CN105229145A - 片状细胞培养物的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种细胞因子产生能力等活性高的片状细胞培养物及其制造方法。本发明涉及片状细胞培养物的制造方法、利用该制造方法制造的高活性片状细胞培养物、利用该片状细胞培养物对与组织的异常相关的疾病进行处理的方法，所述片状细胞培养物的制造方法包括将细胞冷冻的步骤、将冷冻的细胞解冻的步骤、及形成片状细胞培养物的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及高活性的片状细胞培养物的制造方法、用该制造方法制造的片状细胞培养物、包含该片状细胞培养物的医药组合物、使用该片状细胞培养物的疾病处理方法等。
背景技术
近年来，为了修复损伤的组织等，进行了移植各种细胞的尝试。例如，为了修复因心绞痛、心肌梗塞等缺血性心脏病而导致损伤的心肌组织，尝试利用了胎儿心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、间充质干细胞、心脏干细胞、ES细胞等(非专利文献1)。
作为上述尝试的一环，开发出了利用支架(scaffold)形成的细胞结构物、使细胞形成为片状而得的片状细胞培养物(专利文献1)。
关于片状细胞培养物在治疗中的应用，已开展了下述研究：针对由烧伤等导致的皮肤损伤的培养表皮片的利用、针对角膜损伤的角膜上皮片状细胞培养物的利用、针对食道癌内窥镜切除的口腔黏膜片状细胞培养物的利用等。
为了使片状细胞培养物植入所移植的组织中并发挥所期望的功能，需要向该培养物供给氧、营养等，就此而言，已知具有血管新生作用的HGF(肝细胞生长因子，Hepatocytegrowthfactor)、VEGF(血管内皮生长因子，Vascularendothelialgrowthfactor)等各种细胞因子的作用是有用的(专利文献1)。因此，可以认为如果能使基于片状细胞培养物的这些细胞因子的产生能力提高，就可以提高片状细胞培养物的植入率、功能性。另外，已知这些细胞因子对组织的再生有用(非专利文献2)，因此，也可以认为由片状细胞培养物产生的细胞因子对移植靶标的组织发挥作用，从而促进该组织的再生。但是，成本低且简单的提高片状细胞培养物的细胞因子产生能力的方法尚未为人所知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2007-528755号公报
非专利文献
非专利文献1：Haraguchietal.,StemCellsTranslMed.2012Feb；1(2):136-41
非专利文献2：Nakagamietal.,JAtherosclerThromb.2006Apr；13(2):77-81
发明内容
本发明的目的在于提供细胞因子产生能力等活性高的片状细胞培养物、其制造方法、包含该片状细胞培养物的医药组合物、及使用该片状细胞培养物的疾病处理方法。
本申请的发明人在为解决上述课题而进行锐意研究的过程中，发现通过在制造片状细胞培养物时设置将细胞冷冻·解冻的步骤，可以提高片状细胞培养物的细胞因子产生能力等活性，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下内容。
(1)片状细胞培养物的制造方法，所述方法包括：
将细胞冷冻的步骤；
将冷冻的细胞解冻的步骤；及
形成片状细胞培养物的步骤。
(2)如(1)所述的方法，其中，细胞为自体细胞或异体细胞。
(3)如(1)或(2)所述的方法，其中，细胞为自体细胞。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，在将细胞解冻的步骤之后，在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，在形成片状细胞培养物的步骤之后，还包括回收片状细胞培养物的步骤，并且，将细胞解冻的步骤是在回收片状细胞培养物的步骤前的48小时以内进行的。
(6)如(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，在将细胞冷冻的步骤之前，包括使细胞增殖的步骤。
(7)如(1)～(6)中任一项所述的方法，在将冷冻的细胞解冻的步骤之后、且在形成片状细胞培养物的步骤之前，包括清洗细胞的步骤。
(8)如(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，细胞选自成肌细胞、间充质干细胞、心肌细胞、成纤维细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞、滑膜细胞、软骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、胰细胞、肾细胞、肾上腺细胞、牙周韧带细胞、牙龈细胞、骨膜细胞及皮肤细胞组成的组。
(9)如(1)～(8)中任一项所述的方法，所述方法获得活性比利用不包括将细胞冷冻的步骤和将冷冻的细胞解冻的步骤的方法制造的片状细胞培养物高的片状细胞培养物。
(10)如(9)所述的方法，其中，活性选自细胞因子产生能力、植入能力、血管诱导能力及组织再生能力组成的组。
(11)如(10)所述的方法，其中，细胞因子选自HGF及VEGF组成的组。
(12)片状细胞培养物，其是利用(1)～(11)中任一项所述的方法制造的。
(13)医药组合物，其包含(12)所述的片状细胞培养物。
(14)对与对象中组织的异常相关的疾病进行处理的方法，所述方法包括将有效量的(12)所述的片状细胞培养物或(13)所述的医药组合物施予至需要处理的对象。
(15)如(14)所述的方法，其中，组织选自心肌、角膜、视网膜、食道、皮肤、关节、软骨、肝脏、胰、牙龈、肾脏、甲状腺、骨骼肌及中耳组成的组。
(16)如(14)所述的方法，其中，疾病选自心脏疾病、角膜疾病、视网膜疾病、食道疾病、皮肤疾病、关节疾病、软骨疾病、肝疾病、胰疾病、牙科疾病、肾脏疾病、甲状腺疾病、肌肉疾病及中耳疾病组成的组。
利用本发明的方法制造的片状细胞培养物，由于细胞因子产生能力等活性高，向组织中的植入及植入后的存活性、功能性、功能的持续性等优异，因此，可以实现对各种疾病的有效处理。另外，通过利用本发明的方法制造的片状细胞培养物所产生的细胞因子对移植靶标的组织发挥作用，还可以促进该组织的再生。另外，本发明中的冷冻·解冻操作与以往的片状细胞培养物制造方法的相容性高，所需的劳力和时间、成本极少，因此，本发明的制造方法可以广泛用于片状细胞培养物的制造。
附图说明
图1是表示片化培养步骤中被分泌至培养液中的VEGF及HGF的浓度的图。
图2是表示制造后的片状细胞培养物分泌至培养液中的VEGF的浓度的图。
图3是表示制造后的片状细胞培养物分泌至培养液中的HGF的浓度的图。
图4是表示利用例9的制造方法制作的片状间充质干细胞培养物的照片图像。在中央的4个连续的孔内可观察到片状细胞培养物。
具体实施方式
本说明书中，只要未另行定义，则本说明书中使用的所有技术用语及科学用语均具有与本领域技术人员通常理解的意思相同的含义。本说明书中提到的所有专利、申请、已公开的申请及其他出版物均通过引用全部并入本说明书中。
本发明一方面涉及一种片状细胞培养物的制造方法，所述制造方法包括下述步骤：将细胞冷冻的步骤、将冷冻的细胞解冻的步骤、及形成片状细胞培养物的步骤。虽不希望受到特定理论的限制，但可以认为在本发明的制造方法中，通过对细胞实施冷冻及解冻的步骤，活性弱的细胞脱落，而另一方面，活性强的细胞留存，作为片状细胞培养物整体的活性升高。
