CN107847460A - 减轻或改善大疱性表皮松解症用间叶干细胞‑水凝胶‑可降解性或间叶干细胞‑水凝胶‑不可降解性支持体组成物 - Google Patents

减轻或改善大疱性表皮松解症用间叶干细胞‑水凝胶‑可降解性或间叶干细胞‑水凝胶‑不可降解性支持体组成物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种包括间叶干细胞‑水凝胶‑可降解性或间叶干细胞‑水凝胶‑不可降解性支持体的组成物薄片及其制造方法，更具体，根据本发明包括间叶干细胞‑水凝胶‑可降解性或间叶干细胞‑水凝胶‑不可降解性支持体的薄片可不经过利用蛋白质分解梅的单离过程，高活性干细胞可直接敷在大疱性表皮松解症患者的患处，在培养阶段从间叶干细胞分泌的胶原蛋白、层黏连蛋白、纤维粘连蛋白、弹性纤维等细胞外基质完整地贴附在水凝胶上，与现用在大疱性表皮松解症的敷剂相比，显示其皮肤再生及再表皮化能力非常显著，优秀的有利效果。

Description

减轻或改善大疱性表皮松解症用间叶干细胞-水凝胶-可降解 性或间叶干细胞-水凝胶-不可降解性支持体组成物
技术领域
本发明涉及一种减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物、薄片及其制造方法，包括间叶干细胞-水凝胶-可降解性或间叶干细胞-水凝胶-不可降解性支持体组成物，尤其包括干细胞的本发明薄片型组成物作为减轻或改善大疱性表皮松解用敷料非常有效。
背景技术
大疱性表皮松解(epidermolysisbullosa)是由于构成表皮和表皮-真皮交界区及上皮乳头细胞蛋白质的基因突变引起的，轻微的外伤也会引起水泡，皮肤与黏膜上产生病痛的罕见遗传性疾病。大疱性表皮松解症患者因没有稳定两个层的结合蛋白质，双层之间产生小小的摩擦也会产生水沟，据说会经受相应于三度烧伤的疼痛。包括单纯型大疱性表皮松解症(epidermolysisbullosa simplex,EBS)、交界型大疱性表皮松解症(junctionalepidermolysisbullosa,JEB)、营养不良型大疱性表皮松解症(dystrophicepidermolysisbullosa,DEB)等，大多数患者是属于单纯型大疱性表皮松解症。现被知皮肤中生成的角质突变为主要病因，单纯型大疱性表皮松解症(EpidermolysisBullosasimplex；EB implex)是常染色体显性遗传，交界型大疱性表皮松解症(JunctionalEpidermolysisBullosa；JEB)是常染色体劣性遗传，营养不良型大疱性表皮松解症(Dystrophic EpidermolysisBullosa；DEB)具有显性与劣性两种形态。
至今为止，虽然正在研究改变皮肤生产的角质混合物、骨髓移植等方法，但尚不存在疾病的治愈方法，主要治疗方法为减轻症状或综合症的对症疗法。其中，最重要的是防止已生成水疱被感染，只轻微的压力或摩擦也会导致产生水疱，要注意不要触碰，生成水泡时，重要的是减轻疼痛，降低不适感为最低，预防损失过多体液和预防感染，在使用敷料时为了减轻疼痛也有使用镇痛剂。
大疱性表皮松解症患者一般建议外敷以防水泡感染。比如，单纯型大疱性表皮松解症建议使用软硅型敷料、Lipido胶体型敷料、泡沫型敷料、水凝胶型敷料、薄片水凝胶型敷料、生物合成纤维素型敷料、交界型敷料、粉状敷料，疱疹样大疱性表皮松解症建议使用Lipido胶体型敷料、聚合物型膜状敷料、水纤维型敷料，交界型大疱性表皮松解症建议使用水凝胶含针状纱布型敷料、水纤维型敷料、Lipido胶体型敷料、软硅型敷料、聚合物型膜状敷料、软硅泡沫型敷料、具有超级-吸附剂的软硅泡沫型敷料，营养不良型大疱性表皮松解症建议使用软硅型敷料、Lipido胶体型敷料、软硅泡沫型敷料、具有超级-吸附剂的软硅泡沫型敷料、泡沫型敷料、聚合物型膜状敷料、超级-吸附剂型敷料、交界型敷料。(参照DenyerJ,Pillay E.Best practice guidelines for skin and wound careinepidermolysisbullosa.International Consensus.DEBRA,2012.)。
有关治伤用敷料，有聚氨酯泡沫型治伤用敷料的专利(大韩民国注册专利第345，034号)，引进亲水性基增进生物适应性，促进吸收患处分泌物；包含药物层的聚氨酯泡沫型敷料的专利(大韩民国注册专利第1,022,884号)等。
但是现有敷料，适用在大疱性表皮松解症患者患处时，虽然有些产品具有可减轻刺激性或可容易吸收水泡周围涌出物的优点，但至今还没有适用在大疱性表皮松解症患者患处时既没有刺激性也可一并显示皮肤再生效果的敷料技术。
另外，中制造的脂肪来源间叶干细胞固定后加入包含胶原蛋白类型VII或胶原蛋白α-1链是由COL7A1基因编码的蛋白质，现知道此基因产生突变时与营养不良性大疱性表皮松解症有关，据报告，即使没有变异，对胶原蛋白类型VII的自我免疫反应会引发后天性大疱性表皮松解。并且，据知，胶原蛋白类型VII与层黏连蛋白-5及纤维粘连蛋白相互作用。并且，在意大利发表了研究实例，把含有矫正层黏连蛋白-5基因的干细胞，通过皮肤移植移植到交界型大疱性表皮松解症患者的大腿部患处后达到不产生水泡的临床效果。由此可知，为了减轻或改善大疱性表皮松解症，胶原蛋白类型VII及层黏连蛋白-5起着非常重要的作用。
本发明的目的在于提供一种减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物、薄片及其制造方法，把培养的间叶干细胞在水凝胶悬浮，贴附在可降解性或不可降解性支持体后培养，包括存活的高活性间叶干细胞，尤其增加胶原蛋白类型VII及层黏连蛋白-5的表达量，当适用在大疱性表皮松解症患处时，临床可发挥有意义的效果。
发明详细说明
技术课题
本发明的目的在于提供一种减轻或改善大疱性表皮松解症组成物或薄片及其制造方法，包含高活性间叶干细胞使其得到临床有效治疗效果，此间叶干细胞是从脂肪、骨髓、皮肤、血管、肌肉、脑、血液、胎盘、齿髓及脐带血组成的组合中选择的某一种分离的，用作大疱性表皮松解症患处的敷剂。
技术解决方法
为达到上述目的的本发明提供间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体或不降解性支持体，更详细，提供包括间叶干细胞-水凝胶-不可降解性支持体的减轻或改善大疱性表皮松解症支持体，敷薄片及其制造方法。
