WO2017179918A1 - 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 중간엽줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체 조성물 - Google Patents

수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 중간엽줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention provides a composition, sheet, and preparation for mitigating or improving epidermolysis bullosa including mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable support or mesenchymal stem cell-hydrogel-non-degradable support.
  • the sheet-like composition comprising the stem cells of the present invention is very useful as a dressing agent for relieving or improving bullous epidermal detachment.
  • Epidermolysis bullosa is a rare hereditary disease in which the epidermis, the epidermis-dermis border, and the genes that make up the upper papillary dermis are proteins that make blisters easily occur even on minor trauma and cause pain in the skin and mucous membranes. to be. In patients with bullous epidermal detachment, there is no binding protein that holds the two layers, so small friction in the layers creates blisters and experiences the corresponding pain when third-degree burns occur. Epidermolysis bullosa simplex (EBS), junctional epidermolysis bullosa (JEB), dystrophic epidermolysis bullosa (DEB), and most patients have simple bullous It is known to be epidermal detachment.
  • EBS epidermolysis bullosa simplex
  • JEB junctional epidermolysis bullosa
  • DEB dystrophic epidermolysis bullosa
  • EB simplex is an autosomal dominant hereditary, junctional bullous epidermal detachment (JB).
  • JB junctional bullous epidermal detachment
  • DEB dystrophic epidermolysis bullosa
  • a soft silicone type dressing agent for patients with bullous epidermal detachment, dressing is recommended to prevent bullous infection.
  • a soft silicone type dressing agent for example, in the case of EB simplex, a soft silicone type dressing agent, a lipido-colloid type dressing agent, a foam type dressing agent, a hydrogel type dressing agent, a sheet hydro Gel-type dressings, biosynthetic cellulose-type dressings, bordered dressings, powder-type dressings, Lipido-colloid-type dressings if EBS Dowling Meara, polymeric membrane-type dressings ,
  • the hydrofibre-type dressing agent is the joint EB, the hydrogel impregnated gauze type dressing agent, the hydrofiber type dressing agent, the lipido-colloid type dressing agent, the soft silicone type dressing agent, the polymer type membrane type Dressing agent of the soft silicone foam type having a dressing agent, a soft silicone foam type dressing agent, a super-adsorbent, Soft silicone type dressing agent, Lipido-colloid type
  • a patent for a dressing agent for wound treatment in the form of a polyurethane foam that promotes biocompatibility by promoting hydrophilic groups and promotes absorption of secretions at the wound site (Korean Patent No. 345,034), Patents for the polyurethane foam dressing agent containing (Korean Patent No. 1,022,884) and the like.
  • collagen type VII or collagen alpha-1 chain is a protein encoded by the COL7A1 gene. If there is a mutation in this gene, it is known to be related to ditrophic bullous epidermal detachment. It has been reported that an autoimmune response to collagen type VII can cause a condition called acquired bullous epidermolysis. Collagen type VII is also known to interact with laminin-5 and fibronectin. In addition, a stem cell containing a modified laminin-5 gene was transplanted into the femoral area of a patient with junctional bullous epidermal detachment through skin graft, and a study was performed in Italy to achieve a clinical effect without blistering. Therefore, it can be seen that collagen type VII and laminin-5 play a very important role in alleviating or improving bullous epidermal detachment.
  • the present invention comprises a highly active live mesenchymal stem cells, which are cultured after attaching the cultured mesenchymal stem cells to a hydrogel and attached to a biodegradable or non-degradable support, the composition and sheet for reducing or improving bullous epidermal detachment
  • the present invention provides a method for preparing the same, and a composition, a sheet, and a composition thereof, which may express a clinically significant effect when the collagen type VII and laminin-5 are increased to be applied to the bullous epidermal detachment affected area. It is an object to provide a manufacturing method.
  • the present invention is a dressing for applying mesenchymal stem cells isolated from any one selected from the group consisting of fat, bone marrow, skin, blood vessels, muscle, brain, blood, placenta, pulp and umbilical cord blood to the bullous epidermal detachment affected human
  • An object of the present invention is to provide a composition or sheet for mitigating or improving bullous epidermal detachment including high activity mesenchymal stem cells in order to obtain a clinically effective therapeutic effect, and a method for producing the same.
  • mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable support or non-degradable support more specifically, mesenchymal stem cell-hydrogel-decomposable support including alleviation or improvement of bullous epidermal detachment
  • the composition, a sheet, and its manufacturing method are provided.
  • mesenchymal stem cells are autologous or allogeneic derived cells that are positive for CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105 and negative for CD34 and CD45.
  • the support is poly-gamma-glutamic acid (PGA), poly lactic acid (PLA), PGA / PLA, bicrylic mesh, human amniotic membrane, amniotic membrane, porcine collagen, chitin, chitosan, fibronectin
  • biodegradable polymeric supports selected from the group consisting of dextran, sterile nonwoven fibers, polyethylene terephthalate (PET) films, polyethylene (PE) films, polypropylene (PP) films and polyurethane films, net-like polyurethane films Or non-degradable supports such as softsilcoated polyurethane films on one side, or combinations thereof, such as PGA / nonwoven fibers, PLA / nonwoven fibers, PGA / PLA / nonwoven fibers.
  • the hydrogel may be selected from the group consisting of fibrin glue, hyaluronic acid or derivatives thereof, gelatin, collagen, alginic acid, cellulose and pectin, wherein the concentration of fibrinogen forming fibrin glue is 0.5 To 60 mg / mL, specifically 0.5 to 45 mg / mL, more specifically 0.5 to 30 mg / mL, even more specifically 0.5 to 20 mg / mL, and even more Specifically, it may be 0.5 to 10 mg / mL.
  • stem cells are mixed with a hydrogel and uniformly applied to 1,000 to 10,000 cells per cm 2 of a support, and contain FBS and bFGF or EGF. Culturing in a medium to proliferate to 20,000 or more, more specifically, 20,000 to 400,000 stem cells per cm 2 of the support.
  • a composition or sheet for mitigating or improving bullous epidermal detachment comprising a mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable support or a non-degradable support according to the present invention, in particular, increases the expression of collagen type VII and laminin-5 to cause bullous epidermis.
  • a mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable support or a non-degradable support increases the expression of collagen type VII and laminin-5 to cause bullous epidermis.
  • composition or sheet containing the highly active mesenchymal stem cells according to the present invention without the isolation (selection) process using a protease can be applied to the affected part of the bullous epidermal detachment patient as it is, without high activity stem cells, Extracellular substrates such as collagen, laminin, fibronectin, and elastin secreted from mesenchymal stem cells in the culture stage are intactly encapsulated in hydrogels, and when applied to the affected areas of bullous epidermal detachment patients compared to conventional treatments, It shows an advantageous effect that the re-epithelialization ability is remarkably good.
  • the mesenchymal stem cell-hydrogel-support according to the present invention maintained fibroblast morphology even in a serum-free medium and survived 90% or more after one week, and the survival time was significantly higher than that of the conventional stem cell therapy.
  • the shape and strength of the sheets were maintained as they were and the cells in the sheets survived more than 95%, allowing long-term freezing at -80 ° C without damaging cells, the active ingredient, and long-term freezing.
  • the cells survived more than 95% when thawed even after 1 year.
  • various growth factors and cytokines that promote cell growth and angiogenesis are continuously secreted, and in addition to secreting large amounts of various kinds of extracellular matrix, including collagen type VII and laminin-5, It stays in the hydrogel to provide a variety of substrates when applied to the affected area to facilitate the healing of bullous epidermal detachment, and does not induce an immune response.
  • the expression of collagen type VII is significantly increased, resulting in tissue regeneration and regeneration. It has the advantage of promoting epithelialization.
  • FIG. 1A is a fluorescence microscope photograph of the morphology of human adipose-derived mesenchymal stem cells cultured with fibrin gel prepared from fibrinogen stock solution and step-diluted solutions by staining with AO / EtBr (400 magnification). The concentrations are indicated in parentheses when the mixture was diluted 1: 1 with fibrinogen and the cell suspension containing thrombin to form the final fibringlu.
  • FIG. 1B is a graph of absorbance measured by adding WST-1 to human adipose derived mesenchymal stem cells cultured by mixing with fibrin gel made of fibrinogen stock solution and stepwise diluted solution.
  • Figure 2 is a photograph comparing before and after freezing of human adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet.
  • Figure 2a is a picture of the cells in the sheet, the human adipose-derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable support or non-degradable support sheet after 5 days incubation of the cells in the sheet AO / EtBr staining after fluorescence microscope.
  • FIG. 2B is a photograph of human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable support or non-degradable support sheet frozen at -80 ° C. and thawed to stain cells in the sheet with AO / EtBr and observed with a fluorescence microscope.
  • Figure 3 is 1 month, 3 months, 6 months, 9 after cryopreservation of the sheet at -80 °C to evaluate the long-term storage stability of human adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable support or non-degradable support sheet It is a graph showing the survival rate of the cells in the sheet after thawing at months and 12 months.
  • Figure 4a is a graph quantifying the amount of VEGF and HGF secreted by human adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable support sheet or non-degradable support sheet by ELISA.
  • Figure 4b is the result of analyzing the angiogenesis-promoting factors secreted from human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable support sheet or non-degradable support sheet using a cytokine array kit.
  • Figure 5a shows the amount of TNF- ⁇ secreted from peripheral blood mononuclear cells after co-culture of human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable support sheet or non-degradable support sheet with homologous peripheral blood mononuclear cells. It is a graph which quantified.
  • FIG. 5B shows the secretion of TNF- ⁇ secreted from peripheral blood mononuclear cells after co-culture by addition of human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable support sheets or non-degradable support sheets to homologous activated peripheral blood mononuclear cells. After quantifying the amount by ELISA, it is a graph expressed in terms of percent inhibition of secretion of TNF- ⁇ .
  • Figure 6a is the result of confirming the expression of collagen type VII and laminin in the extracellular matrix protein expressed in human adipose derived mesenchymal stem cells and fibroblasts by Western blot technique.
  • Figure 6b is a graph showing the expression of the collagen type VII in extracellular matrix protein expressed in human adipose derived mesenchymal stem cells by ELISA technique.
  • Figure 6c is a photograph of the expression of extracellular matrix proteins collagen type VII and collagen type I in human adipose-derived mesenchymal stem cells observed by fluorescence microscope after immunofluorescence staining.
  • Figure 7a is a graph showing the amount of extracellular matrix protein collagen type VII, collagen type I secreted from the sheet according to the present invention.
  • Figure 7b is a photograph of the expression of the extracellular matrix proteins collagen type VII, collagen type I, collagen type V, laminin 5, fibronectin, laminin and the like contained in the sheet according to the present invention after fluorescence microscopy.
  • Figure 8 is a graph comparing the amount of collagen type VII, the extracellular matrix protein secreted from human adipose-derived mesenchymal stem cells in a sheet and monolayer culture according to the present invention.
  • Figure 9 shows the rapid increase in the expression of collagen type VII when human adipose derived mesenchymal stem cells are exposed to inflammatory cytokines TGF- ⁇ 2, TNF- ⁇ secreted from the wound site.
  • Figure 10 is a graph showing the change in the size of the wound area for a total of four weeks before and after the attachment of the sheet according to the present invention to patients with bullous epidermal detachment.
  • the present invention provides a composition for mitigating or improving bleb epidermal detachment, a sheet comprising the mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support, and a method for producing the same.
