CN111808809A - 一种人脐带血来源的外泌体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人脐带血来源的外泌体及其制备方法和用途，通过将差速离心、蔗糖密度梯度和超滤法等方法结合对人脐带血外泌体进行分离纯化；本发明人脐带血来源的外泌体的制备方法以天然存在的人脐带血为原料，无需经过人工的修饰和改造，减少质量及安全性风险，对外泌体的获取更便捷，成本亦更低，易推广，对于进一步充分利用了脐带血资源有重要的意义；另外，相对于通过培养的细胞中获取的外泌体，外泌体中的调控因子成分更丰富，经实验证明，本发明方法提取的外泌体能够有效抵抗内皮细胞和机体衰老，具有巨大的临床和经济价值。

Description

一种人脐带血来源的外泌体及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于分子生物学及生物医药、医学保健领域，涉及一种外泌体，具体涉及一种人脐带血来源的外泌体及其制备方法和用途。
背景技术
随着近些年的科学研究发展，脐带血在遗传病、代谢病、免疫治疗及再生医学中的价值受到广泛重视。目前，脐带血的应用主要集中在细胞移植方面，因为脐带血中含有大量的可分化成人体各种细胞的干细胞。脐带血中的干细胞用以治疗疾病的方法日渐显现其重要性。
外泌体(exosome)或者细胞外小囊泡(small Extracellular Vesicles，sEV)是自然存在于生物体液中的30-200nm的细胞外囊泡。外泌体或细胞外小囊泡(sEV)的概念包涵于细胞外囊泡(EV，0-1000nm)的概念之内。几乎所有的细胞均可分泌外泌体(细胞外小囊泡)。因其内包涵大量的RNA、蛋白质等丰富的内容物，外泌体在细胞间或组织间通信和跨物种通信中发挥极其重要的作用。除作为生物标志物外，因其能够保护其有效载荷不受化学和酶降解的影响，并能够逃避免疫系统的识别清除(免疫原性非常低)，故成为无细胞治疗的新型手段。同时，外泌体有别于细胞因子等其他小分子物质，其作为细胞间信息传递的重要媒介，通过进入靶细胞并进一步参与细胞的相关转录、翻译过程，从而起到相应的生物学效应。并非细胞因子等易灭活的体液成分单纯干预所产生的效应。
目前关于外泌体的应用还并没有进入临床使用阶段。现阶段外泌体应用研究前沿主要以通过细胞培养、分泌外泌体的方式获取。但是，培养细胞获取外泌体的方式存在重大缺陷。第一，众所周知，体外培养细胞的性状会随传代而发生变化。因此其分泌的外泌体的性状也会随之发生改变。不同细胞代数分泌的外泌体都是不一样的。而且因为外泌体内含物十分复杂，所以对于培养细胞的外泌体的均一性而言，就目前来说，现阶段的科学技术还没有能力做到满足使用条件的质控。第二，体外细胞培养很难良好地复制机体内外泌体的状态。第三，引入体外培养的步骤，大大增加了人为风险，比如外源细胞因子或血清的引入。
因此，有必要对开发一种提取方便、临床应用价值好的外泌体。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种制备过程简单、安全可控，且临床应用价值更高的外泌体及其提取方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人脐带血来源的外泌体的提取方法，所述外泌体是指脐带血中大小为30-200nm的细胞外小囊泡，提取方法包括以下步骤：
(1)将脐带血和预冷的PBS按体积比为1：0.5～3混合，
(2)通过差速离心分离得到初步的外泌体混合物1；
(3)将所述外泌体混合物1加入蔗糖垫溶液，通过密度梯度离心分离得到含有外泌体的蔗糖溶液；
(4)收集所述含有外泌体的蔗糖溶液，转移至截留值至少为100kD超滤管中进行超滤，并通过PBS洗涤截留组分；
(5)收集滤网中的截留组分即为所述人脐带血来源外泌体；