本发明减轻或改善大疱性表皮松解症的支持物，间叶干细胞对CD29,CD44,CD73,CD90及CD105显阳性，对CD34及CD45显阴性的自体或同种来源细胞。
本发明一形态中，支持体使用由聚谷氨酸、聚乳酸、可吸收聚羟基乳酸网、人羊膜、牛羊膜、猪胶原蛋白、几丁质、甲壳质、纤维粘连蛋白及葡聚糖组成的组合中选择的可降解性高分子支持体，或使用如灭菌无纺布纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜及单面软硅涂层的聚氨酯等不可降解性支持体或它们的组合体，举例，可使用聚谷氨酸/无纺布纤维、聚乳酸/无纺布纤维、聚谷氨酸/聚乳酸/无纺布纤维。
根据本发明一形态中，水凝胶可从纤维蛋白胶、玻尿酸或此衍生物、明胶、胶原蛋白、藻酸、纤维素及果胶组成的组合中选择，此时形成纤维蛋白胶的纤维蛋白原的浓度可在0.5～60mg/mL之间，具体可以是0.5～45mg/mL，更具体可以是0.5～30mg/mL，还更具体可在0.5～20mg/mL，再具体可以是0.5～10mg/mL。
根据本发明一形态中，为制造减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片，包括：混合干细胞与水凝胶在支持体1cm2中均匀涂层1,000～10,000个，在包含胎牛血清及碱性纤维母细胞生长因子或表皮生长因子的培养基中培养，干细胞增殖到支持体1cm2中为20,000个以上，更具体，增殖到20,000～400,000个的阶段。
发明的效果
根据本发明包括间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体或不可降解性支持体的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片，尤其增加薄片包含胶原蛋白类型VII或层黏连蛋白-5的表达量，用在大疱性表皮松解症患处时具有临床可发挥有意义效果的优点。
并且，根据本发明包含高活性间叶干细胞的组成物或薄片，可不经过利用蛋白酶的分离过程，高活性干细胞原样适用在大疱性表皮松解症患者的患处，在培养阶段间叶干细胞中分泌的细胞外基质如胶原蛋白、层黏连蛋白、纤维粘连蛋白、弹性蛋白等完整地罩在水凝胶中存在，与现有治疗剂相比，适用在大疱性表皮松解症患者的患处时，显示有利效果证明其具有显著的皮肤再生及再表皮化能力。
更详细，本发明间叶干细胞-水凝胶-支持体，在无血清培养苦上也维持了纤维芽细胞状态，经过1周后存活率达90％以上，跟现有干细胞治疗剂相比，存活期间显著增加，冻结保管后解冻时，薄片的形态及硬度维持原状，薄片内细胞存活率也达95％，在-80℃也可无细胞损伤地长期保管，长期冻结保管时经过1年以上时解冻后也显示出95％以上的细胞还在生存。并且，持续分泌促进细胞生长及血管形成的多种生长因子和细胞因子，分泌大量包括胶原蛋白类型VII和层黏连蛋白-5在内的多种细胞外基质，当分泌的细胞外基质停留在水凝胶内，适用在患处时提供多种基质，可方便治疗大疱性表皮松解症，不引发免疫反应，反而即使患处发生炎症时显著减少免疫细胞大量分泌增加免疫反应的肿瘤坏死因子-α的分泌量，减轻炎症，可帮助治疗大疱性表皮松解症患者患发的水泡及炎症，尤其显著增加胶原蛋白类型VII的表达量，具有促进组织再生及再表皮化优点。
附图说明
图1a是图示把混合以纤维蛋白原原液及分步稀释的溶液制成的纤维蛋白凝胶培养的人脂肪来源间叶干细胞的形态用AO/EtBr染色后观察的荧光显微镜照片(放大系数400)。纤维蛋白原的稀释倍数及包括凝血酶的细胞悬浮液1：1混合，最终形成纤维蛋白胶时的浓度用括号表示。
图1b是图示纤维蛋白原原液及分步稀释的溶液制成的纤维蛋白凝胶培养的人脂肪来源间叶干细胞中加入WST-1后测量的吸光度图表。
图2是图示人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片的冻结前后比较图。
图2a是图示薄片中细胞的照片，把人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体或不可降解性支持体薄片培养5天后，把细胞经AO/EtBr染色后用荧光显微镜观察的照片。
图2b是图示把人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体或不可降解性支持体薄片在-80℃冻结保管后解冻，再把细胞用AO/EtBr染色后用荧光显微镜观察的照片。
图3是图示为评价人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体或不可降解性支持体薄片的长期保管稳定性，在-80℃冻结保管经过1个月、3个月、6个月、9个月、12个月后解冻时显示薄片中细胞存活率的图表。
图4a是图示把人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体薄片或不可降解性支持体薄片分泌的VEGF和HGF量，采用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)测定的图表。
图4b是图示在人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体薄片或不可降解性支持体薄片分泌的形成血管促进因子采用细胞因子方阵试剂盒分析的结果。
图5a是图示在人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体薄片或不可降解性支持体薄片加同种末梢血单核细胞共同培养的后末梢血单核细胞分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)的量采用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)测定的图表。