本发明的制造方法中的细胞，只要是能够形成片状细胞培养物的细胞则没有特别限制，例如，包括贴壁细胞(粘附性细胞)。贴壁细胞包含例如具有贴壁性的体细胞(例如，心肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、胰细胞、肾细胞、肾上腺细胞、牙周韧带细胞、牙龈细胞、骨膜细胞、皮肤细胞、滑膜细胞、软骨细胞等)、组织干细胞(例如，成肌细胞、心脏干细胞等)、多能干细胞(例如，胚胎干细胞、iPS细胞(inducedpluripotentstemcell，诱导性多能干细胞)等)、间充质干细胞等。因此，本发明的制造方法中的细胞包括例如成肌细胞(例如，骨骼肌成肌细胞等)、间充质干细胞(例如，源于骨髓、脂肪组织、外周血、皮肤、毛根、肌肉组织、子宫内膜、胎盘、脐带血的细胞等)、心肌细胞、成纤维细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞、滑膜细胞、软骨细胞、上皮细胞(例如，口腔黏膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、鼻黏膜上皮细胞等)、内皮细胞(例如，血管内皮细胞等)、肝细胞(例如，肝实质细胞等)、胰细胞(例如，胰岛细胞等)、肾细胞、肾上腺细胞、牙周韧带细胞、牙龈细胞、骨膜细胞、皮肤细胞等。
本发明中，“片状细胞培养物”是指细胞相互连接呈片状的培养物，典型的是由1个细胞层形成的细胞培养物，但也包括由2个以上的细胞层构成的细胞培养物。细胞彼此可以直接(包括经由粘附分子等细胞要素的方式)相互连接、及/或经由中间物而相互连接。作为中间物，只要是至少能够将细胞彼此物理性(机械性)地连接的物质，则不受特别限制，例如，可以举出胞外基质等。中间物优选为来自细胞的物质，特别优选为来自构成细胞培养物的细胞的物质。细胞至少被物理性(机械性)地连接，也可以进一步被功能性地连接，例如化学性连接、电连接。
本发明的片状细胞培养物优选不包含支架(支撑体)。在本技术领域中，支架有时被用于使细胞附着在其表面上及/或其内部从而维持细胞培养物的物理一体性，例如，已知有聚偏氟乙烯(PVDF)制的膜等，但本发明的细胞培养物即使在没有该支架时也能够维持其物理一体性。另外，本发明的细胞培养物优选仅包含来自构成细胞培养物的细胞的物质，不包含其它物质。
本发明中的细胞可以来自能够利用片状细胞培养物进行治疗的任意生物。所述生物不受限制，例如，包括人、非人灵长类、狗、猫、猪、马、山羊、绵羊、啮齿目动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)、兔等。另外，用于形成片状细胞培养物的细胞可以仅为1种，也可以使用2种以上的细胞。本发明的优选方式中，在形成细胞培养物的细胞有2种以上的情况下，最多的细胞的比率(纯度)在细胞培养物制造结束时为60％以上，优选为70％以上，更优选为75％以上。
细胞可以是源自异种的细胞，也可以是源自同种的细胞。此处，关于“源自异种的细胞”，在细胞培养物被用于移植的情况下，表示源自与其受体为不同的种的生物的细胞。例如，受体为人时，源自猴、猪的细胞等属于源自异种的细胞。另外，“源自同种的细胞”是指源自与受体为相同的种的生物的细胞。例如，受体为人时，人细胞属于源自同种的细胞。源自同种的细胞包括自源细胞(也称为自身细胞或自体细胞，即，源自受体的细胞)和同种非自源细胞(也称为异体细胞)。自源细胞即使进行移植也不发生排斥反应，因此在本发明中是优选的。但是，也可以利用源自异种的细胞、同种非自源细胞。利用源自异种的细胞、同种非自源细胞时，为了抑制排斥反应，有时需要进行免疫抑制处理。需要说明的是，本说明书中也有时将自源细胞以外的细胞、即源自异种的细胞和同种非自源细胞统称为非自源细胞。在本发明的一个方式中，细胞为自体细胞或异体细胞。在本发明的一个方式中，细胞为自体细胞。在本发明的另一方式中，细胞为异体细胞。
本发明的制造方法中的将细胞冷冻的步骤可以利用已知的任意方法进行。作为所述方法，可不受限制地举出例如将容器内的细胞供于冷冻手段(例如，冰箱、超低温冰箱、低温介质(例如，液氮等))等。关于冷冻手段的温度，只要为能够使容器内的细胞群的一部分(优选为细胞群整体)冷冻的温度，则不受特别限制，典型的温度为0℃以下，优选为－20℃以下，更优选为－40℃以下，进一步优选为－80℃以下。另外，关于冷冻操作中的冷却速度，只要不严重损害冷冻解冻后的细胞的存活率、功能，则不受特别限制，典型地，为如下程度的冷却速度：从4℃开始冷却，直至达到－80℃为止，历经1～5小时、优选为2～4小时、特别优选为约3小时。具体而言，例如，可以以0.46℃/分钟的速度进行冷却。通过将含有细胞的容器直接供于或收容于冷冻处理容器中后供于设定为所期望的温度的冷冻手段，可以实现上述冷却速度。冷冻处理容器也可以具有将容器内的温度的下降速度控制为规定的速度的功能。作为上述冷冻处理容器，可以使用已知的任意容器，例如，BICELL(R)(NihonFreezerCo.,Ltd.)等。
关于冷冻操作，可以在将细胞浸渍于培养液、生理缓冲液等中的状态下进行，也可以在实施了向培养液中添加冷冻保护剂(其用于保护细胞免受冷冻·解冻操作的损伤)、或将培养液置换为含有冷冻保护剂的冷冻保存液等的处理之后进行。因此，本发明的制造方法也可以还包括向培养液中添加冷冻保护剂的步骤、或将培养液置换为冷冻保存液的步骤。将培养液置换为冷冻保存液时，如果在冷冻时浸渍有细胞的液体中含有有效浓度的冷冻保护剂，则既可以在将培养液实质性地全部除去后添加冷冻保存液，也可以在残留有一部分培养液的状态下添加冷冻保存液。此处，“有效浓度”是指冷冻保护剂显示出冷冻保护效果(例如，与不使用冷冻保护剂时相比，抑制冷冻解冻后的细胞的存活率、活力、功能等的降低的效果)而不显示毒性的浓度。所述浓度为本领域技术人员已知的浓度，或者可以通过常规实验等适当确定。
关于用于本发明的制造方法的冷冻保护剂，只要是对细胞显示出冷冻保护作用的物质，则不受特别限制，例如，包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、丝胶蛋白、丙二醇、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羟乙基淀粉、硫酸软骨素、聚乙二醇、甲酰胺、乙酰胺、核糖醇、鳄梨糖醇(perseitol)、棉子糖(raffinose)、乳糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇等。冷冻保护剂可以单独使用，也可以组合使用2种或3种以上。
关于冷冻保护剂在培养液中的添加浓度、或冷冻保存液中的冷冻保护剂的浓度，只要为上文中定义的有效浓度则不受特别限制，典型地，例如相对于培养液或冷冻保存液总体为2～20％(v/v)。但是，也可以采用虽不在上述浓度范围内、但就各种冷冻保护剂而言为已知的或经实验确定的替代性使用浓度，上述浓度也在本发明的范围之内。
本发明的制造方法中的将冷冻的细胞解冻的步骤可以利用已知的任意细胞解冻方法实施，典型地，例如可通过对冷冻的细胞进行解冻手段(例如，温度比冷冻温度高的固态、液态或气态的介质(例如，水)、水浴、孵育器(incubator)、恒温器等)、或将冷冻的细胞浸渍在温度比冷冻温度高的介质(例如，培养液)中而实现，但并不限于此。关于解冻手段或浸渍介质的温度，只要是能够在所期望的时间内将细胞解冻的温度，则不受特别限制，典型的温度为4～50℃、优选为30℃～40℃、更优选为36～38℃。另外，关于解冻时间，只要不严重损害解冻后的细胞的存活率、功能，则不受特别限制，典型的解冻时间为2分钟以内，尤其是通过使解冻时间为20秒以内，可以大幅抑制存活率的降低。解冻时间例如可以通过改变解冻手段或浸渍介质的温度、冷冻时的培养液或冷冻保存液的容量或组成等来进行调节。
