CN109125349A - 一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法,涉及生物干细胞技术领域,本发明方法能够制备凝胶,该凝胶可以作用于组织外伤,起到止血、修复破损表皮伤口的作用,同时还能改善皮肤老化问题,恢复皮肤的生理机能。
Description
技术领域
本发明涉及生物干细胞技术领域,尤其涉及一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法。
背景技术
脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一类多能干细胞,来源于发育早期的中胚层,具有多向分化潜能、免疫调节作用、旁分泌作用且免疫原性低,不会引起排斥反应等功能,因此受到人们的广泛关注,具有广阔的前景。
本发明利用的就是脐带间充质干细胞的旁分泌作用。脐带间充质干细胞在培养过程中会分泌多种细胞生长因子,包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)等。这些细胞因子具有调节机体免疫、促进细胞增殖、促进血管再生等功能,对受损皮肤、敏感皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用,能淡化色斑、恢复皮肤的光滑与弹性、减少皱纹、改善皮肤老化问题,促进伤口快速愈合,避免形成疤痕等,但是如何能够制备相关药剂,使其能够显著提高皮肤伤口的愈合速度,并且改善皮肤老化问题成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足,提供一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法,该凝胶能够显著提高皮肤伤口的愈合速度,还可以改善皮肤老化问题。
本发明是通过以下技术方案予以实现:一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)脐带间充质干细胞的分离培养鉴定:
a.脐带取样以及检测:取健康足月新生儿脐带8-12cm,置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输,另外采集母体外周血3-5ml用于病毒五项检测;
b.脐带清洗:用浸润有75%酒精的纱布对采集瓶外部进行消毒,然后在生物安全柜内打开瓶盖,用止血钳取出脐带置于200ml无菌杯中用75%酒精浸润2-4秒后迅速取出,并转移到一个新的200ml无菌杯中,然后用生理盐水将脐带反复清洗3-5次;
c.脐带处理:将脐带放置在盛有生理盐水的无菌平皿中,用止血钳挤压血管排空血管中的血液,用生理盐水继续清洗干净;用止血钳挤压脐带排除水分后放入100ml无菌烧杯中,用无菌剪刀将脐带剪成1mm3左右均匀的组织块;
d.脐带间充质干细胞培养:使用无菌药匙将组织块均匀接种于T75培养瓶中,每瓶150-300块,然后将培养瓶竖起,沿未接种组织块的一面瓶壁加入15ml原代无酚完全培养基;拧上瓶盖,翻转培养瓶,使接种组织块的瓶壁在上,放置于37℃,5%CO2的培养箱中静置贴壁4h以上;之后翻转培养瓶,让培养基完全浸润每一块组织块,置于培养箱中培养;前七天保持培养瓶静止,第七天半量换液,第十二天观察到较多纤维状细胞爬出,此时工作人员去除组织块,半量换液继续培养,待细胞融合度>80%时用TrypLE将贴壁细胞消化下来接种到T175培养瓶中加入40ml扩增无酚完全培养基传代培养;每当细胞融合度达到80%-90%时传代一次,每次按1:3到1:6比例传代,直到P6代;
(2)脐带间充质干细胞上清液:收集每次传代时获得的细胞至500ml离心杯中,放到离心机内以3000rpm转速、时间持续30min进行离心得到脐带间充质干细胞上清液,将上清转移到Nalgene 1000ml方形瓶中储存备用;
(3)凝胶的配制:称取凝胶粉末1份和3份丙二醇一起灭菌,将灭菌好的凝胶粉末添加到丙二醇中,再依次加入2份DMSO、35份无菌PBS,于冰箱内4摄氏度静置溶胀24h,然后再用磁力搅拌器搅拌48h得到凝胶。
(4)具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备:向步骤(2)脐带间充质干细胞上清液中加入医用苯扎溴铵,每升加入3ml的5%医用苯扎溴铵;再按1:2比例加入步骤(3)凝胶混合均匀,按3ml/支分装到预充式注射器中;将推杆推进预充管体内使管体倒转后管内的液体无法流出为准,用手指将针帽拧开,再推动推杆,使管体内的空气排除,管体内液体无法流出为最佳,然后拧紧针帽,具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶制备完成。