图5b是图示在人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体薄片或不可降解性支持体薄片加同种末梢血单核细胞共同培养的后末梢血单核细胞分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)的量采用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)定量后换算TNF-α分泌抑制率(％)的图表。
图6a是图示人脂肪来源间叶干细胞与纤维芽细胞表达的细胞外基质蛋白质中胶原蛋白类型VII及层黏连蛋白表达量采用蛋白质印迹法(Western blot)确认的结果。
图6b是图示人脂肪来源间叶干细胞与纤维芽细胞表达的细胞外基质蛋白质中胶原蛋白类型VII表达量采用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法确认的结果图表。
图6c是图示把人脂肪来源间叶干细胞与纤维芽细胞表达的细胞外基质蛋白质中胶原蛋白类型VII及胶原蛋白类型I的表达量免疫荧光染色后用荧光显微镜观察的照片。
图7a是图示本发明薄片中细胞外基质蛋白质胶原蛋白类型VII及胶原蛋白类型I分泌量的图表。
图7b是图示本发明薄片中包括的细胞外基质蛋白质胶原蛋白类型VII及胶原蛋白类型I、胶原蛋白类型V、层黏连蛋白5、纤粘蛋白、层黏连蛋白等的表达免疫荧光染色后用荧光显微镜观察的照片。
图8是图示本发明薄片与单层培养的人脂肪来源间叶干细胞分泌的细胞外基质蛋白质胶原蛋白类型VII量的比较图表。
图9是图示人脂肪来源间叶干细胞露在患处分泌的炎性细胞因子TGF-β2,TNF-α时，胶原蛋白类型VII表达急剧增加的结果。
图10是图示本发明薄片对大疱性表皮松解症患者粘贴前后粘贴后相隔1个星期，总4周的患处面积大小变化的图表。
实施发明最佳形态
为达到上述目的的本发明提供一种减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物、薄片及其制造方法，包括间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体。
以下更详细说明本发明。
本发明涉及一种减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，包括：(a)把间叶干细胞利用水凝胶贴附到，(i)从降解性支持体及不可降解性支持体组成的组合中选择的一种以上的支持体；或(ii)2种以上不可降解性支持体；或(iii)1种以上的降解性支持体及1种以上的不可降解性支持体的组合体，获得间叶干细胞-水凝胶-支持体的阶段；及b在增殖培养基培养阶段a中获得的间叶干细胞-水凝胶-支持体的阶段，此增殖培养基是胎牛血清及碱性纤维母细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β1、血小薄片源生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子及胰岛素样生长因子组成的组合中选择的包括1种以上因子的培养基，水凝胶是从纤维蛋白胶、玻尿酸、明胶、胶原蛋白、藻酸、纤维素及果胶构成的组合中选择的任一一种以上，可降解性支持体是从聚谷氨酸、聚乳酸、可吸收聚羟基乳酸网、人羊膜、牛羊膜、猪胶原蛋白、几丁质、甲壳质、纤维粘连蛋白及葡聚糖组成的组合中选择，不可降解性支持体是从灭菌无纺布纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜及单面软硅涂层的聚氨酯组成的组合中选择。
更具体，本发明涉及一种减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，包括：(a1)把间叶干细胞在增殖培养基中培养2代以上的阶段；(a2)把培养的间叶干细胞利用水凝胶贴附到(i)从降解性支持体及不可降解性支持体组成的组合中选择的一种以上的支持体；或(ii)2种以上不可降解性支持体；或(iii)1种以上的降解性支持体及1种以上的不可降解性支持体的组合体，获得间叶干细胞-水凝胶-支持体的阶段；及b在增殖培养基培养阶段a中获得的间叶干细胞-水凝胶-支持体的阶段，此增殖培养基是胎牛血清及碱性纤维母细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β1、血小薄片源生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子及胰岛素样生长因子组成的组合中选择的包括1种以上因子的培养基，水凝胶是从纤维蛋白胶、玻尿酸、明胶、胶原蛋白、藻酸、纤维素及果胶构成的组合中选择的任一一种以上，可降解性支持体是从聚谷氨酸、聚乳酸、可吸收聚羟基乳酸网、人羊膜、牛羊膜、猪胶原蛋白、几丁质、甲壳质、纤维粘连蛋白及葡聚糖组成的组合中选择，不可降解性支持体是从灭菌无纺布纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜及单面软硅涂层的聚氨酯组成的组合中选择。
根据本发明一形态中，包含在上述增殖培养基的因子更具体是碱性纤维母细胞生长因子、表皮生长因子或它们的组合。
根据本发明一形态中，间叶干细胞是相对CD29,CD44,CD73,CD90及CD105显阳性，相对CD34及CD45显阴性的自我或同种来源细胞。
根据本发明一形态中，为制造减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片，包括：混合干细胞与水凝胶在支持体1cm2中均匀涂层1,000～10,000个，在包含胎牛血清及碱性纤维母细胞生长因子或表皮生长因子组成的组合中选择一个以上的培养基中培养，干细胞增殖到支持体1cm2中为20,000个以上，更具体，增殖到20,000～400,000个的阶段。
根据本发明一形态中，在上述阶段c中还可包括另外采用物理刺激、低氧刺激、丝裂原刺激及炎症因子刺激如干扰素γ组成的组合中选择的一个以上的刺激激活细胞的阶段c。尤其由大疱性表皮松解症引起的损伤组织因其血管破劣或功能低下造成供氧不畅通，存在慢性炎症，投入到损伤组织的干细胞由低氧刺激及炎症因子刺激被激活，生长因子及细胞因子的分泌急剧增加。因此在支持体薄片制造阶段处理低氧压力、丝裂原及炎症因子，可制造分泌高浓度生长因子和细胞因子的包括高活性干细胞的组成物、薄片。
