CN110229783A

CN110229783A - 一种基于温皿制备干细胞膜片的方法

Info

Publication number: CN110229783A
Application number: CN201910431690.9A
Authority: CN
Inventors: 王嵘; 张华军; 吴远斌; 魏士雄; 李力兵; 成楠; 毛磊
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2019-09-13

Abstract

本发明公开了一种基于温皿制备干细胞膜片的方法，其包括以下步骤：步骤1、对温皿进行预处理，步骤2、进行细胞接种、培养，步骤3、对培养后的细胞进行洗涤，步骤4、进行膜片获取，步骤5、将膜片移至普通培养皿中，步骤6、将收获后的膜片进行再培养。本发明依据不同种类细胞的形态和特点，确定了细胞膜片在不同规格温度敏感性培养皿中的接种数量、包被时间以及细胞代数和成膜的时间及膜片获取后再培养等技术手段。使膜片制备更加方便快捷并可得到更加完美的细胞膜片。从而解决了不同种类细胞膜片的制备和在收获膜片时的技术问题。

Description

一种基于温皿制备干细胞膜片的方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术、细胞组织工程领域，具体涉及干细胞培养过程中的不同组织类型来源的贴壁培养干细胞的膜片制备技术方法及其涵盖在缺血性疾病治疗中的组织修复及临床症状改善的应用。

背景技术

干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物组各个织器官的原始细胞。在修复机体、器官移植、医学美容等众多领域都有极高的应用价值。干细胞研究已成为生命科学领域的重大热点。

干细胞按照分化潜能可分为三大类：

1、全能干细胞

2、多能干细胞--造血干细胞

3、单能干细胞

细胞膜片制备技术，是通过物理的方法将在特殊处理过的培养皿上扩增融合的细胞从培养皿底壁分离，获得完整膜片状细胞结构的一种技术。与传统胰酶消化收集细胞的方法相比，运用该技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质、建立的细胞-基质连接以及细胞间连接等结构。细胞膜片技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌形成致密细胞膜片组织，能100％将细胞保留在病灶组织部位，有效地修复组织缺损和改善器官功能。

细胞膜片可通过多种方法收获。日本学者Okano等提出利用温度敏感型培养皿获得细胞膜片。还有文献报道在培养的细胞中添加不同浓度的维生素C也可收获细胞膜片。温度敏感型培养皿主要由特殊的温度敏感材料聚N-异丙基丙烯酰胺(poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm)经过特殊处理后结合在培养皿底面，由于其表面分子链上同时具有亲水性基团酰胺基(-CONH-)和疏水性的异丙基[-CH(CH3)2-]，所以；当温皿在37℃细胞培养时皿中的材料为疏水性，细胞处于正常贴壁状态，当温皿离开37℃培养温度至32℃时，温皿中的敏感材料变为亲水性，贴附于培养皿底部的细胞胞即可自动脱壁并依靠其自身分泌的细胞外基质extracellular matrix(ECM)而形成具有二维结构的完整膜性细胞片。

这种基于在温度敏感型培养皿内培养收获的细胞膜片，其优势为；避免了细胞收获时消化胰酶及分散酶对细胞进行消化时导致细胞膜蛋白的损伤，而细胞膜蛋白的变异会致使细胞发生功能障碍或功能缺失，这会减弱干细胞在治疗医学上的应用潜能。采用这种降温回收细胞的方式，可以使细胞与细胞外基质蛋白无损共同脱附，有效的保护了细胞膜蛋白和相关受体，从而保证了细胞的生理功能和细胞更强的功能特性。同时也为组织修复和再生医学领域开创了新的研究方向“细胞膜片工程”。

