CN114521548A - 一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法 - Google Patents

一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鹿茸干细胞研究技术领域，尤其涉及一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法。本发明中的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，以DMSO、人血白蛋白、海藻糖、右旋糖軒和生理氯化钠溶液制备冷冻保存液。其中DMSO能减少基因漂移，减缓细胞系的衰老，减少微生物污染。人血白蛋白具有结合、运输内源性及外源性质，利于保持干细胞性能。海藻糖和右旋糖軒在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用。鹿茸干细胞经过与冷冻保存液混合、液氮冷冻、水浴复苏，有效保证了鹿茸干细胞的活性，延长其存储时间，方便对鹿茸干细胞的研究。

Description

一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法
技术领域
本发明涉及鹿茸干细胞研究技术领域，尤其涉及一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法。
背景技术
鹿茸是哺乳动物中罕见的能够周期性完全再生的器官，是研究哺乳动物器官再生的绝好模型。而鹿茸的周期性再生是一个基于干细胞的过程，鹿茸干细胞(ASC)存在于生茸区骨膜(AP)与角柄骨膜(PP)中。鹿茸干细胞不像胚胎干细胞那样嵌合到整个宿主的组织中，也不像间充质干细胞那样完全消失，而是有限地嵌合到一些组织中，特别是嵌合到了生殖系统中。对再生医学有着重要意义。然而现有的冻存液组成相对单一，缺少必要的维持因子等，复苏后细胞活率较低。因此需要一种有效保持鹿茸干细胞鹿茸干细胞的冻存和复苏方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
针对背景技术中存在的问题，提出一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法。本发明中的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，以DMSO、人血白蛋白、海藻糖、右旋糖軒和生理氯化钠溶液制备冷冻保存液。其中DMSO能减少基因漂移，减缓细胞系的衰老，减少微生物污染。人血白蛋白具有结合、运输内源性及外源性质，利于保持干细胞性能。海藻糖和右旋糖軒在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用。鹿茸干细胞经过与冷冻保存液混合、液氮冷冻、水浴复苏，有效保证了鹿茸干细胞的活性，延长其存储时间，方便对鹿茸干细胞的研究。
本发明提出一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，方法步骤包括：
S1、制备冷冻保护液；冷冻保护液的配置比例为20％-30％的DMSO、2％-7％的人血白蛋白、0.5％-1％的海藻糖、10％-12％的右旋糖軒和50％-70％的生理氯化钠溶液；
S2、将鹿茸干细胞与S1中的冷冻保护液混合，得到细胞悬浊液，至于无菌冷冻管中；
S3、按照4℃1h、-20℃1h、-80℃1h、-196℃1h的顺序进行液氮冻存；
S4、将冷冻管投入37℃水浴中，振荡直至细胞悬浊液完全融化；
S5、离心，缓冲液洗涤除去冷冻保护液。
优选的，冷冻保护液的配置比例为20％的DMSO、2％的人血白蛋白、0.5％的海藻糖、10％的右旋糖軒和7.5％的生理氯化钠溶液。
优选的，冷冻保护液的配置比例为30％的DMSO、7％的人血白蛋白、1％的海藻糖、10％的右旋糖軒和52％的生理氯化钠溶液。
优选的，冷冻保护液的配置比例为25％的DMSO、5％的人血白蛋白、0.5％的海藻糖、11％的右旋糖軒和58.5％的生理氯化钠溶液。
优选的，DMSO的浓度为10v/v％。
优选的，鹿茸干细胞来自生茸区骨膜与角柄骨膜中，干细胞的密度为1-20×106细胞/m，为P1-P9代干细胞。
优选的，人血白蛋白的浓度为20％。
优选的，细胞生长因子为替代血清。
优选的，缓冲液为PBS。