根据本发明一形态，水凝胶可使用纤维蛋白胶、玻尿酸、明胶、胶原蛋白、藻酸、纤维素及果胶，但并不局限于此。把纤维蛋白胶用作水凝胶时，其特征在于，形成纤维蛋白胶的纤维蛋白原的浓度可以在0.5～60mg/mL，具体可以是0.5～45mg/mL，更具体可以是0.5～30mg/mL，还更具体可在0.5～20mg/mL，再具体可以是0.5～10mg/mL，还再具体可以是0.5～10mg/mL，可包括凝血酶其浓度在1～50I.U./mL，具体在1～30I.U./mL，更具体在5～20I.U./mL之间。
根据本发明一形态，只采用水凝胶也可制造干细胞-水凝胶薄片。但是水凝胶硬度低受机械/物理力量很容易撕裂，薄片大小受限制，使用时还需要谨慎。相反，根据本发明，把干细胞-水凝胶贴附到可降解性或不可降解性支持体上，支持体可提高干细胞-水凝胶的强度，容易操作。
根据本发明一形态，可降解性支持体可使用从聚谷氨酸、聚乳酸、可吸收聚羟基乳酸网、人羊膜、牛羊膜及猪胶原蛋白、几丁质、甲壳质、纤维粘连蛋白及葡聚糖组成的组合中选择一种或2种以上组合，不可降解性支持体可使用从灭菌无纺布纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜及单面软硅涂层的聚氨酯、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜组成的组合中选择一种或2种以上组合，但并不局限于此。
本发明一形态中，可使用2种以上不可降解性支持体的组合，但并不局限于此。
本发明一形态中，可使用1种以上可降解性支持体及不可降解性支持体的组合体为支持体，例如，可用作聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜或单面软硅涂层的聚氨酯、聚乳酸/无纺布纤维或聚谷氨酸/聚乳酸/无纺布纤维的形态，但并不局限于此。
本发明一形态中，在上述阶段b中，可另外包括把的间叶干细胞-水凝胶-支持体放在包含1～20w/v％二甲基亚砜及1～80w/v％人血清蛋白的冻结保管剂冷冻保管的阶段d，在此冷冻保管后解冻时，间叶干细胞存活率超过70％以上为特征。
根据本发明一形态中，本发明间叶干细胞-水凝胶-支持体组成物在冷冻保管后解冻时，经过一周、一个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月后间叶干细胞存活率超过70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上更具体经过12个月后可显示超过90％以上，95％以上的存活率。
根据本发明另一形态中，提供一种减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物，包括：间叶干细胞及水凝胶；从降解性支持体及不可降解性支持体组成的组合中选择的一种以上的支持体，或1种以上的降解性支持体不可降解性支持体的组合体。
本发明一形态中，水凝胶可从纤维蛋白胶、玻尿酸、明胶、胶原蛋白、藻酸、纤维素及果胶组成的组合中选择一个以上的，但并不局限于此。把纤维蛋白胶用作水凝胶时，其特征在于，形成纤维蛋白胶的纤维蛋白原的浓度可以在0.5～60mg/mL，具体可以是0.5～45mg/mL，更具体可以是0.5～30mg/mL，还更具体可在0.5～20mg/mL，再具体可以是0.5～10mg/mL，还再具体可以是0.5～10mg/mL，可包括凝血酶其浓度在1～50I.U./mL，具体在1～30I.U./mL，更具体在5～20I.U./mL之间。
本发明一形态中，降解性支持体是从聚谷氨酸、聚乳酸、可吸收聚羟基乳酸网、人羊膜、牛羊膜、猪胶原蛋白、几丁质、甲壳质、纤维粘连蛋白及葡聚糖组成的组合中选择1种或2种以上组合使用，不可降解性支持体是从灭菌无纺布纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜及单面软硅涂层的聚氨酯组成的组合中选择1种或2种以上组合使用，但并不局限于此。
在本发明一形态中，可使用2种以上不可降解性支持体的组合，但并不局限于此。
本发明一形态中，可使用1种以上可降解性支持体或不可降解性支持体的组合体为支持体，例如，可用作聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜或单面软硅涂层的聚氨酯、聚乳酸/无纺布纤维或聚谷氨酸/聚乳酸/无纺布纤维的形态，但并不局限于此。
根据本发明另一形态中，提供减轻或改善大疱性性表皮松解症的薄片，包括上述组成物为有效成分。
根据本发明一形态中，大疱性表皮松解症可从大疱性表皮松解、水泡性极细胞分离、水泡性极细胞症、后天性水疱性表皮剥离症、遗传性水疱性表皮剥离症、致死性水疱性表皮剥离症、延迟性遗传性表皮剥离症、增殖性水疱性表皮剥离症、角质溶解症、局限性水疱性表皮剥离症、非疤痕性水疱性表皮剥离症、束形理想性水泡性表皮剥离症、疤痕性表皮剥离症、单纯表皮水疱症、韦伯-凯恩病、Dowling-Meara综合症、果耳德筛德氏病、多种发育异常性大疱性表皮松解症、Heinrichsbauer综合症、赫利茨综合征及科布内氏病组成的组合中选择。
本发明一形态中，上述间叶干细胞可以是从脂肪、骨髓或脐带血分离的。
本发明一形态中更详细的上述方法，包括：
(a1)把间叶干细胞在包含胎牛血清、生长因子中的碱性纤维母细胞生长因子或表皮生长因子的增殖培养基中培养代以上的阶段；
(a2)把培养的间叶干细胞利用水凝胶贴附到可降解性或不可降解性支持体或其组合体的阶段；
(b)把上述阶段a2的间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体在包含胎牛血清、生长因子中的碱性纤维母细胞生长因子或表皮生长因子的培养基中培养约5天左右制造薄片的阶段；
(c)在上述阶段b的培养时另外采用物理刺激、低氧刺激、丝裂原刺激及炎症因子刺激，激活细胞的阶段；
(d)在上述阶段b或阶段c的间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片中去除胎牛血清和生长因子中的碱性纤维母细胞生长因子或表皮生长因子的培养基中洗涤的阶段；
(e)(b)的间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片放在以10％二甲基亚砜及5％人血清蛋白构成的冻结保管剂冷冻保管的阶段；