根据上述技术方案,优选地,脐带保存液包括50ml HyClone DMEM/F-12培养基以及100U/ml庆大霉素;原代无酚完全培养基包括HyClone DMEM/F-12的无酚红培养基以及体积浓度2%的血清替代物;扩增无酚完全培养基包括HyClone DMEM/F-12无酚红培养基以及体积浓度1%血清替代物。
根据上述技术方案,优选地,按照份数比,凝胶粉末包括8份海藻酸丙二醇酯、2份普鲁兰以及1份硬脂酸钠。
本发明的有益效果是:
(1)采用了血清替代物代替胎牛血清培养脐带间充质干细胞,有效避免了细胞上清液中残留胎牛血清中的动物源成分,提高了产品的安全性,适合各种哺乳动物包括人类使用。
(2)本发明凝胶内含有细胞生长因子,可以与表皮细胞发生作用,促进上皮细胞新陈代谢,迅速修复受损细胞,加速表面伤口愈合,避免形成疤痕,同时还能使老化的皮肤恢复光滑与弹性。
附图说明
图1示出了根据本发明的实施例的制备流程示意图。
图2示出了根据本发明的实施例的原代脐带间充质干细胞示意图。
图3示出了根据本发明的实施例的P6代脐带间充质干细胞示意图。
图4示出了根据本发明的实施例的脐带间充质干细胞表面标志物CD105检测结果示意图。
图5示出了根据本发明的实施例的脐带间充质干细胞表面标志物CD34检测结果示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
如图所示,本发明提供了一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)脐带间充质干细胞的分离培养鉴定:
a.脐带取样以及检测:取健康足月新生儿脐带8-12cm,置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输,另外采集母体外周血3-5ml用于病毒五项检测;
b.脐带清洗:用浸润有75%酒精的纱布对采集瓶外部进行消毒,然后在生物安全柜内打开瓶盖,用止血钳取出脐带置于200ml无菌杯中用75%酒精浸润2-4秒后迅速取出,并转移到一个新的200ml无菌杯中,然后用生理盐水将脐带反复清洗3-5次;
c.脐带处理:将脐带放置在盛有生理盐水的无菌平皿中,用止血钳挤压血管排空血管中的血液,用生理盐水继续清洗干净;用止血钳挤压脐带排除水分后放入100ml无菌烧杯中,用无菌剪刀将脐带剪成1mm3左右均匀的组织块;
d.脐带间充质干细胞培养:使用无菌药匙将组织块均匀接种于T75培养瓶中,每瓶150-300块,然后将培养瓶竖起,沿未接种组织块的一面瓶壁加入15ml原代无酚完全培养基;拧上瓶盖,翻转培养瓶,使接种组织块的瓶壁在上,放置于37℃,5%CO2的培养箱中静置贴壁4h以上;之后翻转培养瓶,让培养基完全浸润每一块组织块,置于培养箱中培养;前七天保持培养瓶静止,第七天半量换液,第十二天观察到较多纤维状细胞爬出,此时工作人员去除组织块,半量换液继续培养,待细胞融合度>80%时用TrypLE将贴壁细胞消化下来接种到T175培养瓶中加入40ml扩增无酚完全培养基传代培养;每当细胞融合度达到80%-90%时传代一次,每次按1:3到1:6比例传代,直到P6代;
(2)脐带间充质干细胞上清液:收集每次传代时获得的细胞至500ml离心杯中,放到离心机内以3000rpm转速、时间持续30min进行离心得到脐带间充质干细胞上清液,将上清转移到Nalgene 1000ml方形瓶中储存备用;
(3)凝胶的配制:称取凝胶粉末1份和3份丙二醇一起灭菌,将灭菌好的凝胶粉末添加到丙二醇中,再依次加入2份DMSO、35份无菌PBS,于冰箱内4摄氏度静置溶胀24h,然后再用磁力搅拌器搅拌48h得到凝胶。
(4)具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备:向步骤(2)脐带间充质干细胞上清液中加入医用苯扎溴铵,每升加入3ml的5%医用苯扎溴铵;再按1:2比例加入步骤(3)凝胶混合均匀,按3ml/支分装到预充式注射器中;将推杆推进预充管体内使管体倒转后管内的液体无法流出为准,用手指将针帽拧开,再推动推杆,使管体内的空气排除,管体内液体无法流出为最佳,然后拧紧针帽,具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶制备完成。