就本发明的制造方法而言，在将冷冻的细胞解冻的步骤之后、且在形成片状细胞培养物的步骤之前，可以包括清洗细胞的步骤。细胞的清洗可以利用已知的任意方法进行，典型地，例如可通过将细胞悬浮于液体(例如，含有或不含有血清、血清成分(血清白蛋白等)的培养液或生理缓冲液等)中、进行离心分离、弃置上清液并回收已沉淀的细胞而实现，但并不限于此。在清洗细胞的步骤中，上述悬浮、离心分离、回收的循环可以实施1次或多次(例如，2、3、4、5次等)。在本发明的一个方式中，清洗细胞的步骤在进行将冷冻的细胞解冻的步骤之后立即进行。
本发明的制造方法中的形成片状细胞培养物的步骤可以利用已知的任意方法进行。作为所述方法，可不受限制地举出例如专利文献1中记载的方法。形成片状细胞培养物的步骤可以包括将细胞接种至培养基材上的步骤、及使接种的细胞片化的步骤。
对于培养基材而言，只要细胞能在其上形成细胞培养物，则不受特别限制，例如，包括各种材质的容器、容器中的固态或半固态的表面等。容器优选为不使培养液等液体透过的结构·材料。作为所述材料，不受限制，例如可以举出聚乙烯、聚丙烯、Teflon(注册商标)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙6,6、聚乙烯醇、纤维素、硅、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、金属(例如，铁、不锈钢、铝、铜、黄铜)等。另外，容器优选具有至少1个平坦的面。作为所述容器的例子，不受限制，例如可以举出细胞培养皿、细胞培养瓶等。另外，容器可以在其内部具有固态或半固态的表面。作为固态的表面，可以举出如上所述的各种材料的板、容器等，作为半固态的表面，可以举出凝胶、软质的聚合物基质等。培养基材可以使用上述材料来制作，也可以利用市售的培养基材。作为优选的培养基材，不受限制，例如可以举出适于片状细胞培养物的形成的、具有粘附性表面的基材。具体而言，可以举出具有亲水性表面的基材，例如，在该表面上涂布有经电晕放电处理的聚苯乙烯、胶原凝胶(collagengel)、亲水性聚合物等亲水性化合物的基材；另外，还可以举出表面涂布有胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白(laminin)、玻连蛋白(tronectin)、蛋白多糖(proteoglycan)、糖胺多糖(glycosaminoglycan)等胞外基质、钙黏着蛋白家族(cadherinfamily)、选择素家族(seletinfamily)、整合素家族(integrinfamily)等细胞粘附因子等的基材等。另外，上述基材已有市售(例如，Corning(R)TC处理培养皿(TC-TreatedCultureDish)、Corning等)。
培养基材可以在表面被覆有响应于刺激(例如，温度、光)而发生物性变化的材料。作为所述材料，不受限制，例如可以使用下述已知材料：由(甲基)丙烯酰胺化合物、N-烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，N-乙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-环丙基丙烯酰胺、N-环丙基甲基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺、N-四氢糠基丙烯酰胺、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺等)、N,N-二烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-甲基乙基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺等)、具有环状基团的(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如，1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)-吗啉、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吗啉等)、或乙烯基醚衍生物(例如，甲基乙烯基醚)的均聚物或共聚物形成的温度响应性材料，具有偶氮苯基的光吸收性高分子、三苯甲烷无色氢氧化物(triphenylmethaneleucohydroxide)的乙烯基衍生物与丙烯酰胺系单体的共聚物、及含有螺苯并呲喃的N-异丙基丙烯酰胺凝胶等光响应性材料等(例如，参见日本特开平2-211865、日本特开2003-33177)。通过对这些材料施加规定的刺激，可以使其物性(例如，亲水性、疏水性)变化，从而促进粘附在该材料上的细胞培养物的剥离。被覆有温度响应性材料的培养皿已有市售(例如，CellSeedInc.的UpCell(R))，可以将其用于本发明的制造方法中。
上述培养基材可以为各种形状，但优选为平坦的。另外，其面积不受特别限制，典型的面积为1～200cm2，优选为2～100cm2，更优选为3～50cm2。
培养基材可以涂覆(被覆或涂布)有血清。通过使用涂覆有血清的培养基材，可以形成密度更高的片状细胞培养物。所谓“涂覆有血清”，是指在培养基材的表面粘附有血清成分的状态。所述状态不受限制，例如，可以通过用血清对培养基材进行处理而获得。利用血清的处理包括使血清与培养基材接触、及根据需要孵育规定的时间。作为血清，可以使用异种血清及同种血清。关于异种血清，在将细胞培养物用于移植的情况下，其表示来自与受体为不同的种的生物的血清。例如，受体为人时，来自牛、马的血清(例如，胎牛血清(FBS、FCS)、小牛血清(CS)、马血清(HS))等属于异种血清。另外，“同种血清”是指来自与受体为相同的种的生物的血清。例如，受体为人时，人血清即为同种血清。同种血清包括自身血清(也称为自体血清，即，来自受体的血清)、及来自受体以外的同种个体的同种异体血清。需要说明的是，在本说明书中，也有时将自身血清以外的血清(即，异种血清和同种异体血清)统称为非自身血清。
关于用以涂覆培养基材的血清，可以为市售的血清，或通过常规方法从采自所期望的生物的血液进行制备。具体而言，例如可以举出下述方法，即，将采集的血液于室温下放置20～60分钟左右从而使其凝固，将其在1000～1200×g左右的条件下离心分离，并采集上清液的方法等。
在培养基材上进行孵育时，血清可以使用原液，也可以稀释后使用。稀释可以使用任意介质进行，例如，可以不受限制地使用水、生理盐水、各种缓冲液(例如，PBS、HBS等)、各种液体培养基(例如，DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7、DMEM/F12等)等。关于稀释浓度，只要血清成分能够粘附在培养基材上则不受特别限制，例如，为0.5～100％(v/v)，优选为1～60％(v/v)，更优选为5～40％(v/v)。
孵育时间也是只要血清成分能够粘附在培养基材上则不受特别限制，例如，为1～72小时，优选为4～48小时，更优选为5～24小时，进一步优选为6～12小时。孵育温度也是只要血清成分能够粘附在培养基材上则不受特别限制，例如，为0～60℃，优选为4～45℃，更优选为室温～40℃。
孵育后可以将血清弃置。作为血清的弃置方法，可以采用利用移液器等的抽吸、倾析(decantation)等惯用的液体弃置方法。在本发明的优选方式中，在弃置血清后，可以使用无血清清洗液清洗培养基材。作为无血清清洗液，只要是不含有血清、且不对已粘附于培养基材的血清成分产生不良影响的液体介质，则不受特别限制，例如，可以不受限制地使用水、生理盐水、各种缓冲液(例如，PBS、HBS等)、各种液体培养基(例如，DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7、DMEM/F12等)等进行。作为清洗方法，可以采用惯用的培养基材清洗方法，例如可以不受限制地采用在培养基材上添加无血清清洗液、搅拌规定时间(例如，5～60秒钟)后弃置的方法等。
