CN112841174A

CN112841174A - 一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液

Info

Publication number: CN112841174A
Application number: CN202110115290.4A
Authority: CN
Inventors: 朱灏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2021-05-28

Abstract

本发明涉及冻存液技术领域，具体涉及一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液。一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，至少包括以下组分：二甲基亚砜、人血白蛋白、复方电解质注射液、氯化钠注射液、海藻糖液、右旋糖苷、维生素C注射液。该冻存液对人脐带间充质干细胞的毒副作用小，可直接临床使用，明显提高人脐带间充质干细胞回输对人体的安全性和生物相容性，同时可以在降低DMSO用量的前提下，提高人脐带间充质干细胞活率、增殖、分化能力，且复苏后直接回输，无需进行离心洗涤，减少对细胞的损伤。

Description

一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液

技术领域

本发明涉及冻存液技术领域，具体涉及一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液。

背景技术

人脐带间充质干细胞是指从脐带中分离的一种多能干细胞，与其他来源的间充质干细胞比较有明显的临床应用优势，如取材容易、易收集、冷冻保存及相对纯净等，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，如成骨细胞、软骨细胞、类肝细胞、类胰岛素细胞、神经细胞和心肌细胞等，且无伦理方面的问题。目前，人脐带间充质干细胞已经在临床领域得到应用并取得令人鼓舞的治疗效果。

人脐带间充质干细胞的种子库在临床上已经广泛应用，但也存在受冻存条件限制而不能大规模应用的问题，干细胞的冻存过程中无外源性污染是人脐带间充质干细胞在临床治疗应用中安全可靠的关键，一方面由于常规冻存液中的胎牛血清含有各种不明确的细胞生长因子，会对细胞的分化形成干扰，另一方面采用动物血清培养的干细胞进行临床应用，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发成分明确的人脐带间充质干细胞无血清冻存液。

人脐带间充质干细胞种子库细胞的长期活性与冻存坏境有密切关系，冻存液的微环境对人脐带间充质干细胞有着重要影响，现有的冻存液对细胞存在较大的毒害作用。因此，急需一种能够长期保存人脐带间充质干细胞，防止冻存过程中的细胞损伤、保持细胞复苏后的高活率及其生物学功能的冻存液。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明第一个方面提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，至少包括以下组分：二甲基亚砜、人血白蛋白、复方电解质注射液、氯化钠注射液、海藻糖液、右旋糖苷、维生素C注射液。

作为本发明一种优选的技术方案，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜0-5％、人血白蛋白10-25％、氯化钠注射液1-10％、海藻糖液1-10％、右旋糖苷5-30％、维生素C注射液1-5％、复方电解质注射液补足余量。

作为本发明一种优选的技术方案，所述冻存液的制备原料还包括人α1-酸性糖蛋白。

作为本发明一种优选的技术方案，所述人α1-酸性糖蛋白的浓度为20-30μg/mL。

作为本发明一种优选的技术方案，所述冻存液的制备原料还包括硫酸乙酰肝素。

作为本发明一种优选的技术方案，所述硫酸乙酰肝素和人α1-酸性糖蛋白的重量比为1：(0.05-0.3)。

作为本发明一种优选的技术方案，所述右旋糖苷为右旋糖酐-40和/或右旋糖酐-70。

作为本发明一种优选的技术方案，所述二甲基亚砜和右旋糖苷的体积比为1：(1-10)。

作为本发明一种优选的技术方案，所述氯化钠注射液的质量分数为0.9％。

本发明第二个方面提供了所述用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中加入预冷复方电解质注射液、氯化钠注射液、海藻糖液、右旋糖苷、维生素C注射液，混合均匀；然后加入预冷的人血白蛋白，混合均匀，即得；所述预冷为2-8℃下保存至少30min。

有益效果

本发明提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，对人脐带间充质干细胞的毒副作用小，可直接临床使用，明显提高人脐带间充质干细胞回输对人体的安全性和生物相容性，同时可以在降低DMSO用量的前提下，提高人脐带间充质干细胞活率、增殖、分化能力，且复苏后直接回输，无需进行离心洗涤，减少对细胞的损伤。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的冻存液用于人脐带间干细胞冻存一年后细胞的形态。

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。

为了解决上述技术问题，本发明第一个方面提供了一种用于人脐带间充质干细胞保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜、人血白蛋白、复方电解质注射液、氯化钠注射液、海藻糖液、右旋糖苷、维生素C注射液。