所述操作过程使用的溶剂均经4℃预冷，各操作过程在4℃进行。本发明通过将差速离心、蔗糖密度梯度和超滤法结合，提取得到的外泌体纯度更好，使用更安全。人脐带血外泌体，不同于文献报道的脐带血细胞外泌体、脐带/胎盘来源细胞(比如脐带血干细胞)的外泌体，后两者是脐带血或脐带/胎盘分离的细胞，经过体外培养，再获得的外泌体。本发明是天然的脐带血外泌体，技术上更易于实现，且对提取外泌体的过程更容易进行质控(比如只要排除病毒等感染以及血型匹配)。一般地，所述含有外泌体的蔗糖溶液为离心后从上至下数第4-9层，但不限于第4-9层。
进一步地，所述脐带血为正常分娩过程收集得到，处理前存放于含有枸橼酸钠的血液收集袋中。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中的差速离心包括如下步骤：250～350g离心10～20分钟；取上清，1800～3000g离心15～25分钟，重复该步骤两次；取上清，9000～15000g离心30～120分钟；取上清，90000～140000g离心30～180分钟。
通过上述过程能较好地分离脐带血中的细胞、凋亡碎片和更大的囊泡，从而得到初步分离的外泌体。
作为本发明的优选实施方式，所述蔗糖垫溶液为包括由下至上如下浓度梯度的蔗糖溶液：2M，1.3M，1.16M，0.8M，0.5M，0.25M。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)的密度梯度离心包括如下步骤：90000～140000g离心2～18小时。
通过密度梯度离心可进一步实现外泌体与非囊泡颗粒分离，分离纯度更高。
本发明还要求保护所述的方法制备得到的外泌体。
根据本发明方法分离的外泌体与既往对于脐带血来源并经过体外分离培养的干细胞(如间充质干细胞等)分泌的外泌体不同，相对地，其外泌体成分更加丰富，抗衰老效果更全面、更佳。
本发明还要求保护所述方法制备得到的外泌体在制备抗衰老产品中的用途。
作为本发明的优选实施方式，所述抗衰老产品可用于制备抗内皮细胞衰老和/或机体衰老的产品。
本发明还要求保护一种抗衰老产品，所述抗衰老产品包括根据所述方法制备的外泌体。
作为本发明的优选实施方式，所述抗衰老产品包括涂抹剂、注射剂和口服剂。
本发明提供了一种人脐带血来源的外泌体的制备方法，所述方法以天然存在的人脐带血为原料，无需经过人工的修饰和改造，减少质量及安全性风险，对外泌体的获取更便捷，成本亦更低，易推广，对于进一步充分利用了脐带血资源有重要的意义；另外，相对于通过培养的细胞中获取的外泌体，其中的调控因子成分更丰富，经实验证明，本发明方法提取的外泌体能够有效抵抗内皮细胞和机体衰老，具有巨大的临床和经济价值。
附图说明
图1为本发明人脐带血来源外泌体的分离提纯的流程图。
图2为本发明方法制备的外泌体对过氧化氢诱导的细胞衰老的干预效果；其中，A为显微镜下各组细胞的β-半乳糖苷酶染色情况及对应的统计结果，B为各组细胞抑制衰老相关周期基因qPCR检测结果，C为各组细胞抑制衰老相关周期基因的蛋白表达情况；Exos即外泌体。
图3为本发明方法制备的外泌体在过氧化氢诱导的细胞衰老实验中对衰老相关分泌表型组件表达情况的影响结果。
图4为本发明方法制备的外泌体对阿霉素诱导的细胞衰老的干预效果；其中，A为显微镜下各组细胞的β-半乳糖苷酶染色情况及对应的统计结果，B为各组细胞抑制衰老相关周期基因qPCR检测结果，C为各组细胞抑制衰老相关周期基因的蛋白表达情况；Exos即外泌体。
图5为本发明方法制备的外泌体在阿霉素诱导的细胞衰老实验中对衰老相关分泌表型组件表达情况的影响结果。
图6为本发明方法制备的外泌体对内皮细胞自然衰老的干预效果；其中，A为显微镜下各组细胞的β-半乳糖苷酶染色情况及对应的统计结果，B为各组细胞抑制衰老相关周期基因qPCR检测结果，C为各组细胞抑制衰老相关周期基因的蛋白表达情况；Exos即外泌体。
图7为本发明方法制备的外泌体对内皮细胞自然衰老实验中对衰老相关分泌表型组件表达情况的影响结果。
图8为衰老模型鼠实验中各组肝肾脾组织切片。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1人脐带血来源外泌体的分离提纯