  • the present invention (a) using mesenchymal stem cells using a hydrogel, (i) at least one support selected from the group consisting of a biodegradable support and a non-degradable support; Or (ii) two or more non-degradable supports; Or (iii) attaching to a combination of at least one biodegradable support and at least one non-degradable support to obtain a mesenchymal stem cell-hydrogel-support; And (b) culturing the mesenchymal stem cell-hydrogel-support obtained in step (a) in a growth medium, wherein the growth medium is a fetal bovine serum (FBS), and a basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • FBS fetal bovine serum
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor beta-1 (TGF-beta1), platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), and IFG-1 (insulin) -like growth factor) is a medium containing one or more factors selected from the group consisting of, hydrogel is any one or more selected from the group consisting of fibrin glue, hyaluronic acid, gelatin, collagen, alginic acid, cellulose and pectin,
  • the biodegradable support is selected from the group consisting of poly-gamma-glutamic acid (PGA), poly lactic acid (PLA), beryl mesh, human amniotic membrane, bovine amniotic membrane, porcine collagen, chitin, chitosan, fibronectin and dextran
  • the non-degradable support is sterile nonwoven fabric, polyethylene terephthalate (PET) film, polyethylene (PE) film, polypropylene
  • the present invention more specifically (a1) culturing the mesenchymal stem cells more than two passages in the growth medium; (a2) cultured mesenchymal stem cells using a hydrogel (i) at least one support selected from the group consisting of a biodegradable support and a non-degradable support; Or (ii) two or more non-degradable supports; Or (iii) attaching to a combination of at least one biodegradable support and at least one non-degradable support to obtain a mesenchymal stem cell-hydrogel-support; And (b) culturing the mesenchymal stem cell-hydrogel-support obtained in step (a2) in a growth medium, wherein the growth medium is a fetal bovine serum (FBS), and a basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • FBS fetal bovine serum
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor beta-1 (TGF-beta1), platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), and IFG-1 (insulin) -like growth factor) is a medium containing one or more factors selected from the group consisting of, hydrogel is any one or more selected from the group consisting of fibrin glue, hyaluronic acid, gelatin, collagen, alginic acid, cellulose and pectin,
  • the biodegradable support is selected from the group consisting of poly-gamma-glutamic acid (PGA), poly lactic acid (PLA), beryl mesh, human amniotic membrane, bovine amniotic membrane, porcine collagen, chitin, chitosan, fibronectin and dextran
  • the non-degradable support is sterile nonwoven fabric, polyethylene terephthalate (PET) film, polyethylene (PE) film, polypropylene
  • the factor contained in the growth medium may be more specifically bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), EGF (Epidermal Growth Factor), or a combination thereof.
  • bFGF Basic Fibroblast Growth Factor
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • the mesenchymal stem cells are autologous or allogeneic derived cells positive for CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105 and negative for CD34 and CD45.
  • stem cells are mixed with a hydrogel and uniformly applied to 1,000 to 10,000 per cm 2 of a support, and made of FBS, bFGF and EGF. Culturing in a medium containing one or more selected from the group, and proliferating to 20,000 or more, more specifically, 20,000 to 400,000 stem cells per cm 2 of the support.
  • the cells are activated by additionally performing one or more stimuli selected from the group consisting of physical stimulation, hypoxic stimulation, mitogen stimulation, and inflammatory factor stimulation such as IFN-gamma It may further comprise the step (c).
  • stimuli selected from the group consisting of physical stimulation, hypoxic stimulation, mitogen stimulation, and inflammatory factor stimulation such as IFN-gamma
  • stem cells administered to damaged tissues may be caused by hypoxic stress and inflammatory factors due to the destruction of blood vessels or deterioration of function, which may result in poor oxygen supply and chronic inflammation. It is activated and the growth factor and cytokine secretion is rapidly increased. Therefore, in the support sheet manufacturing step, by treating the hypoxic stress, mitogen or inflammatory factor can be prepared a composition, a sheet comprising a high activity stem cells secreting high concentration growth factors and cytokines.
  • the hydrogel may use fibrin glue, hyaluronic acid, gelatin, collagen, alginic acid, cellulose or pectin, but is not limited thereto.
  • fibrin glue as a hydrogel, the concentration of fibrinogen forming fibrin glue may be 0.5 to 60 mg / mL, specifically 0.5 to 45 mg / mL, and more specifically 0.5 to 30 mg / mL concentration.
  • 0.5 to 20 mg / mL even more specifically 0.5 to 10 mg / mL, and even more specifically 0.5 to 5 mg / mL, characterized in that it comprises fibrinogen, 1 to 50 Thrombin at an IU / mL concentration, specifically 1-30 IU / mL concentration, more specifically 5-20 IU / mL concentration.
  • the hydrogel has a low strength and can be easily torn by mechanical / physical force, thereby limiting the size of the sheet and using it carefully.
  • the support may be easier to operate by increasing the strength of the mesenchymal stem cell-hydrogel.
  • biodegradable supports include poly-gamma-glutamic acid (PGA), poly lactic acid (PLA), bicrylic mesh, human amnion, bovine amnion and porcine collagen, chitin, chitosan, fibronectin and dex
  • PGA poly-gamma-glutamic acid
  • PLA poly lactic acid
  • bicrylic mesh human amnion, bovine amnion and porcine collagen
  • chitin chitosan
  • fibronectin fibronectin
  • the non-degradable support may be a sterile nonwoven fiber, a polyethylene terephthalate (PET) film, a polyurethane film, a net polyurethane film and a soft cross section.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PP polypropylene
  • a combination of two or more non-degradable supports may be used, but is not limited thereto.
  • a combination of one or more biodegradable supports and non-degradable supports can be used as the support, for example a polyurethane film, a net polyurethane film or a soft silicone coated polyurethane on one side.
  • a polyurethane film for example a polyurethane film, a net polyurethane film or a soft silicone coated polyurethane on one side.
  • the mesenchymal stem cell-hydrogel-support cryopreservative containing 1 to 20 w / v% DMSO and 1 to 80 w / v% human serum albumin It may further comprise the step (d) of cryopreservation in, wherein the survival rate of mesenchymal stem cells when thawed after cryopreservation is characterized in that more than 70%.
  • the mesenchymal stem cell-hydrogel-support composition according to the present invention is thawed after cryopreservation after 1 week, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 After months, after 6 months, after 7 months, after 8 months, after 9 months, after 10 months, after 11 months, and after 12 months, the survival rate of mesenchymal stem cells was 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85 At least 90%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, more specifically after 12 months 90% or more, 95% or more.
  • a composition for alleviating or improving bullous epidermal detachment comprising at least one support selected from the group consisting of a biodegradable support and a non-degradable support, or a combination of at least one biodegradable support and a non-degradable support.
  • the hydrogel may be any one or more selected from the group consisting of fibrin glue, hyaluronic acid, gelatin, collagen, alginic acid, cellulose and pectin, but is not limited thereto.
  • fibrin glue as a hydrogel, the concentration of fibrinogen forming fibrin glue may be 0.5 to 60 mg / mL, specifically 0.5 to 45 mg / mL, and more specifically 0.5 to 30 mg / mL concentration.
  • 0.5 to 20 mg / mL even more specifically 0.5 to 10 mg / mL, and even more specifically 0.5 to 5 mg / mL, characterized in that it comprises fibrinogen, 1 to 50 Thrombin at an IU / mL concentration, specifically 1-30 IU / mL concentration, more specifically 5-20 IU / mL concentration.
  • biodegradable supports include poly-gamma-glutamic acid (PGA), poly lactic acid (PLA), bicrylic mesh, human amnion, bovine amnion and porcine collagen, chitin, chitosan, fibronectin and dex
  • PGA poly-gamma-glutamic acid
  • PLA poly lactic acid
  • bicrylic mesh human amnion, bovine amnion and porcine collagen
  • chitin, chitosan fibronectin and dex
  • the non-degradable support may be sterile nonwoven fabric, polyethylene terephthalate (PET) film, polyethylene (PE) film, polypropylene (PP) film and poly One, or a combination of two or more selected from the group consisting of a urethane film, a net polyurethane film, and a polyurethane coated with a soft silicone coated on one side may be used, but is not limited thereto.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PE
  • a combination of two or more non-degradable supports may be used, but is not limited thereto.
  • a combination of one or more biodegradable supports and non-degradable supports can be used as the support, for example a polyurethane film, a net polyurethane film, or a soft silicone coated polyurethane on one side ( Polyurethane), PLA / nonwoven fibers or PGA / PLA / nonwoven fibers, but is not limited thereto.
  • a polyurethane film for example a polyurethane film, a net polyurethane film, or a soft silicone coated polyurethane on one side ( Polyurethane), PLA / nonwoven fibers or PGA / PLA / nonwoven fibers, but is not limited thereto.
  • a sheet for alleviating or improving blistering epidermal detachment containing the composition as an active ingredient.
  • the mesenchymal stem cells may be isolated from fat, bone marrow or umbilical cord blood.
  • a1 culturing the mesenchymal stem cells in two or more passages in a growth medium comprising a Fetal Bovine Serum (FBS), a growth factor, bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), or an EGF (Epidermal Growth Factor);
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • bFGF Basic Fibroblast Growth Factor
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • step (b) preparing a sheet by incubating the mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support of step (a2) in a medium containing FBS, growth factor bFGF or EGF for about 5 days;
  • step (c) activating the cells by additionally performing physical stimulation, hypoxic stimulation, mitogen stimulation, and inflammatory factor stimulation in the culture of step (b);
  • step (d) washing the medium with mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheets of step (b) or step (c) in a medium in which FBS and growth factors, bFGF or EGF, have been removed;
  • (h) may further comprise covering the sheet with another dressing.
  • mesenchymal stem cells isolated from human adipose tissue can be used, wherein the method of separating mesenchymal stem cells from human adipose tissue and culturing at least two passages is according to the prior art (Korean Patent No. 1,328,604).
  • a proliferation medium By culturing the cells using a proliferation medium, a large amount of mesenchymal stem cells can be effectively obtained in a short time.
  • Human adipose derived mesenchymal stem cells cultured in two or more passages according to the prior art adhere to plastic culture vessels to maintain fibroblast morphology and are positive for CD10, CD13, CD29, CD44, CD59, CD71, CD90, CD105, and Oct4.
  • stem cells have the ability to differentiate into fat cells, bone cells, chondrocytes, muscle cells, neurons in vitro. In addition, it secretes a variety of growth factors such as VEGF, HGF, TGF- ⁇ 1, NGF, IGF, and possesses immunomodulatory ability, and thus, a technology for applying to various diseases is being developed.
  • growth factors such as VEGF, HGF, TGF- ⁇ 1, NGF, IGF, and possesses immunomodulatory ability, and thus, a technology for applying to various diseases is being developed.
  • step a2) the adipose-derived mesenchymal stem cells cultured at least two passages in a1) are trypsin- or dispase-treated into single cells, suspended in a hydrogel, and then about 5,000 cells / cm in biodegradable or non-degradable support fibers. Evenly sprayed at 2 concentrations was attached. Then, cultured for 3-7 days using a growth medium containing 10% FBS and EGF or bFGF.
  • Hydrogel used in the embodiment of the present invention is a fibrin gel, but is not limited thereto, and may also include collagen, hyaluronic acid, gelatin, alginic acid, cellulose, pectin.
  • the biodegradable support used in the embodiment of the present invention is a non-acryl mesh or pruritus
  • the non-degradable support is a sterile gauze, polyurethane film, net-like polyurethane film, soft silicone coated polyurethane (Polyurethane) on the cross-section, PET film, but is not limited thereto, and PGA / nonwoven fibers, PGA / PLA / nonwoven fibers, human amniotic membranes, collagen membranes and the like can be used.
  • the hydrogel is primarily a biodegradable or non-degradable support fiber or polyurethane film, a net polyurethane film, a soft silicone-coated polyurethane (Polyurethane) on one side, PET film, PE film, PP film intermediate It performs a function of attaching the leaf stem cells, and secondly provides a substrate to the mesenchymal stem cells, which are adherent cells, to provide an environment in which cells adhere to the substrate and stably survive.
  • the hydrogel contains a myriad of three-dimensional network structure (pore) to provide an environment in which FBS, bFGF or EGF contained in the culture medium through the network structure to act on the cells and proliferate.
  • Hydrogels have a major influence on cell morphology and proliferation rate because the size, hardness, and rate of degradation of the network structure vary depending on the concentration produced.
  • the final 0.5-10 mg / mL fibrin gel to increase the rate of proliferation of mesenchymal stem cells, while maintaining the appropriate hardness of the gel.
  • the mesenchymal stem cells in the mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet in step b) may proliferate rapidly, increase more than 4 times in 3-7 days and include 20,000 or more cells per cm 2 . have.
  • the cells proliferated in the hydrogel express CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 which are characteristics of adipose derived mesenchymal stem cells, and can secrete various growth factors including VEGF and HGF. It also possesses the ability to inhibit TNF- ⁇ and IFN- ⁇ , which are representative inflammatory factors secreted by immune cells.
  • the cells cultured in the hydrogel is characterized in that it maintains the characteristics of mesenchymal stem cells.
  • hypoxic stress may be mixed.
  • mitogen treatment may be mixed.
  • IFN- ⁇ inflammatory factor
  • the present invention is a high activity of secreting high concentration growth factors and cytokines by treating hypoxic stress, mitogen or inflammatory factors in the adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet manufacturing step It provides a method for producing a sheet containing stem cells.
