CN1184884C - 组织等效物的冷冻保存方法和冷冻保存的组织等效物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供组织等效物的冷冻保存方法可以提高冷冻细胞的存活率以及融解细胞的生物活性。进一步提供由本发明方法而制得的冷冻保存的组织等效物。将在冷冻保存液中悬浮的细胞接种在基材上，在细胞和基材发生粘附之前进行冷冻。

Description

组织等效物的冷冻保存方法 和冷冻保存的组织等效物
技术领域
本发明涉及组织等效物的冷冻保存方法和冷冻保存的组织等效物。进一步详细地说是涉及由在冷冻保存液中悬浮细胞工序、在基材上接种该细胞工序、以及由此得到的组织等效物在细胞和基材粘附前使其冷冻的工序构成的组织等效物的冷冻保存方法以及利用该方法得到的冷冻保存的组织等效物。
背景技术
作为现有一般的组织等效物的保存方法，是采用在培养基中悬浮细胞、在基材上接种培养、使其粘附到基材上，在冷冻保存液中浸泡一定时间、达到平衡后，缓缓冷却冷冻的方法。
但是，现有方法存在细胞生存率非常低之外，为调节下降一定的温度又必需精密而且昂贵的程序冷冻仪等冷冻装置的问题。另外还存在为和基材粘附，需要细胞经预培养工序(数小时到过夜)或在冷冻前用冷冻保存液洗细胞的工序，进一步往细胞内浸透冷冻保存液以及达到平衡都需要时间的问题。
特别是在人造皮肤，特许公报第2722134号公开了片状上皮细胞在冷冻状态保存的方法，另外在特开平第8-23968号公报中还公开了利用溶胶—凝胶法固定培养皮肤，以及保存·运输的方法。
还有在特表平第9-505032号公报中记载了通过在冷冻保护剂溶液中浸泡搅拌组织等效物，使冷冻保护剂溶液充分浸透组织等效物时、冷冻组织等效物的冷冻保存方法。这种方法即使在组织等效物比较厚且不均匀的情况下，也能无损地保全结构、保持着细胞生命力而使组织等效物的冷冻保存成为可能，但在冷冻保护剂溶液浸透时需要时间这一点上，还是不能充分满足冷冻保存工序的简单化。
还有，植物细胞的冷冻保存方法以及解冻方法在特开平第9-87102号公报中、人造肝脏的冷冻保存方法在特开昭第53-56897号公报、特开平2-71755号公报以及特表平11-506687号公报中、角膜组织等效物的冷冻保存方法在美国专利5374515号公报中分别有记载。但是，这些方法并不能充分满足冷冻细胞的高存活率、融解后的高生物活性(例如细胞的增殖活性(率)、物质生产能力等)以及冷冻保存工序的简单化。
因此，本发明的目的是提高冷冻细胞的存活率和融解细胞的生物活性，并且提供工序简化的组织等效物的冷冻方法。进一步本发明的目的是还提供由该方法得到的冷冻保存的组织等效物。
发明的公开
本发明人为解决上述问题进行了深入地研究，结果发现将冷冻保存液中悬浮的细胞接种在基材上，在细胞和基材粘附之前进行冷冻，可以维持细胞的高存活率和生物活性而保存组织等效物，从而完成了本发明。
即，本发明涉及：
一种组织等效物的冷冻保存方法，由在冷冻保存液中悬浮细胞的工序、在基材上接种该细胞的工序、以及将得到的组织等效物在细胞和基材粘附前使其冷冻的工序构成；
细胞是选自来自哺乳动物的成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞、朗格尔汉斯细胞、黑素细胞、脂肪细胞、毛母细胞、毛乳头细胞、平滑肌细胞、肝细胞、角膜实质细胞、角膜上皮细胞以及角膜内皮细胞中1种以上的上述冷冻保存方法；以及
由在冷冻保存液中悬浮细胞工序、在基材上接种该细胞工序、以及得到的组织等效物在细胞和基材粘附前使其冷冻的工序构成的方法得到的冷冻保存的组织等效物。
实施发明的最佳方案
本发明中使用的“细胞”是最终作为人造皮肤、人造肝脏、人造角膜所使用者。具体地说，人造皮肤时，优选选自源于哺乳动物的成纤维细胞、表皮细胞、朗格尔汉斯细胞、黑素细胞、脂肪毛母细胞以及毛乳头细胞中的一种以上；人造血管时，优选选自血管内皮细胞、平滑肌细胞以及成纤维细胞中的一种以上，人造肝脏时，优选肝细胞，人造角膜时，优选自角膜实质细胞、角膜上皮细胞以及角膜内皮细胞中的1种以上。
本发明的“悬浮”是指在溶液中将细胞分散的操作。
还有，本发明的“接种”是指将悬浮在培养基等中的细胞植入培养容器的培养基中或者基材中的过程。
进一步，本发明的“冷冻”是指在基材上接种细胞而制得的组织等效物不经培养，就立即冷冻保存的工序。由于经过预培养使细胞粘附到基材上之后冷冻，细胞存活率非常低，所以优选在细胞接种后，细胞和基材粘附前将细胞冷冻。此时，细胞和基材不粘附，融解后的清洗几乎不造成细胞损失。这里所说的粘附是指在加了物理学上的力时，也不能使细胞从基材上容易地脱离的状态。还有，细胞接种后，优选在细胞容易从基材脱离的时间内，将细胞冷冻。在此脱离是指细胞从基材容易脱离而在溶液中浮游的状态。因此具体地说必须以使细胞和基材不发生粘附的速度冷却到4～10℃。冷却速度慢时，细胞和基材就发生粘附，这种状态下冷冻组织等效物会使细胞的存活率下降。这时的冷却速度根据使用的细胞以及冷冻保存液的种类、冷却开始时组织等效物的温度等而变。例如在厚2-3mm的胶原蛋白海绵上接种成纤维细胞的人造皮肤情况下，在4℃～常温接种细胞时，优选在3小时内冷却至4℃。
本发明的冷冻方法没有特别的限制，优选缓冷冻法、快速冷冻法以及玻璃化冷冻法等。
