JPH11343243A

JPH11343243A - 皮膚再形成剤

Info

Publication number: JPH11343243A
Application number: JP10149730A
Authority: JP
Inventors: Akihisa Sugiyama; 章寿杉山; Nobutaka Yamamoto; 宣貴山本; Kyoko Hamano; 京子濱野
Original assignee: Menicon Co Ltd
Current assignee: Menicon Co Ltd
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 1999-12-14

Abstract

(57)【要約】【課題】製造容易で、かつ、使用しやすい皮膚再形成用
物を提供する。【解決手段】流動性媒体あるいは塑性媒体中に、表皮細
胞及び／又は線維芽細胞を分散して含有させて、皮膚再
形成剤とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、創傷面等に適用す
る皮膚再形成材に関するものである。さらに詳しくは、
本発明は、創傷、褥瘡、熱傷、皮膚潰瘍等による皮膚欠
損部位に適用され、かかる部位を保護し、肉芽形成・表
皮再生や治癒を促進することのできる皮膚再形成剤に関
する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、創傷や熱傷等による皮膚欠損
部位に対して適用する被覆材がいくつか知られている。
このような被覆材としては、表皮細胞をシート状の担体
に組み込んで培養させたりあるいは表皮細胞をシート状
に培養したりして形成される被覆材や、シート状のゲル
に細胞を組み込んだ状態で培養したゲル成形体の被覆材
がある。

【０００３】シート状の被覆材の一つである、コラーゲ
ンスポンジシートに細胞を組み込んで培養した被覆材で
は、コラーゲンのスポンジをシート状に成形する工程が
必ず必要である。また、コラーゲンは高価である。表皮
細胞自体をシート状に培養した被覆材は、単離した表皮
細胞を培養フラスコ中で培養することによりシート状に
形成し、その後、酵素処理によって細胞基底層を培養フ
ラスコから剥離することにより培養フラスコから分離さ
れる。通常、皮膚欠損部位への適用前には、シート形態
を維持するために剥離後すぐにガーゼ、豚皮又はコラー
ゲン膜等で支持された状態とする。そして、この基底細
胞層側を皮膚欠損部位に適用して使用される。ゲル成形
体の被覆材の一つとして、コラーゲンゲルに線維芽細胞
を組み込んで培養して得た被覆材がある。この被覆材を
得る工程において、コラーゲンゲル成形体は極度に収縮
する。したがって、広範な皮膚欠損部位を被覆可能な大
きさのゲルを得るには大きな困難が伴う。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来のこのような被覆
材においては、皮膚欠損部位に適用するために、いずれ
もシート状の形態を備えていた。また、かかる形態を保
有するが故に、形態を形成し、維持することの困難さが
製造工程に常に存在し、さらには皮膚欠損部位への表皮
細胞や線維芽細胞の生着不良、さらには、皮膚欠損部位
の発生部位や発生領域によっては使用性が非常に悪い、
という問題があった。そこで、本発明の目的は、これら
の従来の課題を解決できる、皮膚再形成剤及び皮膚再形
成方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、無形の媒
体である流動性媒体あるいは塑性媒体を用いて、表皮細
胞等を皮膚欠損部位に適用することにより、上記した課
題を解決できることを見いだし、本発明を完成した。

【０００６】第１の発明は、流動性媒体あるいは塑性媒
体中に、表皮細胞及び／又は線維芽細胞を含有する皮膚
再形成剤を提供するものである。無形の媒体である流動
性媒体や塑性媒体を用いるため、皮膚欠損部位の発生場
所や発生領域に係わらず容易に適用される。また、表皮
細胞及び／又は線維芽細胞は、無形媒体中に分散されて
いるので細胞の各種活性が保持されており、生着率が向
上される。また、皮膚再形成剤の製造過程においては、
表皮細胞をシート化する成形工程が排除され、また、線
維芽細胞を組み込むシート状の基材の成形工程も排除さ
れる。

【０００７】本発明において、流動性媒体とは、流動性
を有し、一定の形を持たず外力を除いては一定の形を保
持できない、無形の媒体をいう。本発明において、塑性
媒体とは、実質的に流動性を保有せず、一定の形を持た
ないが外力を除いても外力によって付与された一定の形
を保持可能な無形の媒体をいう。ここで、一定の形を保
持可能とは、外力を除いた後の一定期間そのような形を
保持可能であればよい。すなわち、外力を除いて、ごく
わずかの時間付与された形を保持して、その後、変形す
るような媒体であってもよい。