在一种优选的实施方式中，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜0-5％、人血白蛋白10-25％、氯化钠注射液1-10％、海藻糖液1-10％、右旋糖苷5-30％、维生素C注射液1-5％、复方电解质注射液补足余量。

在一种更优选的实施方式中，所述冻存液的制备原料还包括人α1-酸性糖蛋白。

在一种更有选的实施方式中，所述人α1-酸性糖蛋白的浓度为20-30μg/mL。

在一种更优选的实施方式中，所述冻存液的制备原料还包括硫酸乙酰肝素。

在一种更优选的实施方式中，所述硫酸乙酰肝素和人α1-酸性糖蛋白的重量比为1：(0.05-0.3)。

二甲基亚砜

二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物，分子式为C₂H₆OS，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。

本发明中，所述二甲基亚砜在冻存液中所占的体积百分数为0-5％。

在一种优选的实施方式中，所述二甲基亚砜在冻存液中所占的体积百分比为3％，本发明技术方案均在以3％二甲基亚砜的条件下进行。

发明人认为，本发明提供的冻存液中，DMSO易穿透细胞，在细胞冻存过程中可以使冰点下降，减少细胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。但常用的二甲基亚砜对细胞存在一定毒性，研究表明其能与蛋白质结合导致蛋白质变性从而产生危害。因此本发明在此基础上进行研究后得出一种新的冻存液，能大大降低二甲基亚砜的含量。

人血白蛋白

本发明中，所述人血白蛋白在冻存液中所占的体积百分数为10-25％，可提及10％、15％、20％、25％等。

在一种优选的实施方式中，所述人血白蛋白为20％人血白蛋白。

发明人认为，本体系中添加适量的人血白蛋白，不仅不会如牛血清(FBS)等非人体成分一样引起过敏反应，对细胞具有较强的保护作用，能够促进细胞的增长，延长细胞存活的时间，还能够增加血容量和维持渗透压，调节组织与血管之间水分的动态平衡，维持细胞渗透压相对稳定，保证了人脐带间充质干细胞在冻存过程中的安全性，并可作为氮源为组织提供营养。然而，人血白蛋白的含量不能超出20-50％的范围，否则不利于人脐带间充质干细胞从冻存状态恢复，本体系优选人血白蛋白为20％人血白蛋白，能够明显提高细胞回输对人体的安全性和生物相容性。

氯化钠注射液

氯化钠注射液，各种原因所致的失水，包括低渗性、等渗性和高渗性失水；高渗性非酮症糖尿病昏迷，应用等渗或低渗氯化钠可纠正失水和高渗状态；低氯性代谢性碱中毒；外用生理盐水冲洗眼部、洗涤伤口等；还用于产科的水囊引产。

本发明中，所述氯化钠注射液在冻存液中所占的体积百分数为1-10％，可提及1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等。

在一种优选的实施方式中，所述氯化钠注射液的质量浓度为0.9％。

发明人发现，本体系采用复方电解质注射液和氯化钠注射液复配后，产生协同作用，能够进一步维持离子渗透压和胶体渗透压的系统平衡，形成有利于人脐带间充质干细胞存活的环境条件，可用于人脐带间充质干细胞的长期保存，且在冻存之后可用于人体回输，使用更加方便、灵活。

海藻糖液

海藻糖又称为漏芦糖、蕈糖，是由两个葡萄糖分子组成的一个非还原性双糖。结构式为α-D-吡喃葡糖基～α-D-吡喃葡糖苷，经常以二水化合物存在，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O。

本发明中，所述海藻糖液为海藻糖的水溶液，浓度为0.5-2mol/L；使用前通过0.2μm滤膜进行过滤除菌。

右旋糖苷

本发明中，所述右旋糖苷在冻存液中所占体积百分数为5-15％，可提及5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。