在此，“缓冷冻法”是指用添加了冷冻保护剂的溶液、使人造在细胞外形成的冰晶，通过缓慢而且适当的冷却速度冷却而渐渐地增长，以缓慢的速度使细胞内脱水浓缩、随后通过快速冷却、防止细胞胞内冷冻而保存，得到融解后高存活率的方法(日本胚移植学杂志第18卷1期、“由体外受精的牛胚的玻璃化保存”、家畜改良事业团·家畜生命科技中心)。冷却速度，以上述的那样使细胞和基材不发生粘附的温度冷却到4℃，之后优选以-0.1℃/分～-10℃/分，更优选-0.2℃/分～-5℃/分的速度降到至少达-20℃或者更低的温度。
“快速冷冻法”是指用添加了冷冻保护剂的溶液、在超低温冰箱等中快速使组织等效物(或者细胞)冷却冷冻至冰点以下的方法。冷却至4速度以上述的那样使细胞和基材不发生粘附的温度冷却到4℃，之后优选-10℃/分～-30℃/分，更优选-10℃/分～-20℃/分。如果快于-30℃/分，细胞内发生结冻，有细胞破碎的危险。
“玻璃化冷冻法”是指在添加了高浓度冷冻保护剂的溶液(称为玻璃化溶液，通常是细胞渗透性溶液和非细胞渗透性溶液合用)中使细胞浮游后，通过投入液氮等使其快速冷却冷冻的方法。这是应用高浓度水溶液在快速冷却时，成为不存在冰晶核的玻璃化(Vitrification)状态的现象(生殖细胞培养法，学术出版中心，1983年；研究期刊21(9)，志水学著，1998年)。本方法可使组织等效物在数秒内冷冻。
本发明的方法中组织等效物的保存温度，为了长时间维持高的生物活性，无论上述三种冷冻方法的哪一种都优选-20℃～-196℃，更优选-80℃～-196℃。在比-20℃高的温度下长期保存(数月以上)，可使细胞的存活率下降。因此，短期保存时，-20℃完全可以，但长期保存时，就需要在较低温度下保存。在-80℃时，可以保存1-2年，在-120℃以下(氮蒸汽)或者-196℃(液氮)时，可以半永久地保存。
本发明中使用的“冷冻保存液”是指含有选自具有细胞防冻伤效果的冷冻保护剂中至少一种的溶液。
在缓冷冷冻法和快速冷冻法中，作为冷冻保护剂，优选选自甘油、二甲亚砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇、蔗糖、羟甲基纤维素盐、羟甲基纤维素、单糖类和二糖类(海藻糖等)中的至少一种。溶剂使用水系溶液。特别优选生理盐类溶液。生理盐类溶液是指具有适合细胞生存的pH和渗透压的盐水溶液，可以举生理盐水(0.9％水溶液)、在生理盐水中补充了K+、Ca2+等数种主要离子的盐类溶液或者各种细胞培养液等。具体地可以举DMEM(Dulbeco改良Eagles培养基)、磷酸缓冲液、Ringer氏液、Ringer-Locke氏液、Tyrode氏液、Earle氏液、Hank氏液、Locke氏液、Eagle最小必须培养液、Ham合成培养液F12、Green培养液、Leibovitz的L-15培养液、Cheese必须培养液、改良Eagle氏培养液、Waymouth培养液、Kreb氏培养液以及无血清培养液MCDB153、MCDB151、MCDB104、MCDB131、MCDB402、MCDB201、MCDB302、MCDB105和MCDB110等。
在玻璃化冷冻法中，作为冷冻保护剂可以使用非细胞浸透性玻璃化剂和/或细胞浸透性玻璃化剂。作为非细胞浸透性玻璃化剂优选聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech公司制)以及葡聚糖等多糖类，以及蔗糖等；作为细胞浸透性玻璃化剂优选甘油、丙二醇、乙二醇以及DMSO等。还有作为溶剂，缓冷冷冻法和快速冷冻法同样优选生理盐类溶液，具体可以举DMEM、磷酸缓冲液、Ringer氏液、Ringer-Locke氏液、Tyrode氏液、Earle氏液、Hank氏液、Locke氏液、Eagle氏最小必须培养液、Ham合成培养液F12、Green氏培养液、Leibovitz的L-15培养液、Cheese必须培养液、改良Eagle氏培养液、Waymouth培养液、Kreb氏培养液以及无血清培养液MCDB153、MCDB151、MCDB104、MCDB131、MCDB402、MCDB201、MCDB302、MCDB105和MCDB110等。
本发明使用的“基材”必须是给患者使用(贴附)组织等效物后不被患者的免疫机能排斥的、有优良的机体适应性的材料。还有优选用后不需要去除的、具有生物降解性的材料。具体地说是来自生物体的材料，优选胶原蛋白、明胶、甲壳素、壳聚糖、纤维蛋白，以及软骨素、硫酸软骨素以及透明质酸等粘多糖类；生物降解性高分子的聚乙醇酸、聚乳酸以及这些的混合物；非生物降解性的合成高分子中细胞粘附性优良的聚氨酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等；以及由这些组成的混合物。进一步，更优选具有优良的生物体适应性、基材内适宜细胞存留那样的多孔质、具有海绵状形态的不全胶原蛋白(atelocollagen)、胶原蛋白、明胶、硫酸软骨素、透明质酸。细胞接种时，为使细胞容易浸透海绵，孔是和细胞接种面垂直的纵向孔，希望在表面和/或和表面相对的面形成一定大小的孔。孔径为利于接种时细胞浸透并且不利于气泡进入，所以优选20μm-1000μm的范围。但是，只要能实现本发明的目的，并不是非要限定在这个范围。
本发明的“组织等效物”是指由基材和来自哺乳动物的细胞一起组合形成的、至少与哺乳动物组织具有一部分同等机能的构成物。因此，本发明的组织等效物含有基材和该组织有代表性的细胞。因为这些有代表性的细胞在基材或者内部具有和该组织细胞同等的活性，因此该组织等效物是以①组织损伤、切除等造成患者的组织或脏器机能不全，为此为全部或部分取代该组织或脏器而通过各种方法进行移植或者植入为目的，或者以②调查各种制品·原材料和组织的相互作用，或者这些对组织影响为目的而使用。