(f)把冻结保管的间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片解冻，用生理盐水洗涤去除冻结保管剂的阶段；及
(g)根据大疱性表皮松解症患者患处需要薄片的患处大小剪下并贴敷在对象部位的阶段，
还可另外包括(h)把上述薄片用另一种薄片覆盖的阶段。
上述方法详细说明如下。
在阶段a1中，可使用从人脂肪组织分离的间叶干细胞，此时从人脂肪组织分离间叶干细胞培养2代以上是根据现有技术(韩国注册专利1,328,604)的，使用增殖培养基培养细胞，可在短时间内有效收集大量间叶干细胞。根据现有技术培养2代以上的人脂肪来源间叶干细胞贴附到塑料培养容器中保持纤维芽细胞形态，相对CD10,CD13,CD29,CD44,CD59,CD71,CD90,CD105及Oct4显阳性，相对CD34,CD45,CD104,CD106及Stro-1显阴性。并且，作为干细胞具有在体外分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神精细胞的能力。并且分泌多种生长因子如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子β1、神经生长因子、胰岛素样生长因子等多种生长因子，具有免疫调节能力，用作多种疾病的治疗技术正在开发中。
在上述a2阶段，在a1)中培养2代以上的脂肪来源间叶干细胞经胰蛋白酶或分散酶处理形成单一细胞，在水凝胶悬浮后在可降解性或不可降解性支持体纤维上约5,000个/cm2的浓度均匀喷洒贴附。此后利用包括10％胎牛血清及表皮生长因子或碱性纤维母细胞生长因子的增殖培养基培养3-7天。本发明实施例中实用的水凝胶是纤维蛋白凝胶，但并不局限于此，此外还可包括胶原蛋白、玻尿酸、明胶、藻酸、纤维素、果胶。
并且本发明实施例中使用的可降解性支持体使用了可吸收聚羟基乳酸网或牛羊膜，不可降解性支持体使用了灭菌纱布、聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜、单面软硅涂层的聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜，但此亦并不局限于此，也可使用聚谷氨酸/无纺布纤维、聚谷氨酸/聚乳酸/无纺布纤维、人羊膜、胶原蛋白膜等。
本发明中的水凝胶首先进行在可降解性或不可降解性支持体纤维或聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜及单面软硅涂层的聚氨酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜上贴附间叶干细胞的功能，再次向贴附性细胞的间叶干细胞上提供基质，提供细胞贴附到基质可稳定生存的环境。并且，水凝胶包含无数个3维网目结构，包含在培养基中的胎牛血清、碱性纤维母细胞生长因子及表皮生长因子通过网目结构作用到细胞上，提供可增殖的环境。水凝胶根据制造浓度网目结构大小、硬度、分解速度不同，对细胞形态及增殖速度发挥很大的影响。在本发明实施例中最终使用了0.5～10mg/mL浓度的纤维蛋白凝胶，提高了间叶干细胞的增殖速度并与此相反可维持适当的凝胶硬度。
在上述阶段b中，间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片上间叶干细胞快速增殖，在3～7日间增加4倍以上，每cm2可包含20,000个以上细胞。
在本发明中，在水凝胶中增殖的细胞表达脂肪来源干细胞的特征CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，可分泌包括血管内皮生长因子、肝细胞生长因子的多种生长因子。并且还具有免疫细胞分泌的肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ等代表性炎症因子的抑制能力。即，在水凝胶中培养的细胞以具有间叶干细胞特性为特征。
并且，在上述阶段b中可混用低氧刺激、丝裂原刺激及炎症因子刺激。由大疱性表皮松解症引起的损伤组织因其血管破劣或功能低下造成供氧不畅通，存在慢性炎症，投入到损伤组织的干细胞由低氧刺激及炎症因子刺激被激活，生长因子及细胞因子的分泌急剧增加。
如前所述，本发明提供包含高活性干细胞的薄片制造方法，在脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片制造阶段中处理低氧压力、丝裂原及炎症因子,分泌高浓度生长因子和细胞因子。
并且，根据本发明制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片，不经过蛋白酶分离过程，直接适用在大疱性表皮松解症患者的患处，治疗能力卓越。并且，在培养阶段间叶干细胞分泌的细胞外基质如胶原蛋白、层黏连蛋白、纤维粘连蛋白、弹性蛋白等完整地罩在水凝胶中存在，可增进大疱性表皮松解症的减轻或发病效果。
如前所述，在上述本发明a2阶段，只采用水凝胶也可制造干细胞-水凝胶薄片。但是水凝胶硬度低受机械/物理力量很容易撕裂，薄片大小受限制，使用时还需要谨慎。相反，根据本发明，把干细胞-水凝胶贴附到可降解性或不可降解性支持体上，支持体可提高干细胞-水凝胶的强度，容易操作。并且薄片可制造成0.1～2mm厚，以防贴敷患处时薄片被撕裂，薄片内也可包含充分的细胞数，查明了可提高治疗效果。
本发明d阶段脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片用生理盐水洗涤2～3次去除动物来源成分胎牛血清，为了完全去除，可在无血清DMEM培养基洗涤。通过上述过程去除胎牛血清，把薄片贴敷到人体时因动物来源成分引发的副作用减少为最低。
本发明还包括冻结保管间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片的方法。冷冻袋中加入由10％二甲基亚砜和5％人血清蛋白溶液构成的冻结保管剂沿没到薄片，密封后可在-80℃保管。一般蛋白酶处理单离的细胞、人工皮肤(表皮细胞或真皮细胞或由两种细胞构成的人工皮肤)在-80℃冻结保管时，会导致细胞损伤，已知适用在患处时治疗效果减少。(Tissue eng 4(4):1403-414,1988).
