ES2540242T3

ES2540242T3 - Estructura tridimensional de tejido

Info

Publication number: ES2540242T3
Application number: ES10183361.4T
Authority: ES
Inventors: Hikaru Matsuda; Yoshiki Sawa; Satoshi Taketani; Shigeru Miyagawa
Original assignee: Cellseed Inc
Current assignee: Cellseed Inc
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2004-02-02
Publication date: 2015-07-09
Anticipated expiration: 2024-02-02
Also published as: JP2015033637A; JP2007528755A; EP2266500A2; ES2535087T3; DK2266500T3; EP2266499A3; EP2266500B1; US20070092492A1; JP4943844B2; WO2005011524A1; US20150110756A1; EP1659979A1; JP2012139541A; EP2266499B1; JP2010029680A; DK2266499T3; EP1659979B1; US9587222B2; EP2266499A2; EP2266500A3

Abstract

Una estructura tridimensional para su uso en un método para implantar en un corazón de ser humano para el tratamiento de miocardiopatía dilatada, miocardiopatía hipertrófica en fase dilatada o cardiopatía isquémica, que comprende una célula derivada de una parte distinta del miocardio de un adulto, donde la estructura tridimensional carece de un armazón y tiene un área de al menos 6 cm2, y donde la célula es un mioblasto.

Description

DESCRIPCIÓN

Estructura tridimensional de tejido

Campo de la técnica 5

La presente invención se refiere a una estructura tridimensional aplicable al corazón y, más particularmente, a una estructura tridimensional aplicable al corazón que comprende células derivadas de partes de un adulto distintas al corazón como se define en las reivindicaciones. La presente invención también se refiere a un método para producir dicha estructura tridimensional como se define en las reivindicaciones. 10

Técnica anterior

El infarto de miocardio es una lesión irreversible (Ho K.K., Anderson K.M., Kannel W.B., Grossman W., Levy D., Circulation, 1993; 88: 107-115). Las cardiopatías isquémicas son la causa de muerte responsable del 50 % de todas 15 las muertes relacionadas con el sistema cardiovascular y la principal causa de insuficiencia cardiaca congestiva. La mortalidad a 1 año observada en pacientes en los que se ha diagnosticado insuficiencia cardiaca congestiva y, en última instancia, mueren por cardiopatía crónica es del 20 % (American Heart Association, Dallas, Tex: American Heart Association; 2001). La mayoría de las terapias disponibles en la actualidad para los clínicos mejoran significativamente el pronóstico de los pacientes que sufren un infarto agudo de miocardio. La angioplastia y los 20 agentes trombolíticos puede eliminar la causa del infarto agudo de miocardio, aunque el periodo de tiempo desde el inicio de la oclusión hasta la reperfusión determina el grado de lesión irreversible en el miocardio (Ryan T.J., Antman E.M., Brooks N.H., Califf P.M., Hillis L.D., Hiratzka L.F., Rapaport E., Riegel B., Russell R.O., Smith E.E. III Weaver W.D., Gibbons R.J., Alpert J.S., Eagle K.A., Gardner T.J., Garson A. Jr., Gregoratos G., Ryan T.J., Smith S.C. Jr., J. Am. Coll. Cardiol., 1999; 34: 890-911). Ningún agente farmacéutico o tratamiento usado clínicamente tiene eficacia 25 sobre la sustitución de las cicatrices en el miocardio por tejido de contracción funcional. Existe la demanda de una nueva terapia para regenerar los cardiomiocitos normales.

Se ha propuesto la cardiomioplastia como método quirúrgico para mejorar la función del ventrículo izquierdo (VI) de un paciente que sufre insuficiencia cardiaca congestiva, no obstante el efecto de la misma sobre la función cardíaca 30 sigue sin estar claro (Corin W.J., George D.T., Sink J.D. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1992, 104:1662-1671; Kratz J.M., Johnson W.S., Mukherjee R. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1994, 107:868-878; Carpentier A., Chachques J.C., Lancet, 1985, 8840:1267; y Hagege A. A., Desnos M., Chachques J.C. et al., Preliminary report: follow-up after dynamic cardiomyoplasty, Lancet, 1990, 335:1122-1124). Recientemente, se ha propuesto la implantación de un injerto de corazón modificado biológicamente, donde se usa un armazón biodegradable, como 35 otro nuevo abordaje. No obstante, el injerto apenas se fija al miocardio, lo que tiene como resultado el menos beneficio posible para la mejora de la función cardíaca (Leor J., Etzion S.A., Dar A. et al., Circulation, 2000; 102 [suppl. III] III-56-III-61; y Li R.K., Jia Z.Q., Weisel R.D. et al., Circulation, 1999; 100 [suppl II]: II-63-II-69). La integración histológica y eléctrica del tejido cardíaco modificado biológicamente y un corazón receptor puede ser crucial para la regeneración del miocardio dañado. 40

Cabe esperar que el reciente desarrollo de la ingeniería de tejidos haga posible la producción de un tejido cardiaco funcional usando una nueva técnica donde láminas celulares se estratifican tridimensionalmente sin ningún sustituto biodegradable para matrices extracelulares (MEC) (Okano T., Yamada N., Sakai H., Sakurai Y., J. Biomed. Mater. Res., 1993; 27:1243-1251). En esta nueva técnica, tanto la adhesión intracelular como las proteínas de adhesión 45 dentro de una monocapa celular cultivada de forma confluente se mantienen completamente. La MEC endógena que soporta una lámina celular cuya parte de base se ha recogido mediante un método de recogida (Kushida A., Yamato M., Konno C., Kikuchi A., Sakurai Y., Okano T., J. Biomed. Mater. Res., 45:355-362, 1999) desempeña un papel importante como factor de adhesión para la integración en el corazón receptor. Adicionalmente, la lámina de cardiomiocitos es una construcción de corazón 3-D pulsátil que transmite electricidad (Shimizu T., Yamato M., 50 Akutsu T. et al., Circ. Res., Feb 22, 2002, 90(3):e40). No obstante, se desconoce si las láminas de cardiomiocitos conservan o no sus funciones después de su implantación in vivo.

El reciente progreso en la ingeniería de tejidos tiene el potencial de proporcionar un tejido funcional implantable que comprende varias células y una matriz extracelular. 55

La implantación de órganos (por ejemplo, corazón, vaso sanguíneo etc.) usando un tejido exógeno se ve impedida principalmente por rechazos inmunológicos. Los cambios que se producen en aloinjertos y xenoinjertos se describieron por primera vez hace 90 o más años (Carrel A., 1907, J. Exp. Med. 9:226-228; Carrel A., 1912, J. Exp. Med. 9:389-392; Calne R.Y., 1970, Transplant Proc. 2:550; y Auchincloss 1988, Transplantation 46:1). El rechazo a 60 los injertos arteriales conduce patológicamente a un aumento de tamaño (hasta la rotura) u oclusión de los injertos. El primero está causado por la descomposición de matrices extracelulares, mientras que el último se debe a la proliferación de células en un vaso sanguíneo (Uretsky B. F., Mulari S., Reddy S., et al., 1987, Circulation 76:827-834). Dichos injertos a menudo están hechos de materiales no biológicos que producen efectos adversos.

65

Recientemente, la implantación celular ha atraído la atención como terapia usando material biológico. No obstante, la implantación de mioblastos humanos en el corazón infartado tiene los siguientes inconvenientes: 1. Daños y pérdida de células de implantación; 2 lesión tisular del corazón receptor durante la implantación; 3. eficiencia de suministro tisular en el corazón receptor; 4. aparición de arritmia; 5. dificultades para tratar la totalidad del sitio infartado; y similares. Por tanto, no se puede decir que la implantación de células tenga mucho éxito. 5

Se han desarrollado láminas derivadas de miocardio. Normalmente se requiere miocardio autólogo para la lámina derivada de miocardio en vista de las reacciones inmunológicas. Por tanto, las aplicaciones de la lámina son limitadas.

10

El resumen y la presentación en la reunión de Memon IA en 2003 se refieren a láminas de mioblastos autólogos que regeneran el miocardio alterado.

La publicación de Memon IA en el Circulation Journal en 2003 informa que una lámina de mioblasto de ingeniería tisular mejora el rendimiento cardíaco. 15

De acuerdo con lo anterior, existe una gran demanda de un tejido protésico, una estructura tridimensional o una lámina capaz de aguantar las operaciones de implantación, usándose en operaciones reales y produciéndose mediante cultivo.

20

Divulgación de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un tejido o lámina protésico capaz de aguantar las operaciones de implantación, usándose en las operaciones reales y produciéndose mediante cultivo. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una nueva terapia, que es una alternativa a la terapia celular. La presente invención está 25 dirigida particularmente a la producción de un tejido protésico que comprende células derivadas de otras partes distintas al miocardio, que pueden aguantar operaciones de implantación.

Los objetos descritos anteriormente de la presente invención se consiguen proporcionando una estructura tridimensional que comprende células derivadas de partes distintas al miocardio. Los objetos de la presente 30 invención se consiguieron parcialmente encontrando que cultivando las células en condiciones de cultivo específicas, las células se organizan inesperadamente en un tejido y el tejido protésico resultante es capaz de desprenderse de las placas de cultivo.

La presente invención también se consiguió hallando inesperadamente que una estructura tridimensional que 35 comprende células derivadas de otras partes distintas al miocardio puede funcionar de un modo similar al del miocardio.

Por tanto, la presente invención proporciona lo siguiente:

40

1. Una estructura tridimensional para su uso en un método para implantar en un corazón de ser humano para el tratamiento de miocardiopatía dilatada, miocardiopatía hipertrófica en fase dilatada o cardiopatía isquémica, que comprende una célula derivada de una parte distinta del miocardio de un adulto, donde la estructura tridimensional carece de un armazón y tiene un área de al menos 6 cm2, y donde la célula es un mioblasto.

2. Una estructura de acuerdo con el punto 1, donde el mioblasto es un mioblasto esquelético. 45

3. La estructura de acuerdo con el punto 1, donde la célula deriva del sujeto al que se aplica la estructura.

4. La estructura de acuerdo con el punto 1, donde la célula no deriva del sujeto al que se aplica la estructura.

5. La estructura de acuerdo con el punto 1, donde la estructura expresa al menos un marcador de corazón no adulto seleccionado del grupo que consiste en la cadena IIa pesada de la miosina, la cadena IIb pesada de la miosina, la cadena IId(IIx), pesada de la miosina, CD56, MyoD, Myf5 y miogenina. 50

6. La estructura de acuerdo con el punto 4, donde el nivel de expresión del marcador de corazón no adulto en la estructura es al menos el 50 % de un nivel de expresión del marcador de corazón no adulto en mioblastos esqueléticos.

7. La estructura de acuerdo con el punto 1, donde la estructura tridimensional expresa todas las cadena IIa pesada de la miosina, la cadena IIb pesada de la miosina, la cadena IId(IIx) pesada de la miosina, CD56, MyoD, 55 Myf5 y miogenina.

8. La estructura de acuerdo con el punto 6, donde un nivel de expresión de cada uno de las cadena IIa pesada de la miosina, la cadena IIb pesada de la miosina, la cadena IId(IIx) pesada de la miosina, CD56, MyoD, Myf5 y miogenina en la estructura es de al menos aproximadamente el 50 % de un nivel de expresión de la misma en mioblastos esqueléticos. 60

9. La estructura de acuerdo con el punto 6, donde un nivel de expresión de cada uno de las cadena IIa pesada de la miosina, la cadena IIb pesada de la miosina, la cadena IId(IIx) pesada de la miosina, CD56, MyoD, Myf5 y miogenina en la estructura es de al menos aproximadamente el 100% de un nivel de expresión de la misma en mioblastos esqueléticos.

10. La estructura de acuerdo con el punto 1, donde la célula derivada de una parte distinta al miocardio es una 65 célula no derivada del corazón.

11. La estructura de acuerdo con el punto 1, donde el corazón incluye miocardio.

12. La estructura de acuerdo con el punto 1, que comprende una lámina de células en monocapa.

13. La estructura de acuerdo con el punto 1, que comprende una lámina de células en multicapa.

14. La estructura de acuerdo con el punto 12, donde la lámina de células en multicapas tiene conexión biológica.

15. La estructura de acuerdo con el punto 13, donde la conexión biológica se selecciona del grupo que consiste 5 en:

conexión a través de la matriz extracelular, conexión eléctrica y conexión sin armazón.

16. Un método para producir una estructura tridimensional aplicable al corazón de un ser humano para el tratamiento de la miocardiopatía dilatada, la miocardiopatía hipertrófica en fase dilatada o la cardiopatía isquémica, donde no se utiliza un armazón, que tiene un área de al menos 6 cm2, y que comprende una célula 10 derivada de una parte distinta del miocardio de un adulto, donde la célula un mioblasto y donde el método comprende las etapas de:

a) cultivar la célula derivada de la parte distinta al miocardio de un adulto en presencia de ácido ascórbico o un derivado del mismo sobre un soporte de cultivo celular injertado con una macromolécula respondedora a la temperatura que tiene una temperatura de solución crítica límite superior o una temperatura de solución crítica 15 límite inferior con el agua de 0 ºC a 80 ºC, donde la célula es un mioblasto y la macromolécula respondedora a la temperatura es poli(N-isopropilacrilamida);

b) fijar una temperatura media del cultivo a la temperatura de la solución del límite superior o más o a la temperatura de la solución del límite inferior o menos; y

c) desprender la célula cultivada como una estructura tridimensional. 20

17. El método de acuerdo con el punto 16, donde la temperatura del medio de cultivo en b) se fija en 20 ºC para la temperatura de solución crítica límite inferior al agua.

18. El método de acuerdo con el punto 17, donde el ácido ascórbico o un derivado del mismo se selecciona de ácido ascórbico 2-fosfato, ácido ascórbico 1-fosfato o L-ascorbato sódico.

19. El método de acuerdo con el punto 16 o 17, donde un tratamiento usando una enzima de degradación de 25 proteínas no se realiza durante o antes de la etapa de desprendimiento.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá a modo de realizaciones preferidas. Los expertos en la técnica entenderán que las realizaciones de la presente invención se pueden realizar o efectuar adecuadamente en base a la descripción de la presente memoria descriptiva y técnicas de uso habitual bien 30 conocidas en la materia. Los expertos en la técnica pueden reconocer fácilmente La función y el efecto de la presente invención.

La presente invención proporciona un tejido protésico implantable. El tejido tiene un tamaño grande que no se puede conseguir mediante técnicas convencionales y tiene una resistencia excelente. De este modo, se hace posible tratar 35 sitios que no pueden ser accesibles convencionalmente al tratamiento de implantación usando materiales protésicas convencionales. La presente invención hace posible proporcionar un tejido protésico o estructura tridimensional hecho de no solo de tejido miocardial sino también de partes distintas al miocardio. Por tanto, se pueden usar partes distintas al miocardio antólogo como material para realizar terapias de implantación.

40

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A muestra un ejemplo donde se produce un tejido protésico de la presente invención usando un polímero respondedor a la temperatura.

45

La Figura 1B muestra otro ejemplo donde se produce un tejido protésico de la presente invención usando un polímero respondedor a la temperatura.

La Figura 2 muestra un ejemplo donde se compara una terapia usando un tejido protésico de la presente invención con una terapia celular. 50

La Figura 3 muestra un esquema de terapia de ejemplo usando un tejido protésico de la presente invención.

La Figura 4 muestra un límite de terapias regeneradoras de miocardio usando implantación celular. Como se muestra en la parte derecha, un sitio dañado no cicatriza completamente con células en implantación celular. 55

La Figura 5 muestra un límite de implantación tisular usando un armazón.

La Figura 6 muestra un ejemplo de implantación de un tejido protésico de la presente invención en un corazón infartado. 60

La Figura 7 muestra un estado de un tejido protésico de la presente invención después de la implantación. La parte izquierda muestra el tejido 2 semanas después de la implantación, mientras que la parte derecha muestra el tejido 8 semanas después de la implantación. La tinción con HE se muestra sobre el panel izquierdo (izquierda: ×100; derecha: ×200). La tinción del factor VIII se muestra debajo del panel izquierdo, mientras que la 65 tinción de conexina 43 se muestra a la derecha. El panel derecho muestra la tinción con HE (superior: ×40;

inferior: ×100).

La Figura 8 es un ecograma de ultrasonidos que muestra un ejemplo de evaluación de la función cardíaca mejorada por un tejido protésico de la presente invención. La parte izquierda muestra un control, mientras que la parte derecha muestra una lámina de cardiomiocitos. 5

La Figura 9 muestra un ejemplo de evaluación de la función cardíaca mejorada por un tejido protésico de la presente invención. En la figura se muestran la fracción de eyección (FE), el acortamiento fraccional (AF) y el área endosistólica (AES). Los cuadrados indican la lámina de cardiomiocitos, mientras que los triángulos indican el control. Una fotografía del panel izquierdo es una fotografía de ecografía de ultrasonidos (superior: control; 10 inferior: lámina de cardiomiocitos).

La Figura 10 muestra una técnica para la evaluación electrofisiológica de un tejido protésico de la presente invención. La parte derecha muestra esquemáticamente cambios en el potencial eléctrico, mientras que la parte derecha muestra valores numéricos del umbral. La parte derecha muestra un control y una lámina de fibroblastos 15 de la presente invención y una lámina de cardiomiocitos de la presente invención.

La Figura 11 muestra una evaluación electrofisiológica de un tejido protésico de la presente invención. La parte superior izquierda muestra un corazón normal, la parte inferior izquierda muestra un modelo de infarto y la parte inferior derecha muestra una terapia usando una lámina de cardiomiocitos. 20

La Figura 12 muestra un ejemplo de procedimientos para aislar y cultivar mioblastos en un método de acuerdo con la presente invención.

La Figura 13 muestra un ejemplo de cultivo de tejido protésico que contiene mioblastos en un método de acuerdo 25 con la presente invención.

La Figura 14 muestra un esquema experimental de ejemplo usando un tejido protésico de mioblastos de la presente invención.

30

La Figura 15 muestra fotografías que indican un tejido protésico de mioblastos de la presente invención 4 semanas después de la implantación (×10, ×200 y ×1000).

La Figura 16 muestra una operación de implantación de ejemplo usando un tejido protésico de mioblastos de la presente invención. 35

La Figura 17 muestra una implantación de ejemplo de un tejido protésico de mioblastos de la presente invención (tinción histológica). La parte superior muestra el tejido protésico, inyección celular y el control desde la derecha (×10). La parte inferior muestra una fotografía (×400) para cada uno.

40

La Figura 18 muestra un ecograma de ultrasonidos de la implantación de un tejido protésico de mioblastos de la presente invención (parte superior) y un resultado de ejemplo del análisis en modo M (parte inferior). La parte izquierda muestra un, mientras que la parte derecha muestra el corazón infartado tras el tratamiento.

La Figura 19 muestra resultados de ejemplo de una prueba para la función cardíaca de un tejido protésico de 45 mioblastos de la presente invención tras la implantación. Se muestran la fracción de eyección (FE), el acortamiento fraccional (AF), el área endosistólica (AES) y la onda E. Los rombos indican un tejido protésico de mioblastos, los cuadrados indican la inyección de mioblastos y los triángulos indican un control.

La Figura 20 muestra un ejemplo de la comparación en la presión de la pared entre un tejido protésico de 50 mioblastos de la presente invención y mioblastos. Los resultados de las fotografías (parte superior izquierda: tejido protésico; parte superior derecha: inyección de células; parte inferior derecha: control) se resumen en un gráfico de la parte inferior izquierda.

La Figura 21 muestra la comparación entre un tejido protésico de mioblastos de la presente invención y un 55 control visualizado mediante tinción con desmina, tinción del factor VIII y expresión de GFP. La parte superior muestra la tinción con desmina (izquierda: tejido protésico), expresión de GFP (derecha: tejido protésico) y expresión de GFP (centro: control). La parte inferior muestra la tinción del factor VIII (tejido protésico, inyección celular y el control desde la derecha).

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Las Figuras 22A a 22F muestran la conexión electrofisiológica cuando se usa un tejido protésico de la presente invención. Las Figuras 22A a 22C muestran un control, mientras que las Figuras 22D a 22F muestran un tejido protésico de mioblastos. En el tejido protésico de mioblastos se observa la conexión electrofisiológica.

Las Figuras 23A a 23C muestran la expresión de GFP cuando se usa un tejido protésico de la presente 65 invención. La expresión de GFP se muestra mediante visualización de imágenes en movimiento. Las Figuras

23A a 23C proporcionan marcos representativos como imágenes fijas.

Las Figuras 24A a 24C muestran un análisis temporal mediante ecografías de ultrasonidos de ejemplo del tratamiento usando un tejido protésico de la presente invención. Los resultados de la ecográfica de ultrasonidos para un corazón infartado tratado de acuerdo con la presente invención se muestran mediante visualización de 5 imágenes en movimiento. Las Figuras 24A a 24C proporcionan marcos representativos como imágenes fijas.

Las Figuras 25A a 25C muestran un análisis temporal mediante ecografías de ultrasonidos de ejemplo del tratamiento usando un tejido protésico de la presente invención. La Figura 25A muestra un control, mientras que la Figura 25B muestra el uso de un tejido protésico de la presente invención. Los resultados de la ecográfica de 10 ultrasonidos se muestran mediante visualización de imágenes en movimiento. Las Figuras 25A a 25C proporcionan marcos representativos como imágenes fijas. La parte izquierda muestra un control del corazón infartado, mientras que la parte derecha muestra un resultado de una lámina de mioblastos de la presente invención.