作为本发明的一种实施方式，所述人脐带血来源外泌体的分离提纯的流程如图1所示，具体步骤如下：
(1)收集的脐带血存放于含有枸橼酸钠作为抗凝剂的血液收集袋中；
(2)将脐带血与预冷的PBS按体积比为1:1混合，4℃，300g离心15分钟；
(3)取上清，4℃，2000g离心20分钟；重复两次；
(4)取上清，4℃，10000g离心1小时；
(5)取上清，4℃，100000g离心90分钟；
(6)弃上清，用500μL预冷的PBS重悬沉淀；并转移至蔗糖垫溶液(所述蔗糖垫溶液为由下至上如下浓度梯度的蔗糖溶液组成：2M 1.5mL，1.3M 2.5mL，1.16M 2.5mL，0.8M2mL，0.5M 2mL，0.25M 1mL)中，120000g离心6小时；
(7)收集第4～9层蔗糖溶液中的外泌体，加入至截留值为100kD的超滤管中进行超滤；4℃，5000g离心20分钟；
(8)以1mL预冷的PBS为洗涤液洗涤截留组分，4℃，5000g离心至内槽截留液大约为50～100μL为止；
(9)收集超滤网中的截留组分即为所述人脐带血来源外泌体。
实施例2
作为本发明的一种实施方式，所述人脐带血来源外泌体的分离提纯的流程如图1所示，具体步骤如下：
(1)收集的脐带血存放于含有枸橼酸钠作为抗凝剂的血液收集袋中；
(2)将脐带血与预冷的PBS按体积比为1:0.5混合，4℃，250g离心20分钟；
(3)取上清，4℃，3000g离心15分钟；重复两次；
(4)取上清，4℃，15000g离心30分钟；
(5)取上清，4℃，90000g离心180分钟；
(6)弃上清，用500μL预冷的PBS重悬沉淀；并转移至蔗糖垫溶液(所述蔗糖垫溶液为由下至上如下浓度梯度的蔗糖溶液组成：2M 1.5mL，1.3M 2.5mL，1.16M 2.5mL，0.8M2mL，0.5M 2mL，0.25M 1mL)中，140000g离心120分钟；
(7)收集第4～9层蔗糖溶液中的外泌体，加入至截留值为100kD的超滤管中进行超滤；4℃，3000g离心30分钟；
(8)以1mL预冷的PBS为洗涤液洗涤截留组分，4℃，3000g离心至内槽截留液大约为50～100μL为止；
(9)收集超滤网中的截留组分即为所述人脐带血来源外泌体。
实施例3
作为本发明的一种实施方式，所述人脐带血来源外泌体的分离提纯的流程如图1所示，具体步骤如下：
(1)收集的脐带血存放于含有枸橼酸钠作为抗凝剂的血液收集袋中；
(2)将脐带血与预冷的PBS按体积比为1:3混合，4℃，350g离心10分钟；
(3)取上清，4℃，1800g离心25分钟；重复两次；
(4)取上清，4℃，9000g离心120分钟；
(5)取上清，4℃，140000g离心30分钟；
(6)弃上清，用500μL预冷的PBS重悬沉淀；并转移至蔗糖垫溶液(所述蔗糖垫溶液为由下至上如下浓度梯度的蔗糖溶液组成：2M 1.5mL，1.3M 2.5mL，1.16M 2.5mL，0.8M2mL，0.5M 2mL，0.25M 1mL)中，90000g离心18小时；
(7)收集第4～9层蔗糖溶液中的外泌体，加入至截留值为100kD的超滤管中进行超滤；4℃，6000g离心20分钟；
(8)以500μL预冷的PBS为洗涤液洗涤截留组分，4℃，6000g离心至内槽截留液大约为50～100μL为止；
(9)收集超滤网中的截留组分即为所述人脐带血来源外泌体。
实施例4本发明方法制备的外泌体对过氧化氢诱导的细胞衰老的干预效果
将培养至第4～6代的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分为5组对照组、过氧化氢组(H2O2)、外泌体干预(移植)低、中、高剂量组，每组8个重复。除对照组外，各组的培养基中加入终浓度为100μM的过氧化氢，继续培养1小时后，换液(替换为含有5％胎牛血清的M199完全培养基)。