【０００８】第２の発明は、流動性媒体あるいは塑性媒
体中に、表皮細胞を含有する皮膚再形成剤を提供するも
のである。第３の発明は、流動性媒体に表皮細胞及び／
又は線維芽細胞を含有する皮膚再形成剤を提供するもの
である。

【０００９】これらの皮膚再形成剤中には、細胞外基質
を含有することが好ましい。細胞外基質の存在により、
媒体を皮膚欠損部位に保持しやすく皮膚欠損部位が良好
に被覆される。また、皮膚欠損部位の皮膚再生や治癒が
促進される。

【００１０】細胞外基質として、コラーゲン、ゼラチ
ン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、あるいは、こ
れらのうちから選ばれる２種類以上を含むことが好まし
い形態である。

【００１１】第４の発明は、流動性媒体あるいは塑性媒
体中に非ヒト哺乳動物の表皮細胞及び／又は線維芽細胞
を含有する皮膚再形成剤を、皮膚欠損部位に適用する皮
膚再形成方法を提供するものである。この方法による
と、無形の媒体である流動性媒体や塑性媒体を用いるた
め、皮膚欠損部位の発生場所や発生領域に係わらず容易
に適用することができ、生着率が向上される。この発明
においては、細胞外基質を含有する皮膚再形成剤を適用
することが好ましい。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明は、無形の媒体中に表皮細
胞及び／又は線維芽細胞を分散して含有する皮膚再形成
剤を提供するものである。ここで、無形の媒体として
は、流動性媒体と、塑性媒体とを挙げることができる。
流動性媒体としては、例えば、液体、粘性の低い流動
体、ある程度の粘性を有するが依然流動性を有している
ような媒体がある。具体的には、水、各種溶媒、溶液、
懸濁液等がある。

【００１３】また、塑性媒体としては、例えば、ゼリー
状体（無形の状態のもの、あるいは有形物をクラッシャ
した状態のもの等）、クリーム状体等がある。例えば、
ある種のクリーム、ゼリーやクラッシャされたゼリー
が、チューブから絞り出された状態において、ほとんど
流動性を保有しないか、あっても小さく、本来無形物で
あって、外力によって付与された一定の形を保持可能で
あるとき、このクリームやゼリーは塑性媒体である。流
動性媒体と塑性媒体とは、区別が困難である場合もあ
る。例えば、高濃度に増粘剤を含有し粘度が高い状態の
媒体である。本発明においては、無形の媒体であれば、
本願発明における流動性媒体あるいは塑性媒体に包含さ
れるものとする。本願発明における流動性媒体と塑性媒
体とは、本来的に無形の媒体を、実質的な流動性の有無
によって区分したにすぎないものである。

【００１４】流動性媒体及び塑性媒体は、いずれも、ｐ
Ｈ６．５〜８．０、好ましくはｐＨ６．８〜７．８、浸
透圧２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２６０
〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇに調製されていることが好まし
い。生理的に許容されやすいからである。また、滅菌の
処理が簡便に行うことができることが好ましい。流動性
媒体と塑性媒体を構成する成分は、生理的に許容される
ものであることが好ましい。より好ましくは、哺乳類に
おいて生理的に許容されるものが好ましく、さらに好ま
しくはヒトにおいて生理的に許容されるものが好まし
い。なお、ここでいう媒体構成成分とは、媒体構成材料
の意味である。したがって、流動性媒体においても塑性
媒体においても、液体成分は媒体構成成分となる。

【００１５】好ましい媒体構成成分としては、水の他、
中性塩類溶液、生理的塩類溶液等である。中性塩類溶液
は、中性域のｐＨを有する塩類溶液である。このような
中性塩類溶液としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム
等の各種塩類の溶液を挙げることができる。好ましく
は、中性塩類溶液は、ｐＨの緩衝能を有している。

【００１６】生理的塩類溶液は、細胞の生存に適したｐ
Ｈと浸透圧を備えた塩類溶液である。このような生理的
塩類溶液としては、生理的食塩液（０．９％水溶液）、
さらには生理食塩液にＫ⁺、Ｃａ²⁺等の細胞液中の主要
なイオンを数種加えた組成の塩類溶液を挙げることがで
きる。また、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺のイオンの
平衡を保つように緩衝系を加えた塩類溶液である平衡塩
類溶液を挙げることができる。また、各種細胞培養液を
挙げることができる。