与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
本发明中的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，以DMSO、人血白蛋白、海藻糖、右旋糖軒和生理氯化钠溶液制备冷冻保存液。其中DMSO能减少基因漂移，减缓细胞系的衰老，减少微生物污染。人血白蛋白具有结合、运输内源性及外源性质，利于保持干细胞性能。海藻糖和右旋糖軒在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用。鹿茸干细胞经过与冷冻保存液混合、液氮冷冻、水浴复苏，有效保证了鹿茸干细胞的活性，延长其存储时间，方便对鹿茸干细胞的研究。
附图说明
图1为本发明一种实施例结构示意图。
具体实施方式
实施例一
如图1所示，本发明提出的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，方法步骤包括：
S1、制备冷冻保护液；冷冻保护液的配置比例为20％-30％的DMSO、2％-7％的人血白蛋白、0.5％-1％的海藻糖、10％-12％的右旋糖軒和50％-70％的生理氯化钠溶液；
S2、将鹿茸干细胞与S1中的冷冻保护液混合，得到细胞悬浊液，至于无菌冷冻管中；
S3、按照4℃1h、-20℃1h、-80℃1h、-196℃1h的顺序进行液氮冻存；
S4、将冷冻管投入37℃水浴中，振荡直至细胞悬浊液完全融化；
S5、离心，缓冲液洗涤除去冷冻保护液。
实施例二
如图1所示，本发明提出的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，方法步骤包括：
S1、制备冷冻保护液；冷冻保护液的配置比例为20％-30％的DMSO、2％-7％的人血白蛋白、0.5％-1％的海藻糖、10％-12％的右旋糖軒和50％-70％的生理氯化钠溶液；
S2、将鹿茸干细胞与S1中的冷冻保护液混合，得到细胞悬浊液，至于无菌冷冻管中；
S3、按照4℃1h、-20℃1h、-80℃1h、-196℃1h的顺序进行液氮冻存；
S4、将冷冻管投入37℃水浴中，振荡直至细胞悬浊液完全融化；
S5、离心，缓冲液洗涤除去冷冻保护液。
进一步的，冷冻保护液的配置比例为20％的DMSO、2％的人血白蛋白、0.5％的海藻糖、10％的右旋糖軒和7.5％的生理氯化钠溶液。
进一步的，鹿茸干细胞来自生茸区骨膜与角柄骨膜中，干细胞的密度为1-20×106细胞/m，为P1-P9代干细胞。人血白蛋白的浓度为20％。DMSO的浓度为10v/v％。细胞生长因子为替代血清。缓冲液为PBS。
鹿茸的处理方法如下：取生长期10-70天的鹿茸，无菌纱布去除鹿茸表面的灰尘及血污，备皮后用75％酒精进行消毒处理；在超净工作台中，用一次性无菌组织切片刀片切下3-5cm厚的鹿茸尖端组织，置于无菌培养皿中，然后沿纵向将其分割为0.5-lcm厚的薄片，舍弃最外侧的两片其余保留；薄片平放于无菌培养皿中，用刀片刮去表面血污后，沿着皮肤下结缔组织将皮层和皮下组织分割开来，取皮下组织中微微凸起的弧形半透明样组织，厚度5-8mm，此半透明组织即为鹿茸间充质层；利用手术刀将间充质层组织块分别切割成0.2mmX0.2mmX0.2mm规格，用PBS缓冲液反复冲洗，直至血污完全去除。
鹿茸干细胞制备方法如下：对处理好的鹿茸再次粉碎，转入50mL离心管中，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；向沉淀中加入30mL消化液，震荡进行消化，每间隔lOmin在显微镜下观察消化情况，在碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，加lOmL DMEM原代培养液洗涤，然后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；取沉淀0.5-1g，均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3mL的DMEM原代培养液，置于CO2浓度为5％，37℃的培养箱中培养2-4h，正置培养瓶继续静置培养，4-7天后在显微镜下观察组织块的贴壁及细胞发散情况，当细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化、冻存，获得原代鹿茸干细胞。
实施例三