本发明的“人造皮肤”是指由基材和来自哺乳类皮肤的细胞(成纤维细胞、表皮细胞、朗格尔汉斯细胞、黑素细胞、脂肪细胞、毛母细胞、毛乳头细胞等)组成而制成的哺乳类(特别是人类)的皮肤组织等效物。本发明的人造皮肤，以促进创伤愈合为目的，适用于由热致伤的部位、溃疡部位、褥疮部位、采皮部位等各种皮肤的缺损部位。构成人造皮肤的各种细胞可以在创伤面增殖的同时，合成·分泌对创伤愈合有效的物质(通过促进各种细胞增殖·移动以及增殖因子的分泌而促进创伤愈合的细胞因子，周围细胞移动成为再形成组织时的基础的细胞外基质等)。
本发明的“人造肝脏”是指由基材和来自哺乳动物的肝细胞组合而制成的哺乳动物肝脏等效物。该人造肝脏是以代行肝脏担负的机能；生命必需物的代谢或合成、有害物质的异化作用、除去代谢产物中的部分功能为目的而开发的，并有望作为治疗末期急性和慢性肝衰竭患者而应用于临床。
作为人造皮肤的一般制作方法，首先利用来自皮肤细胞调制细胞悬浮液后，在基材上接种该细胞悬浮液而制得。以下例示从成纤维细胞制作人造皮肤。
首先在清洁的环境下对采取的皮肤(含有表皮以及真皮的一部分或者全部)进行消毒、用含有抗生素的生理盐水或者Hanks’液等缓冲液浸泡，这些皮肤在分散酶(disperse)浓度调至1000IU/ml的DMEM中浸泡后，真皮与表皮分离。将得到的真皮用剪子仔细剪碎，再用均化器等粉碎，在0.5％胶原酶溶液(含有0.5％(w/v)胶原酶的DMEM)中浸泡，在37℃振荡使结缔组织溶解。其次在约200～1000×g下离心分离，回收真皮成纤维细胞。得到的成纤维细胞在添加了FBS(胎牛血清)达到10％(v/v)等的DMEM(以下称DMEM+10％FBS)等作为培养液，在37℃进行培养。根据情况，可进行传代培养。培养的成纤维细胞用0.25％胰蛋白酶溶液(含有0.25％(w/v)胰蛋白酶以及0.005mM乙二胺四乙酸钠(EDTA)的磷酸缓冲液)使其从培养瓶剥离，经离心分离回收。将得到的成纤维细胞的沉淀在DMEM等中进行悬浮调制成纤维细胞悬浮液。得到的成纤维细胞悬浮液的细胞浓度用血细胞计数板等进行测定。再其次是再次离心分离回收成纤维细胞，使用含有甘油等冷冻保护剂的冷冻保存液，调制密度为1×104～5×106细胞/ml，优选5×105～2×106细胞/ml的悬浮液。在来自猪或者牛的不全胶原蛋白溶液胶化以及冷冻干燥得来的、具有纵向空孔的胶原蛋白海绵中，以1×102～1×106细胞/cm2，优选1×104～2×105细胞/cm2的细胞密度接种上述成纤维细胞悬浮液。等细胞悬浮浸透海绵并静置后，得到组织等效物。
人造肝脏的情况下，作为细胞的分离法举例可以用胶原酶溶液灌流肝组织，使细胞分散的胶原酶灌流法，但是本发明并不依赖这些分离技术。还有，使用的培养基可举在DMEM、Cheese必需培养基、改良Eagle氏培养基、Leibovitz氏培养基、Waymouth氏培养基、Kreb氏培养基、Green氏培养基、L-15培养基等中添加了10％(v/v)FBS的培养基等，具体地优选在Green氏培养基中添加了10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素钠的培养基。
人造角膜的情况下，作为角膜上皮、角膜实质、角膜内皮细胞从组织分离方法例，首先在分散酶溶液中浸泡、通过加温·振荡使角膜内皮细胞剥离，其次用剪刀或者剃刀在显微镜下从角膜上剥离角膜上皮，仔细切碎分离使角膜上皮细胞、得到除去角膜内皮以及角膜上皮细胞的角膜在盘子上进行培养，回收从组织上脱离的细胞而分离角膜实质细胞的方法(Adclheid I.Schneider等，In Vitro Cell.Dev.Biol-Animal，Vol.35.515-526(1999)和Yoichi Minami等，InvestigativeOphthalmology & Visual Science，Vol.34.2316-2324(1993))虽然以上方法是为人所知的，但本发明并不依赖于这些分离技术。还有，使用的培养基在角膜实质细胞的情况下，可举在DMEM，改良Eagle氏培养基、Eagle氏最小必须培养基、以及改良Eagle氏培养基等中添加了10％(v/v)FBS的培养基等，优选DMEM+10％FBS。还有，角膜上皮细胞的情况下，优选在Green氏培养基等中添加了10％(v/v)FBS的培养基。
以下，通过实施例说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1-1：来自人成纤维细胞的人造皮肤的缓冷冷冻保存
A按照本发明的方法进行人造皮肤的冷冻保存
使用培养瓶(培养面积80cm2)，在DMEM+10％FBS中培养人成纤维细胞。对数增殖期中的成纤维细胞用0.25％胰蛋白酶处理并回收。分别在FBScryo(含有20％(v/v)FBS和10％(v/v)甘油的DMEM)、Cell Banker-II(日本全药工业(株)制)、Cellvation(ICN生物医学公司制)三种类的冷冻保存液中将细胞悬浮，制成9.0×105细胞/ml的细胞悬浮液。事先在12孔板放入直径22mm的圆形胶原蛋白海绵，各接种0.5ml细胞悬浮液(1.2×105细胞/cm2)。静置至细胞悬浮液浸透海绵后，将12孔板以-0.5～-2℃/分的速度冷却冷冻。
A-1)人造皮肤的融解以及存活率测定
