TW201914581A - 減輕或改善大皰性表皮松解症用間葉幹細胞－水凝膠－可降解性或間葉幹細胞－水凝膠－不可降解性支持體組成物 - Google Patents

Abstract

本發明乃係一種減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物、薄片及其制造方法，包括間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或間葉幹細胞-水凝膠-不可降解性支持體組成物，尤其包括幹細胞的本發明薄片型組成物作為減輕或改善大皰性表皮松解用敷料非常有效。

Description

減輕或改善大皰性表皮松解症用間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或間葉幹細胞-水凝膠-不可降解性支持體組成物

本發明乃係一種減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物、薄片及其制造方法，包括間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或間葉幹細胞-水凝膠-不可降解性支持體組成物，尤其包括幹細胞的本發明薄片型組成物作為減輕或改善大皰性表皮松解用敷料非常有效。

大皰性表皮松解(epidermolysis bullosa)是由於構成表皮和表皮-真皮交界區及上皮乳頭細胞蛋白質的基因突變引起的，輕微的外傷也會引起水泡，皮膚與黏膜上產生病痛的罕見遺傳性疾病。大皰性表皮松解症患者因沒有穩定兩個層的結合蛋白質，雙層之間產生小小的摩擦也會產生水溝，據說會經受相應於三度燒傷的疼痛。包括單純型大皰性表皮松解症(epidermolysis bullosa simplex,EBS)、交界型大皰性表皮松解症(junctional epidermolysis bullosa,JEB)、營養不良型大皰性表皮松解症(dystrophic epidermolysis bullosa,DEB)等，大多數患者是屬於單純型大皰性表皮松解症。現被知皮膚中生成的角質突變為主要 病因，單純型大皰性表皮松解症(Epidermolysis Bullosa simplex；EB implex)是常染色體顯性遺傳，交界型大皰性表皮松解症(Junctional Epidermolysis Bullosa；JEB)是常染色體劣性遺傳，營養不良型大皰性表皮松解症(Dystrophic Epidermolysis Bullosa；DEB)具有顯性與劣性兩種形態。

至今為止，雖然研究改變皮膚生產的角質混合物、骨髓移植等方法正在進行，但尚不存在疾病的治愈方法，主要治療方法為減輕症狀或綜合症的對症療法。其中，最重要的是防止已生成水皰被感染，只輕微的壓力或摩擦也會導致產生水皰，要注意不要觸碰，生成水泡時，重要的是減輕疼痛，降低不適感為最低，預防損失過多體液和預防感染，在使用敷料時為了減輕疼痛也有使用鎮痛劑。

大皰性表皮松解症患者一般建議外敷以防水泡感染。比如，單純型大皰性表皮松解症建議使用軟矽型敷料、Lipido膠體型敷料、泡沫型敷料、水凝膠型敷料、薄片水凝膠型敷料、生物合成纖維素型敷料、交界型敷料、粉狀敷料，皰疹樣大皰性表皮松解症建議使用Lipido膠體型敷料、聚合物型膜狀敷料、水纖維型敷料，交界型大皰性表皮松解症建議使用水凝膠含針狀紗布型敷料、水纖維型敷料、Lipido膠體型敷料、軟矽型敷料、聚合物型膜狀敷料、軟矽泡沫型敷料、具有超級-吸附劑的軟矽泡沫型敷料，營養不良型大皰性表皮松解症建議使用軟矽型敷料、Lipido膠體型敷料、軟矽泡沫型敷料、具有超級-吸附劑的 軟矽泡沫型敷料、泡沫型敷料、聚合物型膜狀敷料、超級-吸附劑型敷料、交界型敷料。(參照Denyer J,Pillay E.Best practice guidelines for skin and wound care in epidermolysis bullosa.International Consensus.DEBRA,2012.).

有關治傷用敷料，現有聚氨酯泡沫型治傷用敷料的專利(大韓民國注冊專利第345，034號)，引進親水性基增進生物適應性，促進吸收患處分泌物；包含藥物層的聚氨酯泡沫型敷料的專利(大韓民國注冊專利第1,022,884號)等。

但現有敷料適用在大皰性表皮松解症患者患處時，雖然有些產品具有可減輕刺激性或可容易吸收水泡周圍湧出物的優點，但至今還沒有適用在大皰性表皮松解症患者患處時既沒有刺激性也可一並顯示皮膚再生效果的敷料技術。

另外，中制造的脂肪來源間葉幹細胞固定後加入包含膠原蛋白類型VII或膠原蛋白α-1鏈是由COL7A1基因編碼的蛋白質，現知道此基因產生突變時與營養不良性大皰性表皮松解症有關，據報告，即使沒有變異，對膠原蛋白類型VII的自我免疫反應會引發後天性大皰性表皮松解。並且，據知，膠原蛋白類型VII與層黏連蛋白-5及纖維黏連蛋白相互作用。並且，在意大利發表了研究實例，把含有矯正層黏連蛋白-5基因的幹細胞，通過皮膚移植移植到交界型大皰性表皮松解症患者的大腿部患處後達到不產生水泡的臨床效果。由此可知，為了減輕或 改善大皰性表皮松解症，膠原蛋白類型VII及層黏連蛋白-5起著非常重要的作用。

本發明的目的在於提供一種減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物、薄片及其制造方法，把培養的間葉幹細胞在水凝膠懸浮，貼附在可降解性或不可降解性支持體後培養，包括存活的高活性間葉幹細胞，尤其增加膠原蛋白類型VII及層黏連蛋白-5的表達量，當適用在大皰性表皮松解症患處時，臨床可發揮有意義的效果。

本發明之主要目的，乃在提供一種減輕或改善大皰性表皮松解症組成物或薄片及其制造方法，包含高活性間葉幹細胞使其得到臨床有效治療效果，此間葉幹細胞是從脂肪、骨髓、皮膚、血管、肌肉、腦、血液、胎盤、齒髓及臍帶血組成的組合中選擇的某一種分離的，用作大皰性表皮松解症患處的敷劑。

為達到上述目的，本發明提供間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體或不降解性支持體，更詳細，提供包括間葉幹細胞-水凝膠-不可降解性支持體的減輕或改善大皰性表皮松解症支持體，敷薄片及其制造方法。