如图1所示，本发明提出的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，方法步骤包括：
S1、制备冷冻保护液；冷冻保护液的配置比例为20％-30％的DMSO、2％-7％的人血白蛋白、0.5％-1％的海藻糖、10％-12％的右旋糖軒和50％-70％的生理氯化钠溶液；
S2、将鹿茸干细胞与S1中的冷冻保护液混合，得到细胞悬浊液，至于无菌冷冻管中；
S3、按照4℃1h、-20℃1h、-80℃1h、-196℃1h的顺序进行液氮冻存；
S4、将冷冻管投入37℃水浴中，振荡直至细胞悬浊液完全融化；
S5、离心，缓冲液洗涤除去冷冻保护液。
进一步的，冷冻保护液的配置比例为30％的DMSO、7％的人血白蛋白、1％的海藻糖、10％的右旋糖軒和52％的生理氯化钠溶液。
进一步的，鹿茸干细胞来自生茸区骨膜与角柄骨膜中，干细胞的密度为1-20×106细胞/m，为P1-P9代干细胞。人血白蛋白的浓度为20％。DMSO的浓度为10v/v％。细胞生长因子为替代血清。缓冲液为PBS。
鹿茸的处理方法如下：取生长期10-70天的鹿茸，无菌纱布去除鹿茸表面的灰尘及血污，备皮后用75％酒精进行消毒处理；在超净工作台中，用一次性无菌组织切片刀片切下3-5cm厚的鹿茸尖端组织，置于无菌培养皿中，然后沿纵向将其分割为0.5-lcm厚的薄片，舍弃最外侧的两片其余保留；薄片平放于无菌培养皿中，用刀片刮去表面血污后，沿着皮肤下结缔组织将皮层和皮下组织分割开来，取皮下组织中微微凸起的弧形半透明样组织，厚度5-8mm，此半透明组织即为鹿茸间充质层；利用手术刀将间充质层组织块分别切割成0.2mmX0.2mmX0.2mm规格，用PBS缓冲液反复冲洗，直至血污完全去除。
鹿茸干细胞制备方法如下：对处理好的鹿茸再次粉碎，转入50mL离心管中，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；向沉淀中加入30mL消化液，震荡进行消化，每间隔lOmin在显微镜下观察消化情况，在碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，加lOmL DMEM原代培养液洗涤，然后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；取沉淀0.5-1g，均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3mL的DMEM原代培养液，置于CO2浓度为5％，37℃的培养箱中培养2-4h，正置培养瓶继续静置培养，4-7天后在显微镜下观察组织块的贴壁及细胞发散情况，当细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化、冻存，获得原代鹿茸干细胞。
实施例四
如图1所示，本发明提出的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，方法步骤包括：
S1、制备冷冻保护液；冷冻保护液的配置比例为20％-30％的DMSO、2％-7％的人血白蛋白、0.5％-1％的海藻糖、10％-12％的右旋糖軒和50％-70％的生理氯化钠溶液；
S2、将鹿茸干细胞与S1中的冷冻保护液混合，得到细胞悬浊液，至于无菌冷冻管中；
S3、按照4℃1h、-20℃1h、-80℃1h、-196℃1h的顺序进行液氮冻存；
S4、将冷冻管投入37℃水浴中，振荡直至细胞悬浊液完全融化；
S5、离心，缓冲液洗涤除去冷冻保护液。
进一步的，冷冻保护液的配置比例为25％的DMSO、5％的人血白蛋白、0.5％的海藻糖、11％的右旋糖軒和58.5％的生理氯化钠溶液。
进一步的，鹿茸干细胞来自生茸区骨膜与角柄骨膜中，干细胞的密度为1-20×106细胞/m，为P1-P9代干细胞。人血白蛋白的浓度为20％。DMSO的浓度为10v/v％。细胞生长因子为替代血清。缓冲液为PBS。
鹿茸的处理方法如下：取生长期10-70天的鹿茸，无菌纱布去除鹿茸表面的灰尘及血污，备皮后用75％酒精进行消毒处理；在超净工作台中，用一次性无菌组织切片刀片切下3-5cm厚的鹿茸尖端组织，置于无菌培养皿中，然后沿纵向将其分割为0.5-lcm厚的薄片，舍弃最外侧的两片其余保留；薄片平放于无菌培养皿中，用刀片刮去表面血污后，沿着皮肤下结缔组织将皮层和皮下组织分割开来，取皮下组织中微微凸起的弧形半透明样组织，厚度5-8mm，此半透明组织即为鹿茸间充质层；利用手术刀将间充质层组织块分别切割成0.2mmX0.2mmX0.2mm规格，用PBS缓冲液反复冲洗，直至血污完全去除。