但是根据本发明制造的间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片，水凝胶包裹干细胞，可从外界冲击及压力中保护细胞，在-80℃也可无细胞损伤地长期保管。
根据本发明一实施形态，用在增进减轻或改善大疱性表皮松解症有效量的种以上生长因子、细胞因子、激素或细胞外矩阵化合物或蛋白质与本发明组成物一起下方，具体可举例颗粒细胞集落刺激因子、白介素-6、白介素-8、白介素-10、单核细胞趋化蛋白1、单核细胞趋化蛋白2、组织因子、碱性纤维母细胞生长因子、角质化细胞生长因子、血管内皮生长因子、胎盘生长因子、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶9、金属蛋白酶组织抑制因子1、金属蛋白酶组织抑制因子2、转化生长因子β1、肝细胞生长因子等，但并不局限于此。
实施发明的形态
以下，通过实施例更详细说明本发明。但，此实施例只是本发明的示例，本发明的范围并不局限于此。
实施例1:人脂肪来源间叶干细胞的培养方法
脂肪组织多为通过吸脂术获得，但并不限于此。从吸脂获得的脂肪组织分离脂肪来源间叶干细胞如下。为了去除血液，洗涤脂肪后加入等同体积的胶原酶溶液在37℃水域进行反应。离心分离后，除去上澄液脂肪层，小心分离下层胶原酶溶液，不要晃动，加入基质培养基悬浮后，在20℃,1500rpm中进行离心分离5分钟。此时，下沉的是基质-血管分划，除去了上澄液。把基质-血管分划悬浮在基质培养基中接种在培养容器中，在37℃,5％CO2细菌培养器培养24小时。
去除培养液后用磷酸盐缓冲溶液洗涤，基质培养基或基质培养基中包含1ng/mL浓度碱性纤维芽细胞生长因子的增殖培养基，或基质培养基中包含5ng/mL浓度表皮细胞生长因子的培养基增殖。当脂肪来源间叶干细胞成长到培养容器的80-90％左右，进行胰蛋白酶处理，分离单一细胞后收集。
实施例2:利用水凝胶决定纤维蛋白胶的浓度[87]冻结干澡的凝血酶加入1mL氯化钙溶液，形成400～600I.U.。或解冻冻结的凝血酶调节到同一浓度后再使用。冻结干燥的纤维蛋白原中加入1mL抗蛋白酶肽溶液或解冻冻结的纤维蛋白原后准备原液，分级稀释成1:5、1:10、1:20、1:40。收集上述实施例1中培养2代以上的细胞悬浮后，以40～50:1的比率(v/v)混合胰蛋白酶，与分级稀释的纤维蛋白原1:1混合形成纤维蛋白凝胶。当凝胶完全凝固，加入包含10％胎牛血清和1ng/mL碱性纤维母细胞生长因子的培养基后在37℃,5％CO2细菌培养器培养5天。收集培养第2天和第5天的细胞-纤维蛋白凝胶混合物薄薄地作成切片，利用10μg/mL吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色，利用荧光显微镜测定细胞形态和存活率。并且培养第5天加入WST-1后测定细胞增殖程度。
图1a是图示原液或稀释的纤维蛋白原溶液制作的纤维蛋白凝胶中干细胞的形态和数量的显微镜照片。用纤维蛋白原溶液制作的纤维蛋白凝胶中，一直到第5天，大部分细胞纵球形细胞状态，几乎没有增殖。相反，随着稀释倍数增加，细胞快速形成纤维芽细胞状态，增殖也更多。利用原液纤维蛋白原制作的纤维蛋白凝胶中观察到一些死细胞，但在利用稀释的纤维蛋白原溶液制作的纤维蛋白凝胶中没有观察到死细胞。即，可知高浓度纤维蛋白凝胶对脂肪来源间叶干细胞具有细微的细胞毒性，但稀释1:5～1:40浓度的纤维蛋白凝胶不具有细胞毒性。
图1b是图示利用WST-1定量测定根据纤维蛋白凝胶的干细胞增殖能力的图表，随着稀释倍数增加，吸光度也增加。即，可知把纤维蛋白原稀释20～40倍制作的纤维蛋白凝胶中干细胞最容易增殖。
实施例3:制作人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片
收集上述实施例1中培养2代以上的间叶干细胞用增殖培养基悬浮。根据上述实施例2的结果，细胞悬浮液中加入凝血酶，最终达到8～15I.U.。
支持体，约5x 5cm大小四角形状可降解性支持体的可吸收聚羟基乳酸网、人羊膜或不可降解性支持体的纱布、单面软硅涂层的聚氨酯及聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上均匀涂布约3～6.5mg/mL浓度的纤维蛋白原。其后把包含凝血酶的细胞悬浮液涂布到支持体上约5,000个/cm2。纤维蛋白凝胶完全凝固后加入增殖培养基，在37℃,5％CO2细菌培养器培养3～7天。
图2a是图示反人脂肪来源间叶干细胞与纤维蛋白水凝胶混合贴附到不可降解性支持体的单面单面软硅涂层的聚氨酯及聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜上后培养制作的薄片经AO/EtBr染色后利用荧光显微镜观察的照片。图2b是图示把在-80℃冻结保管的薄片解冻后用显微镜或经AO/EtBr染色后利用荧光显微镜观察的照片。如图2b所示，冻结保管后解冻后也观察到与冻结前类似的纤维芽细胞形态细胞由水凝胶贴附到支持体增殖。薄片上均等分布了约20,000～400,000个/cm2的细胞，存活率100％。
实施例4:人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片的冷冻保管
上述实施例3中制造的人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片洗涤后除去细胞培养液，放入存有冻结保管剂(10％二甲基亚砜和人血清蛋白溶液)的冷冻袋中，在-80℃冻结保管。经过约1个月、3个月、6个月、9个月、12个月后依期提出上述冷冻袋，泡在37℃恒温水槽中摇晃，融化冻结保管剂并倒掉。加入生理盐水后上下摇晃再倒掉。完全去除冻结保管剂后用AO/EtBr染色后测量存活率。
其结果如图3b所示，根据上述发明制造的薄片中，脂肪来源间叶干细胞一直到12个月存活了95％以上。
即显示，根据本发明制造的人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片，在不损伤主要有效成分细胞的情况下，可在-80℃长期冷冻保管。
实施例5:人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体分泌生长因子。
把实施例3的人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片或把实施例4中冻结保管的薄片解冻后用磷酸盐缓冲液洗涤并切成0.8x 0.8cm，在24孔培养板各放2张，加入了1mL DMEM。在37℃，5％CO2细菌培养器培养72小时后收集上澄液，采用酶联免疫吸附剂测定法测量间叶干细胞分泌的血管内皮生长因子和肝细胞生长因子等主要生长因子。其结果如图4a所示，上述薄片分泌了肝细胞生长因子及血管内皮生长因子。
另一实施例，把上述收集上澄液利用与血管形成有关的细胞因子方阵试剂盒分析。其结果如图4所示，上述试剂盒大量分泌了促进血管形成的肝细胞生长因子及血管内皮生长因子在内的生长因子及纤溶酶原激活物抑制剂1(Serpin E1/PAI-1)和色素上皮衍生因子(SerpinF1/PDEF)、基质金属蛋白酶抑制剂-1、白介素-8、纤维生长因子-2、二肽酶IV等多种细胞因子。即，可知根据本发明制造的，利用水凝胶及可降解性或不可降解性支持体培养的间叶干细胞敷在患处时，持续分泌促进细胞增殖及血管形成的多种生长因子和细胞因子，激活周边组织细胞，可有效减轻或改善大疱性表皮松解症。
实施例6:同种人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体的免疫调节功能
把实施例3的人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片或实施例4的冻结保管的薄片解冻后切成一定大小，在24孔培养板各放1张。然后不同人白细胞抗原的捐献者的末梢血单核细胞5x 10，5个加入到24孔培养板中。阳性对照群末梢血单核细胞中加入了一种促细胞分裂剂，植物血球凝集素，引发末梢血单核细胞的免疫反应。开始反应后第3天收集上澄液，采用酶联免疫吸附测定法测定肿瘤坏死因子-α分泌量。