目前，组织工程技术主要是以“细胞+复合材料”的组合方式，而细胞的获得往往都是使用胰酶或其他酶类作为贴壁细胞的消化液而收获细胞，这种方法使得细胞与细胞间的信号分子和细胞连接受到破坏。会影响移植后细胞的存活及组织的再生效果，同时使用的生物材料载体在体内的植入和降解均会引起局部组织的免疫反应和毒性反应而影响组织的再生修复效果。细胞膜片技术就是以不需要材料支架、收获细胞膜片时不使用消化酶而让细胞膜片最大限度的保留了细胞外基质和细胞连接，可以更好的模拟细胞生长的微环境，细胞膜片直接贴敷于病灶部位，使细胞100％保留在病灶处发挥更大的功能。

有文献报道可以用50mg/m L--100mg/ml维生素C添加到培养基中，可以形成细胞膜片。(《山东医药》2016年35期人牙周膜干细胞膜片的制备)

维生素C可以促进细胞分泌胶原和其他细胞外基质，维生素C可以促进胶原蛋白的合成：胶原蛋白与普通蛋白质的不同之处，主要在于其中含有羟脯氨酸和羟赖氨酸。这两种氨基酸的合成，需要维生素C的参与。胶原蛋白的合成过程中脯氨酸的羟化需要维生素C参加，所以VC缺乏，胶原蛋白不能正常合成，导致细胞连接障碍。细胞间质的关键成分是胶原蛋白，胶原蛋白占身体蛋白质的1/3，生成结缔组织，构成身体骨架。

现有不足之处在于成膜时间长，培养过程易污染，成膜不易操作，形成的膜片大小厚度不均一，形状不能统一且不规则。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述存在的至少一个问题，该目的是通过以下技术方案实现的。

本发明提供了一种基于温皿制备干细胞膜片的方法，包括以下步骤

步骤1、对温皿进行预处理，

步骤2、进行细胞接种、培养，

步骤3、对培养后的细胞进行洗涤，

步骤4、进行膜片获取，

步骤5、将膜片移至普通培养皿中，

步骤6、将收获后的膜片进行再培养。

进一步，可制备所述膜片的细胞种类包括间充质细胞、上皮细胞、内皮细胞和子宫内膜细胞及其他可贴壁培养的细胞。

进一步，所述步骤1中对所述温皿的预处理方法，利用包括黏连蛋白、明胶、多聚赖氨酸、胎牛血清或自体血清，对所述温皿进行包被。

进一步，所述步骤2中细胞接种浓度包括：35mm--90mm皿细胞接种数量为2×10⁶--5×10⁸。

进一步，所述步骤2的培养过程中，所述膜片的细胞培养代数应依据细胞来源限定2-10代内为佳。

进一步，所述步骤2的培养过程中，对细胞进行贴壁培养。

进一步，所述步骤3中对培养后的细胞进行洗涤的可使用的洗涤液包括PBS、D-HBSS+-液、生理盐水。

进一步，所述步骤4中膜片获取方式包括：

1)可将细胞培养皿放置冰块或冰袋上，

2)细胞从皿边缘开始脱离并向皿中央呈兜状卷曲，

3)枪头沿着培养皿壁划一圈使细胞从培养皿边缘脱离，

4)移液枪轻轻吹打细胞帮助细胞向中心卷起。

进一步，所述膜片的规格为1.5cm-6cm，所述膜片的形状为圆形，所述膜片的厚度为3-5mm。

进一步，所述细胞膜片的应用范围包括缺血引起的组织损伤修复、角膜修复、子宫内膜修复、食道癌术后狭窄、支气管胸膜漏气。

进一步，所述细胞膜片可叠加。

本发明依据不同种类细胞的形态和特点，确定了细胞膜片在不同规格温度敏感性培养皿中的接种数量、包被时间以及细胞代数和成膜的时间及膜片获取后再培养等技术手段。使膜片制备更加方便快捷并可得到更加完美的细胞膜片。从而解决了不同种类细胞膜片的制备和在收获膜片时的技术问题。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1为本发明所提供的脐带组织细胞分离的示意图；