  • the adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet prepared according to the present invention can be applied to the affected part of bullous epidermal deprivation patients without the isolation of highly active stem cells using protease. Because it can excel in healing ability. In addition, since there is no isolation process using proteolytic enzymes, extracellular matrix such as collagen, laminin, fibronectin, and elastin secreted from mesenchymal stem cells in the culture stage is completely infiltrated into the hydrogel to alleviate bullous epidermal detachment. Or it can further enhance the improvement effect.
  • the stem cell-hydrogel sheet As described above, it is possible to prepare a stem cell-hydrogel sheet using only hydrogel in the step a2) of the present invention. Hydrogels, however, have low strength and are easily torn by mechanical / physical forces, which limits the size of the sheet and requires careful attention in use. On the other hand, when the stem cell-hydrogel is attached to the biodegradable or non-degradable support according to the present invention, the support increases the strength of the stem cell-hydrogel to facilitate manipulation. In addition, the thickness of the sheet was prepared in 0.1 ⁇ 2 mm to prevent the sheet from being torn when applied to the affected area, it was found that the sufficient effect can be included in the sheet to increase the therapeutic effect.
  • Step d) of the present invention is a fat-derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet is washed two to three times with physiological saline to remove animal-derived FBS and more completely serum-free Can be washed in DMEM medium. FBS was removed in the process to minimize the side effects that can be caused by animal-derived components when the sheet is applied to the human body.
  • the invention also includes a method for cryopreserving adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheets.
  • Cryo-bags can be stored at ⁇ 80 ° C. after sealing with cryopreservatives consisting of 10% DMSO and 5% human serum albumin solution to ensure sufficient seating.
  • cryopreservatives consisting of 10% DMSO and 5% human serum albumin solution to ensure sufficient seating.
  • cells isolated from proteolytic enzymes and artificial skins are damaged when frozen and stored at -80 ° C, which reduces the therapeutic effect when applied to wounds. Tissue eng 4 (4): 1403-414, 1988) .
  • the mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet prepared according to the present invention has a hydrogel encapsulating the stem cells to protect the cells from external shock and stress, so that they are stored for a long time without damage to the cells even at -80 ° C. This made it possible.
  • an effective amount of at least one growth factor, cytokine, hormone or extracellular matrix compound or protein useful in promoting the alleviation or amelioration effect of bullous epidermal detachment is combined with a composition according to the invention.
  • Specific examples include GCSF, IL6, IL8, IL10, MCP1, MCP2, tissue factor, bFGF, KGF, VEGF, PLGF, MMP1, MMP9, TIMP1, TIMP2, TGF- ⁇ 1, HGF, and the like. It is not limited to this.
  • Example 1 Cultivation method of human adipose derived mesenchymal stem cells
  • Adipose tissue is usually obtained by liposuction, but is not limited thereto.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from the adipose tissue obtained by liposuction as follows: The adipose tissue was washed to remove blood, and then reacted in a 37 ° C water bath by adding a collagenase solution of the same volume as the adipose tissue. . After centrifugation, the fat layer as the supernatant was removed, and the collagenase solution as the lower layer was carefully separated so as not to shake, and then suspended in a substrate medium, followed by centrifugation at 20 ° C. and 1500 rpm for 5 minutes.
  • the subsidence was the stromal-vascular fraction, the supernatant was removed.
  • the stromal-vascular fractions were suspended in substrate medium and inoculated in culture vessels and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours. After removal of the culture solution, the cells were washed with phosphate buffer, and the substrate medium or the growth medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) at a concentration of 1 ng / mL in the substrate medium, or the epidermal growth factor (EGF) in the substrate medium. Proliferation was performed using the medium contained at a ng / mL concentration.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells were grown to about 80-90% of the culture vessel and obtained by separating them into single cells by trypsin treatment.
  • Freeze-dried thrombin was added to 1 mL of calcium chloride solution to 400 ⁇ 600 IU. Or frozen thrombin was used after thawing to adjust to the same concentration. 1 mL of aprotinin solution was added to the freeze-dried fibrinogen or the frozen fibrinogen was thawed and prepared as a stock solution, followed by stepwise diluting to 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40. After collecting and suspending cells cultured in two passages or more in Example 1, the thrombin was mixed at a ratio of 40-50: 1 (v / v), and then mixed 1: 1 with fibrinogen diluted in stages to form a fibrin gel. It was.
  • the culture medium containing 10% FBS, 1 ng / mL bFGF was added and then incubated for 5 days at 37 °C, 5% CO 2 incubator.
  • cell-fibrin gel mixtures were taken to make thin sections, stained with 10 ⁇ g / mL acridine orange / ethidium bromide (AO / EtBr), and cell morphology and viability were measured using a fluorescence microscope. .
  • the cell proliferation was measured by adding WST-1 on the fifth day of culture.
  • FIG. 1A is a micrograph showing the morphology and number of stem cells in fibrin gel prepared from stock solution or diluted fibrinogen solution.
  • fibrin gel made of the fibrinogen stock solution most cells remained spherical and almost proliferated until the fifth day.
  • the cells rapidly formed fibroblast morphology and proliferated more.
  • Some dead cells were observed in fibrin gels prepared with undiluted fibrinogen, but no dead cells were observed in fibrin gels prepared with diluted fibrinogen.
  • high concentration fibrin gels have weak cytotoxicity against adipose-derived mesenchymal stem cells, but fibrin gels diluted 1: 5 to 1:40 show no cytotoxicity.
  • 1B is a graph showing quantitative measurement of stem cell proliferation according to fibrinogen gel using WST-1. As the dilution rate increases, the absorbance increases. That is, it can be seen that stem cells proliferate best in fibrin gels made by diluting fibrinogen 20 or 40 times.
  • Example 3 Human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-partitioned to castle base sheet prepared
  • Example 1 the mesenchymal stem cells cultured in two passages or more were collected and suspended in proliferation medium. Based on the result of Example 2, thrombin was added to the cell suspension so that the final 8-15 I.U.
  • a support about 5 x 5 cm square biodegradable support, non-cryryl mesh, lamella or non-degradable support, gauze, soft silicone-coated polyurethane (Polyurethane) on the cross-section and about 3-6.5 mg in PET film Fibrinogen at a concentration of / mL was applied and uniformly applied. Thereafter, the cell suspension containing thrombin was applied to the support to about 5,000 per cm 2 and then cell-fibrin gel was uniformly formed on the support and attached thereto. When the fibrin gel was completely hardened, the growth medium was added and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 3-7 days.
  • Polyurethane soft silicone-coated polyurethane
  • Figure 2a is a mixture of human adipose derived mesenchymal stem cells with fibrin hydrogel and attached to a soft silicon-coated polyurethane (Polyurethane) and PET film on the cross-section that is a non-degradable support after culturing the AO / EtBr staining sheet The photograph was observed with a fluorescence microscope.
  • Figure 2b is a photograph of the sheet was frozen at -80 ° C thawed by the microscope or AO / EtBr staining and observed by fluorescence microscope. As shown in FIG. 2B, even after thawing after freezing, fibroblast-like cells similar to those before freezing were attached to the support by hydrogel and proliferated. About 20,000 to 400,000 cells per cm 2 were homogeneously distributed and 100% viable.
  • Example 4 Human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable's castle or unbranched frozen storage of St. seat support
  • cryopreservative 10% DMSO and human serum albumin solution
  • a cryopreservative 10% DMSO and human serum albumin solution
  • the cryobags were taken out at each time, soaked in a 37 ° C. constant temperature water bath, and shaken to dissolve the cryopreservative. After adding saline, the solution was shaken up and down and poured out. Survival was measured by completely removing the cryopreservative and staining with AO / EtBr.
  • the fat-derived mesenchymal stem cells in the sheet prepared according to the invention as shown in Figure 3b survived more than 95% by 12 months.
  • the human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet prepared according to the present invention has been shown to be capable of long-term freezing storage at -80 ° C without damaging cells as the main active ingredient.
  • Example 5 Human adipose derived mesenchymal stem cell-growth factor secretion of the biodegradable or non-partitioned to support sex-hydrogel
  • the human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet of Example 3 or the cryopreserved sheet of Example 4 was thawed, washed with PBS, cut to 0.8 x 0.8 cm and then 24-well plate 2 pieces each were added to 1 mL of DMEM. After culturing at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 72 hours, the supernatant was collected, and the amounts of VEGF and HGF, which are representative growth factors secreted from mesenchymal stem cells, were measured by ELISA. As a result, as shown in Figure 4a, the sheet secreted HGF and VEGF.
  • the collected supernatants were analyzed using a cytokine array kit associated with angiogenesis.
  • the sheet is a growth factor, including HGF, VEGF to promote angiogenesis and Serprin E1 (PAI-1) and F1 (PDEF), TIMP-1, CXCL8 (IL -8), high levels of various cytokines such as FGF-2, DPPIV (CD26).
  • PAI-1 Serprin E1
  • PDEF Serprin E1
  • PDEF Serprin E1
  • TIMP-1 TIMP-1
  • CXCL8 CXCL8
  • CD26 high levels of various cytokines
  • mesenchymal stem cells cultured using a hydrogel prepared according to the present invention and a biodegradable or non-degradable support to the affected area by continuously secreting various growth factors and cytokines that promote cell proliferation and angiogenesis. It can be seen that by activating the surrounding tissue cells can reduce or improve the bullous epidermal detachment.
  • the human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet of Example 3 or the cryopreserved sheet of Example 4 were thawed, cut into appropriate sizes and placed one by one in a 24-well plate. And 5 x 10 5 Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) from which tissue compatible antigens (Human Leukocyte Antigens (HLA)) were obtained from other donors were added to 24-well plates.
  • PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • HLA Human Leukocyte Antigens
  • PHA phyto-hemagglutinin
  • a mitogen was added to peripheral blood mononuclear cells to induce an immune response of peripheral blood mononuclear cells. Three days after the start of the reaction, the supernatant was collected and the amount of secreted TNF- ⁇ was measured using the ELISA method.
  • Figure 5a is a diagram showing the immune response induction of allogeneic human adipose-derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable support, as shown here peripheral blood mononuclear cells positive control group is activated by PHA
  • peripheral blood mononuclear cells positive control group is activated by PHA
  • almost no TNF- ⁇ was secreted in the reaction with allogeneic human adipose-derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable scaffolds prepared according to Examples 3 or 4. That is, it has been confirmed that homologous human adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable scaffolds do not induce an immune response.
  • peripheral blood mononuclear cells were placed in a 24-well plate and activated with PHA to induce an immune response, and homogenous human adipose-derived mesenchymal stem prepared according to Example 3 or 4 above.
  • Cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheets were cut to the appropriate size and added one by one to the plate.
  • the supernatant was collected to measure the secretion amount of TNF- ⁇ .
  • allogeneic adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheets in PHA-activated peripheral blood mononuclear cells reduced TNF- ⁇ secretion by 60% or more. That is, allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet does not induce an immune response, and when excessive immune response occurs, a large amount is secreted by immune cells to increase the immune response. It serves to significantly reduce the amount of TNF- ⁇ secreted.
  • adipose-derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support sheet can be covered with the bullous epidermal detachment affected area to alleviate the persistent inflammation and promote re-epithelialization.
  • Example 7 derived from human fat Mesenchymal stem cells ECM Secretory
  • Proteins were extracted from the cells obtained in Example 1, and the expression levels of the collagen type VII and laminin 5, which are the causative proteins of bullous epidermal detachment, were measured by Western blot and compared with the expression levels in fibroblasts.
  • Figure 6a shows that the human adipose-derived mesenchymal stem cells that are the raw material of the sheet prepared in the present invention has a higher expression level of collagen type VII and laminin 5 compared to fibroblasts.
  • 6b is a result of quantitative analysis of the amount of collagen type VII and the amount of collagen type VII expressed by human adipose derived mesenchymal stem cells.
  • the fat-derived mesenchymal stem cells prepared in Example 1 were added, followed by washing with PBS containing collagen type VII or collagen type I-specific antibody, followed by reaction at 37 ° C. for 1 hour. Mounted and observed by fluorescence microscope.
  • Figure 6c is a photograph showing the secretion ability of the extracellular matrix protein of adipose derived mesenchymal stem cells (x400), adipose derived mesenchymal stem cells prepared according to the present invention as shown here-hydrogel-biodegradable or non-
  • the degradable support was generally positive for collagen type VII and collagen type I.