【００１７】かかる生理的塩類溶液としては、リンガー
液、リンガー−ロック液、タイロード液、アール液、ハ
ンクス液、ロック液、Ｍｏｒｇａｎ、Ｍｏｒｔｏｎ及び
Ｐａｒｋｅｒの合成培養液Ｎｏ．１１９、Ｅｖａｎｓら
の合成培養液ＮＣＴＣ１０９、Ｐａｒｋｅｒらの合成培
養液ＣＭＲＬ−１０６６、ＭｃＣｏｙの５ａ培養液、Ｅ
ａｇｌｅの最小必須培養液、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａ
ｇｌｅ最小必須培地（ＤＭＥＭ）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ
のＬ−１５培養液、Ｈａｍの合成培養液Ｆ１２、Ｍｏｏ
ｒらのＲＰＭＩ−１６４０培養液、Ｗｉｌｌｉａｍらの
培養液Ｅ、ＫａｔｓｕｔａらのＤＭ−１６０培養液、Ｓ
ＦＭ−１０１の培養液、ＹａｍａｎｅらのＲＩＴＣ８０
−７培養液、Ｇｒｅｅｎ培養液、ＬＨＣ−８培養液、Ｌ
ＨＣ−９培養液、無血清培養液ＭＣＤＢ１５３、同１５
１、同１０４、同１３１、同４０２、同２０１、同３０
２、同１０５、同１１０、無血清培養液ＡＳＦ１０４
（ＲＩＴＣ６２−８）、Ｇｒａｃｅの昆虫細胞の合成培
養液、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒの培養液、Ｍｉｔｓｕｈａｓ
ｉ−Ｍａｒａｍｏｒｏｓｈの培養液、Ｋｎｏｐ液、Ｇａ
ｕｔｈｅｒｅｔの培養液等を挙げることができる。

【００１８】このような媒体構成成分の他、媒体構成成
分としては、媒体の流動性を調整できる成分（流動性調
整成分）がある。このような成分として、具体的には、
増粘性の成分やゲル化成分等を挙げることができる。こ
のような流動性調整成分としては、各種増粘性多糖類や
糖タンパク質やその他の増粘剤等があり、特にゲル化に
寄与する成分として、アガロース、ゼラチン、コラーゲ
ン、コンドロイチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫
酸類、フィブロネクチン、ヘパリン、ラミニン、マトリ
ジェル（基底膜成分、製造元：BECTON DICKINSON LAB
WARE社製）等の各種多糖類やタンパク質やその他増粘成
分として、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリアクリルアミド、ヒドロキシエチルメチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、キトサン、カルボキシメチルキ
トサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノキトサン、Ｎ，Ｎ−ジ
エチルアミノキトサン等を挙げることができる。なお、
いずれの流動性調整成分においても、皮膚再形成剤の生
理的適合性を妨げない濃度に使用されることが好まし
い。また、流動性媒体及び塑性媒体においては、これら
の各成分は、１種あるいは２種以上を組み合わせて用い
ることができる。

【００１９】流動性媒体あるいは塑性媒体には、表皮細
胞及び／又は線維芽細胞が含まれている。表皮細胞及び
線維芽細胞は、この皮膚再形成剤を適用しようとする哺
乳動物の同一個体のものが好ましいが、同じ種の他の個
体、あるいは異種の哺乳動物のものであってもよい。哺
乳類の皮膚は、表皮と真皮とで構成されている。さら
に、表皮は、表皮細胞で構成されており、真皮は、線維
芽細胞と線維芽細胞が産出するコラーゲンをはじめとす
る結合組織成分から構成されている。表皮細胞を含むこ
とにより、表皮の皮膚欠損部位に有効な皮膚再形成剤と
なる。また、線維芽細胞を含むことにより、真皮の皮膚
欠損部位に有効な皮膚再形成剤となる。なお、真皮を効
果的に再生し、治癒を促進するには、真皮の構成成分で
あるコラーゲンを同時に含むことが好ましい。