本發明減輕或改善大皰性表皮松解症的支持物，間葉幹細胞對CD29,CD44,CD73,CD90及CD105顯陽性，對CD34及CD45顯陰性的自體或同種來源細胞。

本發明一形態中，支持體使用由聚穀氨酸、聚乳酸、可吸收聚羥基乳酸網、人羊膜、牛羊膜、豬膠原 蛋白、幾丁質、甲殼質、纖維黏連蛋白及葡聚糖組成的組合中選擇的可降解性高分子支持體，或使用如滅菌無紡布纖維、聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜及單面軟矽塗層的聚氨酯等不可降解性支持體或它們的組合體，舉例，可使用聚穀氨酸/無紡布纖維、聚乳酸/無紡布纖維、聚穀氨酸/聚乳酸/無紡布纖維。

根據本發明一形態中，水凝膠可從纖維蛋白膠、玻尿酸或此衍生物、明膠、膠原蛋白、藻酸、纖維素及果膠組成的組合中選擇，此時形成纖維蛋白膠的纖維蛋白原的濃度可在0.5~60mg/mL之間，具體可以是0.5~45mg/mL，更具體可以是0.5~30mg/mL，還更具體可在0.5~20mg/mL，再具體可以是0.5~10mg/mL。

根據本發明一形態中，為制造減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片，包括：混合幹細胞與水凝膠在支持體1cm²中均勻塗層1,000~10,000個，在包含胎牛血清及堿性纖維母細胞生長因子或表皮生長因子的培養基中培養，幹細胞增殖到支持體1cm²中為20,000個以上，更具體，增殖到20,000~400,000個的階段。

(發明效果)

根據本發明包括間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體或不可降解性支持體的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片，尤其增加薄片包含膠原蛋白類型VII或層黏連蛋白-5的表達量，用在大皰性表皮松解症患處時具有臨 床可發揮有意義效果的優點。

並且，根據本發明包含高活性間葉幹細胞的組成物或薄片，可不經過利用蛋白酶的分離過程，高活性幹細胞原樣適用在大皰性表皮松解症患者的患處，在培養階段間葉幹細胞中分泌的細胞外基質如膠原蛋白、層黏連蛋白、纖維黏連蛋白、彈性蛋白等完整地罩在水凝膠中存在，與現有治療劑相比，適用在大皰性表皮松解症患者的患處時，顯示有利效果證明其具有顯著的皮膚再生及再表皮化能力。

更詳細，本發明間葉幹細胞-水凝膠-支持體，在無血清培養苦上也維持了纖維芽細胞狀態，經過1周後存活率達90%以上，跟現有幹細胞治療劑相比，存活期間顯著增加，凍結保管後解凍時，薄片的形態及硬度維持原狀，薄片內細胞存活率也達95%，在-80℃也可無細胞損傷地長期保管，長期凍結保管時經過1年以上時解凍後也顯示出95%以上的細胞還在生存。並且，持續分泌促進細胞生長及血管形成的多種生長因子和細胞因子，分泌大量包括膠原蛋白類型VII和層黏連蛋白-5在內的多種細胞外基質，當分泌的細胞外基質停留在水凝膠內，適用在患處時提供多種基質，可方便治療大皰性表皮松解症，不引發免疫反應，反而即使患處發生炎症時顯著減少免疫細胞大量分泌增加免疫反應的腫瘤壞死因子-α的分泌量，減輕炎症，可幫助治療大皰性表皮松解症患者患發的水泡及炎症，尤其顯著增加膠原蛋白類型VII的表達量，具有促 進組織再生及再表皮化優點。

第1a圖係圖示把混合以纖維蛋白原原液及分步稀釋的溶液制成的纖維蛋白凝膠培養的人脂肪來源間葉幹細胞的形態用AO/EtBr染色後觀察的熒光顯微鏡照片(放大係數400)。纖維蛋白原的稀釋倍數及包括凝血酶的細胞懸浮液1：1混合，最終形成纖維蛋白膠時的濃度用括號表示。

第1b圖係圖示纖維蛋白原原液及分步稀釋的溶液制成的纖維蛋白凝膠培養的人脂肪來源間葉幹細胞中加入WST-1後測量的吸光度圖表。

第2圖係圖示人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片的凍結前後比較圖。

第2a圖係圖示薄片中細胞的照片，把人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體或不可降解性支持體薄片培養5天後，把細胞經AO/EtBr染色後用熒光顯微鏡觀察的照片。

第2b圖係圖示把人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體或不可降解性支持體薄片在-80℃凍結保管後解凍，再把細胞用AO/EtBr染色後用熒光顯微鏡觀察的照片。

第3圖係圖示為評價人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體或不可降解性支持體薄片的長期保管穩定性，在-80℃凍結保管經過1個月、3個月、6個月、9個月、 12個月後解凍時顯示薄片中細胞存活率的圖表。

第4a圖係圖示把人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體薄片或不可降解性支持體薄片分泌的VEGF和HGF量，采用酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)測定的圖表。

第4b圖係圖示在人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體薄片或不可降解性支持體薄片分泌的形成血管促進因子采用細胞因子方陣試劑盒分析的結果。

第5a圖係圖示在人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體薄片或不可降解性支持體薄片加同種末梢血單核細胞共同培養的後末梢血單核細胞分泌的腫瘤壞死因子(TNF-α)的量采用酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)測定的圖表。

第5b圖係圖示在人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體薄片或不可降解性支持體薄片加同種末梢血單核細胞共同培養的後末梢血單核細胞分泌的腫瘤壞死因子(TNF-α)的量采用酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)定量後換算TNF-α分泌抑制率(%)的圖表。

第6a圖係圖示人脂肪來源間葉幹細胞與纖維芽細胞表達的細胞外基質蛋白質中膠原蛋白類型VII及層黏連蛋白表達量采用蛋白質印跡法(Western blot)確認的結果。

第6b圖係圖示人脂肪來源間葉幹細胞與纖維芽細胞表達的細胞外基質蛋白質中膠原蛋白類型VII表達量采用酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)法確認的結果圖表。

第6c圖係圖示把人脂肪來源間葉幹細胞與纖維芽細 胞表達的細胞外基質蛋白質中膠原蛋白類型VII及膠原蛋白類型I的表達量免疫熒光染色後用熒光顯微鏡觀察的照片。

第7a圖係圖示本發明薄片中細胞外基質蛋白質膠原蛋白類型VII及膠原蛋白類型I分泌量的圖表。

第7b圖係圖示本發明薄片中包括的細胞外基質蛋白質膠原蛋白類型VII及膠原蛋白類型I、膠原蛋白類型V、層黏連蛋白5、纖黏蛋白、層黏連蛋白等的表達免疫熒光染色後用熒光顯微鏡觀察的照片。