  • Example 8 Human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-ECM secretion and expression evaluation of biodegradable or non-partitioned to support St.
  • the cultured medium was collected after 3 days of incubation of the fat-derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support prepared in Example 3 or 4 in DMEM without FBS. Measured.
  • the adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable support prepared according to the present invention secreted collagen type VII and I.
  • frozen sections of the adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable scaffolds prepared in Examples 3 or 4 were prepared and fixed, followed by addition of extracellular matrix protein specific antibody. After reacting at 37 ° C. for 1 hour, the cells were washed, then mounted, and observed with a fluorescence microscope.
  • the adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support prepared according to the present invention is collagen type VII, collagen type I, collagen type V, laminin 5, fibronectin and laminin Showed a positive response. That is, the cells constituting the adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable support prepared according to the present invention not only secrete large amounts of various kinds of extracellular matrix proteins but also secrete extracellular matrix proteins. Staying in the gel can provide a variety of substrates when implanted in the body, which can have the effect of alleviating or improving bullous epidermal detachment.
  • Figure 8 shows the secretion ability of extracellular matrix proteins of fat-derived mesenchymal stem cells and adipose-derived mesenchymal stem cells in a single layer culture in accordance with the conventional culture method, adipose derived mesenchymal stem cells prepared according to the present invention
  • the hydrogel-biodegradable or non-degradable support secreted 6.8 times more collagen type VII compared to conventional monolayer cultured cells.
  • adipose-derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable scaffold was attached to the affected area of bullous epidermal detachment and adipose-derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable scaffold
  • Various extracellular matrix proteins can be supplied to promote tissue regeneration and re-epithelialization.
  • Example 1 The cells obtained in Example 1 were added to the 12-well plate at 5,500 / cm 2 and after 24 hours were further cultured for 48 hours by the addition of TGF- ⁇ 2 and TNF- ⁇ . After collecting the cells, RNA was extracted and the expression level of collagen type VII, the causative agent of bullous epidermal detachment, was measured by RT-PCT method.
  • adipose-derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable support prepared in accordance with the present invention is affixed to the affected area of bullous epidermal detachment patients with fats caused by inflammatory substances present in the site of chronic skin damage.
  • the amount of collagen type VII expression of derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable scaffolds may be increased to promote tissue regeneration and re-epithelialization.
  • Example 11 Human adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-bullous skin dissection treatment Examples of biodegradable or non-partitioned to support St.
  • Example 4 In order to evaluate the therapeutic effect of the adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable scaffold prepared in Example 4, a clinical trial was conducted in patients with bullous epidermal detachment.
  • the patient was diagnosed as bullous epidermal detachment in a 24-year-old female patient, but there was no improvement of the disease due to continuous recurrence and inflammation because there was no treatment.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable scaffolds prepared in Example 4 were affixed to the affected part of the subject, and the wound treatment effect was evaluated by photographing at weekly intervals.
  • FIG. 10 is a graph showing wound area after adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-degradable scaffold, adipose derived mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable or non-derived prepared according to the present invention. After degradable scaffolding, the wound area decreased with time and decreased 64.4% after 4 weeks.
  • the adipose derived mesenchymal stem cells-hydrogel-biodegradable or non-degradable support prepared according to the present invention not only secrete a large amount of various extracellular matrix but also secreted extracellular matrix stays in the hydrogel in the body. It can be seen that when transplanted, various substrates can be provided to alleviate or improve bullous epidermal detachment.
  • a composition or sheet for mitigating or improving bullous epidermal detachment comprising a mesenchymal stem cell-hydrogel-biodegradable support or a non-degradable support according to the present invention, in particular, increases the expression of collagen type VII and laminin-5 to cause bullous epidermis.
  • it shows the advantage that it can express a clinically significant effect, and thus can be useful for alleviating or improving the symptoms of bullous epidermal detachment.

Abstract

본 발명은 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 또는 중간엽줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체를 포함하는 조성물, 시트 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서 보다 구체적으로 본 발명에 따른 중간엽줄기세포-하이드로겔 생분해성 또는 비분해성 지지체를 함유하는 시트는 단백질 분해효소를 이용한 단리과정 없이 고활성의 줄기세포가 그대로 수포성 표피박리증 환자의 환부에 적용될 수 있고, 배양 단계에서 중간엽줄기세포로부터 분비되는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴과 같은 세포외기질이 온전하게 하이드로겔에 첩포되어 존재함으로써 수포성 표피박리증에 사용되던 종래 드레싱제에 비하여 피부 재생 및 재상피화 능력이 현저히 우수한 유리한 효과를 나타낸다.

Description

수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 중간엽줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체 조성물
본 발명은 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 또는 중간엽줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체를 포함하는 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa) 완화 또는 개선용 조성물, 시트(sheet) 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 특히 본 발명의 줄기세포를 포함하는 시트형 조성물은 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 드레싱제로 매우 유용하다.
수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa)이란 표피와 표피-진피 경계부 및 상부 유두진피를 구성하는 단백질을 만드는 유전자의 변이에 의하여, 가벼운 외상에도 쉽게 물집이 발생되어 피부와 점막에 통증이 생기는 희귀한 유전성 질환이다. 수포성 표피박리증 환자의 경우 두 층을 잡아주는 결합 단백질이 없어 층에 작은 마찰이 생기면 수포를 형성하고 3도 화상이 일어났을 때에 상응하는 통증을 경험한다고 한다. 단순 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa simplex, EBS), 접합형 수포성 표피박리증(junctional epidermolysis bullosa, JEB), 이영양성 수포성 표피박리증(dystrophic epidermolysis bullosa, DEB) 등이 있으며 대부분의 환자가 단순 수포성 표피박리증인 것으로 알려져 있다. 피부에 생성되는 케라틴의 돌연변이가 병을 유발하는 주된 원인으로 알려져 있으며, 단순성 수포성 표피박리증(Epidermolysis Bullosa simplex; EB simplex)은 상염색체 우성형 유전, 연접부 수포성 표피박리증(Junctional Epidermolysis Bullosa; JEB)은 상염색체 열성형 유전, 이영양성 수포성 표피박리증(Dystrophic Epidermolysis Bullosa; DEB)은 우성형과 열성형의 두 가지 형태가 있는 것으로 알려져 있다.
현재까지 피부에서 생산되는 케라틴 혼합물을 변형시키는 방법, 골수이식 등의 방법이 연구되고 있기는 하나 아직 질환의 완치 방법은 없고, 증상이나 합병증의 완화를 위한 대증요법이 주된 치료방법이다. 그 중 이미 생긴 수포가 감염되는 것을 막는 것이 가장 중요하며, 약간의 압력이나 마찰에 의해서도 수포가 잘 생기기 때문에 만지지 않도록 주의하여야 하며, 수포가 생겼을 경우는 통증을 경감시키고, 불편감을 최소화하면서, 과도한 체액 손실을 예방하고 감염을 예방하는 것이 중요한 것으로 알려져 있으며, 드레싱 하는 동안 통증 경감을 위해 진통제를 사용하기도 한다.
수포성 표피박리증 환자의 경우 수포감염의 방지 등을 위해 드레싱을 하는 것이 권장되고 있다. 예를 들어 EB simplex인 경우 소프트 실리콘(soft silicone) 타입의 드레싱제, 리피도-콜로이드(lipido-colloid) 타입의 드레싱제, 폼(foam)타입의 드레싱제, 하이드로겔 타입의 드레싱제, 시트 하이드로겔 타입의 드레싱제, 생합성 셀룰로오즈 타입의 드레싱제, 경계형(bordered) 타입의 드레싱제, 파우더 타입의 드레싱제가, EBS Dowling Meara인 경우 리피도-콜로이드 타입의 드레싱제, 폴리머형 멤브레인 타입의 드레싱제, 하이드로파이버 타입의 드레싱제가, 연접부 EB인 경우 하이드로겔 함침형 거즈 타입의 드레싱제, 하이드로파이버 타입의 드레싱제, 리피도-콜로이드 타입의 드레싱제, 소프트 실리콘 타입의 드레싱제, 폴리머형 멤브레인 타입의 드레싱제, 소프트 실리콘 폼 타입의 드레싱제, 수퍼-흡착제를 갖는 소프트 실리콘 폼 타입의 드레싱제가, 이영양성 EB의 경우 소프트 실리콘 타입의 드레싱제, 리피도-콜로이드 타입의 드레싱제, 소프트 실리콘을 갖는 폼 타입의 드레싱제, 수퍼-흡착제를 갖는 소프트 실리콘 폼 타입의 드레싱제, 폼 타입의 드레싱제, 폴리머형 멤브레인 타입의 드레싱제, 수퍼-흡착형 드레싱제, 경계형 드레싱제가 추천되고 있다 (Denyer J, Pillay E. Best practice guidelines for skin and wound care in epidermolysis bullosa. International Consensus. DEBRA, 2012. 참조).
상처 치료용 드레싱 관련하여서는 친수성기를 도입하여 생체 적합성을 증진시키고 상처 부위에서의 분비물의 흡수를 촉진하는 폴리우레탄 폼 형태의 상처치료용 드레싱제에 대한 특허(대한민국 등록특허 제345,034호), 약물층을 포함하는 폴리우레탄 폼 드레싱제에 대한 특허(대한민국 등록특허 제 1,022,884호) 등이 존재한다.
그러나 종래 사용되고 있는 드레싱제의 경우 수포성 표피박리증 환자의 환부에 적용하였을 때 자극성이 보다 완화될 수 있다는 점 또는 수포 부위로부터의 용출물의 흡수를 용이하게 할 수 있다는 장점이 있는 제품은 있으나, 수포성 표피박리증 환자의 환부에 적용하였을 때 자극성이 없으면서도 피부재생 효과를 함께 나타내는 드레싱제에 대한 기술은 알려진 바 없다.
한편 콜라겐 타입 VII(collagen type VII) 또는 콜라겐 알파-1 chain은 COL7A1 유전자에 의해 코딩되는 단백질로서, 이 유전자에 돌연변이가 있는 경우 이영양성 수포성 표피박리증과 관련되어 있다고 알려져 있고, 변이가 없다 하여도 콜라겐 타입 VII에 대한 자가면역반응이 후천성 수포성 표피박리증이라 불리는 질환을 일으킬 수 있다고 보고되었다. 또한 콜라겐 타입 VII는 라미닌-5 및 피브로넥틴과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 교정된 라미닌-5 유전자를 담고 있는 줄기세포를 피부이식을 통해 연접부 수포성 표피박리증 환자의 대퇴부 환부에 이식하여, 수포가 생기지 않는 임상적 효과를 달성한 연구예가 이탈리아에서 발표되었다. 따라서 수포성 표피박리증의 완화 내지 개선을 위해서는 콜라겐 타입 VII 및 라미닌-5가 매우 중요한 역할을 한다는 점을 알 수 있다.
본 발명은 배양한 중간엽줄기세포를 하이드로겔에 현탁하여 생분해성 또는 비분해성 지지체에 부착한 후 배양하는 고활성의 살아있는 중간엽줄기세포를 포함하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물 및 시트, 그리고 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 하며, 특히 콜라겐 타입 VII 및 라미닌-5의 발현을 증가시켜 수포성 표피박리증 환부에 적용하였을 때 임상적으로 유의미한 효과를 발현할 수 있는 조성물, 시트 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 인간의 지방, 골수, 피부, 혈관, 근육, 뇌, 혈액, 태반, 치수 및 제대혈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리한 중간엽줄기세포를 수포성 표피박리증 환부에 적용하기 위한 드레싱제로 이용하기 위한 것으로, 임상적으로 유효한 치료효과를 얻기 위해 고활성의 중간엽줄기세포를 포함하는 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물 또는 시트, 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 또는 비분해성 지지체, 보다 구체적으로 중간엽줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체를 포함하는 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물, 시트 및 이의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물에서, 중간엽줄기세포는 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성이며, CD34 및 CD45에 대해 음성인 자가 또는 동종 유래 세포이다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 지지체로는 PGA(poly-gamma-glutamic acid), PLA(poly lactic acid), PGA/PLA, 비크릴 메쉬, 사람 양막, 소 양막, 돼지 콜라겐, 키틴, 키토산, 피브로넥틴 및 덱스트란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 생분해성 고분자 지지체를 사용하거나, 멸균된 부직포 섬유, PET(polyethylene terephthalate) 필름, PE(polyethylene) 필름, PP(polypropylene) 필름 및 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름, 또는 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane) 필름과 같은 비분해성 지지체, 또는 이들의 조합체 예를 들어 PGA/부직포 섬유, PLA/부직포 섬유, PGA/PLA/부직포 섬유를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산 또는 이의 유도체, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 이 때 피브린 글루를 형성하는 피브리노겐의 농도는 0.5 내지 60 mg/mL일 수 있고, 구체적으로 0.5 내지 45 mg/mL일 수 있으며, 보다 구체적으로 0.5 내지 30 mg/mL일 수 있고, 보다 더 구체적으로 0.5 내지 20 mg/mL일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 0.5 내지 10 mg/mL일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트를 제조하기 위하여 줄기세포를 하이드로겔과 혼합하여 지지체 1 cm2 당 1,000 내지 10,000개로 균일하게 도포하고, FBS 및 bFGF 또는 EGF를 함유하는 배지에서 배양하여 지지체 1 cm2 당 줄기세포 20,000개 이상, 보다 구체적으로 20,000개 내지 400,000개가 되도록 증식시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 또는 비분해성 지지체를 포함하는 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물 또는 시트는 특히 콜라겐 타입 VII 및 라미닌-5의 발현을 증가시켜 수포성 표피박리증 환부에 적용하였을 때 임상적으로 유의미한 효과를 발현할 수 있다는 장점을 갖는다.