本发明中，也可以用生长因子涂覆培养基材。此处，“生长因子”是指较之其不存在的情况而言能促进细胞的增殖的任意物质，例如，包括上皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。对于利用生长因子的培养基材的涂覆方法、弃置方法及清洗方法，除了孵育时的稀释浓度例如为0.0001μg/mL～1μg/mL、优选为0.0005μg/mL～0.05μg/mL、更优选为0.001μg/mL～0.01μg/mL之外，基本与血清相同。
本发明中，也可以用甾体药物涂覆培养基材。此处，“甾体药物”是指具有甾核的化合物中可能会对生物体造成肾上腺皮质功能障碍、库欣综合征等不良影响的化合物。作为所述化合物，不受限制，例如，包括皮质醇、泼尼松龙、去炎松(triamcinolone)、地塞米松、倍他米松等。对于利用甾体药物的培养基材的涂覆方法、弃置方法及清洗方法而言，除了孵育时的稀释浓度以外基本与血清相同，关于前述稀释浓度，对于地塞米松而言，例如为0.1μg/mL～100μg/mL，优选为0.4μg/mL～40μg/mL，更优选为1μg/mL～10μg/mL。
培养基材可以用血清、生长因子及甾体药物中的任一种进行涂覆，也可以用这些成分的任意组合(即，血清和生长因子、血清和甾体药物、血清和生长因子和甾体药物、或生长因子和甾体药物的组合)进行涂覆。用多种成分进行涂覆时，可以将这些成分混合并同时进行涂覆，也可以通过各自分开的步骤进行涂覆。
对于培养基材，可以在用血清等进行涂覆后立即接种细胞，也可以在涂覆后预先保存，然后接种细胞。经涂覆的基材可以通过保存于例如4℃以下、优选－20℃以下、更优选－80℃以下来进行长期保存。
细胞向培养基材上的接种可以以已知的任意方法及条件进行。关于细胞向培养基材上的接种，例如可以通过将细胞悬浮于培养液而得的细胞悬浮液注入培养基材(培养容器)中而进行。关于细胞悬浮液的注入，可以使用滴管(spuit)、移液器等适合于细胞悬浮液的注入操作的器具。
在本发明的优选方式中，以能够在细胞不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度进行接种。“能够在细胞不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度”是指，在用实质上不含生长因子的非增殖系培养液进行培养时，可以形成片状细胞培养物的细胞密度。例如，为骨骼肌成肌细胞时，在使用含有生长因子的培养液的方法中，为了形成片状细胞培养物，将细胞以约6,500个/cm2的密度接种至培养基材(例如，参见专利文献1)，但即便将上述密度的细胞用不含生长因子的培养液进行培养，也不会形成片状的细胞培养物。因此，本方式中的接种密度高于使用含有生长因子的培养液的方法中的密度。关于所述密度，具体而言，例如，对于骨骼肌成肌细胞而言，典型的密度为1.0×105个/cm2以上。关于接种密度的上限，只要不损害细胞培养物的形成、且细胞不进入分化状态，则不受特别限制，对于骨骼肌成肌细胞而言，上限为小于3.4×106个/cm2。
因此，骨骼肌成肌细胞的“能够在不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度”在某一方式中为1.0×105～3.4×106个/cm2，在另一方式中为3.0×105～3.4×106个/cm2，在又一其他方式中为3.5×105～3.4×106个/cm2，在又一其他方式中为1.0×106～3.4×106个/cm2，在又一其他方式中为3.0×105～1.7×106个/cm2，在又一其他方式中为3.5×105～1.7×106个/cm2，在又一其他方式中为1.0×106～1.7×106个/cm2。对于上述范围而言，只要上限小于3.4×106个/cm2，则可以包含上限及下限两者、或其中任一方。因此，上述密度也可以为例如3.0×105个/cm2以上且小于3.4×106个/cm2(包含下限，不包含上限)、3.5×105个/cm2以上且小于3.4×106个/cm2(包含下限，不包含上限)、1.0×106个/cm2以上且小于3.4×106个/cm2(包含下限，不包含上限)、大于1.0×106个/cm2且小于3.4×106个/cm2(既不包含下限，也不包含上限)、大于1.0×106个/cm2且为1.7×106个/cm2以下(不包含下限，但包含上限)。对于骨骼肌成肌细胞以外的细胞，本领域技术人员可以根据本说明书的教导，通过实验来适当确定适合于本发明的细胞密度。
使接种的细胞片化的步骤也可以以已知的任意方法及条件进行。上述方法的非限定性例子记载于例如专利文献1等中。认为细胞的片化可以通过细胞彼此经由粘附分子、胞外基质等细胞间粘附机构相互粘附而实现。因此，使接种的细胞片化的步骤可以通过例如在形成细胞间粘附的条件下对细胞进行培养来实现。关于所述条件，只要可以形成细胞间粘附则可以为任何条件，通常只要是与一般的细胞培养条件相同的条件，即可形成细胞间粘附。作为所述条件，例如可以举出在37℃、5％CO2下的培养。另外，培养可以在通常的气压(大气压)下进行。本领域技术人员可以根据接种细胞的种类来选择最适合的条件。本说明书中，也有时将用以使接种的细胞片化的培养称为“片化培养”。
在本发明的一个方式中，细胞的培养在规定时期内进行，优选在细胞不进入分化状态的时期内进行。因此，在该方式中，细胞在培养时期内维持为未分化的状态。细胞进入分化状态可以通过本领域技术人员所知的任意方法进行评价。例如，为骨骼肌成肌细胞时，可以将MHC的表达、肌酸激酶(CK)活性、细胞的多核化、肌管的形成等作为分化的指标。在本发明的优选方式中，培养时期为48小时以内，更优选为40小时以内，进一步优选为24小时以内。
用于培养的细胞培养液(有时也简称为“培养液”或“培养基”)只要可以维持细胞的生存则不受特别限制，典型地，可以利用以氨基酸、维生素类、电解质为主成分的培养液。在本发明的一个方式中，培养液为以细胞培养用的基础培养基为基底的培养液。所述基础培养基不受限制，例如，包括DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、120、131、153、199等)、L15、SkBM、RITC80-7等。这些基础培养基大多已有市售，其组成也为已知的。
关于基础培养基，可以以标准的组成直接(例如，在市售的原本状态下)进行使用，也可以根据细胞种类、细胞条件来适当变更其组成。因此，本发明中使用的基础培养基并不限于已知组成的培养基，包括1种或2种以上的成分被追加、除去、增量或减量而得的培养基。
作为基础培养基中含有的氨基酸，不受限制，例如包含L-精氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等；作为维生素类，不受限定，例如包含D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、内消旋肌醇(i-inositol)、烟酰胺、核黄素、硫胺素、吡哆醇、生物素、硫辛酸、维生素B12、腺嘌呤、胸苷(thymidine)等；此外，作为电解质，不受限定，例如包含CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaH2PO4、NaHCO3、Fe(NO3)3、FeSO4、CuSO4、MnSO4、Na2SiO3、(NH4)6Mo7O24、NaVO3、NiCl2、ZnSO4等。在基础培养基中，除含有这些成分以外，还可以含有D-葡萄糖等糖类、丙酮酸钠、酚红等pH指示剂、腐胺等。