鹿茸干细胞制备方法如下：对处理好的鹿茸再次粉碎，转入50mL离心管中，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；向沉淀中加入30mL消化液，震荡进行消化，每间隔lOmin在显微镜下观察消化情况，在碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化，在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，加lOmL DMEM原代培养液洗涤，然后在1000rpm的条件下离心5min，弃上清液，收集沉淀；取沉淀0.5-1g，均匀涂在细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入2-3mL的DMEM原代培养液，置于CO2浓度为5％，37℃的培养箱中培养2-4h，正置培养瓶继续静置培养，4-7天后在显微镜下观察组织块的贴壁及细胞发散情况，当细胞达到70％汇合，将细胞进行胰蛋白酶消化、冻存，获得原代鹿茸干细胞。
本发明中的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，以DMSO、人血白蛋白、海藻糖、右旋糖軒和生理氯化钠溶液制备冷冻保存液。其中DMSO能减少基因漂移，减缓细胞系的衰老，减少微生物污染。人血白蛋白具有结合、运输内源性及外源性质，利于保持干细胞性能。海藻糖和右旋糖軒在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于此，在所属技术领域的技术人员所具备的知识范围内，在不脱离本发明宗旨的。其中提下还可以作出各种变化。

Claims (9)

1.一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，其特征在于，方法步骤包括：
S1、制备冷冻保护液；冷冻保护液的配置比例为20％-30％的DMSO、2％-7％的人血白蛋白、0.5％-1％的海藻糖、10％-12％的右旋糖軒和50％-70％的生理氯化钠溶液；
S2、将鹿茸干细胞与S1中的冷冻保护液混合，得到细胞悬浊液，至于无菌冷冻管中；
S3、按照4℃1h、-20℃1h、-80℃1h、-196℃1h的顺序进行液氮冻存；
S4、将冷冻管投入37℃水浴中，振荡直至细胞悬浊液完全融化；
S5、离心，缓冲液洗涤除去冷冻保护液。
2.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，其特征在于，冷冻保护液的配置比例为20％的DMSO、2％的人血白蛋白、0.5％的海藻糖、10％的右旋糖軒和7.5％的生理氯化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，其特征在于，冷冻保护液的配置比例为30％的DMSO、7％的人血白蛋白、1％的海藻糖、10％的右旋糖軒和52％的生理氯化钠溶液。
4.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，其特征在于，冷冻保护液的配置比例为25％的DMSO、5％的人血白蛋白、0.5％的海藻糖、11％的右旋糖軒和58.5％的生理氯化钠溶液。
5.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，其特征在于，DMSO的浓度为10v/v％。
6.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，其特征在于，鹿茸干细胞来自生茸区骨膜与角柄骨膜中，干细胞的密度为1-20×106细胞/m，为P1-P9代干细胞。
7.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，其特征在于，人血白蛋白的浓度为20％。
8.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，其特征在于，细胞生长因子为替代血清。
9.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞冻存和复苏方法，其特征在于，缓冲液为PBS。
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