在-80℃保存一定期间后的人造皮肤，用5％二氧化碳、37℃的条件下静置10～15分钟使其融解。吸取除去培养基后，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。添加2ml DMEM+10％FBS或者DMEM后，在5％二氧化碳、37℃条件下进行15小时以上培养。其次将得到的人造皮肤浸泡在5.0ml的0.5％胶原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振荡5-10分钟使该人造皮肤溶解。在约400×g、4℃的条件下，进行5分钟离心操作回收细胞、测定存活率。细胞的存活率在表1中表示。不管使用哪种冷冻保存液，在冷冻时存活率急剧下降，之后1个月左右存活率几乎不变、或者呈缓慢下降。还有，1个月以上仍得到了50％以上的存活率。
表1
冷冻保存液                         细胞存活率(％)
    0日     1日     1星期     1个月     3个月
 FBScryoCellbankerCellvation     97.297.297.2     70.2--     62.959.869.9     58.267.359.0     42.339.557.1
A-2)人造皮肤的融解以及生物活性的测定
A-2-1：细胞增殖率
在-80℃保存的人造皮肤用5％二氧化碳、37℃条件下静置10～15分钟使其融解。吸取除去培养基后，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。添加2ml DMEM+10％FBS或者DMEM后，在5％二氧化碳、37℃条件下进行3日或7日培养。其次将得到的人造皮肤浸泡在5.0ml的0.5％胶原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振荡5-10分钟使该组织等效物溶解。在约400×g、4℃的条件下，进行5分钟离心操作回收细胞、用台盼蓝色素排除法对总细胞数、活细胞数以及细胞存活率进行计数。特别是在DMEM+10％FBS培养情况下，培养3日后-7日后活细胞数增加到1.4倍。表2中表示融解后人造皮肤中的活细胞数。
表2
保存方法 细胞 保存用培养基 培养用培养基          活细胞数(个)
  培养3日后   培养7日后
本发明 缓冷冷冻缓冷冷冻 浮游浮游   FBScryoFBScryo     DMEM+10％FBSDMEM   1.41×1051.30×105   1.94×1051.42×105
比较例 不冷冻不冷冻 粘附粘附   DMEM+10％FBSDMEM     DMEM+10％FBSDMEM   3.07×1052.36×105   2.44×1052.04×105
A-2-2：血管内皮细胞增殖因子(VEGF)产生能力
在-80℃保存的人造皮肤用5％二氧化碳、37℃条件下静置10～15分钟使其融解。吸取除去培养基后，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。分别添加各培养液2ml后，在5％二氧化碳、37℃的条件下培养。培养3日后回收培养上清液，用酶联免疫分析(ELISA)法测定上清液中的VEGF量。做为对照，对没有进行冷冻的人造皮肤进行同样的测定。在活细胞的vEGF产生量方面，冷冻的人造皮肤(表3中的①和②)和不冷冻的人造皮肤(表3的③和④)之间几乎没有差异。表3表示培养3日后人造皮肤的VEGF产生量(pg/ml/105活细胞)。
表3
保存方法 保存培养基     VEGF产生量(pg/ml/105活细胞)
本发明 ①缓冷冷冻②缓冷冷冻   DMEM+10％FBSDMEM     13991474
比较例 ③不冷冻④不冷冻   DMEM+10％FBSDMEM     9831137
A-2-3：胶原蛋白型I产生能力
在-80℃保存的人造皮肤，用5％二氧化碳、37℃的条件下静置10～15分钟使其融解。吸取除去培养基后，用2ml DMEM洗2次。添加2ml DMEM后，在5％二氧化碳、37℃条件下进行培养。培养3日后回收培养上清液，用ELISA法测定上清液中的胶原蛋白I型的量。作为对照，对没有进行冷冻的人造皮肤进行同样的测定。由于本发明人使用的抗胶原蛋白I型抗体和培养基含有血清中的牛胶原蛋白发生交叉反应，所以仅对在DMEM上培养的人造皮肤进行了胶原蛋白I型的定量。培养3日后活细胞的胶原蛋白产生量和非冷冻的人造皮肤几乎一样。表4表示培养3日后人造皮肤的胶原蛋白型I产生量(ng/ml/105活细胞)。
表4
保存方法 培养基     胶原蛋白I型的产生量(ng/ml/105活细胞)
  缓冷冷冻(本发明)     DMEM     1883
  不冷冻(比较例)     DMEM     1928
B利用现有方法的人造皮肤的冷冻保存
使用培养瓶(培养面积80cm2)，在DMEM+10％FBS中培养人成纤维细胞。对数增殖期中的成纤维细胞用0.2％胰蛋白酶溶液处理并回收。用DMEM+10％FBS调制9.0×105细胞/ml的细胞悬浮液。事先在12孔板放入直径22mm的圆形胶原蛋白海绵，各接种0.5ml细胞悬浮液(1.2×105细胞/cm2)。将12孔板在5％二氧化碳、37℃条件下进行15小时以上培养。在确认细胞已经粘附时，吸取除去培养基后，用冷冻保存液(FBScryo、Cell BonkerII、Cellvation)2ml分别洗2次。各孔中分别添加冷冻保存液2ml，将12孔板以-0.5～2℃/分的速度进行冷却冷冻。