【００２０】表皮細胞は、分散して媒体中に含有されて
いる。表皮細胞の分散状態は、小さな細胞塊ないし単細
胞の範囲であるが、単細胞あるいはそれに近い状態で媒
体中に分散されていることが好ましい。分散状態であれ
ば、シート状に積層されている場合よりも、単細胞ある
いは単細胞に近い状態のほうが、細胞の生着能、増殖
能、分化能、タンパク質等分泌能等が温存されており、
皮膚再生や治癒が促進されやすいからである。したがっ
て、あらかじめ、採取されたあるいは培養によって得ら
れた表皮細胞を酵素処理等によって、小さな細胞塊ある
いは単細胞にまで分離された状態で媒体に添加すること
が好ましい。酵素処理は、表皮細胞を分離するのに用い
る従来公知の酵素を用いることができる。具体的には、
ディスパーゼ、トリプシン等である。

【００２１】含有される表皮細胞は、自家細胞（皮膚再
形成剤が適用されるレシピエント自身の細胞）及び又は
同種細胞（皮膚再形成材が適用される被検体と同じ種に
属している他のドナーの細胞）を使用することが好まし
い。皮膚の欠損が広範囲であり、全層（表皮から真皮最
深部に至る全層）に近い欠損の場合等、自発的表皮の再
形成が困難であることが予想される場合には、自家細胞
を用いることが好ましい。また、皮膚の欠損が広範囲に
はわたるが浅い欠損の場合又は欠損が広範囲にわたらな
いが深い欠損の場合等、適用する細胞から分泌される生
理活性物質、成長因子、成長ホルモン等のタンパク質、
糖タンパク質等による自発的表皮の再形成の促進や治癒
促進が期待できるので、同種細胞であってもよい。ま
た、潰瘍等の治療の場合等、肉芽組織の再建を行う場合
には、適用される細胞から分泌される生理活性物質、成
長因子、成長ホルモン等のタンパク質、糖タンパク質等
により、レシピエントの損傷部位の線維芽細胞や血管内
皮細胞を活性化して肉芽組織を再建させることができる
ので、同種細胞であってもよい。また、いずれの場合に
も自家細胞と同種細胞を混合して用いてもよい。ただ
し、損傷部位が広範囲で深い場合等で表皮の形成を目的
とすべき場合には、自家細胞を多く含有することが好ま
しい。

【００２２】線維芽細胞も、分散して媒体中に含有され
る。線維芽細胞の分散状態は、小さいな細胞塊ないし単
細胞の範囲であるが、単細胞あるいはそれに近い状態で
媒体中に分散されていることが好ましい。単細胞あるい
は単細胞に近い状態のほうが、細胞の生着能、増殖能、
タンパク質等分泌能等が温存されており、皮膚再生や治
癒が促進されるからである。採取したあるいは培養した
線維芽細胞は、表皮細胞を分離するのと同じように、酵
素処理等によって分離され、その後、媒体に添加され
る。

【００２３】線維芽細胞についても、自家細胞及び／又
は同種細胞を用いることが好ましい。線維芽細胞を利用
する場合とは、真皮以下に損傷を受け、再建されにくい
損傷部周辺の血管内皮細胞や線維芽細胞の活性を向上さ
せて、肉芽組織を再建する場合であるので、自家及び同
種のどちらの線維芽細胞も用いることができる。

【００２４】以下に、哺乳動物の線維芽細胞及び表皮細
胞を得る一般的な方法を説明する。（線維芽細胞の調製方法）まず、清潔な環境下で採取さ
れた皮膚（表皮及び真皮の一部又は真皮全層）を消毒
し、抗生物質を含有する生理食塩水またはハンクス（Ｈ
ａｎｋ’ｓ）液などの緩衝液に浸漬する。この皮膚をデ
ィスパーゼ濃度を１０００ＩＵ／ｍｌに調製したダルベ
ッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）（以下、
「ディスパーゼ溶液」という。）に浸漬した後、真皮と
表皮とに分離する。

【００２５】得られた真皮をはさみ、ホモジナイザー等
を用いて砕き、０．５w/v ％のコラーゲナーゼのＤＭＥ
Ｍ溶液（以下、コラゲナーゼ溶液という。）に加えて、
約３〜６時間、約３７℃にて振とうして結合組織を溶解
させた上で約２００×ｇ〜約１，５００×ｇ、好ましく
は約３００×ｇ〜約５００×ｇで遠心分離して、真皮線
維芽細胞を採取する。得られた線維芽細胞は、ＦＢＳ
（牛胎児血清）が１０v/v ％となるように添加されたＤ
ＭＥＭ（以下、単に、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳとい
う。）などを培地としてＣＯ₂インキュベーター中、３
７℃にてサブコンフルーエントとなるまで培養し、必要
に応じて多くの線維芽細胞を得るように継代培養する。