15

La Figura 26A muestra un análisis mediante ecografías de ultrasonidos de ejemplo del tratamiento usando un tejido protésico de la presente invención. La Figura 26A es una fotografía que muestra la misma muestra que en las Figuras 25A a 25C a un punto de tiempo diferente. Los resultados de la ecográfica de ultrasonidos se muestran mediante visualización de imágenes en movimiento. La Figura 26A proporciona marcos representativos como imágenes fijas. La parte izquierda muestra un control del corazón infartado, mientras que la 20 parte derecha muestra un resultado de una lámina de mioblastos de la presente invención.

La Figura 26B muestra un análisis mediante ecografías de ultrasonidos de ejemplo del tratamiento usando un tejido protésico de la presente invención. La Figura 26B es una fotografía que muestra la misma muestra que en las Figuras 25A a 25C a un punto de tiempo diferente. Los resultados de la ecográfica de ultrasonidos se 25 muestran mediante visualización de imágenes en movimiento. La Figura 26B proporciona marcos representativos como imágenes fijas. La parte izquierda muestra un control del corazón infartado, mientras que la parte derecha muestra un resultado de una lámina de mioblastos de la presente invención.

La Figura 26C muestra un análisis mediante ecografías de ultrasonidos de ejemplo del tratamiento usando un 30 tejido protésico de la presente invención. La Figura 26C es una fotografía que muestra la misma muestra que en las Figuras 25A a 25C a un punto de tiempo diferente. Los resultados de la ecográfica de ultrasonidos se muestran mediante visualización de imágenes en movimiento. La Figura 26C proporciona marcos representativos como imágenes fijas. La parte izquierda muestra un control del corazón infartado, mientras que la parte derecha muestra un resultado de una lámina de mioblastos de la presente invención. 35

Las Figuras 27A a 27C muestran un análisis mediante ecografías de ultrasonidos de ejemplo del tratamiento usando un tejido protésico de la presente invención. Los resultados de la ecográfica de ultrasonidos para un corazón infartado tratado de acuerdo con la presente invención se muestran mediante visualización de imágenes en movimiento. Las Figuras 27A a 27C proporcionan marcos representativos como imágenes fijas. 40

La Figura 28 muestra la afinidad celular mediante RT-PCR.

La Figura 29 muestra un cambio en una lámina de mioblastos implantada tras la implantación.

45

La Figura 30A muestra un ejemplo de la tinción tricrómica de Masson de un tejido protésico de la presente invención usando mioblastos, que se aplicó a un hámster con cardiomiopatía. La parte superior muestra la implantación de una lámina (tejido protésico), implantación celular y un control (×10). La parte inferior muestra una vista agrandada para cada uno (×40).

50

La Figura 30B muestra la histología (la lámina de mioblastos es aceptada por un corazón cardiomiopático dilatado y agranda una pared ventricular).

La Figura 30C muestra la comparación de los niveles de expresión de α-sarcoglicano (la implantación de la lámina de mioblastos potencia la expresión de α-sarcoglicano). 55

La Figura 30D muestra la comparación de los niveles de expresión de β-sarcoglicano (la implantación de la lámina de mioblastos potencia la expresión de β-sarcoglicano).

La Figura 31 muestra una tasa de supervivencia de hámsteres cardiomiopático en los que se ha implantado un 60 tejido protésico (lámina) que comprende mioblastos de la presente invención. La inyección de células como tales se compara con la administración de un tejido protésico.

La Figura 32 muestra las características eléctricas tras la implantación de un tejido protésico de la presente invención. La parte izquierda muestra un tejido protésico que comprende cardiomiocitos, mientras que la parte 65 derecha muestra un tejido protésico que comprende mioblastos.

La Figura 33A muestra una terapia para hámster con miocardiopatía dilatada usando un tejido protésico de la presente invención. La parte izquierda muestra la FE, mientras que la parte derecha muestra la tinción con HE. La parte inferior derecha muestra la tinción tricrómica de Masson.

La Figura 33B muestra un resultado de la ecocardiografía 48 semanas después de la implantación (la 5 implantación de láminas de mioblastos mejora la función cardíaca de un corazón con miocardiopatía dilatada).

La Figura 33C muestra un resultado de la ecocardiografía (la contractilidad de un ventrículo izquierdo) 48 semanas después de la implantación (la implantación de láminas de mioblastos mejora la contractilidad del ventrículo izquierdo con miocardiopatía dilatada). 10

La Figura 34 muestra un ejemplo de una terapia para un modelo de infarto en cerdos usando un tejido protésico de la presente invención.

La Figura 35 muestra un efecto terapéutico (contractilidad) en un modelo de infarto en cerdos usando un tejido 15 protésico de la presente invención.

La Figura 36 muestra un efecto terapéutico (expansibilidad) en un modelo de infarto en cerdos usando un tejido protésico de la presente invención.

20

La Figura 37 muestra una lámina producida mediante un método de producción de tejido protésico sin ácido ascórbico.

La Figura 38 muestra una lámina producida mediante un método de producción de tejido protésico con ácido ascórbico de acuerdo con la presente invención. 25

La Figura 39 muestra una lámina producida mediante un método de producción de tejido protésico con ácido ascórbico de acuerdo con la presente invención (tinción con HE).

La Figura 40 muestra una técnica para medir las características de tensión y distorsión para determinar la 30 resistencia a la tracción.

La Figura 41 muestra un método para obtener una carga/eliminación de una curva de carga.

La Figura 42 muestra un estado de un tejido obtenido cultivando células sinoviales en presencia de ácido 35 ascórbico 2-fosfato.

(Descripción del listado de secuencias)

La SEC ID Nº 1 expone una secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de miosina IIa (humana: Nº de 40 acceso NM_017534).

La SEC ID Nº 2 expone una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de miosina IIa (humana: Nº de acceso NM_017534).

45

La SEC ID Nº 3 expone una secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de miosina IIb (humana: Nº de acceso NM_017533).

La SEC ID Nº 4 expone una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de miosina IIb (humana: Nº de acceso NM_017533).

50

La SEC ID Nº 5 expone una secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de miosina IId (IIx) (humana: Nº de acceso NM_005963).

La SEC ID Nº 6 expone una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de miosina IId (IIx) (humana: Nº de acceso NM_005963). 55

La SEC ID Nº 7 expone una secuencia de ácido nucleico de la CD56 (humana: Nº de acceso U63041).

La SEC ID Nº 8 expone una secuencia de aminoácidos de la CD56 (humana: Nº de acceso U63041).

60

La SEC ID Nº 9 expone una secuencia de ácido nucleico de MyoD humana (nº de acceso en GENBANK X56677).

La SEC ID Nº 10 expone una secuencia de polipéptidos codificada por la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº 2.

65

La SEC ID Nº 11 expone una secuencia de ácido nucleico del factor 5 miogénico humano (nº de acceso en

GENBANK NM_005593).

La SEC ID Nº 12 expone una secuencia de polipéptidos codificada por la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº 3.

5

La SEC ID Nº 13 expone una secuencia de ácido nucleico de la miogenina humana (factor biogénico 4) (nº de acceso en GENBANK BT007233).

La SEC ID Nº 14 expone una secuencia de polipéptidos codificada por la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº 5. 10

La SEC ID Nº 15 expone un cebador directo en la RT-PCR para SRY.

La SEC ID Nº 16 expone un cebador inverso en la RT-PCR para SRY.

15

La SEC ID Nº 17 expone una sonda en la RT-PCR para SRY.

La SEC ID Nº 18 expone un cebador directo en la RT-PCR para IL2.

La SEC ID Nº 19 expone un cebador inverso en la RT-PCR para IL3. 20

La SEC ID Nº 20 expone una sonda en la RT-PCR para IL2.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

25

La presente invención se describirá a continuación. Debe entenderse a lo largo de la presente memoria descriptiva que los artículos para las formas en singular incluyen el concepto de su pluralidad a menos que se mencione lo contrario. Por tanto, los artículos o adjetivos par alas formas en singular (por ejemplo, “un/uno”, “una”, “el/la” y similares) incluyen el concepto de su pluralidad a menos que se especifique lo contrario. Asimismo, debe entenderse que los términos como se usan en el presente documento tienen las definiciones usadas habitualmente en la técnica 30 a menos que se mencione lo contrario. Por tanto, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entienden habitualmente los expertos en la técnica relevante. Por el contrario, la presente solicitud (incluyendo las definiciones) tiene prioridad.

(Definición de los términos) 35

Las definiciones de los términos específicos usados en el presente documento se describen más adelante.

(Medicina regeneradora)

40

Como se usa en el presente documento, el término “regeneración” hace referencia a un fenómeno donde cuando un organismo individual pierde una parte de tejido, el tejido restante crece y se recupera. La extensión o modo de regeneración varía en función de la especie animal o entre los tejidos en el mismo individuo. La mayoría de los tejidos humanos tienen una capacidad de regeneración limitada y, por tanto, no se espera que se produzca la regeneración completa si se pierde una gran parte de tejido. En el caso de daños graves, puede crecer un tejido que 45 tiene una fuerte capacidad de proliferación diferente de la del tejido perdido, lo que tiene como resultad una regeneración incompleta cuando el tejido dañado se regenera de forma incompleta y la función del tejido no se puede recuperar. En este caso, se usa una estructura hecha de un material bioabsorbible para prevenir que un tejido que tenga una fuerte capacidad de proliferación infiltre la parte defectuosa del tejido para asegurar un espacio para la proliferación del tejido dañado. Además, suplementando con un factor de crecimiento celular, se potencia la 50 capacidad de regeneración del tejido dañado. Dicha técnica de regeneración se aplica a cartílagos, huesos y nervios periféricos, por ejemplo. Hasta ahora se ha creído que las células nerviosas y los músculos cardíacos tienen nula o mala capacidad de regeneración. Recientemente se ha notificado que existen células madre de tejido (células madre somáticas), que tienen ambas la capacidad de diferenciarse en estos tejidos y capacidad de autoproliferación. Las expectativas son muy altas para la medicina regenerativa usando células madre de tejido. Las células madre 55 embrionarias (células ME) son células que tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tejidos. Se han efectuado esfuerzos para usar células ME para la regeneración de órganos complicados, tales como de riñón, de hígado y similares, pero todavía no se han realizado.

El término “célula” se usa en el presente documento en su sentido más amplio en la técnica, haciendo referencia a 60 una unidad estructural de tejido de un organismo multicelular, que es capaz de autorreplicarse, tiene información genética y un mecanismo para expresarla y está rodeada por una estructura de membrana que aísla el cuerpo vivo del exterior. En el método de la presente invención se puede usar cualquier célula como sujeto. El número de células usadas en la presente invención se puede contar mediante un microscopio óptico. Al contra usando un microscopio óptico se cuenta el número de núcleos. Los tejidos se laminan en secciones de tejido que después se tiñen con 65 hematoxilina-eosina (HE) para variegar los núcleos derivados de matrices extracelulares (por ejemplo, elastina o

colágeno) y células. Estas secciones de tejido se observan bajo un microscopio óptico y se puede estimar que el número de núcleos en un área concreta (por ejemplo, 200 µm × 3200 µm) es el número de células. Las células usadas en el presente documento pueden ser células de origen natural o células modificadas artificialmente (por ejemplo, células de fusión, células modificadas genéticamente etc.). Ejemplos de fuentes de células incluyen, entre otros, un cultivo de una sola célula; el embrión, sangre, o tejido corporal de un animal transgénico que ha crecido 5 normalmente; una mezcla de células derivadas de líneas celulares cultivadas normalmente, y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión “célula madre” hace referencia a una célula capaz de autorreplicarse y pluripotencia. El término “célula madre” excluirá las células madre embrionarias humanas. Las células madre tisulares tienen un nivel relativamente limitado de diferenciación, al contrario que las células madre 10 embrionarias. Las células madre tisulares están presentes en los tejidos y tienen una estructura intracelular indiferenciada. Las células madre tisulares tienen una proparte núcleo/citoplasma más alta y tienen menos orgánulos intracelulares. La mayoría de las células madre tisulares tienen pluripotencia, un ciclo celular largo y capacidad de proliferación más allá de la vida del individuo. Como se usa en el presente documento, las células madre tisulares también se pueden usar dependiendo de la circunstancia. 15

Las células madre tisulares se clasifican en categorías de sitios de los que derivan las células, tales como el sistema dérmico, el sistema digestivo, el sistema de la médula ósea, el sistema nervioso y similares. Las células madre tisulares en el sistema dérmico incluyen células madre epidérmicas, células madre del folículo piloso y similares. Las células madre tisulares en el sistema digestivo incluyen células madre pancreáticas (habituales), células madre 20 hepáticas y similares. Las células madre tisulares en el sistema de la médula ósea incluyen células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimatosas y similares. Las células madre tisulares en el sistema nervioso incluyen células madre neurales, células madre retinianas y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión “célula somática” hace referencia a cualquier célula que no 25 sea una célula germinal, tal como un huevo, un espermatozoide o similares, que no transfiere su ADN a la siguiente generación. Normalmente, las células somáticas tienen nula o limitada pluripotencia. Las células somáticas usadas en el presente documento pueden ser de origen natural o estar modificadas genéticamente siempre que puedan alcanzar el tratamiento indicado.

30

El origen de una célula madre se clasifica en el ectodermo, endodermo o mesodermo. Las células madre de origen ectodérmico están principalmente presentes en el cerebro, incluidas las células madre neurales. Las células madre de origen endodérmico están principalmente presentes en la médula ósea, incluidas las células madre de los vasos sanguíneos, las células madre hematopoyéticas, las células madre mesenquimatosas y similares. Las células madre de origen mesodérmico están principalmente presentes en los órganos, incluyendo las células madre hepáticas, las 35 células madre pancreáticas, y similares. Como se usa en el presente documento, las células somáticas pueden derivar de cualquier mesénquima. Preferentemente, se pueden usar las células somáticas derivadas del mesénquima.

Las células para usar en la construcción de un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención 40 incluyen células madre mesenquimatosas.

Como células para usar en la construcción de un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención, puede ser empleados mioblastos (por ejemplo, mioblastos esqueléticos, etc.). Como tales células, se puede utilizar células diferenciadas o células madre. Se pueden utilizar células diferenciadas a partir de células 45 madre en una dirección deseada.

Como se usa en el presente documento, el término “aislado” significa que el material acompañante natural al menos se reduce, o preferentemente se elimina sustancialmente completamente, en circunstancias normales. Por tanto, la expresión "célula aislada” hace referencia a una célula sustancialmente libre de otras sustancias acompañantes (por 50 ejemplo, otras células, proteínas, ácidos nucleicos etc.) en circunstancias naturales. La expresión “tejido aislado” hace referencia a un tejido sustancialmente libre de sustancias distintas al tejido (por ejemplo, en el caso de tejidos protésicos, sustancias, armazones, láminas, recubrimientos etc. usados cuando se produce el tejido protésico. El término “aislado” en relación con ácidos nucleicos o polipéptidos significa que, por ejemplo, los ácidos nucleicos o los polipéptidos están sustancialmente libres de sustancias celulares o medios de cultivo cuando se producen 55 mediante técnicas de ADN recombinante; o sustancias químicas precursoras u otras sustancias químicas cuando se sintetizan químicamente. Los ácidos nucleicos aislados carecen preferentemente de secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico dentro de un organismo del que deriva el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en el extremo 5’ y el extremo 3’ del ácido nucleico).

60

Como se usa en el presente documento, el término “intacto” en relación con tejidos protésicos, estructuras tridimensionales y similares, hace referencia a ausencia de lesión externa física. Por ejemplo, cuando se produce un tejido protésico o similares y después se separa de una circunstancia donde se ha realizado la producción, tiene sustancialmente ninguna lesión externa, tal como impacto físico o similares.

65

Como se usa en el presente documento, el término "establecido” en relación con las células hace referencia a un

estado de una célula donde una propiedad concreta (pluripotencia) de la célula se mantiene y la célula sufre proliferación estable en condiciones de cultivo. Por tanto, las células madre establecidas mantienen la pluripotencia.

Como se usa en el presente documento, la expresión “no embrionario” hace referencia a no derivar directamente de embriones tempranos. Por tanto, la expresión “no embrionaria” hace referencia a células derivadas de partes del 5 cuerpo distintas a los embriones tempranos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “célula diferenciada” hace referencia a una célula que tiene una función y una forma especializadas (por ejemplo, células musculares, neuronas etc.) Al contrario que las células madre, las células diferenciadas tienen poca o nula pluripotencia. Los ejemplos de células diferenciadas incluyen 10 células epidérmicas, células del parénquima pancreático, células del conducto pancreático, células hepáticas, células sanguíneas, células de músculo cardíaco, células de músculo esquelético, osteoblastos, mioblastos esqueléticos, neuronas, células endoteliales vasculares, células pigmentarias, células de músculo liso, células de grasa, células óseas, células de cartílago y similares.

15

Como se usa en el presente documento, el término “tejido” se refiere a un grupo de células que tienen la misma función y forma en los organismos celulares. En organismos multicelulares, las células constituyentes normalmente están diferenciadas, de modo que las células tienen funciones especializadas, lo que da lugar a la división del trabajo. Por tanto, los organismos multicelulares no son simples agregaciones celulares sino que constituyen grupos de células orgánicas o sociales que tienen una determinada función y estructura. Como ejemplos de tejidos se 20 incluyen, entre otros, tejido del integumento, tejido conjuntivo, tejido muscular, tejido nervioso y similar Tejido diana en la presente invención es el corazón. En una realización preferida de la presente invención, el tejido diana de la presente invención incluye, pero no se limita a, los vasos sanguíneos, los vasos sanguíneos como el tejido, válvulas cardíacas, pericardio..

25

Como se usa en le presente documento, la expresión “tejido protésico” se refiere a tejido que tiene un estado diferente de los estados naturales. Normalmente, en el presente documento un tejido protésico se prepara mediante cultivo celular. El tejido que se elimina de u organismo y no se somete a ningún tratamiento no se denomina tejido protésico. Un tejido protésico puede incluir materiales derivados de organismos y materiales no derivados de organismos. El tejido protésico de la presente invención normalmente comprende una célula y/o material biológico y 30 puede comprender otros materiales. Más preferentemente, un tejido protésico de la presente invención está compuesto sustancialmente por, únicamente, una célula y/o un material biológico. Dicho material biológico deriva preferentemente de células que constituyen el tejido (por ejemplo, matriz extracelular etc.).

Como se usa en el presente documento, la expresión “tejido protésico implantable” hace referencia a un tejido 35 protésico que se puede usar para la implantación clínica real y puede funcionar como un tejido en el lugar de la implantación durante un determinado periodo de tipo tras la implantación. Normalmente, el tejido protésico implantable tiene resistencia suficiente, tamaño suficiente, no porosidad suficiente, espesor suficiente, biocompatibilidad suficiente, afinidad suficiente y similar.

40

La resistencia suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida por la implantación, pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. No obstante, un tejido protésico implantable tiene, preferentemente, al menos un nivel determinado de resistencia. Dicho nivel de resistencia (por ejemplo, resistencia a la tracción) es al menos aproximadamente un 50 % de la resistencia natural de una parte dirigida por la implantación, preferentemente al menos aproximadamente un 60 %, más preferentemente al menos 45 aproximadamente un 70 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente un 80 % y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 100 %. La resistencia se puede medir midiendo las características de resistencia o de distorsión o realizando una prueba de indentación de las características de deslizamiento como se describe más adelante.

50

El tamaño suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida por la implantación, pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. No obstante, un tejido protésico implantable tiene, preferentemente, al menos un nivel determinado tamaño. Dicho tamaño (por ejemplo, área) es al menos 6 cm2, al menos 7 cm2, al menos 8 cm2, al menos 9 cm2, al menos 10 cm2, al menos 15 cm2, o al menos 20 cm2. 55

La no porosidad suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida por la implantación, pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. Como se usa en el presente documento, el término “no porosidad” hace referencia a un estado que carece de poro(s). En el presente documento, el poro se refiere a un agujero que tiene un tamaño sustancial de un modo tal que el fluido corporal o su equivalente 60 (por ejemplo, una solución acuosa etc.) se fuga de un tejido protésico. Por tanto, la no porosidad se puede determinar del siguiente modo. Un tejido protésico se coloca horizontalmente. El fluido corporal o su equivalente se coloca sobre el tejido. Se observa si el fluido corporal o su equivalente se sale o no del tejido. Si no hay fuga, se considera que el tejido tiene no porosidad.

65

El espesor suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida por la implantación,

pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. No obstante, un tejido protésico implantable tiene, preferentemente, al menos un nivel determinado espesor. Dicho espesor normalmente es de aproximadamente al menos 50 µm, preferentemente al menos aproximadamente 100 µm, más preferentemente aproximadamente 150 µm, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 200 µm, al menos aproximadamente 300 µm, al menos aproximadamente 400 µm, al menos aproximadamente 500 µm, al menos 5 aproximadamente 600 µm, al menos aproximadamente 700 µm, al menos aproximadamente 800 µm, al menos aproximadamente 900 µm, al menos aproximadamente 1 mm. Cuando un tejido protésico implantable se implanta en el corazón, el tejido puede tener solo estos espesores mínimos. Cuando se usa tejido protésico implantable en otras aplicaciones, el tejido puede tener, preferentemente, un espesor mayor. En este caso, por ejemplo, el tejido protésico implantable tiene, preferentemente, un espesor de al menos 2 mm, más preferentemente de al menos 3 10 mm e incluso más preferentemente de 5 mm.