图5a是表示同种人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体的免疫反应引导能力的图片，如在此显示，阳性对照群的末梢血单核细胞由聚羟基脂肪酸酯激活，相反，根据上述实施例3或4制造的同种人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体的反应中几乎不分泌肿瘤坏死因子-α。即，已确认同种人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体不引发免疫反应。
另一实验例，把末梢血单核细胞5x 10，5个加入到24孔培养板中利用聚羟基脂肪酸酯激活，引发免疫反应，把根据上述实施例3或4制造的是表示同种人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片切成适当大小，在培养板中各放1张。收集反应第3天的上澄液测定肿瘤坏死因子-α分泌量。
其结果如图5b所示，被聚羟基脂肪酸酯激活的末梢血单核细胞中，同种人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片减少了60％以上的肿瘤坏死因子-α分泌量。即，同种人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体薄片不引必免疫反映，并且在发生过多免疫反应时，起显著降低免疫细胞大量分泌并增加免疫反应的肿瘤坏死因子-α的分泌量。因此，把脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体薄片敷到大疱性表皮松解症患处时可减轻持续发作的炎症因而促进再表皮化。
实施例7:人脂肪来源间叶干细胞的细胞外基质分泌功能
在上述实施例1中收集的细胞中提取蛋白质，采用蛋白质印迹法测量大疱性表皮松解症起因蛋白质胶原蛋白类型VII和层黏连蛋白-5的表达量，与纤维芽细胞中的表达量相比较。并且，采用酶联免疫吸附剂测定技法测定了成为本发明制造薄片材料的人脂肪来源间叶干细胞的表达量和分泌量。
图6a图示本发明制造薄片材料人脂肪来源间叶干细胞胶原蛋白类型VII和层黏连蛋白-5的表达量高于纤维芽细胞。图6b是图示人脂肪来源间叶干细胞的胶原蛋白类型VII表达量和层黏连蛋白-5的分泌量定量分析的结果。
另一实施例中，在上述把实施例1中制造的脂肪来源间叶干细胞固定后加入包含胶原蛋白类型VII或胶原蛋白类型I特异抗体的磷酸盐缓冲液后，在37℃反应1个小时后洗涤封片后用荧光显微镜观察。
图6c是显示脂肪来源间叶干细胞的细胞外基质蛋白质分泌功能的照片(x 400)，如图所示，根据发明制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体
大体上相对胶原蛋白类型VII或胶原蛋白类型I显示阳性反应。
实施例8:人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体的细胞外基质的分泌及表达评价
在上述实施例3或4中制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体在不加胎牛血清的DMEM中培养3天后收集培养液，采用酶联免疫吸附剂测定法测定细胞外基质的分泌功能及表达量。
其结果如图7a所示，根据本发明脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体分泌了胶原蛋白类型VII及胶原蛋白类型I。
另一实施例，制作上述实施例3或4制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体的冻结切片固定，加入细胞外基质特异抗体后，在37℃反应1个小时后洗涤封片后用荧光显微镜观察。
其结果如图7b所示，根据本发明制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体相对胶原蛋白类型VII、胶原蛋白类型I、胶原蛋白类型V、层黏连蛋白-5、纤维粘连蛋白及层黏连蛋白显示阳性反应。即，根据构成本发明制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体细胞大量分泌多种细胞外基质蛋白质，并且分泌的细胞外基质蛋白质停留在水凝胶内，当移植到体内时可提供多种基质，得到减轻或改善大疱性表皮松解症的效果。
实施例9:人脂肪来源间叶干细胞和人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体的胶原蛋白类型VII的表达
图8是图示根据现有培养法单层培养的人脂肪来源间叶干细胞和薄片内脂肪来源间叶干细胞的细胞外基质蛋白质的分泌功能的结果，根据本发明制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体与现有单层培养的细胞相比，分泌更多胶原蛋白类型VII达6.8倍。
以上结果显示，把脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体贴敷到大疱性表皮松解症患者的患处，脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体向皮肤损伤部位供给多种细胞外基质蛋白质，促进组织再生及再表皮化。
实施例10:由碱性物质造成的人脂肪来源间叶干细胞的胶原蛋白类型VII的表达评价
在上述实施例1中收集的细胞在12孔培养板上加5,500/cm2，经24小时后加转化生长因子β2和肿瘤坏死因子-α后继续培养48小时。收集细胞后提取核糖核酸，采用逆转录聚合酶链反应技术测量胶原蛋白类型VII的表达量并比较表达变化。
结果如图9所示，薄片主成分脂肪来源间叶干细胞中处理转化生长因子β2和肿瘤坏死因子-α时胶原蛋白类型VII的表达增加了8倍。以上结果表明，把根据本发明制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体贴簿到大疱性表皮松解症患者患处时，因慢性皮肤损伤部位存在的碱性物质，脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体的胶原蛋白类型VII的表达量增加，可促进组织再生及再表皮化。
实施例11:人脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体治疗大疱性表皮松解症实例。
为了评价上述实施例4中制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体治疗效果，针对大疱性表皮松解症患者进行临床实验。
此患者24岁，女性，诊断出大疱性表皮松解症，但因没有其他治疗方法，病情持续复发引起炎症，病情没有进展。把上述实施例4中制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体贴簿到患者的患处，每隔一个星期用观察照片评价了患处治疗效果。
图10是显示贴簿脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体后患处面积的图表，根据本发明制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体贴簿后，随着时间的推移患处面积减少，贴簿4周后与贴簿前相比，显示减少64.4％的效果。
即，由此可知，根据本发明制造的脂肪来源间叶干细胞-水凝胶-可降解性或不可降解性支持体，大量分泌多种种类的细胞外基质，分泌的细胞外基质存留在水凝胶内，当移植到体内时可提供多种基质，达到减轻或改善大疱性表皮松解症的效果。
产业上利用可能性