【００２６】培養した線維芽細胞を、トリプシン濃度
０．２５w/v ％、エチレンジアミン４酢酸ナトリウム
（ＥＤＴＡ）濃度０．００５ｍＭ／ｍｌに調製したハン
クス液（以下、トリプシン溶液という。）を用いてフラ
スコからはがして採取し、遠心分離後、上澄み液を吸引
除去して、沈殿物をＤＭＥＭ等で懸濁し、単細胞の線維
芽細胞懸濁液を調製する。

【００２７】（表皮細胞の調製方法）表皮細胞は、以下
の手順で調製される。前記と同様にして皮膚から得た表
皮をトリプシン溶液中、３７℃で約１５分間浸漬した
後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳなどの培地を加え、振とう
することにより細胞を分散させ、約４００×ｇ、５分間
遠心分離することによって表皮細胞を得ることができ
る。得られた表皮細胞は、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅ
ｎ）培地，ＮＣＴＣ１６８培地、ＭＣＤＢ１５３培地、
特に好ましくは、グリーン培地を加えて表皮細胞懸濁液
とする。このグリーン培地とは、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ
Ｆ−１２を３：１で混合し、ヒロドコルチゾン（０．
４μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トラン
スフェリン（５μｇ／ｍｌ）、トリヨードチロニン
（０．００１３μｇ／ｍｌ）、コレラ毒素（０．０１μ
ｇ／ｍｌ）、アデニン（２４．３μｇ／ｍｌ）、表皮細
胞因子（０．０１μｇ／ｍｌ）と抗生物質とが添加され
たものであり、１０v/v ％のＦＢＳを含んでなる表皮細
胞増殖培地（以下、Green ＋１０％ＦＢＳという。）で
ある（セル（Ｃｅｌｌ）、第４０巻、６７７〜６８３
頁、１９８５年３月参照）。

【００２８】なお、前記表皮細胞を高効率で増殖させる
には、例えば、マイトマイシン処理や放射線照射などに
よって増殖能を停止させたマウス由来の線維芽細胞であ
る３Ｔ３細胞などを支持細胞として定着させた培養フラ
スコ中で培養を行うことが好ましい。具体的には、次の
ようにする。３Ｔ３細胞を培養した後、培地を除去して
カルシウム及びマグネシウム含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ
（＋））ですすぐ。ついでマイトマイシンＣ２５μｇ／
ｍｌ含有のＤＭＥＭ又はＰＢＳ（＋）を細胞全体が十分
浸かるように（８０ｃｍ²培養フラスコでは８ｍｌが好
ましい。）加え、３７℃にて２時間程度静置した後、緩
衝液で洗浄し、マイトマイシンＣを除去する。こうして
３Ｔ３細胞は、生きたままで増殖能のみが停止せしめら
れる。この増殖能を有さない３Ｔ３細胞を採取して、前
記Green ＋１０％ＦＢＳに懸濁し、１×１０³〜５×１
０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、好ましくは、５×１０³〜３
×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度になるように調製し
た後、培養フラスコに播種する。

【００２９】この培養フラスコに前記表皮細胞を１×１
０³〜１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｃｍ ²、好ましくは、５
×１０³〜２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細胞密度に
て播種し、ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃にて培養
する。３Ｔ３細胞は、この培養中に表皮細胞がコロニー
を形成する過程において、培養フラスコ底面より培地中
に浮き上がり、培地を交換する際に除去されるので、最
終的に得られる表皮細胞に３Ｔ３細胞はほとんど含まれ
ない。培養増殖した表皮細胞は、ディスパーゼ溶液を加
えて、３７℃にて約１時間静置することにより培養フラ
スコ底面からはがして採取することができる。なお、表
皮細胞は、必要に応じて継代培養する。具体的には、前
記支持細胞を必要量作製し、前記したように培養増殖し
た表皮細胞を採取して、支持細胞に播種培養する。この
際、表皮細胞が角質化しないよう注意して継代培養す
る。