在本发明的一个方式中，基础培养基中含有的氨基酸的浓度为：L-精氨酸：63.2～84mg/L、L-胱氨酸：35～63mg/L、L-谷氨酰胺：4.4～584mg/L、甘氨酸：2.3～30mg/L、L-组氨酸：42mg/L、L-异亮氨酸：66～105mg/L、L-亮氨酸：105～131mg/L、L-赖氨酸：146～182mg/L、L-甲硫氨酸：15～30mg/L、L-苯丙氨酸：33～66mg/L、L-丝氨酸：32～42mg/L、L-苏氨酸：12～95mg/L、L-色氨酸：4.1～16mg/L、L-酪氨酸：18.1～104mg/L、L-缬氨酸：94～117mg/L。
另外，在本发明的一个方式中，基础培养基中含有的维生素制剂的浓度为：D-泛酸钙：4～12mg/L、氯化胆碱：4～14mg/L、叶酸：0.6～4mg/L、内消旋肌醇：7.2mg/L、烟酰胺：4～6.1mg/L、核黄素：0.0038～0.4mg/L、硫胺素：3.4～4mg/L、吡哆醇：2.1～4mg/L。
细胞培养液除含有上述成分以外，还可以含有血清、生长因子、甾体药物成分、硒成分等1种或2种以上的添加物。但是，这些成分是来自制造工序的杂质，无法否认其在临床中可能成为给受体带来过敏性休克等副作用的主要原因，因此，优选在应用于临床时将其排除。因此，在本发明的优选方式中，细胞培养液不含有这些添加物中的至少1种的有效量。另外，在本发明的更优选的方式中，细胞培养液实质上不含有这些添加物中的至少1种。另外，在本发明的特别优选的方式中，细胞培养液实质上不含有添加物。因此，细胞培养液可以仅含有基础培养基。
在本发明的一个方式中，细胞培养液实质上不含有血清。本说明书中也有时将实质上不含有血清的细胞培养液称为“无血清培养基”。此处，“实质上不含有血清”是指，培养液中的血清含量为在将细胞培养物应用于生物体时不造成不良影响的程度(例如，细胞培养物中的血清白蛋白含量小于50ng的量)，优选不主动在培养液中添加这些物质。本发明中，为避免移植时的副作用，优选细胞培养液实质上不含有异种血清，进一步优选实质上不含有非自身血清。
在本发明的一个方式中，细胞培养液不含有有效量的生长因子。此处，“有效量的生长因子”是指与不存在生长因子的情况相比显著地促进细胞增殖的生长因子的量，或者，为了方便起见，指该技术领域中以细胞增殖为目的而通常添加的量。关于细胞增殖促进的显著性，例如，可以利用该技术领域中已知的任意统计学方法(例如，t检验等)适当评价，另外，通常的添加量可以从该技术领域的各种已知文献获知。具体而言，骨骼肌成肌细胞培养中的EGF的有效量为例如0.005μg/mL以上。
因此，“不含有有效量的生长因子”是指，本发明的培养液中的生长因子的浓度小于上述有效量。例如，骨骼肌成肌细胞培养中的EGF在培养液中的浓度优选小于0.005μg/mL、更优选小于0.001μg/mL。在本发明的优选方式中，培养液中的生长因子的浓度小于生物体中的通常浓度。该方式中，例如，骨骼肌成肌细胞培养中的EGF在培养液中的浓度优选小于5.5ng/mL，较优选小于1.3ng/mL，更优选小于0.5ng/mL。在更优选的方式中，本发明的培养液实质上不含有生长因子。此处，“实质上不含有”是指，培养液中的生长因子的含量为将细胞培养物应用于生物体时不造成不良影响的程度，优选不主动在培养液中添加生长因子。因此，该方式中，培养液中不含有浓度为其中的其他成分(例如血清等)中所含的浓度以上的生长因子。
在本发明的一个方式中，细胞培养液实质上不含有甾体药物成分。此处，“甾体药物成分”是指具有甾核的化合物中会对生物体造成肾上腺皮质功能障碍、库欣综合征等不良影响的化合物。作为所述化合物，不受限制，例如，包括皮质醇、泼尼松龙、去炎松、地塞米松、倍他米松等。因此，“实质上不含有甾体药物成分”是指，培养液中的这些化合物的含量为将细胞培养物应用于生物体时不造成不良影响的程度，优选不主动在培养液中添加这些化合物，即，培养液中不含有浓度为其中的其他成分(例如血清等)中所含的浓度以上的甾体药物成分。
在本发明的一个方式中，细胞培养液实质上不含有硒成分。此处，“硒成分”包含硒分子、及含硒化合物、特别是可以在生物体内游离出硒分子的含硒化合物(例如，亚硒酸等)。因此，“实质上不含有硒成分”是指，培养液中的这些物质的含量为将细胞培养物应用于生物体时不造成不良影响的程度，优选不主动在培养液中添加这些物质，即，培养液中不含有浓度为其中的其他成分(例如血清等)中所含的浓度以上的硒成分。具体而言，例如，为人的情况下，培养液中的硒浓度比人血清中的正常值(例如，10.6～17.4μg/dL)乘以培养基中所含的人血清的比例而得的值低(即，如果人血清的含量为10％，则硒浓度为例如1.0～小于1.7μg/dL)。
在本发明的上述优选方式中，不需要以往在制作应用于生物体的细胞培养物时所必需的下述步骤：通过清洗等将生长因子、甾体药物成分、异种血清成分等来自制造工序的杂质除去的步骤。因此，本发明的方法的一个方式中不包括将该来自制造工序的杂质除去的步骤。
此处，“来自制造工序的杂质”典型地包含下文中列举的来自各制造工序的物质。即，为来自细胞基材的杂质(例如，来自宿主细胞的蛋白质、来自宿主细胞的DNA)、来自细胞培养液的杂质(例如，诱导剂、抗生素、培养基成分)、或来自细胞培养之后的工序(即，目标物质的提取、分离、加工、纯化工序)的杂质等(例如，参见日本医药审发第571号)。
细胞的培养可以在该技术领域通常实施的条件下进行。例如，作为典型的培养条件，可以举出在37℃、5％CO2下的培养。另外，培养可以在通常的气压(大气压)下进行。从细胞培养物的充分形成、及防止细胞分化的观点考虑，培养期间优选为48小时以内、较优选为40小时以内、更优选为24小时以内。培养可以在任意大小及形状的容器中进行。细胞培养物的大小、形状可以通过下述方法任意调节：调整培养容器的细胞粘附面的大小·形状，或在培养容器的细胞粘附面设置所期望的大小·形状的模框(日文：型枠)、并在其内部培养细胞等。
在本发明的制造方法的一个方式中，在将细胞解冻的步骤之后，在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物。通过该步骤，可以进一步提高片状细胞培养物的活性。
“不使细胞实质性增殖”是指，不使细胞以超出计量误差的范围的程度增殖，关于细胞是否增殖，例如可以通过将接种时的细胞数和细胞培养物形成后的细胞数进行比较来评价。本发明中，对于片状细胞培养物形成后的细胞数而言，典型地为接种时的细胞数的300％以下，优选为200％以下，较优选为150％以下，更优选为125％以下，特别优选为100％以下。
细胞的增殖受到各种条件、例如接种细胞数(接种细胞密度)、培养环境(例如，培养时间、培养温度等)、培养基的组成等的影响，因此，通过调节这些条件，可以不使细胞实质性增殖。这些条件中，通过提高接种细胞密度，可以在抑制细胞的增殖的同时用较短时间获得片状细胞培养物，因此，本发明中优选通过接种细胞密度来控制增殖。关于能够在细胞不实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的密度，如上文所述。
因此，本方式中，在将细胞解冻的步骤之后，不经过进一步的细胞增殖步骤，在不使细胞实质性增殖的条件下进行片化培养。另外，本方式中，在将细胞解冻的步骤之后、到片化培养之前的期间，可以进行不伴有细胞增殖的步骤、例如清洗细胞的步骤等。
对于本发明的制造方法而言，在形成片状细胞培养物的步骤之后，可以还包括回收所形成的片状细胞培养物的步骤。关于片状细胞培养物的回收，只要片状细胞培养物可以在至少部分地保持片结构的状态下从作为支架(日文：足場)的培养基材脱离(剥离)，则不受特别限制，例如，可以通过利用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶等)的酶处理及/或吹吸(pipetting)等机械性处理来进行。另外，在利用响应于刺激(例如，温度、光)而发生物性变化的材料被覆表面而得的培养基材上培养细胞并形成细胞培养物时，通过施加规定的刺激，也可以非酶性地脱离。