第8圖係圖示本發明薄片與單層培養的人脂肪來源間葉幹細胞分泌的細胞外基質蛋白質膠原蛋白類型VII量的比較圖表。

第9圖是圖示人脂肪來源間葉幹細胞露在患處分泌的炎性細胞因子TGF-β 2,TNF-α時，膠原蛋白類型VII表達急劇增加的結果。

第10圖係圖示本發明薄片恢複缺乏膠原蛋白類型VII纖維芽細胞形態與黏附性的圖表。

第11圖係圖示本發明薄片恢複缺乏膠原蛋白類型VII纖維芽細胞的遷移，可再生皮膚的結果。

第12圖係圖示本發明薄片對大皰性表皮松解症患者黏貼前後相隔1周，總4周的患處面積大小變化的圖表。

[實施發明最佳形態]

為達到上述目的的本發明提供一種減輕或改 善大皰性表皮松解症的組成物、薄片及其制造方法，包括間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體。

以下更詳細說明本發明。

本發明涉及一種減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，包括：(a)把間葉幹細胞利用水凝膠貼附到，(i)從降解性支持體及不可降解性支持體組成的組合中選擇的一種以上的支持體；或(ii)2種以上不可降解性支持體；或(iii)1種以上的降解性支持體及1種以上的不可降解性支持體的組合體，獲得間葉幹細胞-水凝膠-支持體的階段；及b在增殖培養基培養階段a中獲得的間葉幹細胞-水凝膠-支持體的階段，此增殖培養基是胎牛血清及堿性纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子β 1、血小薄片源生長因子、血管內皮生長因子、肝細胞生長因子及胰島素樣生長因子組成的組合中選擇的包括1種以上因子的培養基，水凝膠是從纖維蛋白膠、玻尿酸、明膠、膠原蛋白、藻酸、纖維素及果膠構成的組合中選擇的任一一種以上，可降解性支持體是從聚穀氨酸、聚乳酸、可吸收聚羥基乳酸網、人羊膜、牛羊膜、豬膠原蛋白、幾丁質、甲殼質、纖維黏連蛋白及葡聚糖組成的組合中選擇，不可降解性支持體是從滅菌無紡布纖維、聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜及單面軟矽塗層的聚氨酯組成的組合中選擇。

更具體，本發明涉及一種減輕或改善大皰性 表皮松解症的薄片制造方法，包括：(a1)把間葉幹細胞在增殖培養基中培養2代以上的階段；(a2)把培養的間葉幹細胞利用水凝膠貼附到(i)從降解性支持體及不可降解性支持體組成的組合中選擇的一種以上的支持體；或(ii)2種以上不可降解性支持體；或(iii)1種以上的降解性支持體及1種以上的不可降解性支持體的組合體，獲得間葉幹細胞-水凝膠-支持體的階段；及b在增殖培養基培養階段a中獲得的間葉幹細胞-水凝膠-支持體的階段，此增殖培養基是胎牛血清及堿性纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子β 1、血小薄片源生長因子、血管內皮生長因子、肝細胞生長因子及胰島素樣生長因子組成的組合中選擇的包括1種以上因子的培養基，水凝膠是從纖維蛋白膠、玻尿酸、明膠、膠原蛋白、藻酸、纖維素及果膠構成的組合中選擇的任一一種以上，可降解性支持體是從聚穀氨酸、聚乳酸、可吸收聚羥基乳酸網、人羊膜、牛羊膜、豬膠原蛋白、幾丁質、甲殼質、纖維黏連蛋白及葡聚糖組成的組合中選擇，不可降解性支持體是從滅菌無紡布纖維、聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜及單面軟矽塗層的聚氨酯組成的組合中選擇。

根據本發明一形態中，包含在上述增殖培養基的因子更具體是堿性纖維母細胞生長因子、表皮生長因子或它們的組合。

根據本發明一形態中，間葉幹細胞是相對 CD29,CD44,CD73,CD90及CD105顯陽性，相對CD34及CD45顯陰性的自我或同種來源細胞。

根據本發明一形態中，為制造減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片，包括：混合幹細胞與水凝膠在支持體1cm²中均勻塗層1,000~10,000個，在包含胎牛血清及堿性纖維母細胞生長因子或表皮生長因子組成的組合中選擇一個以上的培養基中培養，幹細胞增殖到支持體1cm²中為20,000個以上，更具體，增殖到20,000~400,000個的階段。

根據本發明一形態中，在上述階段c中還可包括另外采用物理刺激、低氧刺激、絲裂原刺激及炎症因子刺激如幹擾素γ組成的組合中選擇的一個以上的刺激激活細胞的階段c。尤其由大皰性表皮松解症引起的損傷組織因其血管破劣或功能低下造成供氧不暢通，存在慢性炎症，投入到損傷組織的幹細胞由低氧刺激及炎症因子刺激被激活，生長因子及細胞因子的分泌急劇增加。因此在支持體薄片制造階段處理低氧壓力、絲裂原及炎症因子，可制造分泌高濃度生長因子和細胞因子的包括高活性幹細胞的組成物、薄片。

根據本發明一形態，水凝膠可使用纖維蛋白膠、玻尿酸、明膠、膠原蛋白、藻酸、纖維素及果膠，但並不局限於此。把纖維蛋白膠用作水凝膠時，其特征在於，形成纖維蛋白膠的纖維蛋白原的濃度可以在0.5~60mg/mL，具體可以是0.5~45mg/mL，更具體可以是 0.5~30mg/mL，還更具體可在0.5~20mg/mL，再具體可以是0.5~10mg/mL，還再具體可以是0.5~10mg/mL，可包括凝血酶其濃度在1~50I.U./mL，具體在1~30I.U./mL，更具體在5~20I.U./mL之間。

根據本發明一形態，只采用水凝膠也可制造幹細胞-水凝膠薄片。但是水凝膠硬度低受機械/物理力量很容易撕裂，薄片大小受限制，使用時還需要謹慎。相反，根據本發明，把幹細胞-水凝膠貼附到可降解性或不可降解性支持體上，支持體可提高幹細胞-水凝膠的強度，容易操作。

根據本發明一形態，可降解性支持體可使用從聚穀氨酸、聚乳酸、可吸收聚羥基乳酸網、人羊膜、牛羊膜及豬膠原蛋白、幾丁質、甲殼質、纖維黏連蛋白及葡聚糖組成的組合中選擇一種或2種以上組合，不可降解性支持體可使用從滅菌無紡布纖維、聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜及單面軟矽塗層的聚氨酯、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜組成的組合中選擇一種或2種以上組合，但並不局限於此。

