清中MDA含量显著升高；治疗组与衰老模型组相比，血清MDA含量显著降低。

3、具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液对胸腺和脾脏中IL-2、IL-10含量的影响结果如图4和图5所示：治疗组与衰老模型组比较，胸腺和脾脏中IL-2含量显著升高，胸腺和脾脏中IL-10含量显著降低。

4、具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液对肝脏的影响，结果如表6所示。

表6

	对照组	衰老组	实验组
				肝脏重量/小鼠重	0.00025	0.00031	0.000024
肝脏硬化程度	正常	硬化、有大量晶状体	正常、有小许晶状体

综上所述及检测结果显示，具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液能显著改善大鼠的衰老状态。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，其特征在于，包含如下数量或浓度的组分：

2.如权利要求1所述的具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，其特征在于，每1000ml所述复方电解质溶液中包含按重量计的如下主要组分：氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠2.22g、氯化钾0.37g、氯化镁0.14g。

3.如权利要求1所述的具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，其特征在于，所述脐血干细胞来自足月生产的、健康的脐血。

4.如权利要求1所述的具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，其特征在于，所述脐血干细胞提取方法包括如下步骤：

S1、脐血筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带，置于脐血保存袋中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；

S2、脐血分离：从脐血中分离出单核细胞以及分离出的脐血自体血浆；

S3、收集所述脐血干细胞并计数和活率，用冷冻保护剂进行冷冻保存。

5.如权利要求4所述的具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，其特征在于，所述单核细胞的冷冻保存的单位剂量为3×10⁷/ml/管。

6.如权利要求4所述的具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，其特征在于，所述冷冻保护剂为脐血自体血浆和二甲亚砜的混合物。

7.如权利要求6所述的具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液，其特征在于，所述冷冻保护剂中，血浆的体积百分数为85～95％，二甲亚砜的体积百分数为5～15％。

8.一种如权利要求1所述的具有抗衰老功效的脐血干细胞注射液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、取冷冻的脐血干细胞，37℃水浴锅恒温解冻；

S2、用生理盐水进行洗涤；

S3、统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按5×10⁵～10×10⁵/ml将细胞和复方电解质溶液、人血白蛋白和脐血自体血浆混匀，得到所述脐血干细胞注射液。