本发明的制造方法的一个方式，在形成片状细胞培养物的步骤之后还包括回收片状细胞培养物的步骤，并且，将细胞解冻的步骤在回收片状细胞培养物的步骤前的48小时以内进行。通过使将细胞解冻的步骤和回收片状细胞培养物的步骤之间的时间为48小时以下、优选为36小时以下、较优选为24小时以下，可以进一步提高片状细胞培养物的活性。
对于本发明的制造方法而言，在将细胞冷冻的步骤之前，可以还包括使细胞增殖的步骤。使细胞增殖的步骤可以通过已知的任意方法进行，本领域技术人员熟知适合于各种细胞的增殖的培养条件。本发明的制造方法中，在下述情形下，为了得到所期望的细胞数，在将细胞冷冻的步骤之前实施使细胞增殖的步骤是有用的，所述情形为：在将细胞解冻的步骤之后，在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物的情形；或在回收片状细胞培养物的步骤前的48小时以内实施将细胞解冻的步骤的情形。
在一个方式中，本发明的制造方法不包括向细胞中导入基因的步骤。在另一方式中，本发明的制造方法包括向细胞中导入基因的步骤。关于导入的基因，只要是对作为对象的疾病的处理有用的基因，则不受特别限制，例如可以是HGF、VEGF等细胞因子。基因的导入可以使用磷酸钙法、脂质体转染法(lipofectionmethod)、超声波导入法、电穿孔法、基因枪法、利用腺病毒载体、逆转录病毒载体等病毒载体的方法、显微注射法等已知的任意方法实施。针对细胞的基因导入不受限制，例如，可以在将细胞冷冻的步骤之前进行。
就通过本发明的制造方法得到的片状细胞培养物而言，其活性高于通过除不包括将细胞冷冻的步骤和将冷冻的细胞解冻的步骤之外与本发明的制造方法相同的方法制造的片状细胞培养物(以下，有时称为对照片状细胞培养物)。作为所述活性，不受限制，例如可以举出细胞因子产生能力、植入能力、血管诱导能力及组织再生能力等。此处，活性高是指，以对照片状细胞培养物的活性为基准，活性高出例如5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或100％以上，但不限于前述这些。
本发明中，细胞因子是指，从细胞释放、介导各种细胞间相互作用的蛋白质性因子。因此，本发明中的细胞因子并不限于从免疫细胞释放的细胞因子。在本发明的一个方式中，细胞因子为有益于片状细胞培养物向移植靶标组织中的植入的物质。在本发明的一个方式中，细胞因子为有益于血管新生的物质。在本发明的一个方式中，细胞因子为有益于组织的再生的物质。这样的细胞因子在该技术领域中已为人所知，本领域技术人员可以基于已知的信息确定合适的细胞因子。在本发明的一个方式中，细胞因子包括生长因子。在本发明的一个方式中，细胞因子选自HGF及VEGF组成的组。因此，在本发明的一个方式中，细胞因子产生能力为产生生长因子的能力。另外，在本发明的一个方式中，细胞因子产生能力为产生选自HGF及VEGF组成的组中的生长因子的能力。
片状细胞培养物的活性可以使用各种方法进行定量化。活性为细胞因子产生能力时，例如可以通过下述方法对细胞因子产生能力进行定量化：在培养液中以规定时间培养片状细胞培养物，测定被分泌至培养液中的细胞因子的量，或测定在片状细胞培养物中表达的细胞因子基因的量等。测定特定蛋白质的量、基因表达水平的方法在该技术领域中是公知的，作为测定蛋白质的量的方法，不受限制，例如可以举出电泳法、Western印迹法、质谱法、EIA、ELISA、RIA、免疫组织化学法、免疫细胞化学法等；作为测定基因表达水平的方法，不受限制，例如可以举出Northern印迹法、Sourthern印迹法、DNA微阵列(DNAmicroarry)分析、RNA酶保护试验(RNaseprotectionassay)、RT-PCR、实时PCR等PCR法、原位杂交法(insituhybridization)等。
活性为植入能力时，可以通过下述方法对植入能力进行定量化：将片状细胞培养物应用于组织，经过规定时间后观察所应用的片状细胞培养物的状态(例如，对组织的粘附、残存的培养物的尺寸、颜色、形态等)，对其进行评分的方法等。活性为血管诱导能力时，可以通过下述方法对血管诱导能力进行定量化：将片状细胞培养物应用于组织，经过规定时间后观察所应用的片状细胞培养物及应用部位的组织的状态(例如，有无血管新生等)，对其进行评分的方法等。另外，活性为组织再生能力时，可以通过下述方法对组织再生能力进行定量化：将片状细胞培养物应用于组织，经过规定时间后观察应用部位(移植靶标)的组织的状态(例如，组织的大小、组织的微细结构、损伤组织和正常组织的比例、组织的功能等)，对其进行评分的方法等。
在一个方式中，本发明的制造方法的所有步骤均在体外(invitro)实施。在另一方式中，本发明的制造方法包括在体内(invivo)实施的步骤，其不受限制，例如为从对象采集细胞或成为细胞供给源的组织的步骤。在一个方式中，本发明的制造方法的所有步骤均在无菌条件下实施。在一个方式中，本发明的制造方法以使得最终得到的片状细胞培养物为实质上无菌的方式实施。在一个方式中，本发明的制造方法以使得最终得到的片状细胞培养物为无菌的方式实施。
本发明的另一方面涉及利用本发明的制造方法制造的片状细胞培养物。本发明片状细胞培养物的特征在于，活性比对照片状细胞培养物高。关于活性的高低的详细内容如上文所述。在一个方式中，本发明片状细胞培养物的选自细胞因子产生能力、植入能力、血管诱导能力及组织再生能力组成的组中的活性比对照片状细胞培养物高。另外，在一个方式中，本发明片状细胞培养物的产生选自HGF及VEGF组成的组中的细胞因子的能力比对照片状细胞培养物高。本发明的片状细胞培养物由于具有高活性，所以在各种治疗用途中显示出比对照片状细胞培养物更优异的效果。特别地，如果HGF及/或VEGF的产生能力高，则向组织中的植入、血管诱导、组织再生被促进，片状细胞培养物能够长期持续性地发挥功能，从而能够提高治疗效果。
本发明的片状细胞培养物对与组织的异常相关的各种疾病的处理有用。因此，在一个方式中，本发明的片状细胞培养物用于对与组织的异常相关的疾病进行处理。本发明的片状细胞培养物除了具有比以往的片状细胞培养物高的活性以外，还具有与其相同的构成细胞固有的性质，因此，至少可以适用于能利用以往的片状细胞培养物进行处理的组织、疾病。作为成为处理对象的组织，不受限制，例如，可以举出心肌、角膜、视网膜、食道、皮肤、关节、软骨、肝脏、胰、牙龈、肾脏、甲状腺、骨骼肌、中耳等。另外，作为成为处理对象的疾病，不受限定，例如，可以举出心脏疾病(例如，心肌损伤(心肌梗塞、心脏外伤)、心肌病等)、角膜疾病(例如，角膜上皮干细胞缺乏症、角膜损伤(热·化学腐蚀)、角膜溃疡、角膜混浊、角膜穿孔、角膜瘢痕、史－约综合征(Stevens-Johnsonsyndrome)、眼类天疱疮等)、视网膜疾病(例如，视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性等)、食道疾病(例如，食道手术(食道癌切除)后的食道的炎症·狭窄的预防等)、皮肤疾病(例如，皮肤损伤(外伤、烫伤)等)、关节疾病(例如，变形性关节炎等)、软骨疾病(例如，软骨的损伤等)、肝疾病(例如，慢性肝病等)、胰疾病(例如，糖尿病等)、牙科疾病(例如，牙周病等)、肾脏疾病(例如，肾功能衰竭、肾性贫血、肾性骨营养不良症等)、甲状腺疾病(例如，甲状腺功能减退症等)、肌肉疾病(例如，肌肉损伤、肌炎等)、中耳疾病(例如，中耳炎等)。