또한 본 발명에 따른 고활성의 중간엽줄기세포를 포함하는 조성물 또는 시트는, 단백질 분해효소를 이용한 단리(선별) 과정 없이 고활성의 줄기세포가 그대로 수포성 표피박리증 환자의 환부에 적용될 수 있고, 배양 단계에서 중간엽줄기세포로부터 분비되는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴과 같은 세포외기질이 온전하게 하이드로겔에 첩포되어 존재함으로써 종래 치료제에 비하여 수포성 표피박리증 환자의 환부에 적용하였을 때 피부 재생 및 재상피화 능력이 현저히 우수하다는 유리한 효과를 나타낸다.
보다 구체적으로 본 발명에 따른 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체는, 무혈청 배지에서도 섬유아세포 형태를 유지하였고 1주가 경과한 후 90% 이상 생존하는 것으로 나타나 종래 줄기세포치료제에 비하여 생존기간이 현저히 증가하였고, 동결보관 후 해동하였을 때 시트의 형태 및 강도가 그대로 유지되었으며 시트 내 세포도 95% 이상 생존한 것으로 나타나 주유효 성분인 세포의 손상없이 -80℃에서 장기간 냉동보관이 가능하고, 장기간 동결보관하였을 때 1년 이상 경과한 시점에서도 해동 시 세포가 95% 이상 생존한 것으로 나타났다. 또한 세포 성장 및 혈관형성을 촉진하는 다양한 성장인자와 사이토카인이 지속적으로 분비되며, 콜라겐 타입 VII 및 라미닌-5을 포함하는, 다양한 종류의 세포외기질을 다량 분비할 뿐만 아니라 분비된 세포외기질이 하이드로겔 내에 머물러 있어 환부에 적용하였을 때 다양한 기질을 제공함으로써 수포성 표피박리증 치유를 용이하게 할 수 있고, 면역반응을 유발하지 않으며 오히려 환부에 염증이 발생하더라도 면역세포에 의해 다량 분비되어 면역반응성을 증가시키는 역할을 하는 TNF-alpha의 분비량을 현저히 감소시켜 염증을 완화시킴으로써 수포성 표피박리증 환자에서 나타나는 수포 및 염증의 치유를 도울 수 있고, 특히 콜라겐 타입 VII의 발현이 현저히 증가하므로, 조직재생 및 재상피화를 촉진시키는 장점이 있다.
도 1a는 피브리노겐 원액 및 단계별 희석된 용액으로 만들어진 피브린 겔과 혼합하여 배양한 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 형태를 AO/EtBr로 염색하여 관찰한 형광현미경 사진이다 (400 배율). 피브리노겐의 희석배수 및 트롬빈이 포함된 세포현탁액과 1:1 혼합되어 최종 피브린글루를 형성하였을 때 농도는 괄호하여 표기하였다.
도 1b는 피브리노겐 원액 및 단계별 희석된 용액으로 만들어진 피브린 겔과 혼합하여 배양한 인간 지방유래 중간엽줄기세포에 WST-1을 첨가하여 측정한 흡광도 그래프이다.
도 2는 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트의 동결 전 후를 비교한 사진이다.
도 2a는 시트 내 세포 사진으로, 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 또는 비분해성 지지체 시트를 5일 배양 후 시트내 세포를 AO/EtBr 염색 후 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 2b는 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 또는 비분해성 지지체 시트를 -80℃에서 동결보관한 후 해동하여 시트 내 세포를 AO/EtBr로 염색하여 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3은 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 또는 비분해성 지지체 시트의 장기보관 안정성을 평가하기 위하여 시트를 -80℃에서 동결보관한 후 1개월, 3개월, 6개월, 9개월, 12개월에 해동한 후 시트 내 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 시트 또는 비분해성 지지체 시트에서 분비되는 VEGF와 HGF 의 양을 ELISA로 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 4b는 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 시트 또는 비분해성 지지체 시트에서 분비되는 혈관형성 촉진 인자를 사이토카인 어레이 킷트를 이용하여 분석한 결과이다.
도 5a는 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 시트 또는 비분해성 지지체 시트를 동종의 말초혈액단핵세포와 공동배양한 후 말초혈액단핵세포에서 분비되는 TNF-α의 양을 ELISA로 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 5b는 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 시트 또는 비분해성 지지체 시트를 동종의 활성화된 말초혈액단핵세포에 첨가하여 공동배양한 후 말초혈액단핵세포에서 분비되는 TNF-α의 양을 ELISA로 정량한 후 TNF-α의 분비 억제율 (%)로 환산하여 나타낸 그래프이다.
도 6a는 인간 지방유래 중간엽줄기세포와 섬유아세포에서의 발현되는 세포외 기질 단백질 중 콜라겐 타입 VII 및 라미닌의 발현양을 Western blot 기법을 통해 확인한 결과이다.
도 6b는 인간 지방유래 중간엽줄기세포에서 발현되는 세포외기질 단백질 중 콜라겐 타입 VII의 발현양을 ELISA 기법을 통해 확인한 결과 그래프이다.
도 6c는 인간 지방유래 중간엽줄기세포에서의 세포외기질단백질인 콜라겐 타입 VII 및 콜라겐 타입 I의 발현을 면역형광염색한 후 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7a는 본 발명에 따른 시트로부터 분비되는 세포외기질단백질인 콜라겐 타입 VII, 콜라겐 타입 I의 양을 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명에 따른 시트 내 포함된 세포외기질단백질인 콜라겐 타입 VII, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 V, 라미닌 5, 피브로넥틴, 라미닌 등의 발현을 면역형광염색 후 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8는 본 발명에 따른 시트와 단층 배양한 인간 지방유래 중간엽줄기세포로부터 분비되는 세포외기질단백질인 콜라겐 타입 VII의 양을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 인간 지방유래 중간엽줄기세포가 상처부위에서 분비되는 염증성 사이토카인인 TGF-β2, TNF-α에 노출되었을 때 콜라겐 타입 VII의 발현이 급격히 증가하는 것을 보여주는 결과이다.
도 10는 본 발명에 따른 시트를 수포성 표피박리증 환자에게 부착 전과 부착 후 1주일 간격으로 총 4주 동안 상처 면적의 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체를 포함하는 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물, 시트 및 이의 제조 방법을 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 중간엽줄기세포를 하이드로겔을 이용하여, (i) 생분해성 지지체 및 비분해성 지지체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 지지체; 또는 (ii) 2종 이상의 비분해성 지지체; 또는 (iii) 1종 이상의 생분해성 지지체 및 1종 이상의 비분해성 지지체의 조합체에 부착시켜 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체를 수득하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 수득된 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체를 증식배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기에서 증식배지는 FBS(fetal bovine serum), 및 bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), TGF-beta1(transforming growth factor beta-1), PDGF(platelet-derived growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 및 IFG-1(insulin-like growth factor)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 포함하는 배지이고, 하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 생분해성 지지체는 PGA(poly-gamma-glutamic acid), PLA(poly lactic acid), 비크릴 메쉬, 사람 양막, 소 양막, 돼지 콜라겐, 키틴, 키토산, 피브로넥틴 및 덱스트란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 비분해성 지지체는 멸균된 부직포 섬유, PET(polyethylene terephthalate) 필름, PE(polyethylene) 필름, PP(polypropylene) 필름 및 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름 및 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄(polyurethane)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 보다 구체적으로 (a1) 중간엽줄기세포를 증식배지에서2계대 이상 배양하는 단계; (a2) 배양한 중간엽줄기세포를 하이드로겔을 이용하여 (i) 생분해성 지지체 및 비분해성 지지체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 지지체; 또는 (ii) 2종 이상의 비분해성 지지체; 또는 (iii) 1종 이상의 생분해성 지지체 및 1종 이상의 비분해성 지지체의 조합체에 부착시켜 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체를 수득하는 단계; 및 (b) 단계(a2)에서 수득된 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체를 증식배지에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기에서 증식배지는 FBS(fetal bovine serum), 및 bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), TGF-beta1(transforming growth factor beta-1), PDGF(platelet-derived growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 및 IFG-1(insulin-like growth factor)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 포함하는 배지이고, 하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며, 생분해성 지지체는 PGA(poly-gamma-glutamic acid), PLA(poly lactic acid), 비크릴 메쉬, 사람 양막, 소 양막, 돼지 콜라겐, 키틴, 키토산, 피브로넥틴 및 덱스트란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 비분해성 지지체는 멸균된 부직포 섬유, PET(polyethylene terephthalate) 필름, PE(polyethylene) 필름, PP(polypropylene) 필름 및 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름 및 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄(polyurethane)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 증식배지에 포함되는 인자는 보다 구체적으로 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor), 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 중간엽줄기세포는 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성이며, CD34 및 CD45에 대해 음성인 자가 또는 동종 유래 세포이다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트를 제조하기 위하여 줄기세포를 하이드로겔과 혼합하여 지지체 1 cm2 당 1,000 내지 10,000개로 균일하게 도포하고, FBS, bFGF 및 EGF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상이 포함되는 배지에서 배양하여 지지체 1 cm2 당 줄기세포 20,000개 이상, 보다 구체적으로 20,000개 내지 400,000개가 되도록 증식시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)에서, 물리적 자극, 저산소 자극, 마이토겐 자극, 및 IFN-gamma와 같은 염증인자 자극으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 자극을 추가적으로 수행하여 세포를 활성화시키는 단계(c)를 추가로 포함할 수 있다. 특히 수포성 표피박리증으로 손상된 조직의 경우, 혈관이 파괴되거나 기능이 저하되어 산소공급이 원활하지 못하고 만성 염증이 존재할 수 있기 때문에 손상된 조직에 투여된 줄기세포는 저산소 스트레스 및 염증인자에 염증인자에 의해 활성화되고 성장인자 및 사이토카인 분비가 급격히 증가된다. 