La biocompatibilidad suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida por la implantación, pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. No obstante, un tejido protésico implantable tiene, preferentemente, al menos un nivel determinado de biocompatibilidad. Normalmente, un 15 nivel deseado de biocompatibilidad es, por ejemplo, tal que se alcanza la conexión biológica con los tejidos circundantes sin ninguna inflamación, ninguna reacción inmunitaria o similar. La presente invención no está limitada a esto. En algunos casos (por ejemplo, córneas etc.), es menos probable que se produzca una reacción inmunológica. Por tanto, un tejido protésico implantable tiene biocompatibilidad en cierta medida, que alcanza el objeto de la presente invención incluso cuando es probable que se produzca una reacción inmunológica en otros 20 órganos. Ejemplos de parámetros que indican biocompatibilidad incluyen, entre otros, la presencia o ausencia de una matriz extracelular, la presencia o ausencia de una reacción inmunológica, el grado de inflamación y similares. Dicha biocompatibilidad se puede determinar investigando la compatibilidad de un tejido protésico en un lugar de implantación tras la implantación (por ejemplo, confirmando que no se destruye un tejido protésico implantado). Véase "Hito Ishoku Zoki Kyozetsu Hanno no Byori Soshiki Shindan Kijyun Kanbetsu Shindan to Seiken Hyohon no 25 Toriatsukai (Zufu) Jinzo Ishoku, Kanzo Ishoku Oyobi Shinzo Ishoku [Pathological Tissue Diagnosis Criterion for Human Transplanted Organ Rejection Reaction Handling of Differential Diagnosis and Biopsy Specimen (Illustrated Book) Kidney Transplantation, Liver Transplantation and Heart Transplantation]" The Japan Society for Transplantation and The Japanese Society for Pathology editores, Kanehara Shuppan Kabushiki Kaisha (1998). De acuerdo con este documento, la biocompatibilidad se divide en de grado 0, 1A, 1B, 2, 3A, 3B y 4. En el grado 0 (sin 30 rechazo agudo), en las muestras de biopsia no se encuentran reacciones de rechazo agudo, fallo de los cardiomiocitos o similares. En el Grado 1A (rechazo agudo leve focal), existe infiltración focal de linfocitos grandes alrededor de los vasos sanguíneos o en el tejido intersticial, mientras que no hay daños en los cardiomiocitos. Esta observación se obtiene en una o una pluralidad de muestras de biopsia. En el Grado 1B (rechazo agudo leve difuso), existe infiltración difusa de linfocitos grandes alrededor de los vasos sanguíneos o en el tejido intersticial, o en 35 ambos, mientras que no hay daños en los cardiomiocitos. En el Grado 2 (rechazo agudo moderado focal), se observa un único foco de infiltración de células inflamatorias que claramente bordean las porciones circundantes. Las células de inflamación son linfocitos grandes activados y pueden incluir eosinófilos. En las lesiones se observan daños en los cardiomiocitos asociados con la modificación de músculo cardíaco. En el Grado 3A (rechazo agudo moderado multifocal) existen múltiples focos de infiltración de células inflamatorias que son linfocitos grandes 40 activados y pueden incluir eosinófilos. Do o más de los múltiples focos de infiltración inflamatoria de células inflamatorias tienen daños en los cardiomiocitos. En algunos casos, también hay una infiltración irregular de células inflamatorias en el endocardio. Los focos de infiltración se observan en una o una pluralidad de muestras de biopsia. En el Grado 3B (rechazo agudo grave límite y multifocal), existen más focos de infiltración confluente y difusa de células inflamatorias que se encuentran en más muestras de biopsia que los observados en el Grado 3A. Existe 45 infiltración de células inflamatorias, incluyendo linfocitos grandes y eosinófilos, en algunos casos neutrófilos, así como daños en los cardiomiocitos. No existe hemorragia. En el grado 4 (rechazo agudo grave), existe infiltración de varias células inflamatorias, incluyendo linfocitos activados, eosinófilos y neutrófilos. Siempre se producen daños a los cardiomiocitos y necrosis de cardiomiocitos. Normalmente también se observa edema, hemorragia y/o angeítis. Normalmente se observa infiltración de células inflamatorias en el endocardio, diferente del efecto de 50 "acolchamiento". Cuando se administra una fuerte terapia usando un inmunosupresor durante un periodo de tiempo considerablemente largo, el edema y la hemorragia pueden ser más significativos que la infiltración.

La afinidad suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida mediante implantación, pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. Ejemplos de parámetros para la afinidad 55 incluyen, entre otros, capacidad de realizar conexión biológica entre un tejido protésico implantado y su lugar de implantación, y similares. Dicha afinidad se puede determinar en base a la presencia de conexión biológica en un lugar de implantación tras la implantación. La afinidad preferible es tal en el presente documento que un tejido protésico implantado tenga la misma función que la de un lugar donde se implanta el tejido, por ejemplo.

60

Como se usa en el presente documento, la expresión “tejido membranoso” hace referencia a un tejido en forma de membrana y también se denomina “tejido planar”. Ejemplos de tejido membranoso incluyen una parte de tejido que tiene una determinada zona de un órgano (por ejemplo, pericardio, duramadre, córnea etc.) o tejido en forma de bolsa y similares.

65

Como se usa en el presente documento, el término “órgano” hace referencia a una estructura que es una parte

específica de un organismo individual donde una determinada función del organismo individual se realiza localmente y que es morfológicamente independiente. En general, en organismos multicelulares (por ejemplo, animales y plantas), los órganos están hechos de varios tejidos en una disposición espacial específica y el tejido está hecho de una serie de células. Ejemplos de dichos órganos incluyen, entre otros, piel, vaso sanguíneo, córnea, riñón, corazón, hígado, cordón umbilical, intestino, nervio, pulmón, placenta, páncreas, cerebro, articulación, hueso, cartílago, 5 extremidades periféricas, retina y similares. Ejemplos de dichos órganos incluyen, entre otros, órganos del sistema de la piel, el sistema pancreático parenquimatoso, el sistema ductal pancreático, el sistema hepático, el sistema sanguíneo, el sistema del miocardio, el sistema muscular esquelético, el sistema de los osteoblastos, el sistema de mioblastos esqueléticos, el sistema nervioso, el sistema endotelial de los vasos sanguíneos, el sistema pigmentario, el sistema de músculo liso, el sistema graso, el sistema óseo, el sistema de cartílago y similares. 10

Como se usa en el presente documento, la expresión “órgano en forma de bolsa” hace referencia a un órgano que tiene una expansión tridimensional y cuyo interior puede estar conectado a través de un tejido tubular con el exterior. Ejemplos de órganos con forma de bolsa incluyen, entre otros, corazón, hígado, riñón, estómago, bazo y similares.

15

En una realización, la presente invención está dirigida al corazón y, preferentemente, a corazones isquémicos (por ejemplo, corazón que tiene infarto de miocardio, corazón que tiene isquemia etc.). En una realización preferida, la presente invención está dirigida a vasos sanguíneos, tejido de tipo vaso sanguíneo, válvulas cardiacas, pericardio. En otra realización preferida, la presente invención está dirigida al corazón, las válvulas cardíacas, el pericardio y los vasos sanguíneos. 20

Como se usa en el presente documento, el término “envuelve” en relación con un tejido protésico, una estructura tridimensional o similares que envuelve una parte determinada (por ejemplo, un lugar dañado, etc.) significa que el tejido protésico o similar está dispuesto de un modo tal que cubre la parte (es decir, oculta una lesión o similar). Los términos “envuelve(n)” y “dispone(n) (o localiza(n)) de modo que cubre(n)” se usan de forma intercambiable. 25 Observando la relación especial entre la parte y el tejido protésico o similar se puede determinar si la parte está o no cubierta por el tejido protésico o similar. En una realización preferida, en una etapa de envoltura, un tejido protésico o similar puede envolver con un giro un determinado sitio.

Un “tiempo suficiente requerido para que un tejido protésico se una biológicamente a una parte” en el presente 30 documento varía en función de una combinación de la parte y el tejido protésico, pero los expertos en la técnica pueden determinarlo según se adecuado en base a la combinación. Ejemplos de dicho tiempo incluyen, entre otros, 2 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año y similares, tras la operación. En la presente invención, un tejido protésico comprende, preferentemente, sustancialmente solo células y materiales derivados de las células y, por tanto, no existe material concreto que necesite extraerse después de la operación. Por tanto, el 35 límite inferior del tiempo suficiente no es particularmente importante. Por tanto, en este caso, es más preferible un tiempo más prolongado. Si el tiempo es sustancialmente extremadamente largo, el refuerzo se completa sustancialmente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “reacción inmunológica” hace referencia a una reacción debido 40 a la disfunción de la tolerancia inmunológica entre un injerto y un huésped. Ejemplos de reacciones inmunológicas incluyen, entre otros, una reacción de rechazo hiperagudo (en varios minutos desde la implantación) (reacción inmunológica causada por anticuerpos, tal como β-Gal o similar), una reacción de rechazo agudo (reacción causada por la inmunidad celular aproximadamente de 7 a 21 días después de la implantación), una reacción de rechazo crónico (reacción de rechazo causada por la inmunidad celular 3 o más meses después de la operación) y similares. 45

Como se usa en el presente documento, la provocación de una reacción inmunológica se puede confirmar mediante análisis patológico e histológico del tipo, el número o similar de la infiltración de células (inmunológicas) en tejido implantado usando tinción (por ejemplo, tinción con HE etc.), tinción inmunológica o inspección microscópica de secciones tisulares. 50

Como se usa en el presente documento, el término “calcificación” hace referencia a la precipitación de sustancias calcáreas en organismos.

Como se usa en el presente documento, la “calcificación” in vivo se puede determinar midiendo la concentración de 55 calcio. Específicamente, se extrae el tejido implantado; la sección tisular se disuelve mediante tratamiento ácido o similar y la absorción atómica de la solución se mide mediante un dispositivo de cuantificación de oligoelementos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “dentro del o los organismos” o "in vivo" hace referencia a la parte interna del o los organismos. En un contexto específico, “dentro del o los organismos” hace referencia a una 60 posición en la cual se coloca un tejido u órgano sujeto.

Como se usa en el presente documento, "in vitro" indica que una parte de un organismo se extrae o libera fuera del organismo para varios fines de investigación (por ejemplo, en un tubo de ensayo). El término in vitro contrasta con el término in vivo. 65

Como se usa en el presente documento, el término "ex vivo" hace referencia a una serie de operaciones en las que las células diana en las que se va a introducir un gen se extraen de un sujeto, se introduce un gen terapéutico in vitro en las células y las células se devuelven al mismo sujeto.

Como se usa en el presente documento, la expresión “material derivado de célula(s)” hace referencia a cualquier 5 material procedente de la(s) célula(s), incluyendo, entre otros, materiales que constituyen la(s) célula(s), materiales secretados por la(s) célula(s), materiales metabolizados por la(s) célula(s) o similares. Ejemplos representativos de materiales derivados de las células incluyen, entre otros, matrices extracelulares, hormonas, citocinas y similares. Los materiales derivados de las células normalmente no tienen sustancialmente efectos adversos sobre las células y sus huéspedes. Por tanto, cuando el material está contenido en un tejido protésico, una estructura tridimensional o 10 similar, el material normalmente carece sustancialmente de efectos adversos sobre el tejido protésico, la estructura tridimensional o similar.

Como se usa en el presente documento, la expresión “matriz extracelular” (MEC) hace referencia a una sustancia que existe entre las células somáticas con independencia de si las células son células epiteliales o células no 15 epiteliales. Las matrices extracelulares normalmente son producidas por las células y, por tanto, son materiales biológicos. Las matrices extracelulares están implicadas en el soporte de tejido, así como en la estructura ambiental interna esencial para la supervivencia de todas las células somáticas. Las matrices extracelulares generalmente son producidas por las células del tejido conjuntivo. Algunas matrices extracelulares se secretan de las células que poseen membrana basal, tales como células epiteliales o células endoteliales. Las matrices extracelulares se dividen 20 aproximadamente en componentes fibrosos y matrices que los llenan. Los componentes fibrosos incluyen fibras de colágeno y fibras elásticas. Un componente básico de las matrices es el glucosaminoglucano (mucopolisacárido ácido), la mayor parte del cual está unido a proteínas no colagenosas para formar un polímero de un proteoglicano (complejo mucopolisacárido ácido-proteína). Además, las matrices incluyen glucoproteínas, tales como laminina de la membrana basal, microfibrillas alrededor de las fibras elásticas, fibronectinas sobre las superficies celulares y 25 similares. Tejido particularmente diferenciado tiene la misma estructura básica. Por ejemplo, en el cartílago hialino, los condroblastos producen característicamente una gran cantidad de matrices cartilaginosas, incluyendo proteoglicanos. En los huesos, los osteoblastos producen matrices óseas que producen calcificación. En una realización de la presente invención, el tejido protésico, la estructura tridimensional o similar de la presente invención pueden ser ventajosamente similares a la composición de una matriz extracelular (por ejemplo, elastina, colágeno 30 (por ejemplo de tipo I, de tipo IV etc.), laminina etc.) de un sitio de un órgano para el que se pretende la implantación. En la presente invención, las matrices extracelulares incluyen moléculas de adhesión celular. Como se usa en el presente documento, las expresiones “molécula de adhesión celular” y “molécula de adhesión” se usan de forma intercambiable, en referencia a una molécula capaz de mediar la unión de dos o más células (adhesión celular) o adhesión entre un sustrato y una célula. En general, las moléculas de adhesión celular se dividen en dos 35 grupos: Moléculas implicadas en la adhesión célula-célula (adhesión intercelular) (moléculas de adhesión célula-célula) y moléculas implicadas en la adhesión célula-matriz extracelular (adhesión célula-sustrato) (moléculas de adhesión célula-sustrato). Un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención normalmente comprende dicha molécula de adhesión celular. Por tanto, las moléculas de adhesión celular en el presente documento incluyen una proteína de un sustrato y una proteína de una célula (por ejemplo, integrina etc.) en una 40 adhesión célula-sustrato. Una molécula distinta a las proteínas entra dentro del concepto de molécula de adhesión celular siempre que pueda participar en la adhesión celular.

Para la adhesión célula-célula se conocen la cadherina, una serie de moléculas que pertenecen a una superfamilia de inmunoglobulinas (NCAML1, ICAM, fasciclina II, III, etc.), la selectiva y similares, cada una de ellas se sabe que se unen a las membranas celulares a través de una reacción molecular específica. Por tanto, en una realización, el 45 tejido protésico, estructura tridimensional o similar de la presente invención tiene, preferentemente, sustancialmente la misma composición de cadherina, moléculas de la superfamilia de inmunoglobulinas o similares que la de un sitio para el cual se pretende la implantación.

Por tanto, varias moléculas están implicadas en la adhesión celular y tienen diferentes funciones. Los expertos en la 50 técnica pueden seleccionar adecuadamente una molécula para estar contenida en un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención en función de la finalidad. Las técnicas para la adhesión celular son bien conocidas como se ha descrito anteriormente y como se describe en, por ejemplo, "Saibogaimatorikkusu - Rinsho heno Oyo- [Extracellular matrix -Clinical Applications-], Medical Review.

55

Se puede determinar si una determinada molécula es una molécula de adhesión celular o no mediante un ensayo, como cuantificación bioquímica (un método de SDS-PAGE, un método de colágeno marcado etc.), cuantificación inmunológica (un método de enzima anticuerpo, un método de anticuerpo fluorescente, un estudio inmunohistológico etc.), un método de PCR, un método de hibridación o similares, donde se detecta una reacción positiva. Los ejemplos de dicha molécula de adhesión celular son, entre otros, colágeno, integrina, fibronectina, laminina, 60 vtronectina, fibrinógeno, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas (por ejemplo, CD2, CD4, CD8, ICM1, ICAM2, VCAM1), selectina, cadherina y similares. La mayoría de estas moléculas de adhesión celular se transmiten a una célula una señal auxiliar para la activación celular debido a la interacción intercelular, así como adhesión celular. Por tanto, un factor de adhesión para su uso en un implante de la presente invención transmite, preferentemente, una señal auxiliar para la activación celular en una célula. Esto es porque la activación celular 65 puede estimular el crecimiento de células presentes inicialmente o que se agregan en un tejido u órgano en un punto

dañado después de la aplicación al mismo de un implante. Se puede determinar si dicha señal auxiliar se puede o no transmitir a una célula mediante un ensayo, tal como cuantificación bioquímica (un método de SDS-PAGE, un método de colágeno marcado etc.), cuantificación inmunológica (un método de enzima anticuerpo, un método de anticuerpo fluorescente, un estudio inmunohistológico etc.), un método de PCR, un método de hibridación o similares, donde se detecta una reacción positiva. 5

Un ejemplo de una molécula de adhesión celular es la cadherina, que está presente en muchas células capaces de fijarse al tejido. La cadherina se puede usar en una realización preferida de la presente invención. Ejemplos de una molécula de adhesión celular en las células de la sangre y el sistema inmunológico que no están fijadas a tejido incluyen, entre otros, moléculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas (CD 2, LFA-3, ICAM-1, CD2, CD4, CD8, 10 ICM1, ICAM2, VCAM1, etc.); moléculas de la familia de la integrina ((LFA-1, Mac-1, gpIIbIIIa, p150, p95, VLA1, VLA2, VLA3, VLA4, VLA5, VLA6, etc.); moléculas de la familia de la selectina (L-selectina, E-selectina, P-selectina, etc.), y similares. Por tanto, dicha molécula puede ser útil para el tratamiento de un tejido u órgano de la sangre y el sistema inmunológico.

15

Las células no fijadas tienen que adherirse a un tejido específico para actuar sobre el tejido. En este caso, se cree que la adhesión célula-célula se potencia gradualmente a través de una primera adhesión mediante una molécula de selectina o similar, que se expresa constantemente y una segunda adhesión mediante una molécula de integrina activada posteriormente. Por tanto, en la presente invención, una molécula de adhesión celular para participar en la primera adhesión y otra molécula de adhesión celular para participar en la segunda adhesión se pueden usar juntas. 20

Como se usa en el presente documento, la expresión “tasa de lesión tisular” hace referencia a un parámetro que indica una función de un tejido u órgano; un indicador que indica cuánto se daña un tejido u órgano tratado; y un indicador que indica si un tejido u órgano puede tener o no su función original. Los métodos para determinar una tasa de lesión tisular se conocen en la técnica. Por ejemplo, una tasa de lesión tisular se puede determinar contando 25 los sitios de rotura de la elastina. En el presente documento, un campo visual se divide en unidades de 100 µm × 100 µm. En cada unidad se determina la presencia o ausencia de un sitio de rotura de la elastina. Si existe un sitio de rotura de la elastina en una unidad se incrementa el recuento. Un campo visual tiene 24 unidades. Las matrices extracelulares de las secciones tisulares teñidas mediante tinción con HE se someten a inspección microscópica y recuento. El tejido no tratado se define como que tiene una tasa de lesión tisular del 0 %. Una tasa de lesión tisular 30 se calcula mediante x/24. En este caso, el tejido no tratado corresponde a x=0.

Como se usa en el presente documento, el término “resistencia del tejido” se refiere a un parámetro que indica una función de un tejido u órgano y una resistencia física del tejido u órgano. La resistencia del tejido se puede determinar generalmente midiendo la resistencia a la tracción (por ejemplo, la resistencia de rotura, el módulo de 35 rigidez, el módulo de Young, etc.). Dicha prueba de tracción general es bien conocida. Analizando los datos obtenidos mediante una prueba de tracción general se pueden obtener varios datos, como la resistencia a la rotura, el módulo de rigidez, el módulo de Young y similares. Estos valores se pueden usar en el presente documento como indicadores de la resistencia del tejido. Normalmente, en el presente documento se requiere resistencia del tejido que permite aplicaciones clínicas. 40

La resistencia a la tracción de un tejido protésico, estructura tridimensional o similar de la presente invención se puede determinar midiendo las características de estrés y distorsión del mismo. En resumen, se aplica una carga a una muestra y la distorsión resultante y la carga se introducen en respectivos convertidores A/D (por ejemplo, ELK-5000) (1 ch: distorsión, 2 ch: carga); las características de estrés y distorsión se miden para determinar la resistencia 45 a la tracción de la muestra (Figura 40). La resistencia a la tracción también se puede determinar analizando las características de deslizamiento. Se realiza una indentación de las características de deslizamiento para investigar cómo se extiende una muestra en el tiempo mientras se aplica una carga constante a la muestra. Para materiales pequeños, materiales finas y similares se realiza una prueba de indentación usando, por ejemplo, un indentador con forma de pirámide triangular con una punta que tiene un radio de aproximadamente 0,1 µm a aproximadamente 1 50 µm. Inicialmente, el indentador es empujado al interior de una pieza de prueba de forma que se proporciona una carga a la pieza de prueba. Cuando el indentador alcanza de varias decenas de nanómetros a varios micrómetros de profundidad en la pieza de prueba, se extrae el indentador para retirar la carga. La Figura 41 muestra una carga/retirada de la curva de carga obtenida mediante el método de prueba descrita anteriormente. La rigidez, el módulo de Young o similares se pueden obtener según el comportamiento de la carga y la profundidad de empuje 55 derivada de la curva.

En una realización preferida, la resistencia a la tracción del tejido protésico o la estructura tridimensional de la presente invención normalmente es de al menos aproximadamente un 50 % de la resistencia natural de una parte donde se pretende la implantación, preferentemente de al menos aproximadamente un 60 %, más preferentemente 60 de al menos aproximadamente un 70 %, incluso más preferentemente de al menos aproximadamente un 80 %, y lo más preferentemente de al menos aproximadamente un100 %.