取实施例1方法制备的外泌体，在外泌体干预(移植)低、中、高剂量组分别加入终浓度如下的外泌体：5×108个/mL、10×108个/mL、20×108个/mL，继续培养24小时，替换为含有5％胎牛血清的M199完全培养基。
继续培养各组细胞，每天换液。继续培养第7天通过β-半乳糖苷酶染色法检测各组细胞的衰老情况，并收集细胞DNA，通过qRCR和免疫印迹法检测各组细胞抑制衰老相关周期基因p16、p21、p27、p53的转录和表达情况。结果如图2(A为显微镜下各组细胞的β-半乳糖苷酶染色情况及对应的统计结果，B为各组细胞抑制衰老相关周期基因qPCR检测结果，C为各组细胞抑制衰老相关周期基因的蛋白表达情况；Exos即外泌体)。
如图2所示，人脐带血外泌体干预呈浓度依赖性地抑制过氧化氢诱导的细胞衰老(各组重复次数n＝8)。qPCR和免疫印迹结果均表明：人脐带血外泌体干预可以呈浓度依赖性地抑制衰老相关周期基因p16、p21、p27、p53的转录或/和表达，以及促进抗衰老基因sirt1、核膜相关基因lamin B1的转录或/和表达(n＝3)。
进一步通过qPCR对各组细胞的衰老相关分泌表型组件的表达情况进行检测，结果如图3(***P<0.001，有极显著差异；**P<0.01，有显著差异；*P<0.05，有统计学差异。)。
由图3可得，人脐带血外泌体干预呈浓度依赖性地抑制SASP(包括il-1a、il-6、il-8、ccl-2、cxcl-10等)。说明人脐带血外泌体能有效干预过氧化氢诱导的细胞衰老，且效果具有浓度依赖性。
实施例5本发明方法制备的外泌体对阿霉素诱导的细胞衰老的干预效果
将培养至第4～6代的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分为5组对照组、阿霉素组、外泌体干预(移植)低、中、高剂量组，每组8个重复。除对照组外，各组的培养基中加入终浓度为50nM的盐酸阿霉素，继续培养24小时后，换液(替换为含有5％胎牛血清的M199完全培养基)。
取实施例1方法制备的外泌体，在外泌体干预(移植)低、中、高剂量组分别加入终浓度如下的外泌体：5×108个/mL、10×108个/mL、20×108个/mL，继续培养24小时，替换为含有5％胎牛血清的M199完全培养基。
按照与实施例4相同的方法对细胞衰老情况进行检测，结果如图4、5所示。(图4：A为显微镜下各组细胞的β-半乳糖苷酶染色情况及对应的统计结果，B为各组细胞抑制衰老相关周期基因qPCR检测结果，C为各组细胞抑制衰老相关周期基因的蛋白表达情况。图5为qPCR对各组细胞的衰老相关分泌表型组件的表达情况的检测结果；***P<0.001，有极显著差异；**P<0.01，有显著差异；*P<0.05，有统计学差异。)
结果表明人脐带血外泌体能够有效抑制促衰老基因、促进抗衰老基因的表达，并抑制细胞的SASP，能够有效抑制阿霉素诱导的细胞衰老，且相关的作用呈浓度依赖性。
实施例6本发明方法制备的外泌体对内皮细胞自然衰老的干预效果
一般到第5代的人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)视为功能正常细胞。HCAECs一直自然生长传代复制到第9代作为自然衰老模型。待细胞至第7-8代时，细胞形态呈胞体增大、胞质内颗粒增多、浑浊，细胞贴壁不牢，细胞生长缓慢。
将培养至第9代细胞分为正常组、外泌体干预(移植)低、中、高剂量组(每组12个重复)，其中，外泌体干预(移植)低、中、高剂量组分别加入终浓度如下的实施例1方法制备的外泌体：5×108个/mL、10×108个/mL、20×108个/mL，继续培养24小时，替换为EBM-2完全培养基。
按照与实施例4相同的方法对细胞衰老情况进行检测，结果如图6、7所示。(图6：A为显微镜下各组细胞的β-半乳糖苷酶染色情况及对应的统计结果，B为各组细胞抑制衰老相关周期基因qPCR检测结果，C为各组细胞抑制衰老相关周期基因的蛋白表达情况。图7为qPCR对各组细胞的衰老相关分泌表型组件的表达情况的检测结果；***P<0.001，有极显著差异；**P<0.01，有显著差异；*P<0.05，有统计学差异。)