本發明一形態中，可使用2種以上不可降解性支持體的組合，但並不局限於此。

本發明一形態中，可使用1種以上可降解性支持體及不可降解性支持體的組合體為支持體，例如，可用作聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜或單面軟矽塗層的聚氨酯、聚乳酸/無紡布纖維或聚穀氨酸/聚乳酸/無紡布纖維的 形態，但並不局限於此。

本發明一形態中，在上述階段b中，可另外包括把的間葉幹細胞-水凝膠-支持體放在包含1~20w/v%二甲基亞碸及1~80w/v%人血清蛋白的凍結保管劑冷凍保管的階段d，在此冷凍保管後解凍時，間葉幹細胞存活率超過70%以上為特征。

根據本發明一形態中，本發明間葉幹細胞-水凝膠-支持體組成物在冷凍保管後解凍時，經過一周、一個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月後間葉幹細胞存活率超過70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上更具體經過12個月後可顯示超過90%以上，95%以上的存活率。

根據本發明另一形態中，提供一種減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物，包括：間葉幹細胞及水凝膠；從降解性支持體及不可降解性支持體組成的組合中選擇的一種以上的支持體，或1種以上的降解性支持體不可降解性支持體的組合體。

本發明一形態中，水凝膠可從纖維蛋白膠、玻尿酸、明膠、膠原蛋白、藻酸、纖維素及果膠組成的組合中選擇一個以上的，但並不局限於此。把纖維蛋白膠用作水凝膠時，其特征在於，形成纖維蛋白膠的纖維蛋白原的濃度可以在0.5~60mg/mL，具體可以是0.5~45mg/mL，更具體可以是0.5~30mg/mL，還更具體可在0.5~20mg/mL，再 具體可以是0.5~10mg/mL，還再具體可以是0.5~10mg/mL，可包括凝血酶其濃度在1~50I.U./mL，具體在1~30I.U./mL，更具體在5~20I.U./mL之間。

本發明一形態中，降解性支持體是從聚穀氨酸、聚乳酸、可吸收聚羥基乳酸網、人羊膜、牛羊膜、豬膠原蛋白、幾丁質、甲殼質、纖維黏連蛋白及葡聚糖組成的組合中選擇1種或2種以上組合使用，不可降解性支持體是從滅菌無紡布纖維、聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜及單面軟矽塗層的聚氨酯組成的組合中選擇1種或2種以上組合使用，但並不局限於此。

在本發明一形態中，可使用2種以上不可降解性支持體的組合，但並不局限於此。

本發明一形態中，可使用1種以上可降解性支持體或不可降解性支持體的組合體為支持體，例如，可用作聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜或單面軟矽塗層的聚氨酯、聚乳酸/無紡布纖維或聚穀氨酸/聚乳酸/無紡布纖維的形態，但並不局限於此。

根據本發明另一形態中，提供減輕或改善大皰性性表皮松解症的薄片，包括上述組成物為有效成分。

根據本發明一形態中，大皰性表皮松解症可從大皰性表皮松解、水泡性極細胞分離、水泡性極細胞症、後天性水皰性表皮剝離症、遺傳性水皰性表皮剝離症、致死性水皰性表皮剝離症、延遲性遺傳性表皮剝離症、增殖 性水皰性表皮剝離症、角質溶解症、局限性水皰性表皮剝離症、非疤痕性水皰性表皮剝離症、束形理想性水泡性表皮剝離症、疤痕性表皮剝離症、單純表皮水皰症、韋伯-凱恩病、Dowling-Meara綜合症、果耳德篩德氏病、多種發育異常性大皰性表皮松解症、Heinrichsbauer綜合症、赫利茨綜合征及科布內氏病組成的組合中選擇。

本發明一形態中，上述間葉幹細胞可以是從脂肪、骨髓或臍帶血分離的。

本發明一形態中更詳細的上述方法，包括：(a1)把間葉幹細胞在包含胎牛血清、生長因子中的堿性纖維母細胞生長因子或表皮生長因子的增殖培養基中培養代以上的階段；(a2)把培養的間葉幹細胞利用水凝膠貼附到可降解性或不可降解性支持體或其組合體的階段；(b)把上述階段a2的間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體在包含胎牛血清、生長因子中的堿性纖維母細胞生長因子或表皮生長因子的培養基中培養約5天左右制造薄片的階段；(c)在上述階段b的培養時另外采用物理刺激、低氧刺激、絲裂原刺激及炎症因子刺激，激活細胞的階段；(d)在上述階段b或階段c的間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片中去除胎牛血清和生長因子中的堿性纖維母細胞生長因子或表皮生長因子的培養基中洗滌的階段； (e)(b)的間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片放在以10%二甲基亞碸及5%人血清蛋白構成的凍結保管劑冷凍保管的階段；(f)把凍結保管的間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片解凍，用生理鹽水洗滌去除凍結保管劑的階段；及(g)根據大皰性表皮松解症患者患處需要薄片的患處大小剪下並貼敷在對象部位的階段，還可額外包括(h)把上述薄片用另一種薄片覆蓋的階段。

上述方法詳細說明如下。

在階段a1中，可使用從人脂肪組織分離的間葉幹細胞，此時從人脂肪組織分離間葉幹細胞培養2代以上是根據現有技術(韓國注冊專利1,328,604)的，使用增殖培養基培養細胞，可在短時間內有效收集大量間葉幹細胞。根據現有技術培養2代以上的人脂肪來源間葉幹細胞貼附到塑料培養容器中保持纖維芽細胞形態，相對CD10,CD13,CD29,CD44,CD59,CD71,CD90,CD105及Oct4顯陽性，相對CD34,CD45,CD104,CD106及Stro-1顯陰性。並且，作為幹細胞具有在體外分化成脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、神精細胞的能力。並且分泌多種生長因子如血管內皮生長因子、肝細胞生長因子、轉化生長因子β 1、神經生長因子、胰島素樣生長因子等多種生長因子，具有免疫調節能力，用作多種疾病的治療技術正在 開發中。

在上述a2階段，在a1)中培養2代以上的脂肪來源間葉幹細胞經胰蛋白酶或分散酶處理形成單一細胞，在水凝膠懸浮後在可降解性或不可降解性支持體纖維上約5,000個/cm²的濃度均勻噴灑貼附。此後利用包括10%胎牛血清及表皮生長因子或堿性纖維母細胞生長因子的增殖培養基培養3~7天。本發明實施例中實用的水凝膠是纖維蛋白凝膠，但並不局限於此，此外還可包括膠原蛋白、玻尿酸、明膠、藻酸、纖維素、果膠。