B-1)人造皮肤的融解以及存活率测定
在-80℃保存必要期间的人造皮肤用5％二氧化碳、37℃条件下静置10～15分钟使其融解。吸取除去培养基后，用2ml DMEM+10％FBS或者DMEM洗2次。添加2ml DMEM+10％FBS或者DMEM后，在5％二氧化碳、37℃条件下进行15小时以上培养。其次将得到的人造皮肤浸泡在5.0ml的0.5％胶原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振荡5-10分钟使该组织等效物溶解。在约400×g、4℃的条件下，进行5分钟离心操作回收细胞。冷冻1日后溶解人造皮肤测定总细胞数、活细胞数以及细胞的存活率。细胞和胶原蛋白海绵粘附状态下缓冷冷冻，与冷冻保存液的种类无关，细胞的存活率非常低，仅10～20％。表5表示细胞的存活率。
表5
    冷冻保存液     组成或制造商     细胞存活率(％)
    FBScryoCellbankerCellvation     FBS20％(v/v)甘油10％(v/v)DMEM日本全药工业(株)制ICN生物医学公司制 111515
C冷冻时细胞形态和细胞存活率的相互关系
在细胞与胶原蛋白海绵粘附状态冷冻人造皮肤的现有方法中，与冷冻保存液的种类无关，细胞存活率非常低。在用本发明方法的人造皮肤与细胞和胶原蛋白海绵呈粘附状态冷冻的人造皮肤之间被确认存活率有差异，作为其原因可以认为是由冷冻时细胞形态的不同而造成的。因此，为了明确人造皮肤冷冻时细胞形态与存活率之间关系，改变冷冻前的培养时间，其它和实施例1-1的A同样顺序制作人造皮肤，测定冷冻和融解后细胞存活率。具体是静置到细胞悬浮液浸透海绵后(本发明)，或者在37℃培养2小时或者15小时后和实施例1-1的A同样顺序制作冷冻人造皮肤。还有，作为对照，对细胞接种后在37℃培养48小时的人造皮肤进行同样的细胞存活率测定。细胞接种后培养2小时-15小时的人造皮肤的存活率低，但细胞接种后立即冷冻的人造皮肤得到了非常高的存活率。冷冻前用显微镜进行观察确认了在接种后2小时培养的人造皮肤中有一半以上的细胞、15小时以上培养的人造皮肤中全部的细胞，和海绵粘附着。即，可以认为细胞的存活率因冷冻时细胞形态的不同而异。细胞在没有粘附状态冷冻人造皮肤的细胞回收率和没有冷冻的人造皮肤相比在90％以上。因此，人造皮肤融解后既使进行洗的操作，仍可以认为细胞还滞留在海绵上。表6表示细胞的存活率和总细胞数。
表6
冷冻保存方法 预培养   细胞存活率(％)     总细胞数(个)
本发明   ①缓冷冷冻   无   71.2     2.21×105
比较例   ②缓冷冷冻③缓冷冷冻④不冷冻   2小时15小时48小时   20.119.890.7     2.04×1052.51×1052.31×105
实施例1-2：来自人成纤维细胞的人造皮肤的快速冷冻保存
A利用本发明的方法进行人造皮肤的冷冻保存
使用培养瓶(培养面积80cm2)，在DMEM+10％FBS中培养人成纤维细胞。对数增殖期中的成纤维细胞用0.25％胰蛋白酶处理并回收。使细胞悬浮在FBScryo中，调制成9.0×105细胞/ml的细胞悬浮液。事先在12孔板放入直径22mm的圆形胶原蛋白海绵，各接种0.5ml细胞悬浮液(1.2×105细胞/cm2)。静置至细胞悬浮液浸透海绵时，用塑料带密封。保持12孔板原样直接放入-152℃的超低温冰箱中冷冻保存。
A-1)人造皮肤的融解以及存活率测定
冷冻1日后，在-152℃保存的人造皮肤在37℃水浴中浸泡3分钟使其融解，吸取去除FBScryo培养基，用2ml DMEM+10％FBS洗2次。添加2mlDMMEM+10％FBS后，在5％二氧化碳、37℃条件下进行15小时以上培养。其次将得到的人造皮肤浸泡在5.0ml的0.5％胶原蛋白酶溶液中，37℃的水浴中振荡5-10分钟使该人造皮肤溶解。在约400×g、4℃的条件下，进行5分钟离心操作回收细胞，用台盼蓝色素排除法测定总细胞数，活细胞数以及存活率。作为对照，对没有进行冷冻的人造皮肤也同样测定了存活率。在-152℃的快速冷冻人造皮肤中，获得了77.4％高存活率。这个结果可以说和缓冷冷冻时相同。还有，本发明方法冷冻的人造皮肤融解后，培养过夜时确认了细胞伸长伪足和胶原蛋白海绵粘附。表7表示细胞的存活率。
表7
预培养   细胞接种时的培养基 冷冻保存液 冷冻温度   细胞存活率(％)
冷冻(本发明)   无   FBScryo   FBScryo   -152℃   77.4
不冷冻(比较例)   48小时   DMEM+10％FBS   不冷冻   -   88.7
实施例2：来自表皮细胞的人造皮肤的冷冻保存
A由本发明的方法制作人造皮肤及冷冻方法
使用培养瓶(培养面积80cm2)在含有3％(V/V)FBS的Green氏培养基(以下写作Green氏培养基+3％FBS)上培养人表皮细胞。人表皮细胞用调制成1000单位/ml分散酶(合同酒精(株)制)的PBS(-)(磷酸缓冲液)溶液2ml进行处理并回收。回收的表皮细胞进一步用0.25％胰蛋白酶溶液处理使其单细胞化。在冷冻保存液A(含有10％(v/v)甘油、20％(v/v)FBS的Green氏培养基)悬浮调制成2.5×106细胞/ml的细胞悬浮液。将其以各0.5ml接种在事先放入12孔板的直径为22mm的圆形胶原蛋白海绵(3.3×105细胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造皮肤。