따라서 지지체 시트 제조단계에서 저산소 스트레스, 마이토겐 또는 염증인자를 처리하여 고농도의 성장인자와 사이토카인을 분비하는 고활성의 줄기세포를 포함하는 조성물, 시트를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 하이드로겔로는 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스 또는 펙틴을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 하이드로겔로서 피브린 글루를 사용할 경우, 피브린 글루를 형성하는 피브리노겐의 농도는 0.5 내지 60 mg/mL일 수 있고, 구체적으로 0.5 내지 45 mg/mL일 수 있으며, 보다 구체적으로 0.5 내지 30 mg/mL 농도, 보다 더 구체적으로 0.5 내지 20 mg/mL의 농도, 보다 더 구체적으로 0.5 내지 10 mg/mL 농도, 보다 더 구체적으로 0.5 내지 5 mg/mL 농도의 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하며, 1 내지 50 I.U./mL 농도, 구체적으로 1 내지 30 I.U./mL 농도, 보다 구체적으로 5 내지 20 I.U./mL 농도의 트롬빈을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 하이드로겔 자체만으로도 줄기세포-하이드로겔 시트의 제조가 가능하나, 하이드로겔은 강도가 낮아 기계적/물리적 힘에 의해 쉽게 찢어질 수 있어 시트의 크기가 제한되며 사용 시 세심한 주의가 요구되는 단점이 있는데, 생분해성 지지체 또는 비분해성 지지체에 중간엽줄기세포-하이드로겔을 부착시키는 경우 지지체가 중간엽줄기세포-하이드로겔의 강도를 높여 조작이 보다 용이해질 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 생분해성 지지체로는 PGA(poly-gamma-glutamic acid), PLA(poly lactic acid), 비크릴 메쉬, 사람 양막, 소 양막 및 돼지 콜라겐, 키틴, 키토산, 피브로넥틴 및 덱스트란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 조합을 사용할 수 있고, 비분해성 지지체로는 멸균된 부직포 섬유, PET(polyethylene terephthalate) 필름, 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름 및 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane), PE(polyethylene) 필름 및 PP(polypropylene) 필름으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 조합을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 2종 이상의 비분해성 지지체의 조합을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 1종 이상의 생분해성 지지체 및 비분해성 지지체의 조합체를 지지체로 사용할 수 있으며, 예를 들면 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름 또는 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane) 필름, PLA/부직포 섬유 또는 PGA/PLA/부직포 섬유의 형태로 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(b)에서, 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체를 1 내지 20 w/v% DMSO 및 1 내지 80 w/v% 인간혈청알부민을 함유하는 동결보관제에 넣어 냉동보관하는 단계(d)를 추가로 포함할 수 있으며, 여기에서 냉동보관 후 해동하였을 때 중간엽줄기세포의 생존율은 70% 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 본 발명에 따른 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체 조성물은 냉동보관 후 해동하였을 때 1주일 후, 1개월 후, 2개월 후, 3개월 후, 4개월 후, 5개월 후, 6개월 후, 7개월 후, 8개월 후, 9개월 후, 10개월 후, 11개월 후, 12개월 후 중간엽줄기세포의 생존율이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상이고, 보다 구체적으로 12개월 후 90% 이상, 95% 이상의 생존율을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 일 양태에서, 중간엽줄기세포 및 하이드로겔을 포함하며; 생분해성 지지체 및 비분해성 지지체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 지지체, 또는 1종 이상의 생분해성 지지체 및 비분해성 지지체의 조합체를 함유하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 하이드로겔로서 피브린 글루를 사용할 경우, 피브린 글루를 형성하는 피브리노겐의 농도는 0.5 내지 60 mg/mL일 수 있고, 구체적으로 0.5 내지 45 mg/mL일 수 있으며, 보다 구체적으로 0.5 내지 30 mg/mL 농도, 보다 더 구체적으로 0.5 내지 20 mg/mL의 농도, 보다 더 구체적으로 0.5 내지 10 mg/mL 농도, 보다 더 구체적으로 0.5 내지 5 mg/mL 농도의 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하며, 1 내지 50 I.U./mL 농도, 구체적으로 1 내지 30 I.U./mL 농도, 보다 구체적으로 5 내지 20 I.U./mL 농도의 트롬빈을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 생분해성 지지체로는 PGA(poly-gamma-glutamic acid), PLA(poly lactic acid), 비크릴 메쉬, 사람 양막, 소 양막 및 돼지 콜라겐, 키틴, 키토산, 피브로넥틴 및 덱스트란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 조합을 사용할 수 있고, 비분해성 지지체로는 멸균된 부직포 섬유, PET(polyethylene terephthalate) 필름, PE(polyethylene) 필름, PP(polypropylene) 필름 및 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름, 및 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 조합을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 2종 이상의 비분해성 지지체의 조합을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 1종 이상의 생분해성 지지체 및 비분해성 지지체의 조합체를 지지체로 사용할 수 있으며, 예를 들면 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름, 또는 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane), PLA/부직포 섬유 또는 PGA/PLA/부직포 섬유의 형태로 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 또 다른 일 양태에서, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트가 제공된다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 수포성 표피박리증은, 수포성 표피박리증, 수포성 극세포 분리, 수포성 극세포증, 후천성 수포성 표피박리증, 유전성 수포성 표피박리증, 치사성 수포성 표피박리증, 지연성 유전성 표피박리증, 증식성 수포성 표피박리증, 각질용해증, 국한성 수포성 표피박리증, 비흉터성 수포성 표피박리증, 다발형성이상성 수포성 표피박리증, 흉터성 표피박리증, 단순 표피 수포증, 웨버-코케인 병, 도울링-미에라 신드롬(Dowling-Meara Syndrome), 골드쉐이더 질환(Goldscheider's disease), 할로포우-지멘스 질환(Hallopeau-Siemens disease), 하인리크바우어 신드롬(Heinrichsbauer syndrome), 헬리츠 신드롬(Herlitz syndrome) 및 코브너 질환(Kobner's disease)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 중간엽줄기세포는 지방, 골수 또는 제대혈로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서 보다 구체적으로 상기 방법은:
(a1) 중간엽줄기세포를 FBS(Fetal Bovine Serum), 성장인자인 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor) 또는 EGF(Epidermal Growth Factor)를 포함하는 증식배지에서 2계대 이상 배양하는 단계;
(a2) 배양한 중간엽줄기세포를 하이드로겔을 이용하여 생분해성 또는 비분해성 지지체, 또는 이들의 조합체에 부착하는 단계;
(b) 상기 단계(a2)의 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체를 FBS, 성장인자인 bFGF 또는 EGF를 포함하는 배지에서 약 5일 동안 배양하여 시트를 제조하는 단계;
(c) 상기 단계(b)의 배양시 물리적 자극, 저산소 자극, 마이토겐 자극, 염증인자 자극을 추가적으로 수행하여 세포를 활성화시키는 단계;
(d) 상기 단계(b) 또는 단계(c)의 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트에 FBS와 성장인자인 bFGF 또는 EGF가 제거된 배지에서 세척하는 단계;
(e) (b)의 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트를 10% DMSO 및 5% 인간혈청알부민으로 구성된 동결보관제에 넣어 냉동 보관하는 단계;
(f) 동결 보관된 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트를 해동하여 생리식염수로 세척하여 동결보관제를 제거하는 단계; 및
(g) 수포성 표피박리증 환자의 환부에서 드레싱이 필요한 환부의 크기에 따라 자른 후 적용대상 부위에 부착하는 단계를 포함하며,
(h) 상기 시트를 다른 드레싱으로 덮어주는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법을 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
단계 a1)에서는 인간 지방조직에서 분리된 중간엽줄기세포를 사용할 수 있으며, 이 때 인간 지방조직으로부터 중간엽줄기세포를 분리하고 2계대 이상 배양하는 방법은 종래 기술 (한국등록특허 1,328,604)에 따른 것으로 증식배지를 사용하여 세포를 배양함으로써, 다량의 중간엽줄기세포를 단시간 내에 효과적으로 얻을 수 있다. 종래 기술에 따라 2계대 이상 배양한 인간 지방유래 중간엽줄기세포는 플라스틱 배양용기에 부착하여 섬유아세포 형태를 유지하며, CD10, CD13, CD29, CD44, CD59, CD71, CD90, CD105 및 Oct4에 대하여 양성이고, CD34, CD45, CD104, CD106 및 Stro-1에는 음성을 나타낸다. 또한 줄기세포로서 체외에서 지방세포, 뼈세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포로 분화할 수 있는 능력을 가진다. 또한 VEGF, HGF, TGF-β1, NGF, IGF와 같은 다양한 성장인자를 분비하며, 면역조절능력을 보유하고 있어 다양한 질환치료에 적용하는 기술이 개발되고 있다.
상기 a2) 단계에서는 a1)에서 2계대 이상 배양한 지방유래 중간엽줄기세포를 트립신 또는 디스파아제 처리하여 단일세포로 만들고 하이드로겔에 현탁한 후 생분해성 또는 비분해성 지지체 섬유에 약 5,000 개/cm2 농도로 균일하게 뿌려 부착시켰다. 이후 10% FBS 및 EGF 또는 bFGF가 포함된 증식배지를 이용하여 3~7일 동안 배양하였다. 본 발명의 실시예에서 사용한 하이드로겔은 피브린 겔이나, 이에 한정되지는 않으며 이외에도 콜라겐, 히알루론산, 젤라틴, 알긴산, 셀룰로오스, 펙틴을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 실시예에서 사용한 생분해성 지지체는 비크릴 메쉬 또는 소양막을, 비분해성 지지체로는 멸균된 거즈, 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름, 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane), PET 필름이나, 이 또한 이에 한정되지 않고, PGA/부직포 섬유, PGA/PLA/부직포 섬유, 사람 양막, 콜라겐 막 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 하이드로겔은 일차적으로는 생분해성 또는 비분해성 지지체 섬유 또는 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름, 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane), PET 필름, PE 필름, PP필름에 중간엽줄기세포를 부착시키는 기능을 수행하고, 이차적으로는 부착성 세포인 중간엽줄기세포에 기질을 제공하여 세포가 기질에 부착하여 안정적으로 생존할 수 있는 환경을 제공한다. 또한 하이드로겔은 무수히 많은 3차원 망목 구조 (pore)를 포함하고 있어 배양액에 포함된 FBS, bFGF 또는 EGF가 망목 구조를 통과하여 세포에 작용하여 증식할 수 있는 환경을 제공한다. 하이드로겔은 제조하는 농도에 따라 망목 구조의 크기, 경도, 분해속도가 다르기 때문에 세포의 형태 및 증식 속도에 주요한 영향을 미치게 된다. 본 발명의 실시예에서는 최종 0.5-10 mg/mL의 피브린 겔을 사용함으로써 중간엽줄기세포의 증식속도를 높였으며, 반면 적절한 겔의 경도가 유지되도록 하였다.
상기 b) 단계에서 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트에서 중간엽줄기세포는 빠르게 증식하여 3~7일 동안 4배 이상 증가하며 cm2 당 20,000개 이상의 세포를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 하이드로겔 내에서 증식한 세포는 지방유래 중간엽줄기세포의 특성인 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105를 발현하며, VEGF, HGF를 포함한 다양한 성장인자를 분비할 수 있다. 또한 면역세포에서 분비되는 대표적인 염증성 인자인 TNF-α와 IFN-γ 억제 능력도 보유하고 있다. 즉, 하이드로겔 내에서 배양된 세포는 중간엽줄기세포의 특성을 유지하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 b) 단계에서는 저산소 스트레스, 마이토겐 (mitogen) 처리, 염증인자 (IFN-γ) 처리를 혼용할 수 있다. 수포성 표피박리증으로 인해 손상된 조직은 혈관이 파괴되거나 기능이 저하되어 산소공급이 원활하지 못하고 만성적인 염증이 존재하기 때문에 손상된 조직에 투여된 줄기세포는 저산소 스트레스 및 염증인자에 의해 활성화되고 성장인자 및 사이토카인 분비가 급격히 증가된다.
앞서 설명한 바와 같이 본 발명은 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트 제조 단계에서 저산소 스트레스, 마이토겐 또는 염증인자를 처리하여 고농도의 성장인자와 사이토카인을 분비하는 고활성의 줄기세포를 포함하는 시트의 제조방법을 제공하고 있다.
또한, 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트는 고활성의 줄기세포가 단백질분해효소를 이용한 단리과정 없이 그대로 수포성 표피박리증 환자의 환부에 적용될 수 있기 때문에 치료능력이 뛰어나다. 또한, 단백질분해효소를 이용한 단리 과정이 없기 때문에 배양하는 단계에서 중간엽줄기세포에서 분비되는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴과 같은 세포외기질이 온전하게 하이드로겔에 첩포되어 존재하여 수포성 표피박리증 완화 또는 개선효과를 더욱 증진시킬 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이 본 발명의 상기 a2) 단계에서 하이드로겔 자체만으로도 줄기세포-하이드로겔 시트의 제조가 가능하다. 그러나 하이드로겔은 강도가 낮아 기계적/물리적 힘에 의해 쉽게 찢어지기 때문에 시트의 크기가 제한적이고 사용시 세심한 주의가 요구된다. 반면, 본 발명에 따라 줄기세포-하이드로겔을 생분해성 또는 비분해성 지지체에 부착하게 되면 지지체가 줄기세포-하이드로겔의 강도를 높여 조작이 용이하도록 하였다. 또한 시트의 두께는 0.1~2 mm 로 제조하여 환부에 적용 시 시트가 찢어지는 것을 방지하고 시트 내 충분한 세포수가 포함되도록 하여 치료 효과를 높일 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 d) 단계는 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트는 생리식염수로 2~3회 세척하여 동물유래 성분인 FBS를 제거하고 보다 완전하게 제거하기 위하여 무혈청 DMEM 배지에서 세척할 수 있다. 상기 과정에서 FBS가 제거되어 시트를 인체에 도포할 때 동물유래 성분에 의해 발생할 수 있는 부작용을 최소화하였다.