並且本發明實施例中使用的可降解性支持體使用了可吸收聚羥基乳酸網或牛羊膜，不可降解性支持體使用了滅菌紗布、聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜、單面軟矽塗層的聚氨酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜，但此亦並不局限於此，也可使用聚穀氨酸/無紡布纖維、聚穀氨酸/聚乳酸/無紡布纖維、人羊膜、膠原蛋白膜等。

本發明中的水凝膠首先進行在可降解性或不可降解性支持體纖維或聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜及單面軟矽塗層的聚氨酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜上貼附間葉幹細胞的功能，再次向貼附性細胞的間葉幹細胞上提供基質，提供細胞貼附到基質可穩定生存的環境。並且，水凝膠包含無數個3維網目結構，包含在培養基中的胎牛血清、堿性纖維母細胞生長因子及表皮生長因子通過網目結構作用到細胞上，提供可增殖的環境。水凝膠根據制造濃度網目結構大小、硬度、分 解速度不同，對細胞形態及增殖速度發揮很大的影響。在本發明實施例中最終使用了0.5-10mg/mL濃度的纖維蛋白凝膠，提高了間葉幹細胞的增殖速度並與此相反可維持適當的凝膠硬度。

在上述階段b中，間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片上間葉幹細胞快速增殖，在3~7日間增加4倍以上，每cm 2可包含20,000個以上細胞。

在本發明中，在水凝膠中增殖的細胞表達脂肪來源幹細胞的特征CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，可分泌包括血管內皮生長因子、肝細胞生長因子的多種生長因子。並且還具有免疫細胞分泌的腫瘤壞死因子-α和幹擾素-γ等代表性炎症因子的抑制能力。即，在水凝膠中培養的細胞以具有間葉幹細胞特性為特征。

並且，在上述階段b中可混用低氧刺激、絲裂原刺激及炎症因子刺激。由大皰性表皮松解症引起的損傷組織因其血管破劣或功能低下造成供氧不暢通，存在慢性炎症，投入到損傷組織的幹細胞由低氧刺激及炎症因子刺激被激活，生長因子及細胞因子的分泌急劇增加。

如前所述，本發明提供包含高活性幹細胞的薄片制造方法，在脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片制造階段中處理低氧壓力、絲裂原及炎症因子，分泌高濃度生長因子和細胞因子。

並且，根據本發明制造的脂肪來源間葉幹細 胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片，不經過蛋白酶分離過程，直接適用在大皰性表皮松解症患者的患處，治療能力卓越。並且，在培養階段間葉幹細胞分泌的細胞外基質如膠原蛋白、層黏連蛋白、纖維黏連蛋白、彈性蛋白等完整地罩在水凝膠中存在，可增進大皰性表皮松解症的減輕或發病效果。

如前所述，在上述本發明a2階段，只采用水凝膠也可制造幹細胞-水凝膠薄片。但是水凝膠硬度低受機械/物理力量很容易撕裂，薄片大小受限制，使用時還需要謹慎。相反，根據本發明，把幹細胞-水凝膠貼附到可降解性或不可降解性支持體上，支持體可提高幹細胞-水凝膠的強度，容易操作。並且薄片可制造成0.1~2mm厚，以防貼敷患處時薄片被撕裂，薄片內也可包含充分的細胞數，查明了可提高治療效果。

本發明d階段脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片用生理鹽水洗滌2~3次去除動物來源成分胎牛血清，為了完全去除，可在無血清DMEM培養基洗滌。通過上述過程去除胎牛血清，把薄片貼敷到人體時因動物來源成分引發的副作用減少為最低。

本發明還包括凍結保管間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片的方法。冷凍袋中加入由10%二甲基亞碸和5%人血清蛋白溶液構成的凍結保管劑沿沒到薄片，密封後可在-80℃保管。一般蛋白酶處理單離的細胞、人工皮膚(表皮細胞或真皮細胞或由兩種細胞 構成的人工皮膚)在-80℃凍結保管時，會導致細胞損傷，已知適用在患處時治療效果減少。(Tissue eng 4(4)：1403~414,1988).

但是根據本發明制造的間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片，水凝膠包裹幹細胞，可從外界沖擊及壓力中保護細胞，在-80℃也可無細胞損傷地長期保管。

根據本發明一實施形態，用在增進減輕或改善大皰性表皮松解症有效量的種以上生長因子、細胞因子、激素或細胞外矩陣化合物或蛋白質與本發明組成物一起下方，具體可舉例顆粒細胞集落刺激因子、白介素-6、白介素-8、白介素-10、單核細胞趨化蛋白1、單核細胞趨化蛋白2、組織因子、堿性纖維母細胞生長因子、角質化細胞生長因子、血管內皮生長因子、胎盤生長因子、基質金屬蛋白酶1、基質金屬蛋白酶9、金屬蛋白酶組織抑制因子1、金屬蛋白酶組織抑制因子2、轉化生長因子β 1、肝細胞生長因子等，但並不局限於此。

[發明實施形態]

以下，通過實施例更詳細說明本發明。但，此實施例只是本發明的示例，本發明的範圍並不局限於此。

實施例1：人脂肪來源間葉幹細胞的培養方法

脂肪組織多為通過吸脂術獲得，但並不限於此。從吸脂獲得的脂肪組織分離脂肪來源間葉幹細胞如下。為了去 除血液，洗滌脂肪後加入等同體積的膠原酶溶液在37℃水域進行反應。離心分離後，除去上澄液脂肪層，小心分離下層膠原酶溶液，不要晃動，加入基質培養基懸浮後，在20℃，1500rpm中進行離心分離5分鍾。此時，下沉的是基質-血管分劃，除去了上澄液。把基質-血管分劃懸浮在基質培養基中接種在培養容器中，在37℃,5% CO²細菌培養器培養24小時。

去除培養液後用磷酸鹽緩沖溶液洗滌，基質培養基或基質培養基中包含1ng/mL濃度堿性纖維芽細胞生長因子的增殖培養基，或基質培養基中包含5ng/mL濃度表皮細胞生長因子的培養基增殖。當脂肪來源間葉幹細胞成長到培養容器的80~90%左右，進行胰蛋白酶處理，分離單一細胞後收集。

實施例2：利用水凝膠決定纖維蛋白膠的濃度

凍結幹澡的凝血酶加入1mL氯化鈣溶液，形成400~600I.U.。或解凍凍結的凝血酶調節到同一濃度後再使用。凍結幹燥的纖維蛋白原中加入1mL抗蛋白酶肽溶液或解凍凍結的纖維蛋白原後準備原液，分級稀釋成1：5、1：10、1：20、1：40。收集上述實施例1中培養2代以上的細胞懸浮後，以40~50：1的比率(v/v)混合胰蛋白酶，與分級稀釋的纖維蛋白原1：1混合形成纖維蛋白凝膠。當凝膠完全凝固，加入包含10%胎牛血清和1ng/mL堿性纖維母細胞生長因子的培養基後在37℃，5%CO²細菌培養器培養 5天。收集培養第2天和第5天的細胞-纖維蛋白凝膠混合物薄薄地作成切片，利用10μg/mL吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色，利用熒光顯微鏡測定細胞形態和存活率。並且培養第5天加入WST-1後測定細胞增殖程度。