①接种后，静置至细胞充分浸透海绵后，以-0.2～-5℃/分的速度冷却至-80℃冷冻(缓冷冷冻法)。
②接种后，静置至细胞充分浸透海绵后，放入-80℃超低温冰箱中冷冻(快速冷冻法)。
③接种后，静置至细胞充分浸透海绵后，放入-152℃超低温冰箱中冷冻(快速冷冻法)。
B由现有方法制作的人造皮肤以及对照用人造皮肤的制作方法
使用培养烧瓶(培养面积80cm2)在Green氏培养基+3％FBS上培养人表皮细胞。人表皮细胞用调制成1000单位/ml分散酶(合同酒精(株)制)的PBS(-)(磷酸缓冲液)溶液2ml进行处理并回收。回收的表皮细胞进一步用0.25％胰蛋白酶溶液处理使其单细胞化。调制Green氏培养基+3％FBS中悬浮的2.5×106细胞/ml的细胞悬浮液。将其以各0.5ml接种在事先放入12孔板的直径为22mm的圆形胶原蛋白海绵(3.3×105细胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造皮肤。
④接种后用5％二氧化碳、37℃下培养过夜(15小时以上)。吸取去除培养基后，用冷冻保存液A洗2次。往各孔中添加冷冻保存液A1.5ml，以-0.2～-5℃/分的速度冷却至-80℃冷冻(缓冷冷冻法)。
⑤不经冷冻培养2日，用C的方法(后述)测定细胞的存活率。
C人造皮肤的融解以及存活率测定
上述实施例2的A、B制作的人造皮肤中细胞存活率以下述方法进行测定。
在-80℃或-152℃的超低温冰箱中保存了1～7日的人造皮肤，在37℃水浴中浸泡5-10分钟使其融解。吸取去除培养基后，用2.0ml Green氏培养基+3％FBS洗人造皮肤2次。再添加上述的培养基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃条件下培养过液(15小时以上)。其次，将得到的人造皮肤浸泡在0.5％胶原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振荡5～10分钟使胶原蛋白海绵溶解。用约100×g、4℃、5分钟的离心操作回收细胞。除去上清液后，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到细胞中，在37℃水浴中振荡5-10分钟。再一次用约400×g、4℃、5分钟的离心操作回收细胞。将细胞悬浮在Green氏培养基+3％FBS中，用台盼蓝色素排除法测定细胞的存活率。
其结果是在胶原蛋白海绵上接种细胞后，在细胞发生粘附前缓冷冷冻(本发明，表8中的①)或者快速冷冻(本发明，表8中的②和③)的人造皮肤，得到了高存活率。与此相对，细胞接种并培养15小时后缓冷冷冻的人造皮肤(现有方法，表8中的④)，其存活率低。表8表示细胞的存活率。
表8
保存方法 预培养 冷冻温度(℃)   细胞存活率(％)
本发明   ①缓冷冷冻②快速冷冻③快速冷冻   无无无   -80-80-152   84.674.683.2
比较例   ④缓冷冷冻⑤不冷冻   15小时48小时   -80-   19.189.6
实施例3：来自血管内皮细胞的人造血管的冷冻保存
A由本发明方法制作人造血管以及冷冻方法
使用培养瓶(培养面积80cm2)在含有10％(v/v)FBS以及10ng/ml人FGF(人成纤维细胞增殖因子)的Green氏培养基中培养人血管内皮细胞。人血管内皮细胞用0.25％胰蛋白酶溶液处理并回收。在冷冻保存液B(含有10％(v/v)甘油、20％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培养基)中悬浮，调制成1.4×106细胞/ml的细胞悬浮液。将其以各0.6ml接种在事先放入12孔板的直径为22mm的圆形胶原蛋白海绵(2.2×105细胞/cm2)。
其次，按以下方法制作人造血管。
①接种后，静置至细胞充分浸透海绵后，以-0.2～-5℃/分的速度冷却至-80℃冷冻(缓冷冷冻法)。
B由现有方法制作人造血管以及对照用人造血管的制作方法
使用培养瓶(培养面积80cm2)在含有10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF(人成纤维细胞增殖因子)的Green氏培养基上培养人血管内皮细胞。人血管内皮细胞用0.25％胰蛋白酶溶液处理并回收。在含有10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培养基中悬浮，调制成1.4×106细胞/ml的细胞悬浮液。将其以各0.6ml接种在事先放入12孔板的直径为22mm的圆形胶原蛋白海绵(2.2×105细胞/cm2)。
其次，按以下方法制作人造血管。
②接种后培养过夜，用冷冻保存液B洗2次后，以-0.2～-5℃/分的速度冷却至-80℃冷冻(缓冷冷冻法)。
③不经冷冻培养2日，用C的方法(后述)测定细胞的存活率。
C人造血管的融解以及存活率测定
上述实施例3的A、B制作的人造血管中的细胞存活率以下述方法进行测定。