在一种优选的实施方式中，所述右旋糖苷为右旋糖酐-40和/或右旋糖酐-70。

在一种更优选的实施方式中，所述右旋糖苷-40为右旋糖苷-40葡萄糖注射液。

在一种更优选的实施方式中，所述右旋糖苷40的重均分子量在32000-42000之间。

本发明中，所述二甲基亚砜和右旋糖苷的体积比为1：(1-10)。

在一种优选的实施方式中，所述二甲基亚砜和右旋糖苷的体积比为1：(5-10)。

本体系中，为降低人脐带间充质干细胞在深低温保存时降温的损伤，增加右旋糖苷40葡萄糖注射液的含量。发明人认为可能的原因是，一方面，从细胞冻存保护剂作用方式角度看，DMSO作为渗透型试剂，可渗入细胞内，使水分大量渗出；而右旋糖苷40葡萄糖注射液作为非渗透性试剂在细胞外形成高渗，使细胞脱水，从而保护细胞不受冰晶形成的损伤；本体系采用两者复配的方式，尤其当所述二甲基亚砜和右旋糖苷的体积比为1：(5-10)，右旋糖苷40的重均分子量在32000-42000之间时，可以维持渗透压和pH，同时提供适宜人充质干细胞生存的环境，取得更好的冻存效果，维持人脐带间充质干细胞功能性指标和生物学功能，提高脐带间充质干细胞活率、增殖、分化能力；另一方面，由于DMSO常温下对组织细胞有毒性，所以采用降低DMSO的方式，减少其常温下对细胞的损伤，提高细胞活率，便于临床回输。

维生素C注射液

维生素C注射液，1.用于防治坏血病，也可用于各种急慢性传染性疾病及紫癜等辅助治疗。2.慢性铁中毒的治疗：维生素C促进去铁胺对铁的整合，使铁排出加速。3.特发性高铁血红蛋白症的治疗。4.克山病患者发生心源性休克时，可用大剂量本品治疗。5.下列情况对维生素C的需要量增加：(1)病人接受慢性血液透析、胃肠道疾病(长期腹泻、胃或回肠切除术后)、艾滋病、结核病、癌症、溃疡病、甲状腺功能亢进、发热、感染、创伤、烧伤、手术后等；(2)因严格控制或选择饮食，接受肠道外营养的病人，营养不良，体重骤降，以及在妊娠期和哺乳期；(3)应用巴比妥类、四环素类、水杨酸类，或以维生素C作为泌尿系统酸化药时。

本发明中，所述维生素C注射液在冻存液中所占体积百分数为1-5％，可提及1％、2％、3％、4％、5％等。

复方电解质注射液

本品与血液和血液成分相容，可使用同一给药装置在输血前或输血后输注(即作为预充液)，可加入正在输注的血液组分中，或作为血细胞的稀释液。

发明人认为，本体系通过引入复方电解质，使制备得到的冻存液兼具细胞冻存保护液与电解质注射液的双重优点，既可以在低至-130℃以下的低温冻存过程中保护细胞，同时解冻后可以直接作为电解质注射液回输人体，无需经过额外的处理工序，从而减少操作流程，降低污染概率；同时能够降低回输之时和之后可能出现电解质紊乱的问题，可作为水、电解质的补充源和碱化剂。

人α1-酸性糖蛋白

本发明中，所述人α1-酸性糖蛋白的浓度为20-30μg/mL。

在一种优选的实施方式中，所述人α1-酸性糖蛋白的浓度为23-28μg/mL。

在一种更优选的实施方式中，所述人α1-酸性糖蛋白的分子量为30000-50000。

发明人认为，本体系无动物源血清成分，能够较好的维持细胞状态，极大的降低了外源感染风险，在此基础上复配一定量的人α1-酸性糖蛋白，有助于提高低温(液氮环境)保存状态的血小板的活性，保持人充质干细胞内ATP水平的稳定，为人脐带间充质干细胞的保存提供了较为温和的生存环境，同时为人脐带间充质干细胞的生长提供必须的能量物质，在细胞的代谢过程中起着非常重要的营养作用，能够增强细胞活性，同时发挥细胞保护作用，防止冻存条件下造成的功能损伤，适用于人脐带间充质干细胞的长期保存。

硫酸乙酰肝素

本发明中，所述硫酸乙酰肝素和人α1-酸性糖蛋白的重量比为1：(0.05-0.3)。

在一种优选的实施方式中，所述硫酸乙酰肝素和人α1-酸性糖蛋白的重量比为1：0.1。

发明人认为，人α1-酸性糖蛋白带有5条多分支的N-糖链，将带有多分支的N-糖链的人α1-酸性糖蛋白和具有线性糖链的硫酸乙酰肝素复配使用后，具有不同结构的糖链彼此之间产生协同增效的作用，能更好地束缚水分子，阻止水分子通过扩散运动聚集在一起形成冰晶，从而更有效地抑制细胞外冰晶的形成和长大，减少对细胞的机械损伤，从而有效提高人脐带间充质干细胞的抗冻性。同时，可有效减缓渗透性损伤稳定细胞结构，抗氧化等作用，可以帮助细胞维持各种过氧化物酶的活性，减少细胞损伤，抑制细胞的凋亡信号通路，适用于对人脐带间充质干细胞进行深低温长期储存，可实现远距离运输，从而扩大了细胞的配送范围，实现干细胞的远距离治疗，且细胞在复苏后能够直接回输，减少了繁杂的操作带来的安全隐患。