第1a圖是圖示原液或稀釋的纖維蛋白原溶液制作的纖維蛋白凝膠中幹細胞的形態和數量的顯微鏡照片。用纖維蛋白原溶液制作的纖維蛋白凝膠中，一直到第5天，大部分細胞縱球形細胞狀態，幾乎沒有增殖。相反，隨著稀釋倍數增加，細胞快速形成纖維芽細胞狀態，增殖也更多。利用原液纖維蛋白原制作的纖維蛋白凝膠中觀察到一些死細胞，但在利用稀釋的纖維蛋白原溶液制作的纖維蛋白凝膠中沒有觀察到死細胞。即，可知高濃度纖維蛋白凝膠對脂肪來源間葉幹細胞具有細微的細胞毒性，但稀釋1：5~1：40濃度的纖維蛋白凝膠不具有細胞毒性。

第1b圖是圖示利用WST-1定量測定根據纖維蛋白凝膠的幹細胞增殖能力的圖表，隨著稀釋倍數增加，吸光度也增加。即，可知把纖維蛋白原稀釋20~40倍制作的纖維蛋白凝膠中幹細胞最容易增殖。

實施例3：制作人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片

收集上述實施例1中培養2代以上的間葉幹細胞用增殖培養基懸浮。根據上述實施例2的結果，細胞懸浮液中加入凝血酶，最終達到8~15I.U.。

支持體，約5x5cm大小四角形狀可降解性支持體的可吸收聚羥基乳酸網、人羊膜或不可降解性支持體的紗布、單面軟矽塗層的聚氨酯及聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜上均勻塗布約3~6.5mg/mL濃度的纖維蛋白原。其後把包含凝血酶的細胞懸浮液塗布到支持體上約5,000個/cm²。纖維蛋白凝膠完全凝固後加入增殖培養基，在37℃,5% CO²細菌培養器培養3~7天。

第2a圖是圖示反人脂肪來源間葉幹細胞與纖維蛋白水凝膠混合貼附到不可降解性支持體的單面單面軟矽塗層的聚氨酯及聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜上後培養制作的薄片經AO/EtBr染色後利用熒光顯微鏡觀察的照片。第2b圖是圖示把在-80℃凍結保管的薄片解凍後用顯微鏡或經AO/EtBr染色後利用熒光顯微鏡觀察的照片。如第2b圖所示，凍結保管後解凍後也觀察到與凍結前類似的纖維芽細胞形態細胞由水凝膠貼附到支持體增殖。薄片上均等分布了約20,000~400,000個/cm²的細胞，存活率100%。

實施例4：人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片的冷凍保管

上述實施例3中制造的人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片洗滌後除去細胞培養液，放入存有凍結保管劑(10%二甲基亞碸和人血清蛋白溶液)的冷凍袋中，在-80℃凍結保管。經過約1個月、3 個月、6個月、9個月、12個月後依期提出上述冷凍袋，泡在37℃恒溫水槽中搖晃，融化凍結保管劑並倒掉。加入生理鹽水後上下搖晃再倒掉。完全去除凍結保管劑後用AO/EtBr染色後測量存活率。

其結果如第3b圖所示，根據上述發明制造的薄片中，脂肪來源間葉幹細胞一直到12個月存活了95%以上。

即顯示，根據本發明制造的人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片，在不損傷主要有效成分細胞的情況下，可在-80℃長期冷凍保管。

實施例5：人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體分泌生長因子

把實施例3的人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片或把實施例4中凍結保管的薄片解凍後用磷酸鹽緩沖液洗滌並切成0.8x0.8cm，在24孔培養板各放2張，加入了1mLDMEM。在37℃，5%CO²細菌培養器培養72小時後收集上澄液，采用酶聯免疫吸附劑測定法測量間葉幹細胞分泌的血管內皮生長因子和肝細胞生長因子等主要生長因子。其結果如第4a圖所示，上述薄片分泌了肝細胞生長因子及血管內皮生長因子。

另一實施例，把上述收集上澄液利用與血管形成有關的細胞因子方陣試劑盒分析。其結果如圖4所 示，上述試劑盒大量分泌了促進血管形成的肝細胞生長因子及血管內皮生長因子在內的生長因子及Serprin E1(PAI-1)和F1(PDEF)、基質金屬蛋白酶抑制劑-1、白介素-8、纖維生長因子-2、二肽酶IV等多種細胞因子。即，可知根據本發明制造的，利用水凝膠及可降解性或不可降解性支持體培養的間葉幹細胞敷在患處時，持續分泌促進細胞增殖及血管形成的多種生長因子和細胞因子，激活周邊組織細胞，可有效減輕或改善大皰性表皮松解症。

實施例6：同種人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體的免疫調節功能

把實施例3的人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片或實施例4的凍結保管的薄片解凍後切成一定大小，在24孔培養板各放1張。然後不同人白細胞抗原的捐獻者的末梢血單核細胞5x10，5個加入到24孔培養板中。陽性對照群末梢血單核細胞中加入了一種促細胞分裂劑，植物血球凝集素，引發末梢血單核細胞的免疫反應。開始反應後第3天收集上澄液，采用酶聯免疫吸附測定法測定腫瘤壞死因子-α分泌量。

第5a圖是表示同種人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體的免疫反應引導能力的圖片，如在此顯示，陽性對照群的末梢血單核細胞由聚羥基脂肪酸酯激活，相反，根據上述實施例3或4制造的同種人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降 解性支持體的反應中幾乎不分泌腫瘤壞死因子-α。即，已確認同種人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體不引發免疫反應。

另一實驗例，把末梢血單核細胞5x10，5個加入到24孔培養板中利用聚羥基脂肪酸酯激活，引發免疫反應，把根據上述實施例3或4制造的是表示同種人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片切成適當大小，在培養板中各放1張。收集反應第3天的上澄液測定腫瘤壞死因子-α分泌量。