图1-1为本发明所提供的脐带组织细胞培养的示意图；

图1-2为本发明所提供的脐带组织细胞膜片制备的示意图

图1-3为本发明所提供的脐带组织细胞膜片叠加的示意图

图2为本发明所提供的脂肪组织细胞分离的示意图；

图2-1为本发明所提供的脂肪组织细胞培养的示意图；

图2-2为本发明所提供的脂肪组织细胞膜片制备的示意图；

图3为本发明所提供的子宫内膜修复细胞膜片分离的示意图

图3-1为本发明所提供的子宫内膜修复细胞培养的示意图；

图3-2为本发明所提供的子宫内膜修复细胞膜片制备的示意图；

图3-3为本发明所提供的子宫内膜修复细胞膜片叠加的示意图。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明利用特殊的温度敏感材料聚N-异丙基丙烯酰胺(poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm)，经过特殊处理后，将其结合在培养皿底面，再利用该培养皿，进行细胞膜片制备。本发明的细胞膜片的应用范围如下：

1)缺血引起的组织损伤修复(心脏、肢体、肝脏、肾脏、皮肤等)

2)角膜修复

3)子宫内膜修复

4)食道癌术后狭窄

5)支气管胸膜瘘

本专利包括其技术中的如下方法：

1、温皿包被预处理方法和步骤：

1)包被；

可用100％胎牛血清或含不同浓度血清培养基(即浓度为2％、5％、10％、20％),纤连蛋白fibronectin,多聚赖氨酸,明胶或胶原蛋白，也可以用自体血清进行温皿包被；