본 발명은 또한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트를 동결보관하는 방법을 포함한다. 크라이오백에 시트가 충분히 잠기도록 10% DMSO와 5% 인간혈청알부민 용액으로 구성된 동결보관제를 넣고 실링한 후 -80℃에서 보관할 수 있다. 일반적으로 단백질효소 처리하여 단리된 세포, 인공피부 (표피세포 또는 진피세포 또는 두 가지 세포 모두로 구성된 인공피부)는 -80℃에서 동결 보관할 경우 세포가 손상되어 상처에 적용할 때 치료효과가 감소되는 것으로 알려져 있다 (Tissue eng 4(4):1403~414, 1988). 그러나 본 발명에 따라 제조한 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트는 하이드로겔이 줄기세포를 감싸고 있어 외부 충격 및 스트레스로부터 세포를 보호하여 -80℃에서도 세포의 손상 없이 장기간 보관이 가능하도록 하였다.
본 발명에 따른 일 실시양태에서, 수포성 표피박리증의 완화 또는 개선 효과를 증진시키는 데 유용한 유효량의 1종 이상의 성장인자, 사이토카인, 호르몬 또는 세포외매트릭스 화합물 또는 단백질을 본 발명에 따른 조성물과 함께 투여할 수 있으며, 구체적으로 GCSF, IL6, IL8, IL10, MCP1, MCP2, 조직인자, bFGF, KGF, VEGF, PLGF, MMP1, MMP9, TIMP1, TIMP2, TGF-β1, HGF 등을 그 예로 들 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 배양 방법
지방 조직은 보통 지방 흡입술로 얻을 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방유래 중간엽줄기세포를 분리하였다: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 세척한 다음 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37 ℃ 수욕에서 반응시켰다. 원심분리 후, 상층액인 지방층을 제거하고 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하여 기질배지를 넣어 현탁시킨 후, 20 ℃, 1500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획으로, 상층액을 제거하였다. 스트로마-혈관 분획을 기질배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기질배지, 또는 기질배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 1 ng/mL 농도로 포함된 증식배지, 또는 기질배지에 표피세포 성장인자(EGF)가 5 ng/mL 농도로 포함된 배지를 이용하여 증식시켰다. 지방유래 중간엽줄기세포가 배양용기의 80~90% 정도로 자라면 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다.
실시예 2: 하이드로겔로써 피브린 글루의 농도 결정
동결 건조된 트롬빈은 염화칼슘용액 1 mL을 첨가하여 400~600 I.U. 가 되도록 하였다. 또는 동결된 트롬빈을 해동하여 동일 농도가 되도록 조절한 후 사용하였다. 동결 건조된 피브리노겐에 아프로티닌 용액 1 mL을 첨가하거나 동결된 피브리노겐을 해동하여 원액으로 준비한 후 1:5, 1:10, 1:20, 1:40이 되도록 단계별 희석하였다. 상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 세포를 수집하여 현탁한 후 트롬빈을 40~50:1의 비율 (v/v)로 섞어준 후 단계별 희석한 피브리노겐과 1:1 혼합하여 피브린 겔이 형성되도록 하였다. 겔이 완전히 굳으면 10% FBS, 1 ng/mL bFGF가 포함된 배양배지를 첨가한 후 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 배양하였다. 배양 2일째와 5일째 세포-피브린 겔 혼합물을 취하여 얇게 절편을 만든 후 10 μg/mL 아크린딘 오렌지/에티듐 브로마이드 (AO/EtBr)로 염색하고 형광현미경을 이용하여 세포형태와 생존율을 측정하였다. 또한 배양 5일째 WST-1을 첨가하여 세포증식 정도를 측정하였다.
도 1a는 원액 또는 희석된 피브리노겐 용액으로 제조한 피브린 겔 내에서 줄기세포의 형태와 수를 보여주는 현미경 사진이다. 피브리노겐 원액으로 만들어진 피브린 겔 내에서는 5일째까지 대부분의 세포가 구형의 세포형태를 그대로 유지하고, 거의 증식하지 못하였다. 반면, 희석배수가 증가할수록 세포는 빠르게 섬유아세포 형태를 형성하였고 더 많이 증식하였다. 원액 피브리노겐으로 제조한 피브린 겔 내에서는 일부 죽은 세포가 관찰되었으나 희석한 피브리노겐으로 제조한 피브린 겔 내에서는 죽은 세포가 관찰되지 않았다. 즉, 고농도 피브린 겔은 지방유래 중간엽줄기세포에 대한 세포독성이 약하게 존재하지만 1:5~1:40으로 희석한 농도의 피브린 겔은 세포독성이 없음을 보여주는 것이다.
도 1b는 피브리노겐 겔에 따른 줄기세포의 증식능력을 WST-1을 이용하여 정량적으로 측정하여 나타낸 그래프로 희석배수가 증가할수록 흡광도가 증가하였다. 즉, 피브리노겐을 20배 또는 40배 희석하여 만든 피브린 겔에서 줄기세포가 가장 잘 증식함을 알 수 있다.
실시예 3: 인간 지방유래 중간엽줄기세포 - 하이드로겔 -생분해성 또는 비분해성 지지체 시트 제조
상기 실시예 1에서 2계대 이상 배양한 중간엽줄기세포를 수집하여 증식배지로 현탁하였다. 상기 실시예 2의 결과에 기초하여 트롬빈을 최종 8~15 I.U.가 되도록 세포현탁액에 첨가하였다.
지지체로써, 약 5 x 5 cm 크기의 사각형 모양의 생분해성 지지체인 비크릴 메쉬, 소양막 또는 비분해성 지지체인 거즈, 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane) 및 PET 필름에 약 3~6.5 mg/mL 농도의 피브리노겐을 도포하여 균일하게 도포하였다. 그 후 트롬빈이 포함된 세포현탁액을 지지체에 cm2 당 약 5,000개가 되도록 도포한 후 세포-피브린 겔이 지지체에 균일하게 형성되어 부착되도록 하였다. 피브린 겔이 완전히 굳으면 증식배지를 첨가하고 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3~7일 동안 배양하였다.
도 2a는 인간 지방유래 중간엽줄기세포를 피브린 하이드로겔과 혼합하여 비분해성 지지체인 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane) 및 PET 필름에 부착시킨 후 배양하여 제조된 시트를 AO/EtBr 염색 후 형광현미경으로 관찰한 사진이다. 도 2b는 시트를 -80˚C에서 동결보관된 시트를 해동하여 현미경 또는 AO/EtBr 염색 후 형광현미경으로 관찰한 사진이다. 도 2b에서 보여주듯이 동결보관 후 해동 후에도 동결전과 유사한 섬유아세포 형태의 세포가 하이드로겔에 의해 지지체에 부착되어 증식된 것이 관찰되었다. 시트 cm2당 약 20,000 ~ 400,000개의 세포가 균질하게 분포하였으며 100% 생존하였다.
실시예 4: 인간 지방유래 중간엽줄기세포 - 하이드로겔 -생분해성 또는 비분해성 지지체 시트의 동결보관
상기 실시예 3에서 제조한 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트를 세척하여 세포배양액을 제거한 후 동결보관제 (10% DMSO 및 인간혈청알부민 용액)가 들어 있는 크라이오백에 넣어 -80℃에서 동결 보관하였다. 약 1개월, 3개월, 6개월, 9개월, 12개월 후 각 시기별로 상기 크라이오백을 꺼내 37℃ 항온수조에 담근 후 흔들어 동결보관제를 녹여 따라 버렸다. 생리식염수를 첨가한 후 위-아래로 흔들어주고 따라버렸다. 동결보관제를 완전히 제거한 후 AO/EtBr로 염색하여 생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 3b에서 보여주듯이 상기 발명에 따라 제조한 시트 내에서 지방유래 중간엽줄기세포는 12개월까지 95% 이상 생존하였다.
즉, 본 발명에 따라 제조된 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트는 주유효 성분인 세포의 손상 없이 -80℃에서 장기간 냉동보관이 가능함을 보여주고 있다.
실시예 5: 인간 지방유래 중간엽줄기세포 - 하이드로겔 -생분해성 또는 비분해성 지지체의 성장인자 분비
실시예 3의 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트 또는 실시예 4의 동결보관된 시트를 해동하여 PBS로 세척한 후 0.8 x 0.8 cm로 자른 후 24-well 플레이트에 2장씩 넣고 DMEM 1 mL를 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 배양한 후 상층액을 수집한 후, 중간엽줄기세포에서 분비되는 대표적인 성장인자인 VEGF, HGF의 양을 ELISA 법을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 4a에서 보여주는 바와 같이, 상기 시트는 HGF 및 VEGF를 분비하였다.
또 다른 실시예로, 상기 수집한 상층액을 혈관형성과 관련된 사이토카인 어레이 키트를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 4b에서 보여주는 바와 같이, 상기 시트는 혈관형성을 촉진하는 HGF, VEGF 를 비롯한 성장인자와 서프린(Serprin) E1(PAI-1)과 F1 (PDEF), TIMP-1, CXCL8 (IL-8), FGF-2, DPPIV (CD26)과 같은 다양한 사이토카인을 다량 분비하였다. 즉, 본 발명에 따라 제조한 하이드로겔 및 생분해성 또는 비분해성 지지체를 이용하여 배양한 중간엽줄기세포를 환부에 적용하면 세포증식 및 혈관형성을 촉진하는 다양한 성장인자와 사이토카인을 지속적으로 분비함으로써 주변조직세포를 활성화시켜 수포성 표피박리증을 완화 또는 개선시키는 효과를 나타낼 수 있다는 점을 알 수 있었다.
실시예 6: 동종의 인간 지방유래 중간엽줄기세포 - 하이드로겔 -생분해성 또는 비분해성 지지체의 면역조절기능
실시예 3의 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트 또는 실시예 4의 동결보관된 시트를 해동하여 적당한 크기로 자른 후 24-well 플레이트에 1장씩 넣었다. 그리고 조직 적합성 항원 (Human Leukocyte Antigen; HLA)이 다른 공여자에서 얻은 말초혈액단핵세포 (peripheral Blood Mononuclear Cell; PBMC) 5 x 105개를 24-well 플레이트에 첨가하였다. 양성대조군으로는 말초혈액단핵세포에 마이토겐 (mitogen)인 PHA (phyto-hemagglutinin)를 첨가하여 말초혈액단핵세포의 면역반응을 유발하였다. 반응 시작 후 3일째 상등액을 수집하여 분비된 TNF-α의 양을 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다.
도 5a는 동종의 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체의 면역반응 유도능을 보여주는 도면으로, 여기에 나타난 바와 같이 양성대조군인 말초혈액단핵세포는 PHA에 의해 활성화되는 반면, 상기 실시예 3또는 4에 따라 제조한 동종인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체와의 반응에서는 TNF-α가 거의 분비되지 않았다. 즉, 동종의 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체는 면역반응을 유발하지 않는 것이 확인되었다.
또 다른 실험예로, 말초혈액단핵세포 5 x 105개를 24-well 플레이트에 넣고 PHA로 활성화시켜 면역반응을 유발하고, 상기 실시예 3 또는 4에 따라 제조한 동종의 인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트를 적당한 크기로 자른 후 플레이트에 1장씩 첨가하였다. 반응 3일째 상등액을 수집하여 TNF-α의 분비량을 측정하였다.
그 결과, 도 5b에서 보여주는 바와 같이 PHA로 활성화된 말초혈액단핵세포에서 동종인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트는 TNF-α의 분비량을 60% 이상 감소시켰다. 즉, 동종인간 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트는 면역반응을 유발하지 않으며, 또한 과도한 면역반응이 발생했을 때는 면역세포에 의해 다량 분비되어 면역반응성을 증가시키는 역할을 하는 TNF-α의 분비량을 현저히 감소시키는 역할을 한다. 따라서 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 시트를 수포성 표피박리증 환부에 덮어주면 지속되는 염증을 완화시켜 재상피화를 촉진할 수 있다.
실시예 7: 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 ECM 분비능
상기 실시예 1에서 수득한 세포에서 단백질을 추출하여 수포성 표피박리증의 원인단백질인 콜라겐 타입 VII과 라미닌5의 발현양을 Western blot 기법으로 측정한 후 섬유아세포에서의 발현양과 비교하였다. 또한 본 발명에서 제조한 시트의 원료가 되는 인간 지방유래 중간엽줄기세포에서 발현양과 분비량을 ELISA 기법으로 측정하였다.