En una realización alternativa, el tejido protésico de la presente invención puede tener una resistencia tisular de al menos aproximadamente un 75 % de la de una parte de tejido natural (por ejemplo, una parte donde se pretende 65 una aplicación clínica (por ejemplo, corazón, etc.)), preferentemente, al menos aproximadamente un 80 %, más

preferentemente, al menos aproximadamente un 85 %, e incluso más preferentemente, al menos aproximadamente un 90 %. La resistencia tisular del tejido protésico puede ser igual o superior a la del tejido natural. La resistencia tisular de un tejido natural hace referencia a una resistencia tisular poseída por un tejido de interés en su estado natural. Además del tejido membranoso, otros tejidos (por ejemplo, tejido tubular etc.) tienen, preferentemente, una resistencia tisular suficientemente fuerte. En el caso del tejido tubular, la resistencia tisular se puede representar 5 mediante un valor β. En otra parte de la presente memoria descriptiva se describirá con detalle un método para calcular un valor β y también se ilustrará en los ejemplos siguientes. En una realización determinada, el tejido protésico de la presente invención tiene una resistencia tisular correspondiente a un valor β de al menos aproximadamente 15, preferentemente de al menos aproximadamente 18, más preferentemente de al menos aproximadamente 20, e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente 22. En otra realización, el tejido 10 protésico de la presente invención tiene un valor β de al menos aproximadamente el 75 % del tejido antes del tratamiento, preferentemente de al menos aproximadamente el 80 %, más preferentemente de al menos aproximadamente el 85 % e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente el 90 %. El valor β del tejido protésico puede ser igual o superior al poseído originalmente por el tejido sin tratar. Una característica (por ejemplo, un valor β) del tejido sin tratar hace referencia a una característica del tejido antes del tratamiento (por 15 ejemplo, tratamiento usando el polímero 1,2-epóxido en la presente invención) (por ejemplo, en el estado natural). Por tanto, por ejemplo, si un tejido original tiene un valor β de 25, un tejido protésico de la presente invención puede tener, preferentemente, un valor β de al menos 17,5, preferentemente de al menos 20, más preferentemente de al menos 21,25 e incluso más preferentemente de al menos 22,5.

20

Como se usa en el presente documento, en el caso del tejido tubular, la resistencia tisular se puede representar mediante un parámetro de rigidez (valor β). El valor β se puede calcular basándose en la expresión siguiente después de establecer la relación P-D (presión-diámetro):

Ln (P/Ps) = β (D/Ds) – 1) (1) 25

donde Ps y Ds representan sus valores normales a 100 mmHg. El valor del diámetro (D) se mide bajo cada P (presión).

Ambos extremos de un tejido tubular (por ejemplo, un vaso sanguíneo etc) está cada uno fijado a una unidad de tipo 30 tubo. El interior y el exterior del tejido se llenan con solución salina fisiológica. En esta situación se aplica presión al interior del tejido mediante un dispositivo externo, mientras se vigila el diámetro externo del tejido bajo la presión. La presión medida y el diámetro externo se sustituyen en la expresión (1) para calcular un valor β (Sonoda H., Takamizawa K. et al., J. Biomed. Matr. Res., 2001: 266-276).

35

Como se usa en el presente documento, la expresión “sustancia fisiológicamente activa” hace referencia a una sustancia capaz de actuar sobre una célula o tejido. Entre las sustancias fisiológicamente activas se incluyen citocinas y factores de crecimiento. Una sustancia fisiológicamente activa celular puede ser de origen natural o sintético. Preferentemente, una sustancia fisiológicamente activa celular es una que es producida por una célula o una que tiene una función similar a ella. Como se usa en el presente documento, una sustancia fisiológicamente 40 activa celular puede estar en forma de una proteína o un ácido nucleico o en otras formas. En la práctica real, las sustancias celulares fisiológicamente activas son normalmente proteínas. En la presente invención, una sustancia fisiológicamente activa puede usarse, por ejemplo, para estimular la afinidad de un tejido protésico implantado de la presente invención.

45

El término “citocina” se usa en el presente documento en el sentido más amplio en la técnica y hace referencia a una sustancia fisiológicamente activa que se produce en una célula y actúa en la misma célula o en una diferente. Generalmente, las citocinas son proteínas o polipéptidos que tienen una función de controlar una respuesta inmunológica, regular el sistema endocrino, regular el sistema nervioso, actuar contra un tumor, actuar contra un virus, regular el crecimiento celular, regular la diferenciación celular o similares. En el presente documento, las 50 citocinas están en forma de una proteína o un ácido nucleico o en otras formas. En la práctica real, las citocinas normalmente son proteínas.

Las expresiones “factor de crecimiento” o “factor de crecimiento celular” se usan en el presente documento de forma intercambiable y cada una hace referencia a una sustancia que estimula o controla el crecimiento celular. Los 55 factores de crecimiento también se denominan “factores de proliferación” o “factores de desarrollo”. Los factores de crecimiento pueden añadirse al medio de cultivo celular o tisular sustituyendo por macromoléculas séricas. Se ha revelado que una serie de factores de crecimiento tienen una función de controlar la diferenciación además de una función de estimular el crecimiento celular.

60

Ejemplos de citocinas incluyen de forma representativa, entre otros, interleucinas, quimiocinas, factores hematopoyéticos tales como factores estimulantes de las colonias, un factor de necrosis tumoral, interferones, un factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un factor de crecimiento endotelial (VEGF), cardiotrofina y similares, que tienen actividad de proliferación. 65

Las sustancias celulares fisiológicamente activas, tales como citocinas, factores de crecimiento y similares normalmente tienen redundancia de su función. De acuerdo con lo anterior, la referencia en el presente documento a una citocina o factor de crecimiento concreto mediante un nombre o función también incluye cualquier otro nombre o función por el cual lo conocen los expertos en la técnica, siempre que el factor tenga la actividad de una sustancia celular fisiológicamente activa para su uso en la presente invención. Las citocinas o factores de crecimiento se 5 pueden usar en un agente terapéutico o farmacéutico de acuerdo con una realización preferida de la presente invención, siempre que tengan actividad preferible como se describe en el presente documento.

Por tanto, en una realización de la presente invención se reveló que cuando dicha citocina o factor de crecimiento (por ejemplo, HGF) se proporciona a un lugar de implantación (por ejemplo, un lugar de implantación del miocardio 10 etc.) junto con un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención, se observan la afinidad del tejido protésico o estructura tridimensional y una mejora de la función del lugar de implantación. Por tanto, la presente invención también proporciona dicha terapia combinada.

Como se usa en el presente documento, el término “diferenciación” hace referencia a un proceso de desarrollo del 15 estado de las partes compuestas de organismos, tales como células, tejidos u órganos, y un proceso en el cual se forma un tejido u órgano característico. El término “diferenciación” se usa principalmente en embriología, biología del desarrollo y similares. En los organismos se forman varios tejidos y órganos a partir de divisiones de un huevo fertilizado (una única célula) hasta un adulto. En estadios tempranos del desarrollo (es decir, antes de la división celular o después de una división celular insuficiente), cada célula o grupo celular no tiene una característica 20 morfológica o funcional y no es muy distinguible. Dicho estado se denomina “indiferenciado”. La “diferenciación” se puede producir a nivel de órganos. Una célula que constituye un organo se puede desarrollar en varias células o grupos de células que tienen diferentes características. Este fenómeno también se denomina diferenciación en un órgano en la formación del órgano. Por tanto, un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención puede comprender un tejido que incluye células diferenciadas. 25

Como se usa en el presente documento, los términos “implante”, “injerto” e “injerto tisular” se usan de forma intercambiable en relación con tejido homólogo o heterólogo o un grupo celular o un material artificial, que se inserta en un sitio concreto de un cuerpo y, después, forma una parte del cuerpo. Por tanto, un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención se puede usar como implante. Entre los ejemplos de injertos convencionales 30 se incluyen órganos o partes de órganos, vasos sanguíneos, tejido de tipo vaso sanguíneo, corazón, válvulas cardíacas, pericardio y similares. Por tanto, los injertos abarcan uno cualquier de estos que se inserta en una parte deficiente para compensar la deficiencia. Los injertos incluyen, entre otros, autoinjertos, aloinjertos y xenoinjertos, que dependen del tipo de su donante.

35

Como se usa en el presente documento, el término “autoinjerto” (un tejido, una célula, un órgano etc.) hace referencia a un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) que se implanta en el mismo individuo del que deriva el injerto. Como se usa en el presente documento, el término “autoinjerto” (un tejido, una célula, un órgano etc.) puede abarcar un injerto de un individuo genéticamente idéntico (por ejemplo, un gemelo idéntico) en un sentido amplio. Como se usa en el presente documento, los términos “autólogo” y “derivado de un sujeto" se usan de forma 40 intercambiable. Por tanto, la expresión “no derivado de un sujeto” en relación con un injerto indica que el injerto no es antólogo (es decir, heterólogo).

Como se usa en el presente documento, el término “aloinjerto” (un tejido, una célula, un órgano etc.) hace referencia a un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) que se implanta en un individuo que es de la misma especie pero 45 es genéticamente diferente del que deriva el injerto. Dado que un aloinjerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) es genéticamente diferente de un individuo (receptor) donde se implanta el injerto, el injerto puede provocar una reacción inmunológica. Dicho injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) incluye, entre otros, por ejemplo, un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) derivado de un padre.

50

Como se usa en el presente documento, el término “xenoinjerto” (un tejido, una célula, un órgano etc.) hace referencia a un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) que se implanta de una especie diferente. Por tanto, por ejemplo, cuando un ser humano es un receptor, un injerto derivado de porcino (un tejido, una célula, un órgano etc.) se denomina xenoinjerto (un tejido, una célula, un órgano etc.).

55

Como se usa en el presente documento, “receptor” (aceptor) hace referencia a un individuo que recibe un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) o materia implantada (un tejido, una célula, un órgano etc.) y también se denomina “huésped”. Por el contrario, un individuo que proporciona un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) o materia implantada (un tejido, una célula, un órgano etc.) se denomina “donante” (proveedor).

60

Con una técnica de formación de tejido protésico de la presente invención se puede usar un tejido protésico derivado de cualquier célula. Esto es porque un tejido protésico (por ejemplo, tejidos membranosos, órganos etc.) formado mediante el método de la presente invención puede exhibir una función deseada mientras que la tasa de lesión tisular se mantiene a un nivel que no interfiere con la terapia (es decir, un nivel bajo). Convencionalmente, los tejidos u órganos se usan como injertos sin modificar. Por el contrario, la presente invención proporciona un tejido que 65 comprende células conectadas tridimensionalmente. Dicho tejido protésico tridimensional no se puede conseguir

mediante técnicas convencionales y, por tanto, constituye un efecto significativo de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” hace referencia a un organismo al que se aplica el tratamiento de la presente invención y también se denomina “paciente”. Un paciente o sujeto puede ser, preferentemente, un ser humano. 5

Las células usadas opcionalmente en un tejido protésico, estructura tridimensional o injerto tisular de la presente invención pueden derivar de un origen singeneico (origen propio=, un origen alogénico (origen no propio) o un origen heterólogo. En vista de las reacciones de rechazo, son preferibles las células singénicas. Si las reacciones de rechazo no producen problemas se pueden usar células alogénicas. Las células que provocan reacciones de 10 rechazo se pueden usar tratando opcionalmente las células de un modo que superen las reacciones de rechazo. Los procedimientos para evitar reacciones de rechazo se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Shin Gekagaku Taikei, Dai 12 Kan, Zoki Ishoku (Shinzo Ishoku Hai Ishoku Gijutsuteki, Rinriteki Seibi kara Jisshi ni Mukete [New Whole Surgery, Vol. 12, Organ Transplantation (Heart Transplantation Lung Transplantation From Technical and Ethical Improvements to Practice)" (3ª edición revisada.), Nakayama Shoten]. Entre los ejemplos de dichos métodos 15 se incluyen un método que usa inmunosupresores o fármacos esteroideos y similares. Por ejemplo, actualmente existen los siguientes inmunosupresores para prevenir las reacciones de rechazo: "ciclosporina" (SANDIMMUNE/NEORAL); "tacrolimus" (PROGRAF); "azatioprina" (IMURAN); "hormona esteroidea" (prednina, metilprednina); y "anticuerpos frente a linfocitos T" (OKT3, ATG, etc.). Un método que se usa en todo el mundo como terapia de inmunosupresión preventiva en muchas instalaciones es el uso simultáneo de tres fármacos: ciclosporina, 20 azatioprina y hormona esteroidea. Un inmunosupresor se administra deseablemente de forma concurrente con un agente farmacéutico de la presente invención. La presente invención no está limitada a esto. Un inmunosupresor se puede administrar antes o después de un método de regeneración/terapéutico de la presente invención siempre que se pueda conseguir un efecto de inmunosupresión.

25

Las células usadas en la presente invención pueden derivarse de cualquier organismo (por ejemplo, vertebrados e invertebrados). Preferentemente se usan células derivadas de vertebrados. Más preferentemente se usan células derivadas de mamíferos (por ejemplo, primates, roedores etc.). Incluso más preferentemente se usan células derivadas de primates. Lo más preferentemente se usan células derivadas de un ser humano. Normalmente se usan, preferentemente, células de la misma especie que el huésped. 30

Entre los ejemplos de un sujeto tratado mediante un tejido protésico de la presente invención se incluyen el corazón que sufre una cardiopatía (por ejemplo, cardiopatías isquémicas, infarto de miocardio, miocardiopatía, miocardiopatía hipertrófica dilatada y miocardiopatía dilatada),

35

El tejido diana objeto de la presente invención es un corazón humano. El organismo dirigido por la presente invención son seres humanos.

Cuando un tejido protésico, estructura tridimensional o similar de la presente invención se usa como una válvula se pueden usar técnicas bien conocidas en la materia para uso general de válvulas protésicas para implantar el tejido 40 protésico o similar. Por ejemplo, en la técnica se conocen bien válvulas de tejido heterólogo sin endoprótesis. Por ejemplo, se conocen válvulas de tejido heterólogo sin endoprótesis. En las válvulas de tejido heterólogo, la presencia de una endoprótesis reduce el área eficaz del puerto de la válvula, que conduce a la calcificación o degeneración de las valvas de la válvula. Recientemente, usando la morfología de la parte de la base de la aorta porcina, una endoprótesis de válvula de tejido heterólogo sin endoprótesis ha atraído la atención como válvula protésica para la 45 válvula aórtica (Gross C., et al., Ann. Thorac. Surg., 68:919, 1999). Se considera que la ausencia de una endoprótesis tiene como resultado una pequeña diferencia de presión a través de la válvula, incluso cuando inevitablemente se usa una válvula de pequeño tamaño y también es eficaz para el agrandamiento postoperatorio del ventrículo izquierdo. Adicionalmente, la elasticidad de la parte de base de la aorta se mantiene, el estrés a la cúspide es pequeño y cabe esperar que la durabilidad mejore en comparación con una válvula de tejido con una 50 endoprótesis. Adicionalmente se pueden usar válvulas de tejido heterólogo sin endoprótesis en el caso de endocarditis debido a infección o infección de la válvula protésica. En la actualidad, se han notificado resultados postoperatorios a plazo medio sustancialmente satisfactorios de válvulas de tejido heterólogo sin endoprótesis en EE.UU. y Europa, y cabe esperar que los resultados a largo plazo sean satisfactorios (Gross C., et al., Ann. Thorac. Surg., 68:919, 1999). 55

Como se usa en la presente invención, la expresión “tamaño grande” en relación con un tejido protésico hace referencia al tamaño de una parte del mismo que no tiene poros. Representativamente, la expresión “tamaño grande” significa que la longitud en una dirección longitudinal de una parte que no tiene poros es de al menos 1 cm, preferentemente de al menos 1,5 cm e incluso más preferentemente de al menos 2 cm. En este caso, la longitud en 60 una dirección transversal del mismo también es de al menos 1 cm, preferentemente de al menos 1,5 cm e incluso más preferentemente de al menos 2 cm. La presente invención no está limitada a esto. Cuando un “tamaño grande” está representado por el área de un tejido protésico, el área de un círculo inscrito en una parte que no tiene poros es al menos 6 cm2.

65

Como se usa en el presente documento, el término “flexibilidad” en relación con un tejido protésico hace referencia a

una capacidad para aguantar estímulos físicos procedentes de ambientes externos (por ejemplo, presión). Un tejido protésico que tiene flexibilidad es preferible cuando el lugar de implantación se mueve o se deforma de modo autónomo o mediante efectos externos. Por tanto, dicho tejido protésico que tiene flexibilidad conserva, preferentemente, flexibilidad después de la implantación.

5

Como se usa en el presente documento, la expresión “extensibilidad y contractibilidad” en relación con un tejido protésico hace referencia a una capacidad para aguantar estímulos de extensión o contracción procedentes de ambientes externos (por ejemplo, pulsación). Un tejido protésico que tiene extensibilidad y contractibilidad es preferible cuando el lugar de implantación se somete a estímulos de extensión o contracción. Los ejemplos de lugares de implantación, que se someten a estímulos de extensión o contracción, incluyen, entre otros, corazón, 10 músculo, articulación, cartílago, tendón y similares. En una realización puede requerirse extensibilidad y contractibilidad capaces de aguantar el movimiento de pulsación del corazón.

Como se usa en el presente documento, la expresión “parte distinta del miocardio de un adulto” hace referencia a cualquier parte, tejido, célula u órgano distinto del miocardio del corazón diferenciado terminalmente. Los ejemplos 15 de dichas partes, tejidos, células y órganos incluyen, mioblastos esqueléticos. Estas células no tienen un marcador característico de las células derivadas del miocardio del corazón adulto. Dicho marcador (en lo sucesivo en el presente documento denominado “marcador de miocardio adulto") puede estar en forma de una molécula de ácido nucleico (expresión de ARNm), una proteína, una matriz extracelular, un fenotipo específico, una forma específica de una célula o similar. Por tanto, los marcadores de miocardio adulto que no se especifican en el presente documento 20 se pueden usar para identificar un tejido protésico de la presente invención siempre que estos marcadores puedan indicar células derivadas del miocardio de un adulto. Los ejemplos representativos de partes distintas del miocardio de un adulto incluyen, entre otros, mioblastos (por ejemplo, mioblastos esqueléticos). Por tanto, identificando un marcador específico característico de otras partes distintas al miocardio de un adulto, se pueden confirmar las partes distintas al miocardio. 25

Como se usa en el presente documento, la expresión “parte distinta del corazón de un adulto” hace referencia a cualquier parte, tejido, célula u órgano distinto del corazón diferenciado terminalmente. Los ejemplos de dichas partes, tejidos, células y órganos incluyen, entre otros, mioblastos esqueléticos, fibroblastos, células sinoviales, células madre y similares. Estas células no tienen un marcador característico de las células derivadas del corazón 30 adulto. Dicho marcador puede estar en forma de una molécula de ácido nucleico (expresión de ARNm), una proteína, una matriz extracelular, un fenotipo específico, una forma específica de una célula o similar. Por tanto, los marcadores de corazón adulto que no se especifican en el presente documento se pueden usar para identificar un tejido protésico de la presente invención siempre que estos marcadores puedan indicar células derivadas del corazón de adulto. Los ejemplos representativos de partes distintas del corazón de un adulto incluyen, entre otros, 35 partes que contienen células madre mesenquimatosas o células derivadas de las mismas, otros tejidos, otros órganos, mioblastos (por ejemplo, mioblastos esqueléticos), fibroblastos, células sinoviales y similares. Por tanto, identificando un marcador específico característico de otras partes distintas al corazón, se pueden confirmar las partes distintas al corazón de un adulto.

40

Una “parte distinta al miocardio de un adulto” y una “parte distinta del corazón de un adulto” se pueden identificar usando marcadores característicos de células derivadas del miocardio de un adulto o del corazón de un adulto, incluyendo mioblastos esqueléticos, (en lo sucesivo en el presente documento denominado “marcador de miocardio no adulto” o “marcador de corazón no adulto”, respectivamente). Si el marcador se expresa en menos de aproximadamente el 100 %, preferentemente menos de aproximadamente el 80 %, más preferentemente menos de 45 aproximadamente el 50 %, incluso más preferentemente menos de aproximadamente el 25 %, en algunos casos menos de aproximadamente el 1 %, se pueden identificar las partes descritas anteriormente. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen, entre otros, cadena pesada IIa de la miosina, cadena pesada IIb de la miosina, cadena pesada IId de la miosina (IIx), CD56, MyoD, Myf5, miogenina y similares. Por tanto, los marcadores de miocardio no adulto que no se especifican en el presente documento se pueden usar para identificar un tejido protésico de la presente 50 invención siempre que estos marcadores puedan indicar células derivadas de partes distintas al miocardio de un adulto. Asimismo, los marcadores de corazón no adulto que no se especifican en el presente documento se pueden usar para identificar un tejido protésico de la presente invención siempre que estos marcadores puedan indicar células derivadas de partes distintas del corazón de un adulto

55

cadena pesada IIa de la miosina (humana: Nº de acceso NM_017534; SEC ID Nº 1 y 2), cadena pesada IIb de la miosina (humana: Nº de acceso NM_017533; SEC ID Nº 3 y 4), cadena pesada IId (IIx) de la miosina (humana: Nº de acceso NM_005963; SEC ID Nº 5 y 6) son marcadores específicos de mioblastos (Havenith M.G., Visser R., Schrijvers-van Schendel J.M., Bosman F.T., "Muscle Fiber Typing in Routinely Processed Skeletal Muscle With Monoclonal Antibodies", Histochemistry, 1990; 93(5):497-499). Estos marcadores se pueden confirmar 60 principalmente observando la presencia de proteínas. Un anticuerpo contra la cadena pesada IIa de la miosina, la cadena pesada IIb de la miosina y la cadena pesada IId (IIx) de la miosina es, por ejemplo, MY-32 disponible en Sigma. Este anticuerpo es específico del músculo esquelético y no se une al miocardio (Webster C., Pavlath G.K., Parks D.R., Walsh F.S., Blau H.M., Exp. Cell. Res., enero 1988; 174(1):252-65; y Havenith M.G., Visser R., Schrijvers-van Schendel J.M., Bosman F.T., Muscle Fiber Typing in Routinely Processed Skeletal Muscle with 65 Monoclonal Antibodies, Histochemistry, 1990, 93(5):497-499).

CD56 (humano: Nº de acceso U63041; SEC ID Nº 7 y 8) es un marcador específico de mioblastos. Este marcador se puede confirmar principalmente observando la presencia de ARNm.