本发明的片状细胞培养物对上述疾病有用的内容已被记载在例如专利文献1、非专利文献1、Arauchietal.,TissueEngPartA.2009Dec；15(12):3943-9、Itoetal.,TissueEng.2005Mar-Apr；11(3-4):489-96、Yajietal.,Biomaterials.2009Feb；30(5):797-803、Yaguchietal.,ActaOtolaryngol.2007Oct；127(10):1038-44、Watanabeetal.,Transplantation.2011Apr15；91(7):700-6、Shimizuetal.,Biomaterials.2009Oct；30(30):5943-9、Ebiharaetal.,Biomaterials.2012May；33(15):3846-51、Takagietal.,WorldJGastroenterol.2012Oct7；18(37):5145-50等中。
本发明的片状细胞培养物适用于成为处理对象的组织，也可以将其用于组织的修复、再生，还可以作为激素等生理活性物质的供给源而移植至成为处理对象的组织以外的部位(例如，皮下组织等)(例如，Arauchietal.,TissueEngPartA.2009Dec；15(12):3943-9、Shimizuetal.,Biomaterials.2009Oct；30(30):5943-9等)。另外，通过将片状细胞培养物制成可以进行注射的大小的碎片，并将其注射至需要处理的部位，也可以得到比利用单细胞悬浮液的注射更高的效果(Wangetal.,CardiovascRes.2008Feb1；77(3):515-24)。因此，对于本发明的片状细胞培养物而言，这样的利用方法也是可能的。
在一个方式中，本发明的片状细胞培养物实质上无菌。在一个方式中，本发明的片状细胞培养物是无菌的。在一个方式中，未对本发明的片状细胞培养物实施基因操作。在另一方式中，对本发明的片状细胞培养物实施了基因操作。基因操作不受限制，例如，包括提高片状细胞培养物的存活性、植入能力、功能等的基因及/或对疾病的治疗有用的基因的导入。作为可导入的基因，不受限制，例如，可以举出HGF基因、VEGF基因等细胞因子基因。
本发明的另一方面涉及包含本发明的片状细胞培养物的医药组合物。
对于本发明的医药组合物而言，除了本发明的片状细胞培养物以外，还可以包含各种追加成分，例如，药学上可允许的载体、提高片状细胞培养物的存活性、植入性及/或功能等的成分、对对象疾病的处理有用的其他有效成分等。作为上述追加成分，可以使用已知的任意成分，本领域技术人员熟知这些追加成分。另外，本发明的医药组合物可以与提高片状细胞培养物的存活性、植入性及/或功能等的成分、对对象疾病的处理有用的其他有效成分等合用。在一个方式中，本发明的医药组合物用于对与组织的异常相关的疾病进行处理。关于作为处理对象的组织、疾病，如上文中针对本发明的片状细胞培养物记载过的那样。
本发明的另一方面涉及对与对象中组织的异常相关的疾病进行处理的方法，所述方法包括将有效量的本发明的片状细胞培养物或医药组合物施予至需要处理的对象。关于作为处理对象的组织、疾病，如上文中针对本发明的片状细胞培养物记载过的那样。另外，本发明的处理方法中，可以将提高片状细胞培养物的存活性、植入性及/或功能等的成分、对对象疾病的处理有用的其他有效成分等与本发明的片状细胞培养物或医药组合物合用。
本发明的处理方法可以还包括按照本发明的制造方法制造片状细胞培养物的步骤。对于本发明的处理方法而言，在制造片状细胞培养物的步骤之前，可以还包括从对象采集用于制造片状细胞培养物的细胞或成为细胞供给源的组织的步骤。在一个方式中，采集细胞或成为细胞供给源的组织的对象与接受片状细胞培养物或医药组合物的施予处理的对象为相同的个体。在另一方式中，采集细胞或成为细胞供给源的组织的对象是与接受片状细胞培养物或医药组合物的施予处理的对象为同一物种的其他个体。在另一方式中，采集细胞或成为细胞供给源的组织的对象是与接受片状细胞培养物或医药组合物的施予处理的对象为不同物种的个体。
本发明中，用语“对象”表示任意的生物个体，优选为动物个体，更优选为哺乳动物个体，进一步优选为人类个体。本发明中，对象可以是健康的，也可以患有某种疾病，但在谋求对与组织的异常相关的疾病的处理时，典型地表示患有该疾病或具有罹患该疾病的风险的对象。
另外，用语“处理”包含以疾病的治愈、暂时性缓解或预防等为目的的、医学上允许的所有种类的预防性及/或治疗性介入。例如，“处理”的用语包含各种目的的医学上允许的介入，所述目的包括与组织的异常相关的疾病发展的延迟或停止、病变的缩减或消失、该疾病发病的预防或复发的防止等。
本发明中，有效量是例如能够抑制疾病的发病、复发、减轻症状、或延迟或停止疾病发展的量(例如，片状细胞培养物的大小、重量)，优选为能够预防该疾病的发病及复发、或治愈该疾病的量。另外，优选为不产生大于施予所带来的利益的不良影响的量。所述量例如可以通过小鼠、大鼠、狗或猪等实验动物、疾病模型动物的试验等来适当确定，这样的试验方法已为本领域技术人员所熟知。另外，成为处理对象的组织病变的大小可能成为用于确定有效量的重要指标。
作为施予方法，可以典型地举出对组织的直接应用，使用片状细胞培养物的碎片时，可以从能够通过注射进行施予的各种途径、例如静脉内、肌肉内、皮下、局部、动脉内、门静脉内、心室内、腹腔内等途径施予。
关于施予频率，典型的频率为每次处理施予1次，但在无法得到所期望的效果时，也可以施予多次。
实施例
参照以下例子更详细地说明本发明，但以下所示为本发明的特定的具体例子，本发明并不限于此。
例1
将经冷冻保存的人骨骼肌成肌细胞(来自人骨骼肌试样)在37℃下解冻，使用含有0.5％血清白蛋白的缓冲液清洗2次。将5×106～5×107个细胞悬浮于含有20％血清的培养基，接种至烧瓶中后，培养2～3天。
在UpCell(R)(3.5cm的皿或24孔培养板(Multiwell)，CellSeedInc.)中以覆盖整个培养表面的程度添加含有20％血清的培养基，在37℃、5％CO2的环境中处理3小时～3天。处理后，弃置添加的培养基。
回收经培养的细胞，将其悬浮于含有20％血清的培养基，并以2～20×105个/cm2的密度接种至已处理过的UpCell(R)，在37℃、5％CO2的环境中进行约1天的片化培养。
例2
将5×106～5×107个人骨骼肌成肌细胞(来自人骨骼肌试样)悬浮于含有20％血清的培养基，接种至烧瓶中后，培养2～3天。回收经培养的细胞后，将其以1～5×107个/mL的浓度悬浮于细胞冷冻用保存液(含有10％DMSO的基础培养基)，在液氮罐内冷冻保存。
在UpCell(R)(3.5cm的皿或24孔培养板，CellSeedInc.)中以覆盖整个培养表面的程度添加含有20％血清的培养基，在37℃、5％CO2的环境中处理3小时～3天。处理后，弃置添加的培养基。
将经冷冻保存的骨骼肌成肌细胞在37℃下解冻，使用含有0.5％血清白蛋白的缓冲液清洗2次。将清洗后的细胞悬浮于含有20％血清的培养基，并以2～20×105个/cm2的密度接种至已处理过的UpCell(R)，在37℃、5％CO2的环境中进行约1天的片化培养。
例3
在上述例1或例2中的片化培养后，回收全部培养上清液，利用ELISA法测定培养上清液中产生的细胞因子(VEGF及HGF)的浓度(n＝3)。测定使用HumanVEGFQuantikineELISAKit(R&Dsystems，商品目录编号：DVE00)及RayBio(R)HumanHGFELISAKit(RayBiotech,Inc.，商品目录编号：ELH-HGF-001)，按照制造商的手册进行。从图1所示结果可知，例1及例2中任一种制造方法中，均在片化培养中产生了VEGF及HGF。另外，例2的制造方法的产生量更多。
例4