本发明中，所述冻存液制备原料的来源，没有特别的限制，市售均适用于本发明。如所述人血白蛋白来源于奥克特珐玛AB公司；所述二甲基亚砜为临床级二甲基亚砜，来源于WAK-Chemie公司；所述复方电解质注射液来源于河北天成药业股份有限公司；所述右旋糖苷40来源于四川科伦药业股份有限公司；所述氯化钠注射液来源于广东大冢制药有限公司；所述海藻糖来源于山西锦洋药用辅料有限公司；所述维生素C注射液来源于百济新特药房；所述硫酸乙酰肝素来源于上海信帆生物科研所；所述复方氨基酸注射液来源于上海甄准生物科技有限公司。

本发明第二个方面提供了所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中加入预冷复方电解质注射液、氯化钠注射液、海藻糖液、右旋糖苷、维生素C注射液，混合均匀；然后加入预冷的人血白蛋白，混合均匀，即得。

在一种优选的实施方式中，所述冻存液制备完成后，还包括预冷的步骤。

在一种优选的实施方式中，所述预冷为2-8℃下预冷至少30min。

在一种最优选的实施方式中，所述的人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中缓慢加入预冷复方电解质注射液、氯化钠注射液、海藻糖液、右旋糖苷、维生素C注射液和硫酸乙酰肝素，混合均匀；然后缓慢加入预冷的人血白蛋白和人α1-酸性糖蛋白，混合均匀，预冷即得。

发明人认为，本体系对冻存液中除DMSO外的其他制备原料进行预冷后，能够提高人脐带间充质干细胞的存活率。发明人认为可能的原因是，常温时DMSO具有严重的细胞毒性；而深低温时，DMSO是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻冻存过程对细胞损害。另外，尽管本体系在冻存液体配置过程中已大幅降低DMSO含量，对冻存液进行预冷可以从一定程度上减少DMSO的细胞毒性，提高细胞的存活率。同时，DMSO遇水会放热，其制备完成后预冷可减少此反应对冻存液的影响。

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。

实施例

实施例1

实施例1提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、20％人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液3％、1mol/L海藻糖液6％、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液2％、人α1-酸性糖蛋白25μg/mL、硫酸乙酰肝素25μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

所述的人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中缓慢加入预冷复方电解质注射液、0.9％氯化钠注射液、1mol/L海藻糖液、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液和硫酸乙酰肝素，混合均匀；然后缓慢加入预冷的人血白蛋白和人α1-酸性糖蛋白，混合均匀，预冷即得；所述预冷为4℃下预冷60min。

实施例2

实施例2提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、20％人血白蛋白10％、0.9％氯化钠注射液1％、1mol/L海藻糖液1％、右旋糖苷-40葡萄糖注射液5％、维生素C注射液1％、人α1-酸性糖蛋白20μg/mL、硫酸乙酰肝素400μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

实施例3

实施例3提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、20％人血白蛋白25％、0.9％氯化钠注射液10％、1mol/L海藻糖液10％、右旋糖苷-40葡萄糖注射液35％、维生素C注射液5％、人α1-酸性糖蛋白30μg/mL、硫酸乙酰肝素100μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

实施例4

实施例4提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、20％人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液3％、1mol/L海藻糖液6％、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液2％、硫酸乙酰肝素25μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

所述的人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中缓慢加入预冷复方电解质注射液、0.9％氯化钠注射液、1mol/L海藻糖液、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液和硫酸乙酰肝素，混合均匀；然后缓慢加入预冷的人血白蛋白，混合均匀，预冷即得；所述预冷为4℃下预冷60min。

实施例5

实施例5提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、20％人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液3％、1mol/L海藻糖液6％、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液2％、人α1-酸性糖蛋白25μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

所述的人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中缓慢加入预冷复方电解质注射液、0.9％氯化钠注射液、1mol/L海藻糖液、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液，混合均匀；然后缓慢加入预冷的人血白蛋白和人α1-酸性糖蛋白，混合均匀，预冷即得；所述预冷为4℃下预冷60min。

实施例6

实施例6提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、0.9％氯化钠注射液3％、1mol/L海藻糖液6％、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液2％、人α1-酸性糖蛋白25μg/mL、硫酸乙酰肝素25μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

所述的人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中缓慢加入预冷复方电解质注射液、0.9％氯化钠注射液、1mol/L海藻糖液、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液和硫酸乙酰肝素，混合均匀；然后缓慢加入预冷的人α1-酸性糖蛋白，混合均匀，预冷即得；所述预冷为4℃下预冷60min。