MyoD (humano: Nº de acceso X56677; SEC ID Nº 9 y 10) es un marcador específico de mioblastos. Este marcador 5 se puede confirmar principalmente observando la presencia de ARNm.

Myf5 (humano: Nº de acceso NM_005593; SEC ID Nº 11 y 12) es un marcador específico de mioblastos. Este marcador se puede confirmar principalmente observando la presencia de ARNm.

10

Miogenina (humana: Nº de acceso BT007233; SEC ID Nº 13 y 14) es un marcador específico de mioblastos. Este marcador se puede confirmar principalmente observando la presencia de ARNm.

En otras realizaciones se pueden usar otros marcadores específicos de otros tejidos. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen, entre otros, Oct-3/4, SSEA-1, Rex-1, Otx2, y similares para células madre embrionarias; VE-15 cadherina, Flk-1, Tie-1, PECAM1, vWF, c-kit, CD34, Thy1, Sca-1, y similares para células endoteliales; α-actina de músculo esquelético además de los marcadores descritos anteriormente para músculos esqueléticos; Nestina, receptor de Glu, receptor de NMDA, GFAP, neuregulina-1, y similares para células nerviosas; c-kit, CD34, Thyl, Sca-1, GATA-1, GATA-2, FOG, y similares para células hematopoyéticas.

20

Como se usa en el presente documento, el término “derivado” en relación con las células significa que las células se separan, aíslan o extraen de una masa celular, tejido u órgano donde las células han estado originalmente presentes o que las células son inducidas por las células madre.

Como se usa en el presente documento, la expresión “aplicable al corazón” significa que el corazón aplicado tiene la 25 capacidad de pulsar. Un tejido aplicable al corazón tiene una resistencia tal que el tejido puede aguantar la dilatación y la contracción del corazón pulsátil. En el presente documento, la aplicabilidad al corazón incluye la aplicabilidad al miocardio. La aplicabilidad al corazón se puede determinar confirmando que un receptor que tiene un injerto implantado sobrevive.

30

Como se usa en el presente documento, la expresión “estructura tridimensional” hace referencia a un objeto que comprende células que tienen conexión eléctrica intracelular y alineación, y se extiende tridimensionalmente. La expresión “estructura tridimensional” abarca objetos que tienen cualquier forma (por ejemplo, forma de lámina etc.). Una estructura con forma de lámina comprende una única capa o una pluralidad de capas.

35

Como se usa en el presente documento, la expresión “lámina celular” se refiere a una estructura que comprende una monocapa de células. Dicha lámina celular tiene al menos una conexión biológica bidimensional. La lámina que tiene conexión biológica se caracteriza por que después de producir la lámina, la conexión entre las células no se destruye sustancialmente incluso cuando la lámina se manipula individualmente. Dicha conexión biológica incluye conexión intracelular a través de una matriz extracelular. 40

Como se usa en el presente documento, la expresión “conexión biológica” respecto a la relación entre células significa que hay determinada interacción entre las células. Los ejemplos de dicha interacción incluyen, entre otros, interacción a través de moléculas biológicas (por ejemplo, matriz extracelular), interacción a través de la transducción de señal, interacción eléctrica (conexión eléctrica, tal como sincronización de señales eléctricas o 45 similares) y similares. Con el fin de confirmar la interacción se usa un ensayo adecuado para una característica de la interacción. Con el fin de confirmar la interacción física a través de moléculas biológicas se mide la resistencia de un tejido protésico, una estructura tridimensional o similar (por ejemplo, una prueba de tracción). Con el fin de confirmar la interacción a través de la transducción de la señal se investiga la expresión génica o similar. Con el fin de confirmar la interacción eléctrica, se mide el potencial eléctrico de un tejido protésico, una estructura tridimensional o 50 similar para determinar si el potencial eléctrico se propaga o no con ondas constantes. Por tanto, preferentemente, la conexión física se puede determinar observando si la conexión se establece o no sin un armazón. En la presente invención, normalmente es suficiente que se proporcione al menos una conexión biológica bidimensional. En una realización preferida, es ventajoso que se proporcione una conexión biológica tridimensional. En este caso se puede formar una estructura tridimensional. Preferentemente, existe conexión biológica sustancialmente uniformemente en 55 todas las direcciones en el espacio tridimensional. En otra realización, se puede usar el tejido protésico, una estructura tridimensional y similar, que tiene conexión biológica bidimensional sustancialmente uniforme y conexión biológica ligeramente más débil en la tercera dimensión.

Un tejido protésico, una estructura tridimensional o similar de la presente invención se puede proporcionar usando 60 métodos de preparación conocidos, como un producto farmacéutico o, como alternativa, como un fármaco para animales, un seudofármaco, un fármaco marino, un producto cosmético y similares.

La presente invención usa un ser humano.

65

Cuando la presente invención se usa como agente farmacéutico, puede comprender además un vehículo

farmacéuticamente aceptable o similar. Un vehículo farmacéuticamente aceptable contenido en un medicamento de la presente invención incluye cualquier material conocido en la técnica.

Ejemplos de dicho vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen, entre otros, antioxidantes, conservantes, colorantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, agentes de suspensión, disolventes, cargas, agentes 5 espesantes, tampones, vehículos de liberación, adyuvantes agrícolas o farmacéuticos, y similares.

Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la cantidad de un agente farmacéutico (por ejemplo, un tejido protésico, un compuesto farmacéutico usado junto con el mismo etc.) usada en el método de tratamiento de la presente invención con referencia a la finalidad de uso, una enfermedad diana (tipo, gravedad y similares), la edad 10 del paciente, el peso, el sexo y el historial de casos, la forma o tipo de la célula y similares. La frecuencia del método de tratamiento de la presente invención aplicado a un sujeto (o paciente) también la determinan los expertos en la técnica con respecto a la finalidad de uso, la enfermedad objetivo (tipo, gravedad y similar), la edad del paciente, el peso, el sexo y el historial de casos, la progresión de la terapia y similares. Ejemplos de la frecuencia incluyen de una vez al día a varios meses (por ejemplo, de una vez a la semana a una vez al mes). Preferentemente, la 15 administración se realiza de una vez a la semana o mes con referencia a la progresión.

Como se usa en el presente documento, el término “administrar” en relación con un tejido protésico, estructura tridimensional o similar de la presente invención o un agente farmacéutico que lo comprende significa que se administrar de forma individual o en combinación con otros agentes terapéuticos. Un tejido protésico de la presente 20 invención se puede introducir en los puntos de terapia (por ejemplo, corazón deteriorado etc.) mediante los siguientes métodos, en las formas siguientes y en las cantidades siguientes. Los ejemplos de los métodos de introducción incluyen, entre otros, fijación directa, sutura tras fijación, inserción y similares. Por ejemplo, un tejido protésico y una estructura tridimensional de la presente invención se puede aplicar mediante los métodos descritos anteriormente en una zona deteriorada de tejido miocárdico isquémico causada por infarto de miocardio, angina de 25 pecho o similares. Las combinaciones se pueden administrar de forma concomitante (por ejemplo como una mezcla) por separado pero simultánea o concurrentemente, o de forma secuencial. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapéutica y, también, procedimientos en los cuales los agentes combinados se administran por separado pero de forma simultánea (por ejemplo, un tejido protésico o similar se proporciona directamente mediante operación mientras que otros agentes farmacéuticos se 30 proporcionan mediante inyección intravenosa). La administración “en combinación” incluye además la administración separada de uno de los compuestos o agentes administrados primero, seguido del segundo.

Como se usa en el presente documento, el término “refuerzo” significa que se mejora la función de una parte objetivo de un organismo. 35

Como se usa en el presente documento, el término “instrucciones” describen un método de administrar un medicamento, un método para diagnóstico o similares de la presente invención para personas que administren, o a las que se administre, el medicamento o similar o para persona que diagnostiquen o que se le diagnostique (por ejemplo, médicos, pacientes y similares). Las instrucciones describen una declaración que indica un método 40 adecuado para administrar un diagnóstico, un medicamento o similar de la presente invención. Las instrucciones se preparan de acuerdo con un formato definido por una autoridad de un país donde se pone en práctica la presente invención (por ejemplo el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón, la Administración de Alimentos y Fármacos de EE.UU. (FDA) y similares), que describa explícitamente que las instrucciones están aprobados por la autoridad. Las instrucciones son la denominada ficha técnica y normalmente se proporcionan en medio de papel. 45 Las instrucciones no están tan limitadas y se pueden proporcionar en forma de medios electrónicos (por ejemplo, sitios web, correos electrónicos y similares proporcionados en Internet).

Como se usa en el presente documento, la expresión “macromolécula respondedora a estímulos” hace referencia a una macromolécula que cambia de forma y/o de propiedad en respuesta a un estímulo, es decir los cambios se 50 producen entre antes y después del estímulo. Los ejemplos de dicho estímulo incluyen, entre otros, la exposición a la luz, la aplicación de campo eléctrico, un cambio en la temperatura, un cambio en el pH, la adición de una sustancia química, y similares. Los ejemplos de macromoléculas respondedoras a estímulo incluyen, entre otros, poli(N-isopropilacrilamida), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-ácido acrílico), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-metilmetacrilato), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-acrilato sódico), copolímero de poli(N-55 isopropilacrilamida-vinilferroceno), poli(vinilmetiléter) (PVME) expuesto a rayos γ, poli(oxietileno), una resina obtenida incorporando un material biológico (por ejemplo, ácido nucleico, etc.) en una macromolécula, y un gel obtenido mediante reticulación de las macromoléculas descritas anteriormente con un agente de reticulación y similares.

60

Como se usa en el presente documento, la expresión “macromolécula respondedora a la temperatura” se refiere a una macromolécula que cambia su forma y/o propiedad en respuesta a la temperatura. Los ejemplos de macromoléculas respondedoras a la temperatura incluyen, entre otros, poli(N-isopropilacrilamida), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-ácido acrílico), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-metilmetacrilato), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-acrilato sódico), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-vinilferroceno), poli(vinilmetiléter) 65 (PVME) expuesto a rayos γ, poli(oxietileno), y un gel obtenido mediante reticulación de las macromoléculas descritas

anteriormente con un agente de reticulación y similares. Los ejemplos preferidos de macromoléculas respondedoras a la temperatura incluyen, entre otros, poli(N-isopropilacrilamida), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-metacrilato de metilo), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-acrilato sódico) y un gel obtenido mediante reticulación de las macromoléculas descritas anteriormente con un agente de reticulación y similares Por ejemplo, una macromolécula respondedora a la temperatura usada en el presente documento tiene una temperatura de 5 solución crítica superior o inferior a la del agua de 0 ºC a 80 ºC. La presente invención no está limitada a esto. La expresión “temperatura de solución crítica” se refiere a un umbral de temperatura que cambia una forma y/o propiedad. Preferentemente, en el presente documento se puede usar poli(N-isopropilacrilamida).

Por ejemplo, el polivinilmetiléter expuesto a rayos γ forma un hidrato a temperatura ambiente en solución acuosa 10 que, a su vez, se hincha. Se sabe que a medida que la temperatura aumenta, la sustancia se deshidrata, de forma que la solución se contrae y se convierte en un gel de macromolécula sensible al calor. El gel de PVME, que es uniforme y transparente como una gelatina, se vuelve turbio (es decir, cambia su transparencia) si se calienta. Si el gel se proporciona con una estructura porosa o se conforma en fibras o partículas, el gen se puede extender o contraer a una velocidad alta. Se cree que un gel de PVME poroso y de tipo fibra puede extenderse o contraerse en 15 menos de un segundo (véase http://www.aist.go.jp/NIMC/overview/v27-j.html, publicación japonesa abierta a consulta por el público nº 2001-213992 y publicación japonesa abierta a consulta por el público nº 2001-131249). El gen de N-isopropilacrilamida (es decir, poli(N-isopropilacrilamida) también se conoce como un gel respondedor a la temperatura. Si la poli(N-isopropilacrilamida) se copolimeriza con un monómero hidrofóbico, la temperatura que le permite cambiar su forma y/o propiedad se puede reducir. Si la poli(N-isopropilacrilamida) se copolimeriza con un 20 monómero hidrofílico, la temperatura que le permite cambiar su forma y/o propiedad se puede aumentar. Usando este carácter, es posible preparar una carga respondedora a une estímulo deseado. Dicha técnica se puede aplicar a otras macromoléculas respondedoras a la temperatura.

Como se usa en el presente documento, la expresión “enzima de degradación de proteínas” tiene el mismo 25 significado que se usa habitualmente en la técnica y hace referencia a una enzima que cataliza la degradación de las proteínas. Esta enzima también se denomina “proteasa”.

Como se usa en el presente documento, la expresión “película de matriz regular” hace referencia a una película que tiene una estructura donde los elementos se disponen según una norma determinada. Los ejemplos de la estructura 30 de dicha película incluyen, entre otros, estructura en panal, estructura en línea, estructura en puntos y similares. Un tejido protésico de la presente invención preferentemente se produce con dicha matriz regular. La película puede estar hecha de un material biodegradable (por ejemplo, ácido poli-L-láctico (PLLA), etc.). Con el fin de producir una película elástica se puede usar (poli (ε-caprolactona) (PCL) o similar.

35

En la ingeniería celular, ingeniería tisular o similar, el cultivo celular suele requerir material de base para las células del armazón. Se sabe que la interacción célula-célula se ve afectada no solo por las propiedades químicas de las superficies celulares sino también por la forma diminuta de las células. Para el fin de controlar las funciones celulares, es importante diseñar tanto las propiedades químicas de las superficies del material en contacto con las células como la estructura diminuta de las células. Se ha revelado que en las películas porosas que tienen estructura 40 en panal, el patrón en panal proporciona una superficie de adhesión celular y la estructura porosa proporciona acceso a las bases que soportan las células y las vías de suministro de nutrientes. Por tanto, es preferible usar la estructura en panal en la presente invención.

La película con estructura en panal se puede usar como base para organizar las células en un órgano protésico o un 45 tejido protésico, por ejemplo. Puede que se desee que dicho órgano o tejido protésico o similar se absorba en el cuerpo. Por tanto, la base se absorbe, deseablemente, en el cuerpo después de un determinado periodo de tiempo. Los materiales convencionales, que tienen una estructura en panal, mantienen de forma estable la estructura durante un periodo de tiempo necesario para cultivo celular y, después, se degradan, se describen en, por ejemplo, la publicación japonesa abierta a consulta por el público nº 2001-157574, la publicación japonesa abierta a consulta 50 por el público nº 2002-335949, y similares.

La publicación japonesa abierta a consulta por el público nº 2001-157574 divulga una estructura en panal y una película que consiste en la estructura en panal. La estructura en panal se obtiene del siguiente modo. Una solución de disolvente orgánico hidrofóbico que consiste en de 50 a 99 % en peso/peso de un polímero biodegradable y de 55 50 a 1 % en peso/peso de un polímero antipático se vierte sobre un sustrato en atmósfera que tiene una humedad relativa del 50 al 95 %, seguido de evaporación gradual del disolvente orgánico y la concurrente condensación de rocío sobre la superficie de la solución vertida. Las pequeñas gotas de rocío causadas por la condensación se evaporan. Como resultado se obtiene una estructura en panal. La publicación japonesa abierta a consulta por el público nº 2002-335949 describe que la película descrita anteriormente que tiene una estructura en panal se puede 60 usar para formar una agregación tridimensional de células organizadas en orden que es similar al tejido biológico.

Una película para uso en la presente invención se produce del siguiente modo. Una solución de disolvente orgánico hidrofóbico de un único polímero biodegradable y antipático o una mezcla de polímeros que contiene un polímero biodegradable y un polímero anfipático se vierte sobre un sustrato, seguido de la evaporación del disolvente 65 orgánico y la condensación de rocío concurrente sobre la superficie de la solución vertida. Las pequeñas gotas de

rocío causadas por la condensación se evaporan.

En la presente invención se puede usar un único polímero biodegradable y antipático o, como alternativa, una mezcla de polímeros que contiene una pluralidad de polímeros que incluyen polímero(s) biodegradables y polímero(s) anfipáticos. 5

Como polímeros biodegradables que se pueden usar en la presente invención, a la luz de la solubilidad en disolventes orgánicos son preferibles los poliésteres alifáticos biodegradables (por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido hidroxibutírico), policaprolactona, poli(adipato de etileno), poli (adipato de butileno), etc.), policarbonato alifático (carbonato de polibutileno, carbonato de polietileno etc.) y similares. En particular, a la luz de la 10 disponibilidad, el precio y similares son deseables el poli(ácido láctico) y la policaprolactona.

Los polímeros anfipáticos que se pueden usar en la presente invención son preferentemente no tóxicos a la luz de su uso como material base para el cultivo celular. Los ejemplos de dichos polímeros anfipáticos incluyen, entre otros, copolímero de bloque de polietilenglicol/polipropileno; un polímero antipático que tiene un polímero de acrilamida 15 como cadena principal (estructura principal), un grupo dodecilo como cadena lateral hidrófoba y un grupo de lactosa o un grupo carboxilo como cadena lateral hidrófila; un complejo iónico de una macromolécula aniónica (por ejemplo, heparina, dextranosulfato, ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN etc.), etc.) y una cadena larga de sal de alquilamonio; un polímero antipático que tiene una proteína hidrosoluble (por ejemplo, gelatina, colágeno, albúmina etc.) como grupo hidrófilo; y similares. Los ejemplos de un único polímero biodegradable y antipático incluyen, entre 20 otros, copolímero de bloque de ácido poliláctico/polietilenglicol, copolímero de bloque de poli(ε-caprolactona)/polietilenglicol, copolímero de bloque de poli(ácido málico) / (un éster de alquilo de ácido polimálico) y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión “corazón deteriorado” y “miocardio deteriorado” hace 25 referencia a un corazón y a un miocardio, respectivamente, que tienen un deterioro, incluyendo, entre otros, deterioros isquémicos y similares. Los ejemplos de los deterioros isquémicos incluyen, entre otros, infarto de miocardio, angina de pecho y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión “agente estimulante tridimensional” hace referencia a un 30 agente que estimula la conexión biológica en una tercera dimensión después de preparar un grupo de células. Los ejemplos de dicho agente incluyen de forma representativa agentes capaces de estimular la secreción de una matriz celular. Los ejemplos de un agente estimulante tridimensional incluyen, entre otros, ácido ascórbico o un derivado del mismo (por ejemplo, ácido 2-fosfato-ascórbico, ácido 2-fosfato-ascórbico, L-ascorbato sódico etc.) y similares. Preferentemente, un agente estimulante tridimensional puede ser, preferentemente, un componente de una matriz 35 extracelular de una parte objetivo mediante la aplicación y/o uno o más componentes capaces de estimular la secreción de una matriz extracelular en una cantidad similar. Cuando un agente estimulante tridimensional comprende una pluralidad de componentes, los componentes pueden ser componentes de una matriz extracelular de una parte objetivo mediante la aplicación y/o uno o más componentes capaces de estimular la secreción de una matriz extracelular en una cantidad similar. 40

Como se usa en el presente documento, la expresión “ácido ascórbico o un derivado del mismo” incluye ácido ascórbico y un análogo del mismo (por ejemplo, ácido 2-fosfato-ascórbico, ácido 1-fosfato-ascórbico, etc.), y una sal del mismo (por ejemplo, sal de sodio, sal de magnesio etc.).

45

(Descripción de las realizaciones preferidas)

En lo sucesivo en el presente documento, se describirán las realizaciones preferidas de la presente invención. Las siguientes realizaciones se proporcionan para una mejor comprensión de la presente invención y el alcance de la presente invención no debe limitarse a la descripción siguiente. Los expertos en la técnica apreciarán claramente 50 que se pueden realizar variaciones y modificaciones sin desviarse del alcance de la presente invención con referencia a la memoria descriptiva.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona una estructura tridimensional aplicable al corazón, que comprende una célula derivada de una parte distinta a la del miocardio de un adulto. Estructuras 55 tridimensionales convencionales aplicables al corazón comprenden una célula derivada del miocardio de un adulto y tienen un tamaño pequeño y mal rendimiento. La presente invención es la primera en el mundo en proporcionar una estructura tridimensional aplicable al corazón que comprende una célula derivada de una parte distinta al miocardio de un adulto (es decir, no embrión) cultivando la célula de la parte distinta al miocardio de un adulto en condiciones específicas (por ejemplo, en presencia de un agente estimulante tridimensional etc.) La estructura tridimensional 60 comprende una célula preferentemente sustancialmente una célula y un componente derivado de la célula (por ejemplo, una matriz extracelular etc.). Por tanto, en una realización preferida, la estructura tridimensional de la presente invención comprende un material biológico y, por consiguiente, supera de forma ventajosa los inconvenientes debidos a un armazón (por ejemplo, mala biocompatibilidad, inmunogeneicidad etc.) en comparación con las estructuras convencionales que tienen un armazón. 65

En una realización preferida, una célula contenida en la estructura tridimensional de la presente invención puede incluir tanto una célula madre como una célula diferenciada.

Una célula utilizada en la presente invención se deriva preferentemente de un mioblasto. Convencionalmente, no era posible esperar que una estructura tridimensional que comprende un mioblasto sea aplicable al corazón. Este 5 hallazgo es un efecto sorprendente. La razón por la que se prefieren los mioblastos es que, por ejemplo, la fuente de suministro de los mismos es abundante. La razón no se limita a esto.

En una realización más preferida, una célula utilizada en la presente invención es un mioblasto esquelético. Los mioblastos esqueléticos son abundantes y, por lo tanto, son preferibles como una fuente de suministro fácilmente 10 disponible. Además, la presente invención reveló por primera vez la posibilidad de que los mioblastos esqueléticos se puedan implantar en un corazón. Por lo tanto, los mioblastos esqueléticos se pueden utilizar en la práctica médica real.