【００３０】得られた表皮細胞をトリプシン溶液に加え
表皮細胞を分散させた後、３７℃のウォーターバスで振
とうし、その後、必要あれば攪拌して単細胞とし、遠心
（４℃、４００×ｇ、５分間）して、上澄み液を吸引除
去して、沈殿物をGreen ＋１０％ＦＢＳ等で懸濁し、単
細胞の表皮細胞懸濁液を調製する。

【００３１】皮膚再形成剤には、皮膚細胞として、表皮
細胞のみを含有するようにしてもよいし、線維芽細胞の
みを含有させるようにしてもよいし、表皮及び線維芽細
胞の双方を含有させるようにしてもよい。皮膚欠損部位
の状況によって、適宜組み合わされる。流動性媒体ある
いは塑性媒体中には、表皮細胞及び／又は線維芽細胞
が、全体として、１．０×１０³〜１．０×１０⁷細胞
／ｍｌの範囲で存在するような適用が好ましい。より好
ましくは、１．０×１０⁴〜１．０×１０⁶細胞／ｍｌ
である。

【００３２】流動性媒体あるいは塑性媒体には、これら
の媒体構成成分及び表皮細胞以外に、細胞外基質を含ま
せることができる。細胞外基質を含有させることによ
り、線維芽細胞の増殖や移動を促進することができ、皮
膚再形成及び治癒を促進できる。また、同時に、皮膚再
形成材の粘度が向上されるので、皮膚再形成材を欠損部
位に良好に保持することができる。このような細胞外基
質としては、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等のム
コ多糖類を主成分とするタンパク質多糖や、コラーゲン
やゼラチンも挙げることができる。これらの細胞外基質
は、１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることが
できる。

【００３３】さらに、成長促進因子やサイトカイン類や
薬剤を含有させることもできる。細胞成長因子として
は、インシュリン、トランスフェリン、アシアロ糖タン
パク質、上皮細胞増殖因子、血小板由来因子、線維芽細
胞増殖因子、トランスホーミング増殖因子、インスリン
様増殖因子、内皮細胞増殖因子等を挙げることができ
る。薬剤としては、抗炎症剤、鎮痛剤、抗生物質等の抗
菌剤等を挙げることができる。

【００３４】流動性媒体中あるいは塑性媒体中に表皮細
胞及び／又は真皮細胞を分散して含有させた皮膚再形成
剤は、創傷部位、熱傷部位、褥瘡部位、潰瘍部位、肌荒
れ部位等の各種の皮膚欠損部位に対して適用され、皮膚
が再形成される。哺乳類としては、ヒトを適用対象とす
ることもでき、また、非ヒト哺乳動物に適用することも
できる。適用方法は、滴下、注入、塗布等である。注入
は、皮下における真皮層の再形成を主目的とする場合に
用いるのに適している。適用に際しては、適用された表
皮細胞あるいは線維芽細胞、また、これらの細胞から分
泌される生理活性物質、さらにはレシピエント自身の細
胞から分泌される生理活性物質等が、欠損部位に滞留し
やすいように、滴下、注入あるいは塗布の後には、創傷
面を湿潤環境に置くウェットドレッシングをすることが
好ましい。よりいっそうの滞留を達成するには、皮膚再
形成剤の適用後に、プラスチックフィルムなどで欠損部
位を密封し、欠損部位を湿潤状態に保持する閉鎖包帯法
（オクルシブドレッシング）をすることが好ましい。な
お、皮膚欠損部位に対するドレッシング面積は、皮膚再
形成剤が皮膚欠損部位からもれないかあるいはにじみで
ない程度にするのが好ましい。また、適用した皮膚再形
成剤の滞留には、粘性の高い流動性媒体や塑性媒体を用
いることも有効である。クリーム状態あるいはゲル状態
の媒体中に皮膚細胞を分散して得た皮膚再形成剤は、適
用部位によく滞留される。

【００３５】表皮細胞及び／又は線維芽細胞を媒体中に
含んだ皮膚再形成剤を、正常真皮層が欠落あるいは不足
している部位に充填することにより、真皮層を構成する
線維芽細胞を活性化するため、真皮再生用の充填剤ある
いは注入剤として有用である。さらに、皮膚の欠損部位
の再生あるいは治癒を促進することを目的とするのみな
らず、すり傷、肌荒れやあかぎれ等、比較的軽度の皮膚
欠損のための外用剤に用いることも可能である。