도 6a는 본 발명에서 제조한 시트의 원료가 되는 인간 지방유래 중간엽줄기세포는 섬유아세포와 비교하여 콜라겐 타입 VII과 라미닌5의 발현량이 높음을 보여주고 있다. 도 6b는 인간 지방유래중간엽줄기세포가 발현하는 콜라겐 타입 VII의 양과 분비되는 콜라겐 타입 VII의 양을 정량분석한 결과이다.
또 다른 실시예로 상기 실시예 1에서 제조한 지방유래 중간엽줄기세포를 고정 후 콜라겐 타입 VII또는 콜라겐 타입 I특이 항체를 포함하는 PBS를 첨가한 후 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후 세척한 다음 마운팅 하고 형광현미경으로 관찰하였다.
도 6c는 지방유래 중간엽줄기세포의 세포외기질단백질의 분비능을 보여주는 사진으로 (x 400), 여기에 나타난 바와 같이 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체는 전체적으로 콜라겐 타입 VII, 콜라겐 타입 I에 양성반응을 나타내었다.
실시예 8: 인간 지방유래 중간엽줄기세포 - 하이드로겔 -생분해성 또는 비분해성 지지체의 ECM 분비 및 발현평가
상기 실시예 3 또는 4에서 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체를 FBS가 첨가되지 않은 DMEM에서 3일 간 배양 후 배양액을 수집하여 ELISA 기법으로 ECM 분비능 및 발현율을 측정하였다.
그 결과 도 7a에서 보여주는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체는 콜라겐 타입 VII 및 I을 분비하였다.
또 다른 실시예로, 상기 실시예 3 또는 4에서 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체의 동결절편을 만든 후 고정하고, 세포외기질단백질 특이 항체를 첨가한 후 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 세척한 다음 마운팅 하고 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 7b에서 보여주는 바와 같이, 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체는 콜라겐 타입 VII, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 V, 라미닌 5, 피브로넥틴 및 라미닌에 양성반응을 나타내었다. 즉, 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체를 구성하는 세포는 다양한 종류의 세포외기질단백질을 다량 분비할 뿐만 아니라 분비된 세포외기질단백질이 하이드로겔 내에 머물러 있어 체내에 이식하였을 때 다양한 기질을 제공함으로써 수포성 표피박리증을 완화 또는 개선시키는 효과를 나타낼 수 있다.
실시예 9: 인간 지방유래 중간엽줄기세포와 인간 지방유래 중간엽줄기세포 -하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체의 콜라겐 타입 VII 발현
도 8은 기존의 배양법에 따라 단층 배양한 지방유래 중간엽줄기세포와 시트내 지방유래 중간엽줄기세포의 세포외기질단백질의 분비능을 보여주는 결과로, 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체는 기존의 단층 배양한 세포와 비교하여 콜라겐 타입 VII을 6.8배 더 많이 분비하였다.
이상의 결과, 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체를 수포성 표피박리증 환자의 환부에 첩부하면 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체가 피부손상 부위에 다양한 세포외기질단백질을 공급하여 조직재생 및 재상피화를 촉진할 수 있다.
실시예 10: 염증성 물질에 의한 인간 지방유래 중간엽줄기세포에서의 콜라겐 타입 VII의 발현평가
상기 실시예 1에서 수득한 세포를 12-well 플레이트에 5,500/cm2으로 첨가하고 24시간 후 TGF-β2 와 TNF-α 를 첨가하여 48시간 동안 추가배양하였다. 세포를 수집한 후 RNA를 추출하여 수포성 표피박리증의 원인유전자인 콜라겐 타입 VII 의 발현양을 RT-PCT기법으로 측정 후 발현 변화를 비교하였다.
그 결과 도 9에서 보여주는 바와 같이, 시트의 주성분인 지방유래 중간엽줄기세포에 TGF-β2 와 TNF-α 를 처리하면 콜라겐 타입 VII의 발현이 약 8배 증가하였다. 이상의 결과, 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체를 수포성 표피박리증 환자의 환부에 첩부하면 만성적인 피부손상 부위에 존재하는 염증성 물질들에 의해 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체의 콜라겐 타입 VII 발현양이 증가하여 조직재생 및 재상피화를 촉진할 수 있다.
실시예 11: 인간 지방유래 중간엽줄기세포 - 하이드로겔 -생분해성 또는 비분해성 지지체의 수포성 표피박리증 치료예
상기 실시예 4에서 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체의 치료효과를 평가하기 위하여 수포성 표피박리증 환자를 대상으로 임상시험을 실시하였다.
본 환자는 24세 여성환자로 수포성 표피박리증 진단을 받았으나 별도의 치료법이 없어 계속적인 재발과 염증으로 인하여 병세의 호전이 없었다. 상기 실시예 4에서 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체를 대상자의 환부에 첩부하였고 1주일 간격으로 사진 관찰을 통해 상처 치료 효과를 평가하였다.
도 10는 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체를 첩부한 후 상처면적을 나타내는 그래프로, 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체 첩부 후 시간이 지남에 따라 상처면적이 감소하였으며 첩부 4 주 후 첩부 전과 비교하였을 때에 비해 64.4% 감소하는 효과를 나타내었다.
즉, 본 발명에 따라 제조한 지방유래 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 비분해성 지지체는 다양한 종류의 세포외기질을 다량 분비할 뿐만 아니라 분비된 세포외기질이 하이드로겔 내에 머물러 있어 체내에 이식하였을 때 다양한 기질을 제공함으로써 수포성 표피박리증을 완화 또는 개선시키는 효과를 나타낼 수 있다는 점을 알 수 있다.
본 발명에 따른 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 지지체 또는 비분해성 지지체를 포함하는 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물 또는 시트는 특히 콜라겐 타입 VII 및 라미닌-5의 발현을 증가시켜 수포성 표피박리증 환부에 적용하였을 때 임상적으로 유의미한 효과를 발현할 수 있다는 장점을 나타내며, 따라서 수포성 표피박리증 환자의 증상 완화 또는 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (20)

  1. (a) 중간엽줄기세포를 하이드로겔을 이용하여,
    (i) 생분해성 지지체 및 비분해성 지지체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 지지체; 또는
    (ii) 2종 이상의 비분해성 지지체; 또는
    (iii) 1종 이상의 생분해성 지지체 및 1종 이상의 비분해성 지지체의 조합체에 부착시켜 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체를 수득하는 단계; 및
    (b) 단계(a)에서 수득된 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체를 증식배지에서 배양하는 단계를 포함하고,
    여기에서 증식배지는 FBS(fetal bovine serum), 및 bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), TGF-beta1(transforming growth factor beta-1), PDGF(platelet-derived growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 및 IFG-1(insulin-like growth factor)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 포함하는 배지이고,
    하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상이며,
    생분해성 지지체는 PGA(poly-gamma-glutamic acid), PLA(poly lactic acid), 비크릴 메쉬, 사람 양막, 소 양막, 돼지 콜라겐, 키틴, 키토산, 피브로넥틴 및 덱스트란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    비분해성 지지체는 멸균된 부직포 섬유, PET(polyethylene terephthalate) 필름, PE(polyethylene) 필름, PP(polypropylene) 필름, 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름 및 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    시트는 콜라겐 타입 VII 또는 라미닌-5를 함유하는 것을 특징으로 하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  3. 피브린 글루는 0.5 내지 45 mg/mL 농도의 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    피브린 글루는 0.5 내지 10 mg/mL 농도의 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계(b)에서, 물리적 자극, 저산소 자극, 마이토겐 자극 및 염증인자 자극으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 자극을 추가적으로 수행하여 세포를 활성화시키는 단계(c)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계(b)에서, 중간엽줄기세포-하이드로겔-지지체를 1 내지 20 w/v% DMSO 및 1 내지 80 w/v% 인간혈청알부민을 함유하는 동결보관제에 넣어 냉동보관하는 단계(d)를 추가로 포함하고,
    여기에서 냉동보관 후 해동하였을 때 중간엽줄기세포의 생존율이 90% 이상인, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    12개월 이상 냉동보관 후 해동하였을 때 중간엽줄기세포의 생존율이 90% 이상인, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    단계(a)에서, 하이드로겔 지지체 1 cm2 당 1,000 내지 10,000개의 중간엽줄기세포를 도포하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    단계(b)에서, 하이드로겔 지지체 1 cm2 당 20,000 내지 400,000개의 중간엽줄기세포가 되도록 증식시키는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 수포성 표피박리증은, 수포성 표피박리증, 수포성 극세포 분리, 수포성 극세포증, 후천성 수포성 표피박리증, 유전성 수포성 표피박리증, 치사성 수포성 표피박리증, 지연성 유전성 표피박리증, 증식성 수포성 표피박리증, 각질용해증, 국한성 수포성 표피박리증, 비흉터성 수포성 표피박리증, 다발형성이상성 수포성 표피박리증, 흉터성 표피박리증, 단순 표피 수포증, 웨버-코케인 병, 도울링-미에라 신드롬(Dowling-Meara Syndrome), 골드쉐이더 질환(Goldscheider’s disease), 할로포우-지멘스 질환(Hallopeau-Siemens disease), 하인리크바우어 신드롬(Heinrichsbauer syndrome), 헬리츠 신드롬(Herlitz syndrome) 및 코브너 질환(Kobner’s disease)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    중간엽줄기세포는 지방, 골수, 피부, 혈관, 근육, 뇌, 혈액, 태반, 치수 및 제대혈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리되는 것인, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트의 제조방법.
  12. 중간엽줄기세포 및 하이드로겔을 포함하며;
    생분해성 지지체 및 비분해성 지지체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 지지체;
    2종 이상의 비분해성 지지체; 또는
    1종 이상의 생분해성 지지체 및 비분해성 지지체의 조합체를 함유하되,
    여기에서, 하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    생분해성 지지체는 PGA(poly-gamma-glutamic acid), PLA(poly lactic acid), 비크릴 메쉬, 사람 양막, 소 양막, 돼지 콜라겐, 키틴, 키토산, 피브로넥틴 및 덱스트란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며,
    비분해성 지지체는 멸균된 부직포 섬유, PET(polyethylene terephthalate) 필름, PE(polyethylene) 필름, PP(polypropylene) 필름, 폴리우레탄 필름, 네트형 폴리우레탄 필름 및 단면에 소프트실리콘 코팅된 폴리우레탄 (Polyurethane)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    조성물은 콜라겐 타입 VII 또는 라미닌-5를 함유하는 것을 특징으로 하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    피브린 글루는 0.5 내지 45 mg/mL 농도의 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물.
  15. 제12항에 있어서,
    피브린 글루는 0.5 내지 10 mg/mL 농도의 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물.
  16. 제12항에 있어서,
    하이드로겔 지지체 1 cm2 당 20,000 내지 400,000개의 중간엽줄기세포를 포함하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 수포성 표피박리증은, 수포성 표피박리증, 수포성 극세포 분리, 수포성 극세포증, 후천성 수포성 표피박리증, 유전성 수포성 표피박리증, 치사성 수포성 표피박리증, 지연성 유전성 표피박리증, 증식성 수포성 표피박리증, 각질용해증, 국한성 수포성 표피박리증, 비흉터성 수포성 표피박리증, 다발형성이상성 수포성 표피박리증, 흉터성 표피박리증, 단순 표피 수포증, 웨버-코케인 병, 도울링-미에라 신드롬(Dowling-Meara Syndrome), 골드쉐이더 질환(Goldscheider’s disease), 할로포우-지멘스 질환(Hallopeau-Siemens disease), 하인리크바우어 신드롬(Heinrichsbauer syndrome), 헬리츠 신드롬(Herlitz syndrome) 및 코브너 질환(Kobner’s disease)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물.
  18. 제12항에 있어서,
    12개월 이상 냉동보관 후 해동하였을 때 중간엽줄기세포의 생존율이 90% 이상인, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    중간엽줄기세포는 지방, 골수, 피부, 혈관, 근육, 뇌, 혈액, 태반, 치수 및 제대혈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리되는 것인, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 조성물.
  20. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 함유하는, 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 시트.
PCT/KR2017/003982 2016-04-12 2017-04-12 수포성 표피박리증 완화 또는 개선용 중간엽줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 중간엽줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체 조성물 WO2017179918A1 (ko)

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