Por tanto, cultivando adecuadamente células derivadas de partes distintas al miocardio antólogo se puede reparar 15 un corazón defectuoso sin cirugía de implantación.

En otra realización, una célula utilizada en la presente invención deriva de una célula madre. Esto se debe a una estructura tridimensional que comprende una célula derivada de una célula madre puede utilizar una célula que se diferencia en una dirección deseada. Por lo tanto, cuando la estructura se aplica a un corazón, puede ser preferible 20 una célula madre que se ha diferenciado en una célula cardíaca. Un método de ejemplo para la diferenciación puede emplear LIF. La presente invención no está limitada a esto.

En una realización preferida, una célula usada en la presente invención es, de forma ventajosa, una célula derivada de un sujeto a la que se aplica una estructura tridimensional. En este caso, una célula usada en el presente 25 documento también se denomina célula autóloga. Usando células autólogas se pueden prevenir o reducir las reacciones inmunológicas de rechazo.

En otra realización, una célula usada en la presente invención puede ser una célula no derivada de un sujeto a la que se aplica una estructura tridimensional. En este caso, preferentemente se adopta una medida para prevenir las 30 reacciones inmunológicas de rechazo.

En otra realización, una célula utilizada en la estructura tridimensional de la presente invención expresa al menos un marcador de corazón no adulto seleccionado del grupo que consiste en la cadena IIa pesada de la miosina, la cadena pesada IIb de la miosina, la cadena pesada IId (IIx) de la miosina, CD56, MyoD, Myf5 y miogenina. Mediante 35 la utilización de un marcador de corazón no adulto de este tipo, es posible confirmar que la célula utilizada en la estructura tridimensional es una célula derivada de corazón no adulto. La estructura tridimensional de la presente invención puede evitar el uso del corazón de un adulto para aumentar significativamente el potencial de las terapias cardíacas.

40

El marcador de corazón no adulto descrito anteriormente se expresa a un nivel que normalmente posee un corazón no adulto o tejido del mismo. Por ejemplo, dicho nivel puede ser de al menos aproximadamente el 50 % del nivel natural de un corazón no adulto o un tejido del mismo, preferentemente al menos aproximadamente el 60 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 70 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 80 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 90 % y todavía más preferentemente inferior al menos 45 aproximadamente el 100 %. Ejemplos de una técnica para determinar el nivel incluyen, pero no se limitan a, PCR, transferencia para la determinación del nivel de expresión de ARNm (por ejemplo, transferencia de tipo Northern, etc.), transferencia para la determinación del nivel de expresión de una proteína (por ejemplo, transferencia de tipo Western, etc.), y similares. PCR se utiliza como sigue. Se selecciona un cebador específico y se diseña a partir de los marcadores cardíacos no adultos descritos anteriormente utilizando un método bien conocido en la técnica (por 50 ejemplo, se utiliza un dispositivo de diseño de cebadores para PCR disponible comercialmente). Las muestras que contienen ARNm se extraen de un tejido o célula de interés. El ADNc se prepara a partir de ARNm usando técnicas bien conocidas en la materia. El ADNc se somete a ciclos de PCR que permiten la detección de la expresión específica. Los productos amplificados se someten a, por ejemplo, electroforesis, seguida de tinción. Como resultado se puede determinar el nivel de expresión. La transferencia de tipo Northern se usa del siguiente modo. La 55 totalidad o una parte del ácido nucleico del marcador cardíaco no adulto descrito anteriormente se prepara como una sonda (en particular, una secuencia capaz de detección específica). Las muestras que contienen ARNm se extraen de un tejido o célula de interés, seguido de separación usando electroforesis. La sonda descrita anteriormente se usa para detectar la expresión. Cuando un marcador está implicado en la expresión proteica, se preparan anticuerpos específicos de la proteína. Estos anticuerpos se usan en transferencia de tipo Western para detectar la 60 expresión usando reacciones de anticuerpos frente al antígeno.

En otra realización, una célula usada en la estructura tridimensional de la presente invención no contiene sustancialmente ningún marcador cardiaco adulto. En base al hecho de que la célula no contiene sustancialmente ningún marcador cardiaco adulto, es posible confirmar que la estructura tridimensional usa una célula no derivada de 65 corazón adulto. La estructura tridimensional de la presente invención puede evitar el uso del corazón de un adulto

para aumentar significativamente el potencial de las terapias cardíacas.

El marcador de corazón adulto descrito anteriormente se expresa a menos de un nivel que normalmente posee un corazón adulto o tejido del mismo. Por ejemplo, dicho nivel puede ser inferior a aproximadamente el 100 % del nivel natural de un corazón adulto o un tejido del mismo, preferentemente inferior a aproximadamente el 80 %, más 5 preferentemente inferior a aproximadamente el 50 %, incluso más preferentemente inferior a aproximadamente el 20 %, todavía más preferentemente inferior a aproximadamente el 10 % e incluso todavía más preferentemente inferior a aproximadamente el 5 %.

En una realización preferida, una célula usada en la estructura tridimensional de la presente invención contiene 10 sustancialmente nada de marcadores de corazón adulto. Confirmando la ausencia de todos los marcadores de corazón adulto, es posible confirmar con más fiabilidad que la estructura no es un corazón adulto. Obsérvese que no todos los marcadores de corazón adulto se comprueban siempre.

Preferiblemente una célula usada en la estructura tridimensional de la presente invención es preferiblemente una 15 célula madre que no sea célula del corazón. Las células distintas de los cardiomiocitos se pueden utilizar en la presente invención. Sin embargo las células derivadas de un corazón tienen una fuente de suministro limitada y las células derivadas de un corazón antólogo están sustancialmente no disponibles. Por tanto, es preferible el uso de las células no derivadas de un corazón.

20

La estructura tridimensional de la presente invención normalmente es aplicable al corazón y puede aplicarse a otros órganos. Preferentemente, la estructura tridimensional de la presente invención se puede aplicar a un miocardio.

En una realización, la estructura tridimensional de la presente invención comprende una lámina celular que tiene al menos una capa. En una realización determinada, la estructura tridimensional de la presente invención comprende 25 una lámina celular que tiene solo una capa. Proporcionando una lámina celular, la naturaleza intacta o no porosa de la estructura tridimensional de la presente invención se asegura. Por tanto, la estructura tridimensional de la presente invención que comprende una lámina celular que tiene al menos una capa es útil en aplicaciones en las que está cubierto un lugar dañado.

30

En una realización preferida, la estructura tridimensional de la presente invención comprende una lámina celular que tiene una pluralidad de capas. Preferentemente, es ventajoso que una pluralidad de capas en la lámina celular se conecte biológicamente entre sí de forma ventajosa. En este caso, la conexión biológica es, preferentemente, una conexión física a través de una matriz extracelular o una conexión eléctrica (por ejemplo, pulsación etc.). La conexión varía en función del lugar deseado. Cuando se pretende implantar la estructura tridimensional de la 35 presente invención en el corazón, la conexión biológica incluye normalmente conexión eléctrica. Como alternativa, la conexión biológica puede ser una conexión sin un armazón.

La estructura tridimensional de la presente invención puede proporcionarse como agente farmacéutico. Como alternativa, la estructura tridimensional de la presente invención puede ser preparada por un profesional médico o 40 similar en un lugar real. Como alternativa, una vez que un profesional médico prepara las células, una tercera parte puede cultivar las células y preparar una estructura tridimensional que comprenda las células y usarla para cirugía. En este caso, el cultivo celular pueden realizarlo los expertos en la técnica, así como profesionales médicos. Por tanto, los expertos en la técnica pueden determinar las condiciones de cultivo en función del tipo de células y el lugar de implantación objetivo de acuerdo con la divulgación de la presente memoria descriptiva. 45

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir una estructura tridimensional aplicable a un corazón adulto, que comprende una célula derivada de una parte que no sea el corazón. El método comprende las etapas de: a) cultivar una célula madre derivada de una parte distinta al miocardio de un adulto sobre un soporte que comprende una macromolécula respondedora a la temperatura; b) fijar una temperatura de cultivo 50 fuera del intervalo de la temperatura de solución crítica de la macromolécula respondedora a la temperatura (por encima del límite superior, si existe; o por debajo del límite inferior, si existe); y c) desprender la célula cultivada como una estructura tridimensional. En este caso la célula derivada de una parte distinta a un miocardio puede ser una célula derivada de una parte que no sea el corazón, incluyendo mioblastos, mioblastos esqueléticos. Preferentemente, la temperatura de solución crítica límite superior o inferior con el agua es de 0 °C a 80 °C. 55 Preferentemente, una macromolécula respondedora a la temperatura que tiene la temperatura de solución crítica descrita anterior se injerta en el soporte.

En una realización preferida de la presente invención, en el método para producir una estructura tridimensional es preferible que la estructura no se trate con una enzima de degradación de proteínas en o antes de la etapa de 60 desprendimiento. En métodos convencionales para preparar láminas celulares o similares, se realiza un tratamiento usando una enzima de degradación de proteínas para facilitar el desprendimiento. No obstante, en este caso, la lámina celular se daña y, por tanto, no se puede usar como una estructura tridimensional. En el método de la presente invención, el tratamiento usando una enzima de degradación de proteínas se puede omitir, de modo que se puede conseguir una estructura tridimensional intacta. 65

En una realización preferida, la macromolécula respondedora a la temperatura es poli(N-isopropilacrilamida). La poli(N-isopropilacrilamida) tiene una temperatura de solución crítica en el límite inferior de un poco más de 20 °C. Por tanto, en este caso, cambiando el medio de cultivo desde una temperatura de cultivo típica (por ejemplo, de aproximadamente 37 °C) a aproximadamente 20 °C, es posible preparar fácilmente una estructura tridimensional. De este modo se puede proporcionar una estructura tridimensional aplicable a la cirugía de implantación, que 5 comprende una célula no derivada del miocardio de un adulto. Como resultado se puede proporcionar una técnica sustancialmente distinta al trasplante de órgano a una serie de enfermedades que se pueden tratar únicamente mediante trasplante de corazón convencional (por ejemplo, miocardiopatía dilatada etc.). Es decir, mediante la presente invención se puede proporcionar una terapia que no se puede conseguir mediante técnicas convencionales. 10

En una realización más preferida, la estructura tridimensional de la presente invención comprende, preferentemente, una agente estimulante de organización tridimensional cuando se realiza cultivo celular. Dicho agente estimulante de organización tridimensional puede ser ácido ascórbico o un derivado del mismo.

15

En otro aspecto, el tejido protésico y la estructura tridimensional de la presente invención carece de lesiones causadas por una enzima de degradación de proteínas, tales como, representativamente, dispara, tripsina, o similares durante el cultivo. Por tanto, el tejido protésico y la estructura tridimensional que se desprende del material de base, se pueden recuperar como una masa celular que sujeta proteínas entre las células (por ejemplo, una matriz extracelular) y que tiene un determinado nivel de resistencia. El tejido protésico y la estructura tridimensional 20 también conservan las funciones intactas, tales como la función de contracción/relajación, conexión eléctrica intracelular, alineación y similares, que son específicas de los cardiomiocitos. Además, la estructura tridimensional puede tener varias alineaciones celulares de tipo tejido biológico características (por ejemplo, formación de una membrana que consiste en tejido conjunto, formación de una luz que consiste en células endoteliales de los vasos sanguíneos etc.). Cuando se usan enzimas de degradación de proteínas típicas (por ejemplo, tripsina etc.) para 25 desprender la estructura tridimensional o tejido protésico no se conservan sustancialmente estructuras de desmosoma entre las células, proteínas de tipo membrana basal entre las células y materiales base o similares, de modo que las células están separadas individualmente. Entre estas enzimas de degradación de proteínas, la dispara destruye las proteínas de tipo membrana basal entre las células y los materiales base sustancialmente completamente, pero no necesariamente estructura de desmosoma. La estructura de desmosoma se puede retener 30 si la temperatura es de 10 °C a 60 °C. No obstante, en este caso, la estructura tridimensional o tejido protésico resultante tiene una resistencia débil. Por el contrario, la estructura tridimensional o tejido protésico de la presente invención puede retener el 80 % o más de cada uno de la estructura de desmosoma y la proteína de tipo membrana basal, lo que tiene como resultado los varios efectos descritos anteriormente. En el soporte de cultivo celular, un polímero respondedor a la temperatura para usar en el recubrimiento del material base tiene una temperatura de 35 solución crítica límite superior o inferior de 0 °C to 80 °C en solución acuosa y, preferentemente, de 20 °C a 50 °C. Si la temperatura de solución crítica límite superior o inferior supera los 80 °C, es probable que las células sean destruidas. Si la temperatura de solución crítica límite superior o inferior es inferior a 0 ºC, la tasa de crecimiento tisular es extremadamente baja o las células son destruidas.

40

El polímero respondedor a la temperatura usado en la presente invención pueden ser un homopolímero o un copolímero. Un ejemplo de dicho polímero es un polímero descrito en, por ejemplo, la publicación japonesa abierta a consulta por el público nº 2-211865, además de los descritos anteriormente. Específicamente, por ejemplo, dicho polímero respondedor a la temperatura se obtiene mediante homo o copolimerización de los monómeros siguientes. Los ejemplos de monómeros utilizables incluyen, entre otros, compuestos de (met)acrilamida, derivados de 45 met(acrilamida) N-(o N,N-di)alquil sustituidos o derivados de éter de vinilo. En el caso de los copolímeros se puede usar dos cualesquiera o más de estos monómeros. Adicionalmente, se pueden usar copolímeros que comprenden monómeros distintos a los monómeros descritos anteriormente, copolímeros obtenidos mediante injerto o copolimerización de polímeros o una mezcla de homopolímeros o copolímeros. Adicionalmente, los polímeros se pueden reticular en una medida tal que no afectan a las propiedades inherentes del polímero. Los ejemplos del 50 material base a recubrir incluyen, entre otros, materiales normalmente usados en cultivo celular (por ejemplo, vidrio, vidrio modificado, poliestireno, polimetilmetacrilato etc.), sustancialmente todos los materiales capaces de conformarse generalmente (por ejemplo, compuestos macromoleculares además de los descritos anteriormente, cerámicas etc.).

55

Un método para recubrir un soporte con un polímero respondedor a la temperatura no está particularmente limitado y se puede realizar de acuerdo con, por ejemplo, la publicación japonesa abierta a consulta por el público nº 2-211865. Específicamente, el recubrimiento se puede realizar sometiendo un material base y el monómero o polímero descrito anteriormente a irradiación de haz de electrones (EB), irradiación de rayos γ, irradiación ultravioleta, tratamiento con plasma, tratamiento con corona o reacción de polimerización orgánica o adsorción física o similares 60 (por ejemplo, aplicación, cruzamiento etc.).

En la presente invención, el cultivo celular se realiza sobre el soporte de cultivo celular descrito anteriormente (por ejemplo, una placa de cultivo celular etc.). Cuando el polímero descrito anteriormente que cubre la superficie del material base tiene una temperatura de solución crítica límite superior, la temperatura del medio se fija para que sea 65 igual o inferior a la temperatura de solución crítica límite superior. Cuando el polímero descrito anteriormente que

cubre la superficie del material base tiene una temperatura de solución crítica límite inferior, la temperatura del medio se fija para que sea igual o superior a la temperatura de solución crítica límite inferior. No obstante, un intervalo de temperatura baja de forma que las células cultivadas no puedan crecer y un intervalo de temperatura alta de forma que las células cultivadas sean destruidas es inadecuado. Las condiciones de cultivo distintas a la temperatura pueden ser aquellas bien conocidas en la técnica y no están particularmente limitadas. Por ejemplo, el 5 medio se puede suplementar con suero bovino fetal (FCS) conocido o similares o, como alternativa, se puede emplear medio sin suero sin suplemento de dicho suero.

En el método de la presente invención, el periodo de tiempo requerido para cultivo puede determinarse en función de la aplicación del tejido protésico o estructura tridimensional. Con el fin de desprender y recuperar el tejido 10 protésico o estructura tridimensional cultivado del material de soporte, la temperatura del material de soporte que tiene células fijadas se incrementa a o por encima de la temperatura de solución crítica límite superior de un polímero que cubre el material base de soporte o se disminuye a o por debajo de la temperatura de solución crítica límite inferior. En este caso, el tejido protésico o la estructura tridimensional que se cultiva se desprenden directamente u, opcionalmente, con una membrana macromolecular unida. Obsérvese que el tejido protésico o 15 estructura tridimensional se puede desprender en el medio de cultivo donde las células se han cultivado o, como alternativa, en otras soluciones isotónicas. Dichas soluciones se pueden seleccionar en función de la finalidad. Los ejemplos de la membrana macromolecular, que opcionalmente está fijada a la lámina celular o estructura tridimensional, incluyen, entre otros, difluoruro de polivinilideno (PVDF) hidrofilizado, polipropileno, polietileno, celulosa y derivados de los mismos, quitina, quitosano, colágeno, papel (por ejemplo, papel de Japón etc.), uretano, 20 materiales macromoleculares de tipo red o de tipo punto de espiga (por ejemplo, licra, etc.) y similares. Cuando se usa un material macromolecular de tipo red o de tipo punto de espiga, el tejido protésico o estructura tridimensional tiene un grado más alto de libertad, de forma que se puede incrementar la función de contracción/relajación del mismo. Un método para producir el tejido protésico o estructura tridimensional que comprende células de la presente invención no está particularmente limitado. Por ejemplo, el tejido protésico o estructura tridimensional de la presente 25 invención se puede producir usando la lámina celular cultivada descrita anteriormente fijada a una membrana macromolecular.

Con el fin de desprender y recuperar el tejido protésico o estructura tridimensional con un rendimiento alto del soporte del cultivo celular, se da golpecitos o se agita el soporte del cultivo celular o el medio se agita con una 30 pipeta. Estos procedimientos se pueden realizar de forma individual o en combinación. Además, el tejido protésico o estructura tridimensional puede aclararse opcionalmente con solución isotónica o similar antes del desprendimiento y la recuperación. Estirando el tejido protésico o estructura tridimensional en una dirección específica después de desprenderse del material base, la lámina celular o estructura tridimensional se proporciona con alineación. El estirado se puede realizar usando un dispositivo de tracción (por ejemplo, Tensilon, etc.), o simplemente unas pinzas 35 o similares. Un método de estiramiento no está particularmente limitado. Proporcionando alineación, es posible conferir direccionalidad al movimiento de la propia lámina celular o estructura tridimensional. Por tanto, por ejemplo, es posible permitir que el tejido protésico o estructura tridimensional se mueva de acuerdo con el movimiento de un órgano específico. El tejido protésico o estructura tridimensional se puede aplicar eficientemente a los órganos.

40

El tejido protésico o la estructura tridimensional que se obtiene de este modo no se puede obtener mediante técnicas convencionales. El tejido protésico o la estructura tridimensional retienen la membrana basal que se rompe en las técnicas convencionales. Por tanto, el tejido protésico o estructura tridimensional se puede aceptar de forma satisfactoria por el tejido circundante y puede pulsar in situ cuando se entierra en cualquier parte de un organismo (por ejemplo, corazón, hueso, músculo, brazo, hombro, pie y otros órganos). Aunque sin desear quedar ligado a 45 teoría alguna, se cree que la razón es la siguiente. El tejido protésico o la estructura tridimensional enterrada dentro de un organismo son aceptados por un tejido biológico y se contrae o relaja. En este caso, el tejido protésico o la estructura tridimensional está en el estado de oxígeno bajo. Para compensar el estado, las células endoteliales de los vasos sanguíneos entran de forma agresiva en el tejido protésico o estructura tridimensional desde el tejido biológico circundante. Como resultado se forman vasos sanguíneos de modo que se pueda suministrar suficiente 50 oxígeno y nutrientes a través de la sangre. Por tanto, el tejido protésico o estructura tridimensional enterrada dentro de un organismo puede formar un tejido funcional dentro del organismo. Cabe esperar firmemente que dicho tejido protésico o estructura tridimensional se use en aplicaciones clínicas, tal como implantación y similar. Específicamente, el tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención se puede usar como instrumento terapéutico para cardiopatías (por ejemplo, infarto de miocardio etc.). En este caso, por ejemplo, el 55 tejido protésico o estructura tridimensional se implanta en un sitio de un corazón que tiene una débil fuerza de contracción. Como alternativa, el tejido protésico o estructura tridimensional se puede aplicar alrededor de un vaso sanguíneo para mejorar la circulación. Por ejemplo, el tejido protésico o estructura tridimensional es útil como instrumento terapéutico para la enfermedad de Raynaud grave, un hombro rígido grave, la disfunción de la aorta y similares. Obsérvese que se puede usar repetidamente un soporte de cultivo celular para su uso en la presente 60 invención.

(Preparación de tejido protésico usando agente estimulante tridimensional)

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un tejido protésico. El método para 65 producir un tejido protésico comprende las etapas de: A) proporcionar una célula; B) introducir la célula en un

recipiente que contiene un medio de cultivo celular que incluye un agente estimulante tridimensional, donde el recipiente tiene una base con un área suficiente para acomodar un tamaño deseado del tejido protésico; y C) cultivar la célula en el recipiente durante un periodo de tiempo suficiente para formar el tejido protésico que tiene el tamaño deseado.

5

La célula descrita anteriormente puede ser cualquier célula. Un método para proporcionar una célula es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, se extrae un tejido y las células se aíslan del tejido. Como alternativa, las células se aíslan del fluido corporal que contiene células sanguíneas o similares. Como alternativa se prepara una línea celular en un cultivo artificial. La presente invención no está limitada a esto.

10

El método para producir un tejido protésico de la presente invención usa un medio de cultivo celular que contiene un agente estimulante tridimensional. Los ejemplos de dicho agente estimulante tridimensional incluyen, entre otros, ácido ascórbico o un derivado del mismo, ácido 1-fosfato-ascórbico, ácido 2-fosfato-ascórbico, ácido L-ascórbico y similares.