2)在35mm--90mm培养皿添加上述包被材料，添加量为1ml--10ml；

3)包被时间为37℃、5％CO₂培养箱中无菌包被8h--48h；

2、待制备膜片的细胞接种和培养操作步骤：

1)培养的细胞酶消化、离心、计数，

2)培养箱中取出包被的温皿，吸弃包被液，

3)按照细胞接种浓度，接种细胞，

4)37℃、5％CO₂培养箱继续培养8h以上(12h-36h)。

3、细胞膜片细胞接种浓度：

35mm--90mm培养皿接种细胞浓度为2×10⁶--5×10⁸

4、膜片获取方法及洗涤：

1)培养箱中取出已接种细胞的温皿，吸弃培养基，

2)加入4℃预冷的HBSS-Hank's+-液或PBS-PH7.2或生理盐，用量为1ml至10ml，

3)可将细胞培养温皿放置冰块或冰袋上(降温)，

4)10--30分钟后细胞从皿边缘开始脱离并向皿中央呈兜状卷曲，

5)若细胞未脱离可用10μl枪头沿着培养皿壁划一圈使细胞从培养皿边缘脱离，

6)细胞开始脱离培养皿后可用吸管、1ml移液枪轻轻吹打细胞帮助细胞向中心卷起。

5、将完全剥离培养皿的细胞膜片移至普通培养皿中(转移时注意膜片的正反面)：

1)可用直接将膜片快速倒入普通培养皿中，

2)使用温皿配套的膜片转移膜贴附在膜片上转移膜片至普通培养皿中，

3)使用盖玻片将膜片转移至普通培养皿中，

4)使用任何铲状物将膜片移至普通培养皿中，

5)向转移至普通培养皿中加入HBSS-Hank's液(PBS、生理盐水)洗膜片2-3次，

6、将制备完成的膜片滴加200-1000μl细胞完全培养液，放入培养箱中继续培养10-30分钟，

7、再次HBSS-Hank's液(PBS、生理盐水)洗膜片2-3次。

8、将2、3张细胞膜片进行叠加。

实施例1

请参考图1，在一种具体实施方式中，利用脐带组织细胞制备人脐带间充质干细胞膜片，其制备过程如下：

1、温皿包被：

1)用自体血清或胎牛血清培养基包被温皿,

2)在90mm培养皿中添加上述血清的量为10ml，

3)包被时间为：在37℃、5％CO₂培养箱中无菌包被8h；

2、待制备膜片的细胞接种与培养：

1)对培养的细胞酶进行消化、离心、计数，

2)从培养箱中取出包被的温皿，吸弃包被液，

3)按照细胞接种浓度，接种细胞，本培养皿接种细胞浓度为3×10⁸

4)在上述37℃、5％CO₂培养箱继续培养10h；

3、获取方法及洗涤：

1)培养箱中取出已接种细胞的温皿，吸弃培养基，

2)加入4℃预冷的HBSS-Hank's+-液10ml，

3)将细胞培养温皿放置冰块或冰袋上降温，

4)10分钟后细胞从皿边缘开始脱离并向皿中央呈兜状卷曲，

6)细胞开始脱离培养皿后可用吸管、1ml移液枪轻轻吹打细胞帮助细胞向中心卷起；

4、直接将完全剥离培养皿的细胞膜片快速倒入普通培养皿中(转移时注意膜片的正反面)，向转移至普通培养皿中加入HBSS-Hank's液洗膜片2次；

5、将制备完成的膜片滴加500μl细胞完全培养液，放入培养箱中继续培养20分钟；

6、再次HBSS-Hank's液洗膜片2次；

7、最后将2张细胞膜片进行叠加完成制备。

实施例2

参见图2，利用脂肪组织细胞，制备角膜修复细胞膜片的过程如下：

1、温皿包被：

1)用纤连蛋白fibronectin培养基包被温皿,

2)在35mm培养皿中添加上述血清的量为1ml，

3)包被时间为：在37℃、5％CO₂培养箱中无菌包被36h；

2、待制备膜片的细胞接种与培养：

1)对培养的细胞酶进行消化、离心、计数，

2)从培养箱中取出包被的温皿，吸弃包被液，

3)按照细胞接种浓度，接种细胞，本培养皿接种细胞浓度为1×10⁷

4)在上述37℃、5％CO₂培养箱继续培养24h；

3、获取方法及洗涤：

1)培养箱中取出已接种细胞的温皿，吸弃培养基，

2)加入4℃预冷的生理盐水2ml，

3)将细胞培养温皿放置冰块或冰袋上降温，

4)10分钟后细胞从皿边缘开始脱离并向皿中央呈兜状卷曲，

6)细胞开始脱离培养皿后可用吸管、0.2ml移液枪轻轻吹打细胞帮助细胞向中心卷起；

4、将完全剥离培养皿的细胞膜片，使用温皿配套的膜片转移膜贴附在膜片上转移膜片至普通培养皿中，向转移至普通培养皿中加入生理盐水洗膜片3次；

5、将制备完成的膜片滴加200μl细胞完全培养液，放入培养箱中继续培养10分钟；

6、再次生理盐水洗膜片3次，最后完成制备。

实施例3

参见图3，利用子宫内膜组织细胞，制备子宫内膜修复细胞膜片的过程如下：

1、温皿包被：

1)用多聚赖氨酸培养基包被温皿,

2)在60mm培养皿中添加上述血清的量为5ml，

3)包被时间为：在37℃、5％CO₂培养箱中无菌包被48h；

2、待制备膜片的细胞接种与培养：

1)对培养的细胞酶进行消化、离心、计数，

2)从培养箱中取出包被的温皿，吸弃包被液，

3)按照细胞接种浓度，接种细胞，本培养皿接种细胞浓度为3×10⁷

4)在上述37℃、5％CO₂培养箱继续培养36h；

3、获取方法及洗涤：

7)培养箱中取出已接种细胞的温皿，吸弃培养基，

8)加入4℃预冷的PBS-PH7.2洗涤液5ml

9)将细胞培养温皿放置冰块或冰袋上降温，

10)10分钟后细胞从皿边缘开始脱离并向皿中央呈兜状卷曲，

11)若细胞未脱离可用10μl枪头沿着培养皿壁划一圈使细胞从培养皿边缘脱离，

12)细胞开始脱离培养皿后可用吸管、1ml移液枪轻轻吹打细胞帮助细胞向中心卷起；

4、将完全剥离培养皿的细胞膜片，使用盖玻片将膜片转移至普通培养皿中(转移时注意膜片的正反面)，向转移至普通培养皿中加入生理盐水洗膜片3次；5、将制备完成的膜片滴加200μl细胞完全培养液，放入培养箱中继续培养30分钟；