实施例7

实施例7提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、20％人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液3％、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液2％、人α1-酸性糖蛋白25μg/mL、硫酸乙酰肝素25μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

所述的人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中缓慢加入预冷复方电解质注射液、0.9％氯化钠注射液、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液和硫酸乙酰肝素，混合均匀；然后缓慢加入预冷的人血白蛋白和人α1-酸性糖蛋白，混合均匀，预冷即得；所述预冷为4℃下预冷60min。

实施例8

实施例8提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、20％人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液3％、1mol/L海藻糖液6％、维生素C注射液2％、人α1-酸性糖蛋白25μg/mL、硫酸乙酰肝素25μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

所述的人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中缓慢加入预冷复方电解质注射液、0.9％氯化钠注射液、1mol/L海藻糖液、维生素C注射液和硫酸乙酰肝素，混合均匀；然后缓慢加入预冷的人血白蛋白和人α1-酸性糖蛋白，混合均匀，预冷即得；所述预冷为4℃下预冷60min。

实施例9

实施例9提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、20％人血白蛋白20％、0.9％氯化钠注射液3％、1mol/L海藻糖液6％、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、人α1-酸性糖蛋白25μg/mL、硫酸乙酰肝素25μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

所述的人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中缓慢加入预冷复方电解质注射液、0.9％氯化钠注射液、1mol/L海藻糖液、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％和硫酸乙酰肝素，混合均匀；然后缓慢加入预冷的人血白蛋白和人α1-酸性糖蛋白，混合均匀，预冷即得；所述预冷为4℃下预冷60min。

实施例10

实施例10提供了一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜3％、20％人血白蛋白20％、50％氯化钠注射液3％、1mol/L海藻糖液6％、右旋糖苷-40葡萄糖注射液24％、维生素C注射液2％、人α1-酸性糖蛋白25μg/mL、硫酸乙酰肝素25μg/mL、复方电解质注射液补足余量。

所述的人脐带间充质干细胞注射液冻存液的制备方法，包括以下步骤：向二甲基亚砜中缓慢加入预冷复方电解质注射液、50％氯化钠注射液、1mol/L海藻糖液、右旋糖苷-40葡萄糖注射液、维生素C注射液和硫酸乙酰肝素，混合均匀；然后缓慢加入预冷的人血白蛋白和人α1-酸性糖蛋白，混合均匀，预冷即得；所述预冷为4℃下预冷60min。

性能测试

1.冻存一年后细胞存活率测试：取适量细胞悬液样本，按1:1比例加入AO/PI染液，混匀后，取20μl加入至Countstar细胞计数板内，在细胞计数仪上选择“AO/PI”模式进行细胞计数。同一样品平行计数两次。根据计数仪显示的细胞活率计算得到平均细胞活率。

性能测试结果见表1。

表1.实施例性能测试结果

前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims

1.一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，其特征在于，所述冻存液的制备原料，至少包括以下组分：二甲基亚砜、人血白蛋白、复方电解质注射液、氯化钠注射液、海藻糖液、右旋糖苷、维生素C注射液。

2.根据权利要求1所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，其特征在于，所述冻存液的制备原料，按体积百分比计，至少包括以下组分：二甲基亚砜0-5％、人血白蛋白10-25％、氯化钠注射液1-10％、海藻糖液1-10％、右旋糖苷5-30％、维生素C注射液1-5％、复方电解质注射液补足余量。

3.根据权利要求1所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，其特征在于，还包括人α1-酸性糖蛋白。

4.根据权利要求3所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，其特征在于，所述人α1-酸性糖蛋白的浓度为20-30μg/mL。

5.根据权利要求1所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，其特征在于，还包括硫酸乙酰肝素。

6.根据权利要求5所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，其特征在于，所述硫酸乙酰肝素和人α1-酸性糖蛋白的重量比为1：(0.05-0.3)。

7.根据权利要求1所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，其特征在于，所述右旋糖苷为右旋糖酐-40和/或右旋糖酐-70。

8.根据权利要求1所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜和右旋糖苷的体积比为1：(1-10)。

9.根据权利要求1所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液，其特征在于，所述氯化钠注射液的质量分数为0.9％。

10.一种根据权利要求1所述的用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：向二甲基亚砜中加入预冷复方电解质注射液、氯化钠注射液、海藻糖液、右旋糖苷、维生素C注射液，混合均匀；然后加入预冷的人血白蛋白，混合均匀，即得；所述预冷为2-8℃下保存至少30min。