15

El medio de cultivo celular usado en la presente invención puede ser cualquier medio que permita el crecimiento de una célula de interés. Los ejemplos de dicho medio incluyen, entre otros, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB104, 199, MCDB153, L15, SkBM, medio basal y similares que se suplementan con glucosa, FCS (suero bovino fetal), antibióticos (penicilina, estreptomicina, etc.) según sea adecuado.

20

El recipiente usado en la presente invención puede ser cualquier recipiente normalmente usado en la técnica que tenga una base con un área suficiente para acomodar un tamaño deseado del tejido protésico. Los ejemplos de dicho recipiente incluyen, entre otros, placas petri, matraces, recipientes de molde y similares, y, preferentemente, recipientes que tienen un área grande de la base (por ejemplo, al menos 1 cm2). El material del recipiente puede ser cualquier material e incluyen, entre otros, vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno, policarbonato etc.), silicona y 25 similares.

En una realización preferida, el agente estimulante tridimensional usado en el método para producir un tejido protésico de la presente invención incluye ácido 2-fosfato ascórbico. Convencionalmente, se sabe que el ácido ascórbico se usa para cultivo celular. No obstante, no se produjeron informes de que el ácido 2-fosfato-ascórbico se 30 use intencionadamente para la formación de tejido. En la presente invención, añadiendo una determinada cantidad de ácido 2-fosfato-ascórbico, es posible prevenir que una matriz extracelular se produzca en una cantidad excesivamente grande, la composición tiene un nivel implantable de matrices extracelulares y, por tanto, la proparte entre la célula y la matriz extracelular tiene como resultado un nivel implantable de resistencia y similares. Estos efectos son inesperados. 35

En una realización preferida, el ácido 2-fosfato-ascórbico usado en la presente invención normalmente tiene una concentración de al menos 0,01 mM, preferentemente al menos 0,05 mM, más preferentemente al menos 0,1 mM, incluso más preferentemente al menos 0,2 mM, todavía más preferentemente al menos 0,5 mM, e incluso todavía más preferentemente 1,0 mM. 40

Como alternativa, el ácido 2-fosfato-ascórbico usado en la presente invención se puede usar junto con ácido 1-fosfato-ascórbico. En este caso, preferentemente se pueden usar ácido 2-fosfato-ascórbico y ácido 1-fosfato-ascórbico a una proparte específica. Dicha proparte preferible está, por ejemplo, en el intervalo de 1:10 a 10:1. Como alternativa, la proparte preferible es tal que la cantidad molar de ácido 1-fosfato-ascórbico es menor que la 45 cantidad molar de ácido 2-fosfato-ascórbico.

En otra realización, el agente estimulante tridimensional usado en la presente invención incluye ácido 2-fosfato-ascórbico. No obstante, no se produjeron informes de que el ácido 2-fosfato-ascórbico se use explícitamente para la formación de tejido. En la presente invención, añadiendo una determinada cantidad de ácido 2-fosfato-ascórbico, es 50 posible prevenir que una matriz extracelular se produzca en una cantidad excesivamente grande, la composición tiene un nivel implantable de matrices extracelulares y, por tanto, la proparte entre las células y la matriz extracelular tiene como resultado un nivel implantable de resistencia y similares. Estos efectos son inesperados.

En una realización preferida, cuando la cantidad molar de ácido 1-fosfato-ascórbico es menor que la cantidad molar 55 de ácido 2-fosfato-ascórbico, el ácido 2-fosfato-ascórbico usado en la presente invención normalmente está presente a una concentración de al menos 0,01 mM, preferentemente al menos 0,05 mM, más preferentemente al menos 0,1 mM, incluso más preferentemente al menos 0,2 mM, y todavía más preferentemente al menos 0,5 mM, e incluso todavía más preferentemente 1,0 mM.

60

En una realización preferida determinada, el agente estimulante tridimensional de la presente invención incluye ácido 1-fosfato-ascórbico o una sal del mismo, ácido 2-fosfato-ascórbico o una sal del mismo y ácido L-ascórbico o una sal del mismo.

El recipiente usado en un método de producción de tejido protésico descrito de la presente invención se recubre, 65 preferentemente, con una macromolécula respondedora a la temperatura. En otra realización preferida, el recipiente

se proporciona, preferentemente, con un armazón que tiene una estructura en panal. La presente invención no está limitada a esto. El uso de una estructura en panal se describe en, por ejemplo, Tanaka K. et al, "Atarashii Baiomedikaru Intafesu [New Biomedical Interface]", Kagaku Kogyo [Chemical Industry], diciembre 2002, 901-906, Kagaku Kogyo Sha.

5

La macromolécula respondedora a la temperatura que se puede usar en el método de producción de tejido protésico de la presente invención incluye poli(N-isopropilacrilamida).

En una realización preferida, después de la etapa de cultivo, el método de producción de tejido protésico de la presente invención comprende además, D) desprender el tejido protésico y permitir que el tejido protésico realice 10 autocontracción. El desprendimiento se puede acelerar aplicando un estímulo físico (por ejemplo, aplicando un estímulo físico a una esquina del recipiente etc.). Cuando se usa una macromolécula respondedora a la temperatura, el desprendimiento se puede acelerar cambiando el ambiente a una temperatura superior o inferior a la temperatura de solución crítica de la macromolécula respondedora a la temperatura. La autocontracción tiene lugar de forma natural después del desprendimiento. Mediante autocontracción, la conexión biológica se acelera 15 particularmente en la tercera dimensión (la dirección perpendicular a las direcciones bidimensionales en el caso del tejido sobre una lámina). Por tanto, un tejido protésico de la presente invención puede tener una estructura tridimensional.

En un método de producción de tejido protésico de la presente invención, el tiempo suficiente significa, 20 preferentemente, al menos 3 días y puede ser más o menos de 3 días, aunque varía en función de la aplicación de un tejido protésico de interés. Al tercer día de cultivo, es posible preparar un injerto que se puede aplicar al menos al refuerzo de un corazón.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un tejido protésico funcional. El tejido protésico funcional de la presente invención es, en el presente documento, un tejido protésico implantable. Hasta ahora se han realizado 25 intentos de producir tejidos protésicos mediante cultivo celular. No obstante, no había tejidos protésicos adecuados para implantación en términos de tamaño, resistencia, lesiones físicas cuando se desprenden o similares. La presente invención proporciona un método de cultivo tisular donde las células se cultivan en presencia de un agente estimulante tridimensional como se ha descrito anteriormente, por lo que no existe problema en términos de tamaño, resistencia y similares, y no existen dificultades en desprender tejidos. Un tejido protésico implantable se 30 proporciona únicamente después de conseguir un método de cultivo tisular. Para enfermedades que se tratan convencionalmente únicamente mediante trasplante de órgano (por ejemplo, cardiopatía resistente (miocardiopatía hipertrófica de fase dilatada, miocardiopatía dilatada etc.)), se proporciona una terapia alternativa que tiene una versatilidad general, que es de una utilidad inconmensurable.

35

Una “enfermedad” objetivo de la presente invención puede ser, infarto de miocardio, miocardiopatía. Una terapia combinada de la presente invención se puede aplicar a órganos, además del corazón, siempre que esté dirigida a la regeneración de tejidos dañados. En una realización específica, una enfermedad objetivo de un método de la presente invención es insuficiencia cardíaca resistente.

40

La expresión “insuficiencia cardíaca” hace referencia a la incapacidad del corazón para circular la sangre en una cantidad y calidad requeridas a los órganos de todo el cuerpo debido a una alteración del propio corazón, tal como el fallo de las funciones cardíacas, el fallo de las funciones circulatorias, una reducción de la potencia de contracción o similares. La insuficiencia cardíaca es un síntoma terminal de las cardiopatías, tales como infarto de miocardio, miocardiopatía y similares. Insuficiencia cardíaca grave significa que el estado del corazón es grave y también se 45 denomina insuficiencia cardíaca terminal.

La expresión “insuficiencia cardíaca resistente” hace referencia a la insuficiencia cardíaca que es resistente a la terapia y es difícil de mejorar mediante terapia médica y terapia farmacológica. La expresión “insuficiencia cardíaca resistente” se denomina sustancialmente sinónimamente insuficiencia cardíaca crónica o insuficiencia cardíaca 50 terminal. La insuficiencia cardíaca resistente no se puede controlar con terapia triple usando un fármaco digitálico típico, diurético, inhibidor de la ECA y similares, o una terapia farmacológica suplementada con un β-bloqueante. Estas terapias requieren una ayuda mecánica para la circulación, tal como BBIA (bombeo con balón intraaórtico), PCPS (soporte cardiopulmonar percutáneo) o similares o, como alternativa, trasplante de corazón. Por tanto, existe una demanda del desarrollo de una simple terapia radical. En particular, el trasplante de corazón tiene un grave 55 problema de falta de donantes. Cuando no se puede usar un trasplante de corazón (por ejemplo, ancianos, pacientes que necesitan diálisis etc.), la insuficiencia cardiaca resistente supone problemas serios. Por tanto, existe una gran demanda de una alternativa a la terapia con trasplante de corazón.

La expresión “infarto de miocardio” hace referencia a una enfermedad donde se produce necrosis isquémica en un 60 área de perfusión asociada con una construcción altamente desarrollada u oclusión causada por varias lesiones de la arteria coronaria. La gravedad del infarto de miocardio se divide en clases de varias formas. La clasificación se puede basar en, por ejemplo, el progreso en el tiempo, la morfología (por ejemplo, el intervalo, el sitio, el tamaño de la necrosis o similares en el miocardio), la forma de necrosis de un miocardio, la reconstrucción de un ventrículo después del infarto, la dinámica de la circulación sanguínea (asociada con terapia, pronóstico etc.), la gravedad 65 clínica y similares. El infarto de miocardio que tiene un nivel elevado de gravedad se denomina particularmente

infarto de miocardio grave.

El término “miocardiopatía” es un término genérico para las enfermedades causadas por anomalías orgánicas y funcionales en un miocardio, que se dividen en miocardiopatía secundaria tras una enfermedad básica (por ejemplo, hipertensión, disbolia, isquemia etc.) y miocardiopatía espontánea que se desarrolla in una enfermedad básica 5 aparente. Como cambio patológico se observa hipertrofia miocárdica, formación de tejido fibroso, degeneración o similares.

La expresión “miocardiopatía dilatada” hace referencia a una insuficiencia funcional del ventrículo izquierdo asociada con la deflación del mismo y también se denomina “miocardiopatía congestiva”. La expresión “miocardiopatía 10 dilatada” puede abreviarse a “DCM”. La miocardiopatía dilatada se asocia con fallos de contracción, que conducen a insuficiencia cardíaca crónica. Los ejemplos de una causa de miocardiopatía dilatada incluyen varias cosas, tales como infección vial, mutación génica y similar. En general, la miocardiopatía dilatada no incluye enfermedades miocárdicas específicas (denominadas convencionalmente enfermedades miocárdicas secundarias), tales como miocardiopatía isquémica causada por otra causa no ambigua, enfermedades miocárdicas asociadas con disbolia o 15 similares. No obstante, estas enfermedades miocárdicas específicas también se incluyen dentro del alcance de la presente invención siempre que la presente invención tenga un efecto terapéutico sobre las mismas. La mayoría de los pacientes tienen una reducción de la potencia de contracción en todo el miocardio. También se dice que la anomalía se puede producir en el movimiento de una parte aislada de una pared. Normalmente, la miocardiopatía dilatada tiene síntomas de insuficiencia cardíaca asociada con congestión y, en ocasiones, tiene malestar por el bajo 20 gasto cardíaco. La miocardiopatía dilatada no tiene una causa conocida y es una enfermedad miocárdica idiopática. La patología de la miocardiopatía dilatada incluye principalmente una reducción de la potencia de contracción de un miocardio, que conduce a la dilatación de la cavidad ventricular izquierda. La patología también incluye una reducción en la cantidad de sangre, un incremento de la presión diastólica en el ventrículo izquierdo y similar. La miocardiopatía dilatada tiene un inicio agudo o insidioso e insuficiencia cardíaca resistente en su etapa final. 25 Patológica o histológicamente, difusamente o localmente se observa degeneración, formación de tejido fibroso o atrofia del tejido miocárdico. Los cardiomiocitos residuales a menudo causan hipertrofia. Además de la insuficiencia cardíaca se producir arritmia grave o tromboembolia, lo que tiene como resultado un mal pronóstico. El ecocardiograma es particularmente útil para el diagnóstico de la miocardiopatía dilatada, que demuestra una reducción difusa del movimiento de la pared, el adelgazamiento de una pared ventricular y la dilatación de una 30 cavidad ventricular. Además se pueden realizar angiografía coronaria (lesión arterial coronaria) y biopsia del miocardio para conseguir un diagnóstico más fiable. Por tanto, en la presente invención se puede usar una técnica de ensayo bien conocida en la material, tal como ultrasonografía cardíaca, un método de ensayo con catéter cardíaco, un método de ensayo médico nuclear (gammagrafía miocárdica), biopsia del miocardio o similares, para confirmar una mejora en la miocardiopatía dilatada. 35

Convencionalmente, para la miocardiopatía dilatada se realizan una terapia farmacológica usando un inhibidor de la ECA, un diurético, un β-bloqueante, un fármaco cardiotónico o similares, guías para regular la ingesta de sal y agua y ejercicio y similares. No obstante, ninguno de ellos cura la propia enfermedad. Para la arritmia se puede administrar un agente antiarrítmico, tal como amiodarona o similar, que, no obstante, es solo un tratamiento 40 sintomático. Para los trombos y los émbolos se usa un anticoagulante, tal como warfarina o similar, que, no obstante, es solo un tratamiento sintomático. Como tratamiento quirúrgico se usa un marcapasos, un desfibrilador enterrado, un dispositivo de circulación asistida (derivación), tranplante de corazón o similares. No obstante, no se puede decir que estos tratamientos distintos al trasplante de corazón erradiquen la enfermedad. En la actualidad, la grave escasez de donantes limita el trasplante de corazón. Una técnica terapéutica de la presente invención es 45 eficaz para la miocardiopatía dilatada y similares y proporciona un efecto terapéutico ventajoso.

La expresión “miocardiopatía hipertrófica” (MCH) hace referencia a un tipo de miocardiopatía cuyo síntoma principal es una reducción del cumplimiento diastólico debido a un aumento de tamaño anormal de un miocardio e hipertrofia del ventrículo izquierdo. La función contráctil del corazón normalmente se conserva. Las tasas de supervivencia a 5 50 años y a 10 años son, satisfactoriamente, de aproximadamente 90 % y de aproximadamente 80 %, respectivamente. No obstante, se cree que la miocardiopatía hipertrófica es una causa de muerte súbita, que supone un problema clínico. Por tanto, existe una demanda de una terapia radical para la enfermedad.

La expresión “miocardiopatía hipertrófica de fase dilatada” hace referencia a un tipo de miocardiopatía hipertrófica 55 donde se desarrolla formación de tejido fibroso en un miocardio en el curso de la enfermedad, lo que conduce al adelgazamiento de una pared ventricular y una reducción de la potencia de contracción y, como resultado, aumenta de tamaño una cavidad ventricular, de forma que aparece un síntoma de miocardiopatía dilatada. Se dice que la miocardiopatía hipertrófica de fase dilatada tiene un pronóstico muy malo. Existe una serie de casos subclínicos, que suponen un problema clínico. Por tanto, también existe una demanda de una terapia radical para la miocardiopatía 60 hipertrófica de fase dilatada. Una técnica terapéutica de la presente invención es eficaz para la miocardiopatía hipertrófica de fase dilatada y similar y proporciona un efecto terapéutico ventajoso.

Las terapias convencionales y las técnicas diagnósticas para la insuficiencia cardiaca resistente o similar como se ha descrito anteriormente se describen en, por ejemplo, "Junkanki Shikkan Saishin no Tiryo [Latest Therapy for 65 Circulatory Diseases] 2002-2003, Shigetake Sasayama y Yoshio Yazaki editores, Nankodo, 2002, y similares. Como

se describe en "Junkanki Shikkan Saishin no Tiryo [Latest Therapy for Circulatory Diseases] 2002-2003, Shigetake Sasayama y Yoshio Yazaki editores, Nankodo, 2002, que se ha publicado muy recientemente, no habrá una terapia radical para la insuficiencia cardíaca resistente.

Como se usa en el presente documento, el término “profilaxis” o “prevención” en relación con una determinada 5 enfermedad o trastorno hace referencia a un tratamiento que impide que se produzca dicha afección antes de se produzca la afección o hace que se produzca la afección a un nivel reducido o que se retrase.

Como se usa en el presente documento, el término “terapia” en relación con una determinada enfermedad o trastorno significa que cuando se produce dicha afección, se previene el deterioro de dicha enfermedad o trastorno, 10 preferentemente se conserva como tal, más preferentemente se reduce e incluso más preferentemente se extingue. Como se usa en el presente documento, el término “terapia radical” hace referencia a una terapia que erradica la raíz o la causa de un proceso patológico. Por tanto, cuando se elabora una terapia radical para una enfermedad, en principio no hay recurrencia de la enfermedad.

15

Como se usa en el presente documento, el término “pronóstico” también se denomina “tratamiento pronóstico”. El término “pronóstico” en relación con una determinada enfermedad o trastorno hace referencia a un diagnóstico o tratamiento de dicha afección después de una terapia.

En una realización preferida, el tejido protésico de la presente invención tiene una conexión biológica tridimensional. 20 Como se describe en otras partes de la memoria descriptiva, los ejemplos de conexión biológica incluyen, entre otros, la conexión física mediante matrices extracelulares, conexión eléctrica y similar. En la presente invención, la conexión física mediante matrices extracelulares es particularmente importante en vista de la resistencia del tejido.

En una realización, el tejido protésico de la presente invención es diferente de los tejidos protésicos convencionales 25 en cuanto a que el primero comprende una célula.

Preferentemente, un tejido protésico de la presente invención consiste sustancialmente en una célula o un material derivado de la célula. Dado que el tejido protésico está compuesto sustancialmente por solo una célula y un material derivado de célula (por ejemplo, matriz extracelular etc.), el tejido protésico puede tener un mayor nivel de 30 biocompatibilidad y afinidad. El material derivado de célula incluye de forma representativa matrices extracelulares. En particular, el tejido protésico comprende, preferentemente, una célula y una matriz extracelular en una proparte adecuada de los mismos. Dicha proparte adecuada entre una célula y una matriz extracelular es de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1, preferentemente de aproximadamente 3:7 a aproximadamente 7:3 y, más preferentemente, de aproximadamente 3: 7 a aproximadamente 5:5. Una proparte preferible varía en función de 35 la finalidad. Los expertos en la técnica pueden preparar dichas variaciones. Se puede estimar una proparte adecuada investigando la proparte entre una célula y una matriz extracelular en un órgano de interés.

En otra realización, preferentemente se aísla el tejido protésico de la presente invención. En este caso, el término “aislado” significa que el tejido protésico se separa de un armazón, un soporte y un medio de cultivo usado en el 40 cultivo. Si un tejido protésico de la presente invención carece sustancialmente de materiales, tal como un armazón y similares, es posible suprimir las reacciones adversas tras la implantación, tales como reacciones inmunológicas de rechazo, reacciones de inflamación y similares.

En otra realización, preferentemente el tejido protésico de la presente invención está intacto. Un tejido protésico 45 intacto se puede proporcionar sustancialmente únicamente después del método de producción del tejido protésico de la presente invención usando un agente estimulante tridimensional. Convencionalmente, cuando un tejido protésico se desprende del ambiente de cultivo, necesariamente se aplica un estímulo físico al tejido, de forma que el tejido se daña inevitablemente. Por tanto, se ha realizado un intento de recopilar una pluralidad de láminas celulares preparadas mediante métodos convencionales. No obstante, dicha multicapa de láminas celulares no se 50 puede usar fácilmente para la implantación real. Por tanto, dicho problema se supera mediante la entereza del tejido protésico de la presente invención.

En una realización preferida, el tejido protésico de la presente invención tiene un tamaño grande. La expresión “tamaño grande” en relación con un tejido protésico normalmente significa que el tejido protésico tiene un área 55 suficiente para cubrir un lugar en el cual se implanta el tejido protésico. Dicha área es, al menos 6 cm2.

En una realización preferida, el tejido protésico de la presente invención es grueso. El término “grueso” en relación con un tejido protésico normalmente significa que el tejido protésico tiene un espesor que proporciona una resistencia suficiente para cubrir un lugar en el cual se implanta el tejido protésico. Dicho espesor es, por ejemplo, 60 de al menos aproximadamente 50 µm, más preferentemente al menos aproximadamente 100 µm, al menos aproximadamente 200 µm, al menos aproximadamente 300 µm, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 400 µm, todavía más preferentemente al menos aproximadamente 500 µm, y todavía incluso más preferentemente aproximadamente 1 mm.

65

Un tejido protésico de la presente invención está, preferentemente, no perforado. El tejido protésico no perforado es

adecuado para la implantación. El tejido protésico no perforado es particularmente preferible para reforzar un sitio defectuoso de un tejido en forma de bolsa que necesita ser cubierto.

En otra realización, el tejido protésico de la presente invención es flexible. Debido a la flexibilidad, el tejido protésico es particularmente adecuado para reforzar órganos móviles. Los ejemplos de órganos móviles incluyen, entre otros, 5 corazones, vasos sanguíneos, músculos y similares.

En otra realización, preferentemente el tejido protésico de la presente invención tiene capacidad de dilatación/contracción. Debido a la capacidad de dilatación/contracción, el tejido protésico es adecuado para los órganos que se expanden y contraen, por ejemplo, corazones, músculos y similares. La capacidad de 10 dilatación/contracción, no la puede lograr una lámina celular o similar preparada mediante métodos convencionales.