其結果如第5b圖所示，被聚羥基脂肪酸酯激活的末梢血單核細胞中，同種人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片減少了60%以上的腫瘤壞死因子-α分泌量。即，同種人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體薄片不引必免疫反映，並且在發生過多免疫反應時，起顯著降低免疫細胞大量分泌並增加免疫反應的腫瘤壞死因子-α的分泌量。因此，把脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體薄片敷到大皰性表皮松解症患處時可減輕持續發作的炎症因而促進再表皮化。

實施例7：人脂肪來源間葉幹細胞的細胞外基質分泌功能

在上述實施例1中收集的細胞中提取蛋白質，采用蛋白質印跡法測量大皰性表皮松解症起因蛋白質膠原蛋白類型VII和層黏連蛋白-5的表達量，與纖維芽細胞中的表達 量相比較。並且，采用酶聯免疫吸附劑測定技法測定了成為本發明制造薄片材料的人脂肪來源間葉幹細胞的表達量和分泌量。

第6a圖圖示本發明制造薄片材料人脂肪來源間葉幹細胞膠原蛋白類型VII和層黏連蛋白-5的表達量高於纖維芽細胞。第6b圖是圖示人脂肪來源間葉幹細胞的膠原蛋白類型VII表達量和層黏連蛋白-5的分泌量定量分析的結果。

另一實施例中，在上述把實施例1中制造的脂肪來源間葉幹細胞固定後加入包含膠原蛋白類型VII或膠原蛋白類型I特異抗體的磷酸鹽緩沖液後，在37℃反應1個小時後洗滌封片後用熒光顯微鏡觀察。

第6c圖是顯示脂肪來源間葉幹細胞的細胞外基質蛋白質分泌功能的照片(x 400)，如圖所示，根據發明制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體，大體上相對膠原蛋白類型VII或膠原蛋白類型I顯示陽性反應。

實施例8：人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體的細胞外基質的分泌及表達評價

在上述實施例3或4中制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體在不加胎牛血清的DMEM中培養3天後收集培養液，采用酶聯免疫吸附劑測定法測定細胞外基質的分泌功能及表達量。

其結果如第7a圖所示，根據本發明脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體分泌了膠原蛋白類型VII及膠原蛋白類型I。

另一實施例，制作上述實施例3或4制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體的凍結切片固定，加入細胞外基質特異抗體後，在37℃反應1個小時後洗滌封片後用熒光顯微鏡觀察。

其結果如第7b圖所示，根據本發明制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體相對膠原蛋白類型VII、膠原蛋白類型I、膠原蛋白類型V、層黏連蛋白-5、纖維黏連蛋白及層黏連蛋白顯示陽性反應。即，根據構成本發明制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體細胞大量分泌多種細胞外基質蛋白質，並且分泌的細胞外基質蛋白質停留在水凝膠內，當移植到體內時可提供多種基質，得到減輕或改善大皰性表皮松解症的效果。

實施例9：人脂肪來源間葉幹細胞和人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體的膠原蛋白類型VII的表達

第8圖是圖示根據現有培養法單層培養的人脂肪來源間葉幹細胞和薄片內脂肪來源間葉幹細胞的細胞外基質蛋白質的分泌功能的結果，根據本發明制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體與現有單層 培養的細胞相比，分泌更多膠原蛋白類型VII達6.8倍。

以上結果顯示，把脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體貼敷到大皰性表皮松解症患者的患處，脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體向皮膚損傷部位供給多種細胞外基質蛋白質，促進組織再生及再表皮化。

實施例10：由堿性物質造成的人脂肪來源間葉幹細胞的膠原蛋白類型VII的表達評價

在上述實施例1中收集的細胞在12孔培養板上加5,500/cm²，經24小時後加轉化生長因子β 2和腫瘤壞死因子-α後繼續培養48小時。收集細胞後提取核糖核酸，采用逆轉錄聚合酶鏈反應技術測量膠原蛋白類型VII的表達量並比較表達變化。

結果如第9圖所示，薄片主成分脂肪來源間葉幹細胞中處理轉化生長因子β 2和腫瘤壞死因子-α時膠原蛋白類型VII的表達增加了8倍。以上結果表明，把根據本發明制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體貼簿到大皰性表皮松解症患者患處時，因慢性皮膚損傷部位存在的堿性物質，脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體的膠原蛋白類型VII的表達量增加，可促進組織再生及再表皮化。

實施例11：人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不 可降解性支持體對缺乏膠原蛋白類型VII的纖維芽細胞形態、黏附性、遷移性的恢複效果

為了評價在上述實施例4中制造的人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體能否恢複缺乏膠原蛋白類型VII細胞的功能，纖維芽細胞經小幹擾RNA處理誘發膠原蛋白類型VII的缺乏。

如第10圖所示，膠原蛋白類型VII缺乏纖維芽細胞接種在培養基中，經過24小時也不能黏附在培養基底面，依舊維持球狀。但經脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體72小時培養上澄液(conditioned media；CM)處理後，膠原蛋白類型VII的缺乏細胞類似正常細胞，黏附在培養基底面並恢複了紡錘狀。

又一實施例，把纖維芽細胞黏附在培養基底並培養後經小幹擾RNA處理誘發了膠原蛋白類型VII的缺乏。在培養細胞中央劃痕制作劃痕模型評價向劃痕部位的遷移性，與正常纖維芽細胞相比，膠原蛋白類型VII缺乏細胞的遷移性減少。在此經脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體CM處理後，其結果如第11圖所示，促進了膠原蛋白類型VII缺乏細胞的遷移。

由以上結果可知，脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體恢複膠原蛋白類型VII缺乏細胞的功能，可有效恢複皮膚組織。

實施例12：人脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不 可降解性支持體治療大皰性表皮松解症實例

為了評價上述實施例4中制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體治療效果，針對大皰性表皮松解症患者進行臨床實驗。

此患者24歲，女性，診斷出大皰性表皮松解症，但因沒有其他治療方法，病情持續複發引起炎症，病情沒有進展。把上述實施例4中制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體貼簿到患者的患處，每隔一個星期用觀察照片評價了患處治療效果。

第10圖是顯示貼簿脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體後患處面積的圖表，根據本發明制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體貼簿後，隨著時間的推移患處面積減少，貼簿4周後與貼簿前相比，顯示減少64.4%的效果。

即，由此可知，根據本發明制造的脂肪來源間葉幹細胞-水凝膠-可降解性或不可降解性支持體，大量分泌多種種類的細胞外基質，分泌的細胞外基質存留在水凝膠內，當移植到體內時可提供多種基質，達到減輕或改善大皰性表皮松解症的效果。

[產業利用可能性]