【００３６】このような皮膚再形成剤によれば、無形の
媒体を介して表皮細胞及び／又は線維芽細胞が皮膚の欠
損部位に適用されるようになっているので、適用部位や
その広さ、さらには欠損の深さ程度に関わらず容易に適
用できる。また、欠損状態に応じて、表皮細胞や線維芽
細胞の他、各種成分を組み合わせた処方が可能となって
いる。また、従来と異なり、表皮細胞等は、積層状態あ
るいはシート状態でなく、単細胞状態あるいはそれに近
似した状態で適用されるので、細胞が活性化された状態
で欠損部位に適用されるというメリットがあり、生着率
が向上される。また、このような皮膚再形成剤を適用
する皮膚再形成方法においても、同様の効果が得られ
る。なお、本発明の皮膚再形成剤によると、従来労力の
かかっていた、表皮細胞等を皮膚状、すなわち、シート
化したり、あるいは、表皮細胞等の担持体たるシート状
の成形体をする工程が排除されている。このため、特
に、表皮細胞を含んだ皮膚再形成剤としては、製造工程
が簡略化されている点においても有用である。

【００３７】

【実施例】以下、本発明の皮膚再形成剤を製造し、皮膚
欠損部位に適用した例を挙げて説明する。（実施例１）（１）培養フラスコ（培養面積８０ｃｍ²）にマイトマ
イシンＣ処理され株化されたマウス肺線維芽細胞（３Ｔ
３細胞）を１×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²で播種し、支
持細胞層（フィーダーレイヤー）とした。（２）次に、ラット背部から全層（表皮層及び真皮層の
欠損）の皮膚片を採取し、消毒し、抗生物質を含有する
生理食塩水又はハンクス液などの緩衝液に浸漬する。こ
の皮膚をディスパーゼ濃度１０００ＩＵ／ｍｌに調製し
たＤＭＥＭ１０ｍｌに浸漬し、冷蔵庫（４℃）内で静置
し、その後ピンセットで真皮と表皮とに分離する。さら
に、分離した表皮を、トリプシン溶液に懸濁し、３７℃
のウォーターバス中で１５分間振とう後、攪拌して単細
胞状態の懸濁液とした。この懸濁液を４００×ｇ、５分
間、４℃で遠心分離し、上澄液を吸引除去し、沈殿した
表皮細胞をGreen ＋１０％ＦＢＳに懸濁して表皮細胞の
単細胞懸濁液を得た。

【００３８】（３）この単細胞懸濁液を、前記フィーダ
ーレイヤーに１×１０⁴cells/cm²程度で播種し、培養
した。培地はGreen ＋１０％ＦＢＳを使用した。

【００３９】（４）表皮細胞を播種後３日後から週２回
培地交換を行い、２０日間表皮細胞を初代培養した。（５）培養フラスコの培養表面に一様に表皮細胞が増殖
したのを確認後、培養フラスコ中の培地を吸引除去し、
培養フラスコ１枚に対し、ハンクス液１０ｍｌを加えて
細胞表面を洗浄し、ハンクス液を吸引除去した。さら
に、培養フラスコ１枚に対し３ｍｌのディスパーゼ溶液
（全体で1500ＩＵ）を加えて、炭酸ガス培養装置（３７
℃、５％ＣＯ₂）内で静置し、１時間ほどで細胞が培養
フラスコ面より剥離してきたら、細胞を、Green ＋１０
％ＦＢＳとともに遠沈管に回収し、４００×ｇ、４℃
で、５分間遠心し、表皮細胞塊を分離した。

【００４０】（６）この表皮細胞塊をさらに、トリプシ
ン溶液に懸濁し、３７℃のウォーターバス中で１５分間
振とう後、攪拌して単細胞状態の懸濁液とした。この懸
濁液を４００×ｇ、５分間、４℃で遠心分離し、上澄液
を吸引除去し、沈殿として単細胞状態の表皮細胞を得
た。（７）この表皮細胞を、ＤＭＥＭ中に約１×１０⁶cell
s/mlの濃度となるように懸濁し、この懸濁液を実施例１
の皮膚再形成剤とした。