在-80℃的超低温冰箱中保存了1～7日的人造血管，在37℃水浴中浸泡5-10分钟使其融解。吸取去除培养基后，用2.0ml含10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培养基洗人造血管2次。再添加上述的培养基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃条件下培养过夜(15小时以上)。其次，将得到的人造血管浸泡在0.5％胶原蛋白醇溶液5ml中，在37℃水浴中振荡5～10分钟使胶原蛋白海绵溶解。用约400×g、4℃、5分钟的离心操作回收细胞。除去上清液后，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到细胞中，在37℃水浴中振荡5-10分钟。再一次用约400×g、4℃、5分钟的离心操作回收细胞。将细胞悬浮在含有10％(v/v)FBS和10ng/ml人FGF的Green氏培养基中，用台盼蓝色素排除法测定细胞的存活率。
其结果是在胶原蛋白海绵接种细胞后，细胞发生粘附前缓冷冷冻(本发明，表9中的①)的人造血管，得到了高存活率。与此相对，细胞接种并培养15小时后缓冷冷冻的人造血管(现有方法，表9中的②)，其存活率低。表9表示细胞的存活率。
表9
保存方法 预培养     冷冻温度(℃)   细胞存活率(％)
  本发明   ①缓冷冷冻   无     -80   83.7
比较例   ②缓冷冷冻③不冷冻   15小时48小时     -80-   51.187.7
实施例4：来自肝细胞的人造肝脏的冷冻保存
A由本发明方法制作人造肝脏以及冷冻方法
使用培养烧瓶(培养面积80cm2)在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素钠的Green氏培养基中培养人肝细胞。人肝细胞用0.25％胰蛋白酶溶液处理并回收。在冷冻保存液C(含有10％(v/v)甘油、20％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素钠的Green氏培养基)中悬浮，调制成1.5×106细胞/ml的细胞悬浮液。将其以各0.5ml接种在事先放入12孔板的直径为22mm的圆形胶原蛋白海绵(2.0×105细胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造肝脏。
①接种后，静置至细胞充分浸透海绵后，以-0.2～-5℃/分的速度冷却至-80℃冷冻(缓冷冷冻法)。
②接种后，静置至细胞充分浸透海绵后，放入-80℃超低温冰箱中冷冻(快速冷冻法)。
③接种后，静置至细胞充分浸透海绵后，放入-152℃超低温冰箱中冷冻(快速冷冻法)。
B对照用人造肝脏的制作方法
使用培养烧瓶(培养面积80cm2)在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素钠的Green氏培养基中培养人肝细胞。人肝细胞用0.25％胰蛋白酶溶液处理并回收。在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素钠的Green氏培养基中悬浮，调制成1.5×106细胞/ml的细胞悬浮液。将其以各0.5ml接种在事先放入12孔板的直径为22mm的圆形胶原蛋白海绵(2.0×105细胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造肝脏。
④接种后，在5％二氧化碳、37℃条件下培养过夜(15小时以上)。吸取除去培养基后，用冷冻保存液C洗2次。往各孔添加冷冻保存液C1.5ml，以-0.2～-5℃的速度冷却至-80℃冷冻(缓冷冷冻法)。
⑤接种后，在5％二氧化碳、37℃条件下培养过夜(15小时以上)。吸取除去培养基后，用冷冻保存液C洗2次。往各孔添加冷冻保存液C1.5ml，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻。
⑥不经冷冻、培养2日，用C的方法(后述)测定细胞的存活率。
C人造肝脏的融解以及存活率测定
上述实施例4的A、B制作的人造肝脏中的细胞存活率以下述方法进行测定。
在-80℃或-152℃的超低温冰箱中保存了1～7日的人造肝脏，在37℃水浴中浸泡5-10分钟使其融解。吸取去除培养基后，用含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素钠的2.0ml Green氏培养基洗人造肝脏2次。再添加同上的培养基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃条件下培养过液(15小时以上)。其次，将得到的人造肝脏浸泡在0.5％胶原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振荡5～10分钟使胶原蛋白海绵溶解。用约400×g、4℃、5分钟的离心操作回收细胞。除去上清液后，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到细胞中，在37℃水浴中振荡5-10分钟。再一次用约400×g、4℃、5分钟的离心操作回收细胞。将细胞悬浮在含有10％(v/v)FBS、10ng/ml人FGF以及13μg/ml肝素钠的Green氏培养基中，用台盼蓝色素排除法测定细胞的存活率。
其结果是在胶原蛋白海绵接种细胞后，细胞发生粘附前缓冷冷冻(本发明，表10中的①)或者快速冷冻(本发明，表10中的②和③)的人造肝脏，得到了高存活率。与此相对，细胞接种并培养15小时后缓冷冷冻的人造肝脏(现有方法，表10中的④和⑤)，其存活率低。表10表示细胞的存活率。
表10
保存方法 预培养     冷冻温度(℃)   细胞存活率(％)
本发明   ①缓冷冷冻②快速冷冻③快速冷冻   无无无     -80-80-152   88.578.579.6