根据上述实施例,优选地,脐带保存液包括50ml HyClone DMEM/F-12培养基以及100U/ml庆大霉素;原代无酚完全培养基包括HyClone DMEM/F-12的无酚红培养基以及体积浓度2%的血清替代物;扩增无酚完全培养基包括HyClone DMEM/F-12无酚红培养基以及体积浓度1%血清替代物。
根据上述实施例,优选地,按照份数比,凝胶粉末包括8份海藻酸丙二醇酯、2份普鲁兰以及1份硬脂酸钠。
本发明的有益效果是:
(1)采用了血清替代物代替胎牛血清培养脐带间充质干细胞,有效避免了细胞上清液中残留胎牛血清中的动物源成分,提高了产品的安全性,适合各种哺乳动物包括人类使用。
(2)本发明凝胶内含有细胞生长因子,可以与表皮细胞发生作用,促进上皮细胞新陈代谢,迅速修复受损细胞,加速表面伤口愈合,避免形成疤痕,同时还能使老化的皮肤恢复光滑与弹性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)脐带间充质干细胞的分离培养鉴定:
a.脐带取样以及检测:取健康足月新生儿脐带8-12cm,置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输,另外采集母体外周血3-5ml用于病毒五项检测;
b.脐带清洗:用浸润有75%酒精的纱布对采集瓶外部进行消毒,然后在生物安全柜内打开瓶盖,用止血钳取出脐带置于200ml无菌杯中用75%酒精浸润2-4秒后迅速取出,并转移到一个新的200ml无菌杯中,然后用生理盐水将脐带反复清洗3-5次;
c.脐带处理:将脐带放置在盛有生理盐水的无菌平皿中,用止血钳挤压血管排空血管中的血液,用生理盐水继续清洗干净;用止血钳挤压脐带排除水分后放入100ml无菌烧杯中,用无菌剪刀将脐带剪成1mm3左右均匀的组织块;
d.脐带间充质干细胞培养:使用无菌药匙将组织块均匀接种于T75培养瓶中,每瓶150-300块,然后将培养瓶竖起,沿未接种组织块的一面瓶壁加入15ml原代无酚完全培养基;拧上瓶盖,翻转培养瓶,使接种组织块的瓶壁在上,放置于37℃,5%CO2的培养箱中静置贴壁4h以上;之后翻转培养瓶,让培养基完全浸润每一块组织块,置于培养箱中培养;前七天保持培养瓶静止,第七天半量换液,第十二天观察到较多纤维状细胞爬出,此时工作人员去除组织块,半量换液继续培养,待细胞融合度>80%时用TrypLE将贴壁细胞消化下来接种到T175培养瓶中加入40ml扩增无酚完全培养基传代培养;每当细胞融合度达到80%-90%时传代一次,每次按1:3到1:6比例传代,直到P6代;
(2)脐带间充质干细胞上清液:收集每次传代时获得的细胞至500ml离心杯中,放到离心机内以3000rpm转速、时间持续30min进行离心得到脐带间充质干细胞上清液,将上清转移到Nalgene 1000ml方形瓶中储存备用;
(3)凝胶的配制:称取凝胶粉末1份和3份丙二醇一起灭菌,将灭菌好的凝胶粉末添加到丙二醇中,再依次加入2份DMSO以及35份无菌PBS,于冰箱内4摄氏度静置溶胀24h,然后再用磁力搅拌器搅拌48h得到凝胶。
(4)具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备:向步骤(2)所述脐带间充质干细胞上清液中加入医用苯扎溴铵,每升加入3ml的5%医用苯扎溴铵;再按1:2比例加入步骤(3)所述凝胶混合均匀,按3ml/支分装到预充式注射器中;将推杆推进预充管体内使管体倒转后管内的液体无法流出为准,用手指将针帽拧开,再推动推杆,使管体内的空气排除,管体内液体无法流出为最佳,然后拧紧针帽,具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶制备完成。
2.根据权利要求1所述的一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法,其特征在于,所述脐带保存液包括50ml HyClone DMEM/F-12培养基以及100U/ml庆大霉素;所述原代无酚完全培养基包括HyClone DMEM/F-12的无酚红培养基以及体积浓度2%的血清替代物;所述扩增无酚完全培养基包括HyClone DMEM/F-12无酚红培养基以及体积浓度1%血清替代物。
3.根据权利要求1所述的一种具有外伤修复和抗衰老功能的凝胶的制备方法,其特征在于,按照份数比,所述凝胶粉末包括8份海藻酸丙二醇酯、2份普鲁兰以及1份硬脂酸钠。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190104 |
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