【００４１】（８）この得られた懸濁液３００μｌを、
（２）で全層の皮膚片を採取したラットの背部に新たに
２つ形成した直径２４mmの全層欠損部位の一つに滴下す
ることにより適用した。また、もう一方の全層欠損部位
には、ＤＭＥＭ３００μｌを対照例１として滴下した。

【００４２】（９）双方の全欠損部位をそれぞれ６ｃｍ
×７ｃｍのテガターム（３Ｍヘルスケア（株）製）で覆
い、その上方からガーゼを被せて、エラスティックテー
プで固定した。

【００４３】かかる処置から１週間後、エラスティック
テープ及びガーゼを取り除き、テガターム上から欠損部
位の状態を観察し、同時に、欠損部位の大きさを、透明
なシート状体を欠損部位にあてて写しとり、そのシート
状体の重量を、当初の欠損部位の大きさに対応するシー
ト状体の重量と対比して、創の閉塞率を求めた。さら
に、処置から１０日後、１４日後、２１日後にも、同様
にして創の閉塞率を求めた。処置後１週間の創閉塞率
は、実施例１で５３％であり、対照例１で３８％であっ
た。処置後１０日では、実施例１では７６％であり、対
照例１では６５％であった。処置後１４日では、実施例
１では９２％であり、対照例１では８８％であった。処
置後２１日では、実施例１では９９％であり、対照例１
では９５％であった。この結果、実施例１の皮膚再形成
剤は、処置後における創閉塞率が対照例１よりも高いこ
とがわかった。特に、処置後早期において、対照例１に
対して良好な創閉塞率を呈した。

【００４４】（実施例２）実施例１の（１）〜（６）に
従って操作して、ラットの単細胞状態の表皮細胞を得
た。この表皮細胞を、中性コラーゲン溶液（（株）高
研、商品名cellgen ）中に約１×１０⁶cells/mlとなる
ように懸濁して、この懸濁液を実施例２の皮膚再形成剤
とした。

【００４５】この懸濁液３００μｌを、全層の皮膚片を
採取したのと同じラットの背部に形成した直径２４mmの
２つの全層欠損部位の一つに滴下することにより適用し
た、対照例２として、懸濁液と同量の前記中性コラーゲ
ン溶液を他方の全層欠損部位に適用した。

【００４６】これらの適用部位について、実施例１と同
様の手順で処置を行い、創閉塞率の経時変化を観察し
た。処置後１週間の創閉塞率は、実施例２で５８％であ
り、対照例２で５３％であった。処置後１０日では、実
施例２では８７％であり、対照例２では８０％であっ
た。処置後１４日では、実施例２では９３％であり、対
照例２では８９％であった。処置後２１日では、実施例
２では９９％であり、対照例２では９８％であった。

【００４７】

【発明の効果】請求項１ないし５に係る発明によれば、
皮膚欠損部位の発生場所や発生領域に係わらず容易に適
用することができる。請求項４及び５に係る発明によれ
ば、さらに、細胞外基質を含有するために、皮膚再形成
剤が皮膚欠損部位に保持されやすく、皮膚欠損部位を良
好に被覆できる。請求項６及び７に係る発明によれば、
皮膚欠損部位の発生場所や発生領域に係わらず容易に適
用することができる。請求項７に係る発明によれば、さ
らに、細胞外基質を含有するために、皮膚再形成剤が皮
膚欠損部位に保持されやすく、皮膚欠損部位を良好に被
覆できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】流動性媒体あるいは塑性媒体中に、表皮細
胞及び／又は線維芽細胞を含有する皮膚再形成剤。
【請求項２】流動性媒体あるいは塑性媒体中に、表皮細
胞を含有する皮膚再形成剤。
【請求項３】流動性媒体に表皮細胞及び／又は線維芽細
胞を含有する皮膚再形成剤。
【請求項４】細胞外基質を含有する請求項１ないし３の
いずれかに記載の皮膚再形成剤。
【請求項５】細胞外基質として、コラーゲン、ゼラチ
ン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、あるいは、こ
れらのうちから選ばれる２種類以上を含む請求項４記載
の皮膚再形成剤。
【請求項６】流動性媒体あるいは塑性媒体中に非ヒト哺
乳動物の表皮細胞及び／又は線維芽細胞を含有する皮膚
再形成剤を、皮膚欠損部位に適用する皮膚再形成方法。
【請求項７】細胞外基質を含有する皮膚再形成剤を適用
する請求項６記載の皮膚再形成方法。