结果表明人脐带血外泌体能够有效抑制促衰老基因、促进抗衰老基因的表达，并抑制细胞的SASP，能够有效内皮细胞的自然衰老，且相关的作用呈浓度依赖性。
实施例7本发明方法制备的外泌体对机体衰老的干预效果
8周龄C57BL/6J小鼠，分为5组(每组10只)：对照组，模型组，外泌体干预低、中、高剂量组。其中，外泌体干预低、中、高剂量组：使用D-半乳糖以皮下注射方式500mg/kg/天，连续注射6周；同时低、中、高剂量组分别通过尾静脉注射30μg、100μg、300μg实施例1方法制备的外泌体，每周一次，注射6周；模型组：每天使用D-半乳糖以皮下注射方式500mg/kg，连续注射6周，尾静脉每周注射一次与外泌体溶解液等体积的PBS，连续注射6周；对照组：以皮下注射方式每天注射与模型组D-半乳糖等体积的生理盐水6周，同时尾静脉每周注射与模型组等量的PBS。
记录各组小鼠试验前后的体重；试验后采集各组小鼠的血浆，并处死小鼠，取其肝、肾、脾，称重，观察其形态学结构，并制备得到相应的石蜡切片，通过HE染色(苏木精—伊红染色法)在显微镜下观察组织结构。
各组小鼠的增重率、脾脏指数、胸腺指数结果如表1所示。
增重率＝(末次体重-初次体重)/初次体重*100％；
脾脏指数(mg/g)＝脾脏重量(mg)/末次体重(g)；
胸腺指数(mg/g)＝胸腺重量(mg)/末次体重(g)。
表1人脐带血外泌体对D-半乳糖诱导的衰老小鼠的增重率、脾脏指数、胸腺指数的影响
组别 增重率(％) 脾脏指数(mg/g) 胸腺指数(mg/g)
对照组 24.07±5.27 4.60±095 1.75±0.23
模型组 10.42±2.61*** 2.49±0.33*** 1.16±0.13***
脐血外泌体-低剂量组 14.29±4.96# 2.52±0.20 1.31±0.09##
脐血外泌体-中剂量组 18.57±6.46## 3.47±0.26###&&& 1.49±0.09###&&&
脐血外泌体-高剂量组 20.75±3.57### 4.22±0.62###&& 1.78±0.20###&&&
注：结果为均数±标准差。***P<0.001，模型组与对照组相比；###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05，各剂量组与模型组相比；&&&P<0.001，&&P<0.01，高剂量组与中剂量组相比，或中剂量组与低剂量组相比。
如表1所示，通过人脐带血外泌体干扰的小鼠较模型组增重明显，脾脏、胸腺指数亦明显优于模型组(说明脾脏、胸腺的萎缩程度更低)，且这种变化呈浓度依赖性。
过量自由基的毒性反应与衰老密切相关。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)是体内重要的抗氧化酶，与自由基清除能力呈正相关。丙二醛(MDA)是脂质过氧化产物，其含量可反映自由基水平。
利用小鼠血浆使用ELISA的方法检测SOD、GSH-Px、CAT和MDA的活性，结果如表2所示。
表2人脐带血外泌体对D-半乳糖诱导的衰老小鼠的血清SOD、MDA、GSH-Px及CAT的影响
组别 SOD(U/mL) MDA(nmol/mL) GSH-Px(U/mL) CAT(U/mL)
对照组 92.87±5.47 4.24±0.76 900.26±40.81 11.37±1.68
模型组 60.76±5.64*** 10.33±1.18*** 491.29±82.28*** 6.04±0.90***
低剂量 70.76±7.69## 8.76±0.91## 466.70±80.02 6.11±0.99
中剂量 77.43±6.80### 7.20±1.17###&& 743.25±41.13###&&& 7.68±1.67#&
高剂量 85.06±5.68###& 5.87±0.76###&& 807.08±11.88###& 11.00±1.37###&&&