比较例   ④缓冷冷冻⑤快速冷冻⑥不冷冻   15小时15小时48小时     -80-80-   23.922.994.0
实施例5：来自角膜实质细胞的人造角膜的冷冻保存
A由本发明方法制作人造角膜以及冷冻方法
使用培养烧瓶(培养面积80cm2)在DMEM+10％(v/v)FBS培养基中培养兔角膜实质细胞。兔角膜实质细胞用0.25％胰蛋白酶溶液处理并回收。在冷冻保存液FBScryo中悬浮，调制成1.0×106细胞/ml的细胞悬浮液。将其以各0.5ml接种在事先放入12孔板的直径为22mm的圆形胶原蛋白海绵(1.3×105细胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造角膜。
①接种后，静置至细胞充分浸透海绵后，以-0.2～-5℃/分的速度冷却至-80℃冷冻(缓冷冷冻法)。
②接种后，静置至细胞充分浸透海绵后，放入-152℃超低温冰箱中冷冻(快速冷冻法)。
B对照用人造角膜的制作方法
使用培养烧瓶(培养面积80cm2)在DMEM+10％(v/v)FBS培养基上培养兔角膜实质细胞。兔角膜实质细胞用0.25％胰蛋白酶溶液处理并回收。在冷冻保存液DMEM+10％FBS中悬浮，调制成1.0×106细胞/ml的细胞悬浮液。将其以各0.5ml接种在事先放入12孔板的直径为22mm的圆形胶原蛋白海绵(1.3×105细胞/cm2)。其次，按以下方法制作人造角膜。
③接种后，在5％二氧化碳、37℃条件下培养过夜(15小时以上)。吸取除去培养基后，用FBScryo洗2次。往各孔添加FBScryo 1.5ml，以-0.2～-5℃的速度冷却至-80℃冷冻(缓冷冷冻法)。
④接种后，在5％二氧化碳、37℃条件下培养过夜(15小时以上)。吸取除去培养基后，用FBScryo洗2次。往各孔添加FBScryo 1.5ml，放入-80℃的超低温冰箱中冷冻。
⑤不经冷冻、培养2日，用C的方法(后述)测定细胞的存活率。
C人造角膜的融解以及存活率测定
上述实施例5的A、B制作的人造角膜中的细胞存活率以下述方法进行测定。
在-80℃或-152℃的超低温冰箱中保存了1～7日的人造角膜，在37℃水浴中浸泡5-10分钟使其融解。吸取去除培养基后，用2.0ml10％(v/v)FBS洗人造角膜2次。再添加上述的培养基1.5ml，在5％二氧化碳、37℃条件下培养过液(15小时以上)。其次，将得到的人造角膜浸泡在0.5％胶原蛋白酶溶液5ml中，在37℃水浴中振荡5～10分钟使胶原蛋白海绵溶解。由约400×g、4℃、5分钟的离心操作回收细胞。除去上清液后，加0.25％胰蛋白酶溶液3.0ml到细胞中，在37℃水浴中振荡5-10分钟。再一次由约400×g、4℃、5分钟的离心操作回收细胞。将细胞悬浮在DMEM+10％FBS中，用台盼蓝色素排除法测定细胞的存活率。
其结果是在胶原蛋白海绵接种细胞后，细胞发生粘附前缓冷冷冻(本发明，表11中的①)或者快速冷冻(本发明，表11中的②)的人造角膜，得到了高存活率。与此相对，细胞接种并培养15小时后缓冷冷冻的人造角膜(现有方法，表11中的③和④)，其存活率低。表11表示细胞的存活率。
表11
保存方法 预培养     冷冻温度(℃)   细胞存活率(％)
本发明   ①缓冷冷冻②快速冷冻   无无     -80-152   63.572.4
比较例   ③缓冷冷冻④快速冷冻⑤不冷冻   15小时15小时48小时     -80-80-   14.99.188.2
本发明的冷冻保存方法由于可以使细胞的存活率比现有方法高，所以可以长期地保存对创伤愈合有效的组织等效物。还有，本方法省去了冷冻前的预培养以及清洗工序、而且融解后的清洗操作简单，所以比现有方法又简便，又经济。进一步，本发明用简单的冷冻装置(-85℃～-20℃)使组织等效物的冷冻保存成为可能，因此可以在更多的医疗设施保存。此外，由本方法冷冻保存的组织等效物无毒、安全性高，所以可以立即应用在临床上。

Claims (11)

1.组织等效物的冷冻保存方法，是由在冷冻保存液中悬浮细胞的工序、在基材上接种细胞的工序、以及将所得到的组织等效物在细胞与基材粘附之前使其冷冻的工序构成的。
2.权利要求1记载的方法，其细胞是选自来自哺乳动物的成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞、朗格尔汉斯细胞、黑素细胞、脂肪细胞、毛母细胞、毛乳头细胞、平滑肌细胞、肝细胞、角膜实质细胞、角膜上皮细胞以及角膜内皮细胞中的一种以上。
3.权利要求1记载的方法，其冷冻工序是通过缓冷冷冻法进行的。
4.权利要求1记载的方法，其冷冻工序是通过快速冷冻法进行的。
5.权利要求1记载的方法，其冷冻工序是通过玻璃化冷冻法进行的。
6.权利要求1记载的方法，其冷冻后的保存温度为-196℃以上-20℃以下。
7.权利要求1记载的方法，其组织等效物是人造皮肤，人造血管、人造肝脏或人造角膜。
8.冷冻保存的组织等效物，是将在冷冻保存液中悬浮的细胞接种在基材上，在细胞和基材发生粘附前进行冷冻而得到的。
9.权利要求8记载的组织等效物，该组织等效物是人造皮肤、人造血管、人造肝脏或人造角膜。
10.权利要求8记载的组织等效物，其中基材和细胞的组合是由不全胶原蛋白构成的海绵和来自人的成纤维细胞的组合。
11.权利要求10记载的组织等效物，其中由不全胶原蛋白构成的海棉具有纵向空孔。
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