本發明包括間葉幹細胞-水凝膠-可降解性支持體或不可降解性支持體的減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物或薄片，尤其增加膠原蛋白類型VII或層黏連蛋白-5的表達，使用在大皰性表皮松解症患處時具有臨床可 發揮有意義效果的優點，因此可有效使用在減輕或改善大皰性表皮松解症患者的症狀。

Claims (20)

1. 一種減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，包括：a把間葉幹細胞利用水凝膠貼附到，(i)從降解性支持體及不可降解性支持體組成的組合中選擇的一種以上的支持體；或(ii)2種以上不可降解性支持體；或(iii)1種以上的降解性支持體及1種以上的不可降解性支持體的組合體，獲得間葉幹細胞-水凝膠-支持體的階段；及b在增殖培養基培養階段a中獲得的間葉幹細胞-水凝膠-支持體的階段，此增殖培養基是胎牛血清及堿性纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子β 1、血小薄片源生長因子、血管內皮生長因子、肝細胞生長因子及胰島素樣生長因子組成的組合中選擇的包括1種以上因子的培養基，水凝膠是從纖維蛋白膠、玻尿酸、明膠、膠原蛋白、藻酸、纖維素及果膠構成的組合中選擇的任一一種以上，可降解性支持體是從聚穀氨酸、聚乳酸、可吸收聚羥基乳酸網、人羊膜、牛羊膜、豬膠原蛋白、幾丁質、甲殼質、纖維黏連蛋白及葡聚糖組成的組合中選擇，不可降解性支持體是從滅菌無紡布纖維、聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜及單面軟矽塗層的聚氨酯組成的組合中選擇。
2. 如申請專利範圍第1項的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，薄片包含膠原蛋白類型VII或層黏 連蛋白-5。
3. 如申請專利範圍第1項的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，纖維蛋白膠包含0.5~45mg/mL濃度的纖維蛋白原。
4. 如申請專利範圍第1項的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，纖維蛋白膠包含0.5~10mg/mL濃度的纖維蛋白原。
5. 如申請專利範圍第1項的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，還包括階段c，在上述階段b中，額外執行物理刺激、低氧刺激、絲裂原刺激及炎症因子刺激組成的組合中選擇一種以上刺激激活細胞。
6. 如申請專利範圍第1項的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，包括階段d，在上述階段b中，間葉幹細胞-水凝膠-支持體放到含1~20w/v%二甲基亞碸及1~80w/v%人血清蛋白的凍結保管劑中冷凍保管的階段，在此，冷凍保管後解凍時，間葉幹細胞存活率是90%以上。
7. 如申請專利範圍第1項的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，冷凍保管12個月以上後解凍時，間葉幹細胞存活率是90%以上。
8. 如申請專利範圍第1項的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，階段a中，水凝膠間葉幹細胞。
9. 如申請專利範圍第1項的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，階段b中，水凝膠支持體1cm ² 中增殖20,000~400,000個間葉幹細胞。
10. 如申請專利範圍第1項的減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，上述大皰性表皮松解症是從大皰性表皮松解、水泡性極細胞分離、水泡性極細胞症、後天性水皰性表皮剝離症、遺傳性水皰性表皮剝離症、致死性水皰性表皮剝離症、延遲性遺傳性表皮剝離症、增殖性水皰性表皮剝離症、角質溶解症、局限性水皰性表皮剝離症、非疤痕性水皰性表皮剝離症、束形理想性水泡性表皮剝離症、疤痕性表皮剝離症、單純表皮水皰症、韋伯-凱恩病、Dowling-Meara綜合症、果耳德篩德氏病、多種發育異常性大皰性表皮松解症、Heinrichsbauer綜合症、赫利茨綜合征及科布內氏病組成的組合中選擇。
11. 如申請專利範圍第1項至10項的任一一項減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片制造方法，間葉幹細胞是從脂肪、骨髓、皮膚、血管、肌肉、腦、血液、胎盤、齒髓及臍帶血組成的組合中選擇的某一種分離的。
12. 一種減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物，包括：間葉幹細胞及水凝膠；可降解性支持體及不可降解性支持體組成的組合中選擇的一種以上的支持體；2種以上不可降解性支持體；或1種以上可降解性支持體及不可降解性支持體的組合體， 在此水凝膠是從纖維蛋白膠、玻尿酸、明膠、膠原蛋白、藻酸、纖維素及果膠組成的組合中選擇，可降解性支持體是從聚穀氨酸、聚乳酸、可吸收聚羥基乳酸網、人羊膜、牛羊膜、豬膠原蛋白、幾丁質、甲殼質、纖維黏連蛋白及葡聚糖組成的組合中選擇，不可降解性支持體是從滅菌無紡布纖維、聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜、聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚氨酯薄膜、網狀聚氨酯薄膜及單面軟矽塗層的聚氨酯組成的組合中選擇。
13. 如申請專利範圍第12項的減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物，組成物包含膠原蛋白類型VII或層黏連蛋白-5。
14. 如申請專利範圍第12項的減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物，纖維蛋白膠包含0.5~45mg/mL濃度的纖維蛋白原。
15. 如申請專利範圍第12項的減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物，纖維蛋白膠包含0.5~10mg/mL濃度的纖維蛋白原。
16. 如申請專利範圍第12項的減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物，水凝膠支持體1cm ²中包含20,000~400,000個間葉幹細胞。
17. 如申請專利範圍第12項的減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物，上述大皰性表皮松解症是從大皰性表皮松解、水泡性極細胞分離、水泡性極細胞症、後天性水皰性表皮剝離症、遺傳性水皰性表皮剝離症、致死性水 皰性表皮剝離症、延遲性遺傳性表皮剝離症、增殖性水皰性表皮剝離症、角質溶解症、局限性水皰性表皮剝離症、非疤痕性水皰性表皮剝離症、束形理想性水泡性表皮剝離症、疤痕性表皮剝離症、單純表皮水皰症、韋伯-凱恩病、Dowling-Meara綜合症、果耳德篩德氏病、多種發育異常性大皰性表皮松解症、Heinrichsbauer綜合症、赫利茨綜合征及科布內氏病組成的組合中選擇。
18. 如申請專利範圍第12項的減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物，冷凍保管12個月以上後解凍時，間葉幹細胞存活率是90%以上。
19. 如申請專利範圍第12項到第18項的任一一項減輕或改善大皰性表皮松解症的組成物，間葉幹細胞是從脂肪、骨髓、皮膚、血管、肌肉、腦、血液、胎盤、齒髓及臍帶血組成的組合中選擇的某一種分離的。
20. 一種減輕或改善大皰性表皮松解症的薄片，包括權利要求12至18的任一一項組成物為有效成分。