本发明包括间叶干细胞-水凝胶-可降解性支持体或不可降解性支持体的减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物或薄片，尤其增加胶原蛋白类型VII或层黏连蛋白-5的表达，使用在大疱性表皮松解症患处时具有临床可发挥有意义效果的优点，因此可有效使用在减轻或改善大疱性表皮松解症患者的症状。

Claims (20)

1.一种减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，包括：
阶段a，把间叶干细胞利用水凝胶贴附到，从降解性支持体及不可降解性支持体组成的组合中选择的一种以上的支持体或2种以上不可降解性支持体或1种以上的降解性支持体及1种以上的不可降解性支持体的组合体上，获得间叶干细胞-水凝胶-支持体的阶段；及
阶段b，把阶段a中获得的间叶干细胞-水凝胶-支持体在增殖培养基培养的阶段，此增殖培养基是从胎牛血清及碱性纤维母细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β1、血小薄片源生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子及胰岛素样生长因子组成的组合中选择的包括1种以上因子的培养基，
水凝胶是从纤维蛋白胶、玻尿酸、明胶、胶原蛋白、藻酸、纤维素及果胶构成的组合中选择的任一一种以上，
可降解性支持体是从聚谷氨酸、聚乳酸、可吸收聚羟基乳酸网、人羊膜、牛羊膜、猪胶原蛋白、几丁质、甲壳质、纤维粘连蛋白及葡聚糖组成的组合中选择，
不可降解性支持体是从灭菌无纺布纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜及单面软硅涂层的聚氨酯组成的组合中选择。
2.根据权利要求1的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，薄片包含胶原蛋白类型VII或层黏连蛋白-5。
3.根据权利要求1的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，纤维蛋白胶包含0.5～45mg/mL浓度的纤维蛋白原。
4.根据权利要求1的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，纤维蛋白胶包含0.5～10mg/mL浓度的纤维蛋白原。
5.根据权利要求1的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，还包括阶段c，在上述阶段b中，额外执行物理刺激、低氧刺激、丝裂原刺激及炎症因子刺激组成的组合中选择一种以上刺激激活细胞。
6.根据权利要求1的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，包括阶段d，在上述阶段b中，间叶干细胞-水凝胶-支持体放到含1～20w/v％二甲基亚砜及1～80w/v％人血清蛋白的冻结保管剂中冷冻保管的阶段，在此，冷冻保管后解冻时，间叶干细胞存活率是90％以上。
7.根据权利要求1的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，冷冻保管12个月以上后解冻时，间叶干细胞存活率是90％以上。
8.根据权利要求1的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，阶段a中，水凝胶水凝胶支持体1cm2中增殖1,000～10,000个间叶干细胞。
9.根据权利要求1的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，阶段b中，水凝胶支持体1cm2中增殖20,000～400,000个间叶干细胞。
10.根据权利要求1的减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，上述大疱性表皮松解症是从大疱性表皮松解、水泡性极细胞分离、水泡性极细胞症、后天性水疱性表皮剥离症、遗传性水疱性表皮剥离症、致死性水疱性表皮剥离症、延迟性遗传性表皮剥离症、增殖性水疱性表皮剥离症、角质溶解症、局限性水疱性表皮剥离症、非疤痕性水疱性表皮剥离症、束形理想性水泡性表皮剥离症、疤痕性表皮剥离症、单纯表皮水疱症、韦伯-凯恩病、Dowling-Meara综合症、果耳德筛德氏病、多种发育异常性大疱性表皮松解症、Heinrichsbauer综合症、赫利茨综合征及科布内氏病组成的组合中选择。
11.根据权利要求1至10的任一一项减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片制造方法，其特征在于，间叶干细胞是从脂肪、骨髓、皮肤、血管、肌肉、脑、血液、胎盘、齿髓及脐带血组成的组合中选择的某一种分离的。
12.一种减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物，其特征在于，包括：
间叶干细胞及水凝胶；
可降解性支持体及不可降解性支持体组成的组合中选择的一种以上的支持体；
2种以上不可降解性支持体；
或1种以上可降解性支持体及不可降解性支持体的组合体，
在此水凝胶是从纤维蛋白胶、玻尿酸、明胶、胶原蛋白、藻酸、纤维素及果胶组成的组合中选择，
可降解性支持体是从聚谷氨酸、聚乳酸、可吸收聚羟基乳酸网、人羊膜、牛羊膜、猪胶原蛋白、几丁质、甲壳质、纤维粘连蛋白及葡聚糖组成的组合中选择，
不可降解性支持体是从灭菌无纺布纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、网状聚氨酯薄膜及单面软硅涂层的聚氨酯组成的组合中选择。
13.根据权利要求12的减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物，其特征在于，组成物包含胶原蛋白类型VII或层黏连蛋白-5。
14.根据权利要求12的减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物，其特征在于，纤维蛋白胶包含0.5～45mg/mL浓度的纤维蛋白原。
15.根据权利要求12的减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物，其特征在于，纤维蛋白胶包含0.5～10mg/mL浓度的纤维蛋白原。
16.根据权利要求12的减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物，其特征在于，水凝胶支持体1cm2中包含20,000～400,000个间叶干细胞。
17.根据权利要求12的减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物，其特征在于，
上述大疱性表皮松解症是从大疱性表皮松解、水泡性极细胞分离、水泡性极细胞症、后天性水疱性表皮剥离症、遗传性水疱性表皮剥离症、致死性水疱性表皮剥离症、延迟性遗传性表皮剥离症、增殖性水疱性表皮剥离症、角质溶解症、局限性水疱性表皮剥离症、非疤痕性水疱性表皮剥离症、束形理想性水泡性表皮剥离症、疤痕性表皮剥离症、单纯表皮水疱症、韦伯-凯恩病、Dowling-Meara综合症、果耳德筛德氏病、多种发育异常性大疱性表皮松解症、Heinrichsbauer综合症、赫利茨综合征及科布内氏病组成的组合中选择。
18.根据权利要求12的减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物，其特征在于，冷冻保管12个月以上后解冻时，间叶干细胞存活率是90％以上。
19.根据权利要求12至18的任一一项减轻或改善大疱性表皮松解症的组成物，其特征在于，间叶干细胞是从脂肪、骨髓、皮肤、血管、肌肉、脑、血液、胎盘、齿髓及脐带血组成的组合中选择的某一种分离的。
20.一种减轻或改善大疱性表皮松解症的薄片，包括权利要求12至18的任一一项组成物为有效成分。
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