注：结果为均数±标准差。***P<0.001，模型组与对照组相比；###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05，各剂量组与模型组相比；&&&P<0.001，&&P<0.01，&P<0.05，高剂量组与中剂量组相比，或中剂量组与低剂量组相比。
如表2所示，人脐带血外泌体呈浓度依赖性的促进小鼠血浆SOD、GSH-Px、CAT的活力、抑制MDA含量，起到抗衰老的作用。
各组小鼠肝肾脾组织切片如图8所示：
对照组小鼠肝脏组织学形态结构正常，肝索完好，中央静脉显示清楚，肝细胞及细胞核染色明显，未见炎症、出血和坏死。
而模型组肝脏样本显示出明显的肝脏病变，表现为肝索变形、大量肝坏死、空泡化、炎性细胞浸润和出血(见模型组肝脏样本)；其肾脏样本显示局灶性肾小球肾炎和肾小球节段性增生(见模型组肾脏样本)——肾近曲小管增生、空腔增宽和上皮细胞数量减少，肾小球萎缩明显，数量减少，局灶区域炎症浸润；且其脾脏白髓体积缩小,脾小体减少，脾小梁内结缔组织增生，红白髓交界以及边缘区炎性浸润明显，存在大量的嗜酸性细胞(见模型组脾脏样本)。
各剂量组小鼠通过人脐带血外泌体注射后显示，人脐带血外泌体能明显改善D-半乳糖引起的小鼠肝脏病理组织学改变、有效预防肝损伤；减轻了肾脏损伤，尤其是高剂量时，很少有萎缩和增宽的空洞，其病理表现与正常小鼠肾小管和肾小球结构接近；且由脾小体可见，脾小梁内结缔组织无明显增生，炎性浸润明显减轻。总的来说，人脐带血外泌体可以有效的保护性干预D-半乳糖引起的肝脏、肾脏和脾脏的衰老损伤，且这种保护作用具有浓度依赖性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种人脐带血来源的外泌体的提取方法，其特征在于，所述外泌体是指脐带血中大小为30-200nm细胞外小囊泡，提取方法包括以下步骤：
(1)将脐带血和预冷的PBS按体积比为1：0.5～3混合，
(2)通过差速离心分离得到初步的外泌体混合物1；
(3)将所述外泌体混合物1加入蔗糖垫溶液，通过密度梯度离心分离得到含有外泌体的蔗糖溶液；
(4)收集所述含有外泌体的蔗糖溶液，转移至截留值至少为100kD超滤管中进行超滤，并通过PBS洗涤截留组分；
(5)收集滤网中的截留组分即为所述人脐带血来源外泌体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脐带血为正常分娩过程收集得到，处理前存放于含有枸橼酸钠的血液收集袋中。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的差速离心包括如下步骤：250～350g离心10～20分钟；取上清，1800～3000g离心15～25分钟，重复该步骤两次；取上清，9000～15000g离心30～120分钟；取上清，90000～140000g离心30～180分钟。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的蔗糖垫溶液为包括由下至上如下浓度梯度的蔗糖溶液：2M，1.3M，1.16M，0.8M，0.5M，0.25M。
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的密度梯度离心包括如下步骤：90000～140000g离心2～18小时。
6.如权利要求1～5任一项所述的方法制备的外泌体。
7.如权利要求6所述外泌体在制备抗衰老产品中的用途。
8.如权利要求7所述用途，其特征在于，所述抗衰老产品可用于制备抗内皮细胞衰老和机体衰老的产品。
9.一种抗衰老产品，其特征在于，包括如权利要求6所述的外泌体。
10.如权利要求9所述的抗衰老产品，其特征在于，所述抗衰老产品包括涂抹剂、注射剂和口服剂。
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