通过温度处理，将按照例1或例2的方法在UpCell(R)(24孔培养板，CellSeedInc.)内进行片化而得的片状细胞培养物剥离，用HBSS(+)清洗后，在各孔中分别添加400μL含有2.5％FBS的MCDB培养基，在CO2孵育器内培养约24小时。培养后，回收全部上清液，与例3同样地利用ELISA法测定培养上清液中产生的细胞因子(VEGF及HGF)的浓度。在已将上清液回收的孔中，再次分别添加400μL含有2.5％FBS的MCDB培养基，在CO2孵育器内培养约48小时。培养后，回收全部上清液，与例3同样地利用ELISA法测定培养上清液中产生的细胞因子(VEGF及HGF)的浓度。从图2～3所示结果可知，用例1及例2中任一种制造方法制作的片状细胞培养物均产生了VEGF及HGF，并且，在长达96小时的长时间内持续产生。另外，就产生量而言，用例2的制造方法制作的片状细胞培养物更多。
例5
将经冷冻保存的人间充质干细胞在37℃下解冻，使用含有0.5％血清白蛋白的缓冲液清洗2次。将5×106～5×107个细胞悬浮于含有血清的培养基，接种至烧瓶中后，培养2～3天。
在UpCell(R)(3.5cm的皿或24孔培养板，CellSeedInc.)中以覆盖整个培养表面的程度添加含有血清的培养基，在37℃、5％CO2的环境中处理3小时～3天。处理后，弃置添加的培养基。
回收经培养的细胞，将其悬浮于含有血清的培养基，并以2～20×105个/cm2的密度接种至已处理过的UpCell(R)，在37℃、5％CO2的环境中进行约1天的片化培养。
例6
将5×106～3×107个人间充质干细胞悬浮于含有血清的培养基，接种至烧瓶中后，培养2～3天。回收经培养的细胞后，将其以1～5×107个/mL的浓度悬浮于细胞冷冻用保存液(含有10％DMSO的基础培养基)，在液氮罐内冷冻保存。
在UpCell(R)(3.5cm的皿或24孔培养板，CellSeedInc.)中以覆盖整个培养表面的程度添加含有血清的培养基，在37℃、5％CO2的环境中处理3小时～3天。处理后，弃置添加的培养基。
将经冷冻保存的细胞在37℃下解冻，使用含有0.5％血清白蛋白的缓冲液清洗2次。将清洗后的细胞悬浮于含有血清的培养基，并以2～10×205个/cm2的密度接种至已处理过的UpCell(R)，在37℃、5％CO2的环境中进行约1天的片化培养。
例7
将经冷冻保存的人心肌细胞在37℃下解冻，使用含有0.5％血清白蛋白的缓冲液清洗2次。将5×106～3×107个细胞悬浮于含有血清的培养基，接种至烧瓶中后，培养2～3天。
在UpCell(R)(3.5cm的皿或24孔培养板，CellSeedInc.)中以覆盖整个培养表面的程度添加含有血清的培养基，在37℃、5％CO2的环境中处理3小时～3天。处理后，弃置添加的培养基。
回收经培养的细胞，将其悬浮于含有血清的培养基，并以2～20×105个/cm2的密度接种至已处理过的UpCell(R)，在37℃、5％CO2的环境中进行约1天的片化培养。
例8
将5×106～3×107个人心肌细胞悬浮于含有血清的培养基，接种至烧瓶中后，培养2～3天。回收经培养的细胞后，将其以1～5×107个/mL的浓度悬浮于细胞冷冻用保存液(含有10％DMSO的基础培养基)，在液氮罐内冷冻保存。
在UpCell(R)(3.5cm的皿或24孔培养板，CellSeedInc.)中以覆盖整个培养表面的程度添加含有血清的培养基，在37℃、5％CO2的环境中处理3小时～3天。处理后，弃置添加的培养基。
将经冷冻保存的心肌细胞在37℃下解冻，使用含有0.5％血清白蛋白的缓冲液清洗2次。将清洗后的细胞悬浮于含有血清的培养基，并以2～20×105个/cm2的密度接种至已处理过的UpCell(R)，在37℃、5％CO2的环境中进行约1天的片化培养。
例9
将1×106～3×107个人间充质干细胞悬浮于含有血清的培养基，接种至烧瓶中后，培养2～3天。回收经培养的细胞后，将其以1～5×106个/mL的浓度悬浮于细胞冷冻用保存液(含有10％DMSO的基础培养基)，在液氮罐内冷冻保存。
在UpCell(R)(48孔培养板，CellSeedInc.)中以覆盖整个培养表面的程度添加含有血清的培养基，与例1、2、5～8同样地，在37℃、5％CO2、通常的气压(大气压)的环境中处理3小时～3天。处理后，弃置添加的培养基。
将冷冻保存的细胞在37℃下解冻，使用含有0.5％血清白蛋白的缓冲液清洗2次。将清洗后的细胞悬浮于含有血清的培养基，并以2～20×105个/cm2的密度接种至已处理过的UpCell(R)，与例1、2、5～8同样地，在37℃、5％CO2、通常的气压(大气压)的环境中进行约1天的片化培养。如图4所示，制作的片状细胞培养物呈均匀的白色，经外观检查未确认到缺陷。
本领域技术人员理解可以不脱离本发明的主旨地进行多种多样的变更。因此，本说明书中记载的方式仅为示例，应理解，这些记载并未意图对本发明的范围加以限制。
Claims (16)
1.片状细胞培养物的制造方法，所述方法包括：
将细胞冷冻的步骤；
将冷冻的细胞解冻的步骤；及
形成片状细胞培养物的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中，细胞为自体细胞或异体细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，细胞为自体细胞。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在将细胞解冻的步骤之后，在不使细胞实质性增殖的情况下形成片状细胞培养物。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，在形成片状细胞培养物的步骤之后，还包括回收片状细胞培养物的步骤，并且，将细胞解冻的步骤是在回收片状细胞培养物的步骤前的48小时以内进行的。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在将细胞冷冻的步骤之前，包括使细胞增殖的步骤。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，在将冷冻的细胞解冻的步骤之后、且在形成片状细胞培养物的步骤之前，包括清洗细胞的步骤。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，细胞选自成肌细胞、间充质干细胞、心肌细胞、成纤维细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞、iPS细胞、滑膜细胞、软骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、胰细胞、肾细胞、肾上腺细胞、牙周韧带细胞、牙龈细胞、骨膜细胞、皮肤细胞组成的组。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，所述方法获得活性比利用不包括将细胞冷冻的步骤和将冷冻的细胞解冻的步骤的方法制造的片状细胞培养物高的片状细胞培养物。
10.如权利要求9所述的方法，其中，活性选自细胞因子产生能力、植入能力、血管诱导能力及组织再生能力组成的组。
11.如权利要求10所述的方法，其中，细胞因子选自HGF及VEGF组成的组。
12.片状细胞培养物，其是利用权利要求1～11中任一项所述的方法制造的。
13.医药组合物，其包含权利要求12所述的片状细胞培养物。
14.对与对象中组织的异常相关的疾病进行处理的方法，所述方法包括将有效量的权利要求12所述的片状细胞培养物或权利要求13所述的医药组合物施予至需要处理的对象。
15.如权利要求14所述的方法，其中，组织选自心肌、角膜、视网膜、食道、皮肤、关节、软骨、肝脏、胰、牙龈、肾脏、甲状腺、骨骼肌及中耳组成的组。
16.如权利要求14所述的方法，其中，疾病选自心脏疾病、角膜疾病、视网膜疾病、食道疾病、皮肤疾病、关节疾病、软骨疾病、肝疾病、胰疾病、牙科疾病、肾脏疾病、甲状腺疾病、肌肉疾病及中耳疾病组成的组。
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