6、再次生理盐水洗膜片3次；

7、最后将3张细胞膜片进行叠加完成制备。

本发明将不同组织来源的干细胞按照特定的细胞浓度接种培养在不同规格的具有温度应答的培养皿中，培养过程不需要使用生物支架和胰酶或其他分离酶对细胞进行消化处理，并以加入其它膜片收获辅助手段就可以得到不同规格的完整的细胞膜性膜片。细胞膜片具有丰富的天然细胞外基质，并且可以保留大部分纤维连接蛋白和层黏连蛋白，在体内移植时可不用缝合，膜片中的粘附分子和细胞外基质可直接黏附于病变组织，使细胞百分之百的作用于机体受损的部位。从而提高细胞移植对组织的再生修复效果和移植的细胞更好保留其活性。

应当理解的是，尽管可以在文中使用术语第一、第二、第三等来描述多个元件、部件、区域、层和/或部段，但是，这些元件、部件、区域、层和/或比段不应被这些术语所限制。这些术语可以仅用来将一个元件、部件、区域、层或部段与另一区域、层或部段区分开。除非上下文明确地指出，否则诸如“第一”、“第二”之类的术语以及其它数字术语在文中使用时并不暗示顺序或者次序。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种基于温皿制备干细胞膜片的方法，其特征在于，包括以下步骤

步骤1、对温皿进行预处理，

步骤2、进行细胞接种、培养，

步骤3、对培养后的细胞进行洗涤，

步骤4、进行膜片获取，

步骤5、将膜片移至普通培养皿中，

步骤6、将收获后的膜片进行再培养。

2.根据权利要求1所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，可制备所述膜片的细胞种类包括间充质细胞、上皮细胞、内皮细胞和子宫内膜细胞及其他可贴壁培养的细胞。

3.根据权利要求1所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤1中对所述温皿的预处理方法，利用包括黏连蛋白、明胶、多聚赖氨酸、胎牛血清或自体血清，对所述温皿进行包被。

4.根据权利要求1所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤2中细胞接种浓度包括：35mm--90mm皿细胞接种数量为2×10⁶--5×10⁸。

5.根据权利要求1所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤2的培养过程中，所述膜片的细胞培养代数为10代以内。

6.根据权利要求1或5所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤2的培养过程中，对细胞进行贴壁培养。

7.根据权利要求1所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤3中对培养后的细胞进行洗涤的可使用的洗涤液包括PBS、D-HBSS+-液、生理盐水。

8.根据权利要求1所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤4中膜片获取方式包括：

1)可将细胞培养皿放置冰块或冰袋上，

2)细胞从皿边缘开始脱离并向皿中央呈兜状卷曲，

3)枪头沿着培养皿壁划一圈使细胞从培养皿边缘脱离，

4)移液枪轻轻吹打细胞帮助细胞向中心卷起。

9.根据权利要求1-8之一所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，所述膜片的规格为1.5cm-6cm，所述膜片的形状为圆形，所述膜片的厚度为3-5mm。

10.根据权利要求1-9之一所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，所述细胞膜片的应用范围包括缺血引起的组织损伤修复、角膜修复、子宫内膜修复、食道癌术后狭窄、支气管胸膜漏气。

11.根据权利要求1-10之一所述的制备干细胞膜片的方法，其特征在于，所述细胞膜片可叠加。