Preferentemente, un tejido protésico de la presente invención tiene una resistencia suficiente para aguantar el movimiento de pulsación de un corazón. La resistencia suficiente para aguantar el movimiento de pulsación es, entre otras, de al menos aproximadamente un 50 % de la resistencia del miocardio de origen natural, preferentemente de 15 al menos aproximadamente un 75 % y más preferentemente de al menos aproximadamente un 100 %.

En una realización preferida, el tejido protésico de la presente invención tiene una conexión biológica en las tres dimensiones. Algunos tejidos protésicos se preparan mediante métodos convencionales que tienen conexión biológica en dos dimensiones en cierta medida. No obstante, mediante métodos convencionales no se puede 20 preparar un tejido que tenga conexión biológica en las tres dimensiones. Por tanto, dado que el tejido protésico de la presente invención tiene conexión biológica en las tres dimensiones, el tejido protésico es sustancialmente implantable en cualquier aplicación.

Los ejemplos de conexión biológica que es un indicador de un tejido protésico de la presente invención incluyen, 25 entre otros, interconexión de matrices extracelulares, conexión eléctrica, la presencia de transducción de señal intracelular y similar. La interacción de matrices extracelulares se puede observar con un microscopio mediante tinción de la adhesión intracelular según sea adecuado. La conexión eléctrica se puede observar midiendo el potencial eléctrico.

30

En una realización preferida, el tejido protésico de la presente invención tiene una resistencia tisular suficiente para aplicaciones clínicas. La resistencia tisular suficiente para aplicaciones clínicas varía en función de un lugar donde se aplica el tejido protésico. Los expertos en la técnica pueden determinar dicha resistencia con referencia a la divulgación de la memoria descriptiva y técnicas bien conocidas en la materia. Por ejemplo, en una realización preferida, una resistencia requerida por la presente invención es al menos un 80 % de la resistencia tisular de una 35 parte objetivo de una aplicación clínica.

En una realización específica, la parte descrita anteriormente objetivo de una aplicación clínica incluye el corazón y, en algunos casos, porciones distintas al corazón.

40

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de cultivo celular para producir tejido protésico de una célula. La composición de cultivo celular contiene un ingrediente (por ejemplo, medio disponible comercialmente etc.) para mantener o cultivar la célula y un agente estimulante tridimensional. El agente estimulante tridimensional se ha descrito con detalle en la descripción anterior del método de producción del tejido protésico. Por tanto, el agente estimulante tridimensional incluye ácido ascórbico o un derivado del mismo (por ejemplo, ácido 1-45 fosfato ascórbico o una sal del mismo, ácido 2-fosfato ascórbico o una sal del mismo, ácido L-ascórbico o una sal del mismo etc.). La composición de cultivo de la presente invención contiene ácido 2-fosfato ascórbico o una sal del mismo a una concentración de al menos 0,1 mM. Como alternativa, en el caso de una composición de cultivo condensada, la composición de cultivo condensada contiene ácido 2-fosfato ascórbico o una sal del mismo a una concentración que se convierte en al menos 0,1 mM tras la preparación. Como alternativa, la concentración límite 50 inferior de ácido 2-fosfato ascórbico o una sal del mismo puede ser 0,01 mM, 0,05 mM, 0,2 mM, o 0,3 mM, incluso más preferentemente 0,5 mM, o, como alternativa, 1,0 mM.

En una realización preferida, el agente estimulante tridimensional, contenido en la composición de cultivo celular descrita en la presente invención, incluye ácido 1-fosfato ascórbico o una sal del mismo y ácido 2-fosfato ascórbico o 55 una sal del mismo.

El ácido 2-fosfato ascórbico usado en la presente invención se usa de forma concomitante con ácido 1-fosfato ascórbico. En este caso, preferentemente pueden estar presentes ácido 2-fosfato-ascórbico y ácido 1-fosfato-ascórbico a una proparte específica. Dicha proparte preferible está, por ejemplo, en el intervalo de 1:10 a 10:1. 60 Como alternativa, la proparte preferible es tal que la cantidad molar de ácido 1-fosfato-ascórbico es menor que la cantidad molar de ácido 2-fosfato-ascórbico.

En otra realización, el agente estimulante tridimensional usado en la presente invención incluye ácido 2-fosfato-ascórbico. No obstante, no se produjeron informes de que el ácido 2-fosfato-ascórbico se use explícitamente para la 65 formación de tejido. En la presente invención, añadiendo una determinada cantidad de ácido 2-fosfato-ascórbico, es

posible prevenir que una matriz extracelular se produzca en una cantidad excesivamente grande, la composición tiene un nivel implantable de matrices extracelulares y, por tanto, la proparte entre la célula y la matriz extracelular tiene como resultado un nivel implantable de resistencia y similares. Estos efectos son inesperados.

En una realización preferida, el ácido 2-fosfato-ascórbico usado en la presente invención normalmente está presente 5 a una concentración de al menos 0,01 mM, preferentemente al menos 0,05 mM, más preferentemente al menos 0,1 mM, incluso más preferentemente al menos 0,2 mM, y todavía más preferentemente al menos 0,5 mM, e incluso todavía más preferentemente 1,0 mM.

En una realización preferida determinada, el agente estimulante tridimensional de la presente invención incluye 10 ácido 1-fosfato-ascórbico o una sal del mismo, ácido 2-fosfato-ascórbico o una sal del mismo y ácido L-ascórbico o una sal del mismo.

(Tejido protésico para “envolver”)

15

En otro aspecto, la presente invención proporciona un tejido protésico para reforzar una parte de un organismo animal. El tejido protésico capaz de dicho refuerzo es una técnica que solo se alcanza después de proporcionar el método de producción de tejido protésico de la presente invención.

En una realización preferida, la parte descrita anteriormente incluye órganos con forma de bolsa. Para los órganos 20 con forma de bolsa es importante que el tejido protésico esté intacto y/o no sea poroso. Un tejido protésico que tiene dicha propiedad y un determinado tamaño no se puede proporcionar mediante técnicas convencionales. Por tanto, se puede decir que una terapia sustancial para los órganos con forma de bolsa solo se puede conseguir después de proporcionar el tejido protésico de la presente invención descrito anteriormente. Por tanto, los órganos con forma de bolsa que tienen enfermedades específicas (por ejemplo, enfermedades resistentes (por ejemplo, miocardiopatía 25 dilatada etc.), etc.), primero se puede proporcionar una terapia distinta al trasplante de órgano.

En una realización específica, los ejemplos del órgano con forma de bolsa descrito anteriormente incluyen, corazón. En una realización específica de la presente invención, el refuerzo descrito anteriormente se puede conseguir disponiendo un tejido protésico de la presente invención para cubrir la parte descrita anteriormente. No es posible 30 usar un tejido protésico proporcionado mediante métodos convencionales para realizar el tratamiento cubriendo la parte descrita anteriormente (es decir, aplicación de “envolver”). Por tanto, el tejido protésico de la presente invención puede proporcionar aplicaciones que no se pueden conseguir mediante técnicas convencionales.

Por tanto, en la realización específica descrita anteriormente, el tejido protésico de la presente invención es 35 resistente a la dilatación/contracción de la parte descrita anteriormente.

En una realización preferida, el tejido protésico de la presente invención tiene ventajosamente conexión biológica.

En otra realización preferida, la conexión biológica incluye al menos uno de interconexión de matrices extracelulares, 40 conexión eléctrica y transducción de señal intracelular.

En otra realización preferida, el tejido protésico para refuerzo de la presente invención se forma cultivando una célula en presencia de un agente estimulante tridimensional.

45

En otra realización, el tejido protésico para refuerzo de la presente invención comprende una célula (célula autóloga) derivada de un animal que se va a tratar (por ejemplo, un ser humano). Más preferentemente, un tejido protésico para refuerzo de la presente invención comprende únicamente una célula (célula autóloga) derivada de un animal que se va a tratar (por ejemplo, un ser humano).

50

(Terapia para “envolver”)

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para reforzar una parte de un organismo animal. El método comprende las etapas de: A) disponer un tejido protésico para cubrir la parte; y B) sujetar el tejido protésico durante un tiempo suficiente para conectar a la parte. La etapa de disponer el tejido protésico para cubrir la parte se 55 puede llevar a cabo usando una técnica bien conocida en la materia. El tiempo suficiente varía en función de una combinación de la parte y el tejido protésico y los expertos en la técnica lo pueden determinar fácilmente según sea adecuado en función de la combinación. Ejemplos de dicho tiempo incluyen, entre otros, 2 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año y similares. En la presente invención, un tejido protésico comprende, preferentemente, sustancialmente sólo célula(s) y material(es) derivado de la célula. Por tanto, no existe un material 60 concreto que necesite extraerse tras la operación. El límite inferior del tiempo suficiente no es particularmente importante. En este caso, se puede decir que cuanto mayor es el tiempo, más preferible es el tejido protésico. Si el tiempo es suficientemente extremadamente largo, se puede decir que el refuerzo se ha completado sustancialmente. Por tanto, el tiempo no está particularmente limitado.

En otra realización, en un método de refuerzo de la presente invención, la parte descrita anteriormente incluye, 65 preferentemente, órganos con forma de bolsa. Con el fin de reforzar dicho tejido con forma de bolsa, es necesario

envolver el órgano (por ejemplo, cubrir una parte dañada). Primero, la presente invención proporciona un tejido protésico resistente a las aplicaciones de envoltura. Por tanto, el método de refuerzo de la presente invención es ventajoso sobre las técnicas convencionales.

En particular, en el método de refuerzo de la presente invención, un tejido protésico de la presente invención es 5 resistente a la dilatación/contracción de la parte descrita anteriormente. Los ejemplos de dicha dilatación/contracción incluyen, entre otros, el movimiento de pulsación de un corazón, la contracción de un músculo y similares.

En otra realización preferida, en el método de refuerzo de la presente invención, un tejido protésico de la presente invención tiene conexión biológica (por ejemplo, interconexión de matrices extracelulares, conexión eléctrica, 10 transducción de señal intracelular etc.). La conexión biológica se proporciona, preferentemente, en las tres dimensiones.

En otra realización preferida, el método de refuerzo de la presente invención descrito comprende adicionalmente cultivar una célula en presencia de un agente estimulante tridimensional para formar un tejido protésico de la presente invención. Una técnica de implantación/regeneración usando el método que comprende la etapa de cultivar 15 una célula en presencia de un agente estimulante tridimensional no se puede proporcionar mediante técnicas convencionales. El método proporciona una terapia para enfermedades (por ejemplo, cardiopatías resistentes (por ejemplo, miocardiopatía dilatada etc.) etc.), que no se puede conseguir mediante terapias convencionales.

En una realización preferida, en el método de refuerzo de la presente invención, la célula usada en el tejido protésico 20 de la presente invención deriva de un animal donde se va a implantar el tejido protésico (es decir, una célula autóloga). Usando una célula autóloga se pueden evitar los efectos secundarios adversos, tales como reacciones inmunológicas de rechazo o similares.

En otra realización preferida, la parte es un corazón. El corazón tiene una enfermedad o trastorno, tal como, 25 cardiopatía isquémica, infarto de miocardio, miocardiopatía hipertrófica de fase dilatada, miocardiopatía dilatada.

Para algunos órganos se dice que es difícil tratar radicalmente una enfermedad, trastorno o afección específica de los mismos (por ejemplo, cardiopatías resistentes). No obstante, la presente invención proporciona el efecto descrito anteriormente, de modo que hace posible un tratamiento que no se pueda conseguir mediante técnicas 30 convencionales. Se ha aclarado que la presente invención se puede aplicar a terapia radical. Por tanto, la presente invención tiene utilidad que no se puede conseguir mediante medicamentos convencionales.

(Terapia combinada)

35

En otro aspecto, la presente invención proporciona una terapia de regeneración que usa una citocina, tal como HGF o similar, en combinación con un tejido protésico.

Las citocinas usadas en la presente invención ya están disponibles comercialmente (por ejemplo, HGF-101 de Toyo Boseki, etc.). No obstante, estas citocinas se pueden preparar mediante varios métodos y se pueden usar en la 40 presente invención si se purifican en una medida que se puedan usar como medicamento. El HGF se puede obtener del siguiente modo: se cultivan células cultivadas primarias o una línea celular establecida capaz de producir HGF; y el HGF e separa del sobrenadante del cultivo o similar, seguido de purificación. Como alternativa, un gen que codifica HGF se incorpora en un vector adecuado mediante una técnica de ingeniería genética; el vector se inserta en un huésped adecuado para transformar el huésped; el HGF recombinante de interés se puede obtener del 45 sobrenadante del cultivo del huésped transformado (por ejemplo, Nature, 342, 440(1989); patente japonesa abierta a consulta por el público nº 5-111383; Biochem-Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989), etc.). La célula huésped descrita anteriormente no es particularmente limitada y pueden ser varias células huésped usadas convencionalmente en técnicas de ingeniería genética, incluyendo, por ejemplo, Escherichia coli, levaduras, células animales y similares. El HGF obtenido de este modo puede tener una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones 50 de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos, siempre que tenga sustancialmente la misma acción que el HGF de origen natural. Los ejemplos de un método para introducir HGF en los pacientes en la presente invención incluyen, entre otros, un método de liposoma del virus Sendai (HVJ) con una seguridad y eficiencia elevadas (Molecular Medicine, 30, 1440-1448 (1993); Jikken Igaku (Experimental Medicine), 12, 1822-1826 (1994)), y un método de introducción génica eléctrica, un método de introducción génica con escopeta y similar. Preferentemente 55 se usa el método del liposoma de HVJ.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá a modo de ejemplos. Los ejemplos descritos más adelante se proporcionan únicamente con fines ilustrativos. De acuerdo con lo anterior, el alcance de la presente invención no está limitado, a excepción de por las reivindicaciones adjuntas. 60

Ejemplos

En los ejemplos siguientes, se trató a los animales de acuerdo con normas definidas por la Universidad de Osaka (Japón) y conforme al espíritu de la protección animal. 65

(Ejemplo 1): Producción y utilización de tejido protésico y estructura tridimensional formados por lámina de cardiomiocitos, la lámina de cardiomiocitos contráctiles de tejido modificado regenera el miocardio deteriorado)

(La lámina de cardiomiocitos contráctiles modificada biológicamente regenera el miocardio infartado) 5

En el ejemplo 1, los presentes inventores investigaron (1) si una lámina de cardiomiocitos (tejido protésico) sobrevive o no tras la implantación y muestra conexión eléctrica histológica con miocardio deteriorado; (2) si la lámina de cardiomiocitos implantada (tejido protésico) puede inducir o no una mejora en una función cardíaca. Como resultado, se determinó que la presente invención proporciona la conexión eléctrica y la mejora de la función cardíaca. 10

Los presentes inventores introdujeron el concepto de la implantación de tejido modificado biológicamente en el tratamiento del miocardio deteriorado. Se demostró que una lámina de cardiomiocitos contráctiles con ingeniería tisular sin un armazón proporciona conexión eléctrica histológica con miocardio deteriorado y regeneración de un miocardio infartado.

15

(Materiales y métodos)

(Modelo de infarto de miocardio)

En este estudio se usaron 30 ratas Lewis macho (300 g, 8 semanas de edad, Seac Yoshitomi Ltd, Fukuoka, Japón). 20 El cuidado de animales por seres humanos cumplía los "Principles of Laboratory Animal Care" preparados por la National Society for Medical Research y "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (publicación del NIH Nº 86-23, 1985, revisado) preparado por el Institute of Laboratory Animal Resource y publicado por el National Institute of Health. Se indujo infarto agudo de miocardio como se describe en Weisman H.F., Bush D.E., Mannisi J. A., et al., Cellular Mechanism of Myocardial Infarct Expansion, Circulation, 1988; 78: 186-201. En resumen, se anestesió a las 25 ratas con pentobarbital sódico, seguido de ventilación con presión positiva mediante un tubo endotraqueal. Se usó una toracotomía en el 4º espacio intercostal izquierdo y la arteria coronaria descendente anterior izquierda (ADI) se ligó completamente con un hilo de polipropileno 8-0 a una distancia de 3 mm desde la raíz de la ADI.

(Preparación de placas de cultivo celular con poliestireno injertado con PIPAAm diseñado en rectángulo) 30

Se preparó un aplaca de cultivo celular injertada con PIPAAm diseñada con forma de rectángulo con un procedimiento específico como se describe en, por ejemplo, Okano T., Yamada N., Sakai H., Sakurai Y., J. Biomed. Mater. Res., 1993; 27:1243-1251. En resumen, una solución monomérica de IPAAm en 2-propanol (amablemente proporcionado por Kohjin, Tokio, Japón) se extendió sobre placas de poliestireno con cultivo tisular (TCPS) (Falcon 35 3002, Becton Dickinson). Después, estas placas se sometieron a irradiación (dosis del haz de electrones: 0,25 MGy) usando un sistema de procesamiento con haz de electrones de área (Nisshin High Voltage), que tiene como resultado la polimerización del IPAAm y la unión covalente de IPAAm a la superficie de la placa. Las placas injertadas con PIPAAm se aclararon con agua destilada fría para eliminar el IPAAm no injertado, seguido de secado de las placas con gas nitrógeno. En la segunda etapa, la superficie injertada con PIPAAm se enmascaró con una 40 cobertura rectangular de vidrio (24×24 mm, Matsunami, Tokio, Japón). Se extendió una solución de monómero de acrilamida (AAm) de 2-propanol sobre la superficie de la placa enmascarada. Después, la superficie de la placa se irradió con un haz de electrones y se lavó. Como resultado, la región rectangular en el centro de cada placa se injertó con PIPAAm (respondedor a la temperatura), mientas que el borde circundante se injertó con polo-AAm (adhesivo no celular). La placa injertada con PIPAAm diseñada en rectángulo se esterilizó con gas de óxido de 45 etileno antes de usar en cultivo.

(Cultivo primario de células de músculo ventricular de rata recién nacida)

Se prepararon cardiomiocitos primarios de rata recién nacida de acuerdo con un procedimiento descrito 50 anteriormente en, por ejemplo, Shimizu T., Yamato M., Akutsu T. et al., Circ. Res., Feb 22, 2002; 90(3):e40. En resumen, se sacrificó a las ratas recién nacidas de 1 a 2 días de edad con anestesia profunda y rápidamente se extrajeron los corazones, seguido de la digestión con solución de Hank con colagenasa (clase II, Worthington Biochemical) a 37 °C. Las células aisladas se suspendieron en medio de cultivo que contiene 6 % de FCS, 40 % de medio 199 (Gibco BRL), 0,2 % de solución de penicilina-estreptomicina, 2,7 mmol/l de glucosa y 54 % de solución 55 salina equilibrada (116 mmol/l de NaCl, 1,0 mmol/l de NaH2PO4, 0,8 mmol/l de MgSO4, 1,18 mmol/l de KCl, 0,87 mmol/l de CaCl2 y 26,2 mmol/l de NaHCO3). La suspensión celular se sembró a una densidad de 8 × 106 células/placa, seguido de incubación en una atmósfera humidificada que contiene 5 % de CO2 a 37 °C.

(Cultivo primario de fibroblastos) 60

Se prepararon fibroblastos primarios de acuerdo con un procedimiento publicado previamente en, por ejemplo, Yablonka-Reuveni Z., Nameroff M., Skeletal Muscle Cell Populations Separation and Partial Characterization of Fibroblast-Like Cells from Embryonic Tissue Using Density Centrifugation, Histochemistry, 1987; 87:27-38. En resumen, una suspensión de células derivadas del músculo de la para de ratas Lewis de 8 semanas de edad se 65 separó en fibroblastos y células musculares mediante centrifugación por gradiente de densidad en Percoll™

(Amersham Biosciences Sweden). Los fibroblastos aislados se usaron para una lámina de fibroblastos control.

(Producción de una lámina de cardiomiocitos)

Los cardiomiocitos aislados de la rata recién nacida se cultivaron sobre placa de cultivo celular de poliestireno 5 injertada con PIPAAm diseñada como rectángulo. Disminuyendo la temperatura a 20 °C, las células se desprendieron como una lámina celular rectangular. Se apilaron dos láminas de cardiomiocitos para producir un injerto de corazón más grueso. La observación transversal de la lámina cardiaca de doble capa demostró una íntima conexión y tejido homogéneo de tipo corazón. El movimiento simultáneo de una lámina de cardiomiocitos de cuatro capas se detectó a simple vista (datos no mostrados). En el caso de la lámina de fibroblastos, los fibroblastos 10 aislados se cultivaron en la misma placa durante 2 días y se desprendieron como una lámina celular rectangular mediante el mismo método.

(Implantación de una lámina de cardiomiocitos)

15

La lámina de cardiomiocitos se implantó en ratas de Lewis 2 semanas después de la unión de la ADI. Específicamente se realizó una toracotomía en el 4º espacio intercostal izquierdo en la rata con anestesia general. La región del infarto se identificó visualmente en base a la cicatriz de la superficie y el movimiento anormal de la pared. La lámina de cardiomiocitos o la lámina de fibroblastos se implantaron en un miocardio infartado. No se trató a un grupo control. 20

La función cardíaca se evaluó 2 semanas, 4 semanas y 8 semanas después de la implantación. 8 semanas después de la implantación se extrajo el corazón y se seccionó y se procesó para pruebas histológicas e inmunohistológicas.

Con el fin de identificar la lámina de cardiomiocitos implantada, se aislaron cardiomiocitos de rata recién nacida 25 EGFP con el mismo protocolo y se preparó una lámina de d. Los presentes inventores implantaron la lámina de cardiomiocitos de rata recién nacida EGFP en un miocardio infartado de ratas atímicas. Los presentes inventores pudieron detectar cardiomiocitos positivos EGFP en el e miocardio infartado (Figura 6, parte inferior izquierda y parte inferior derecha).

30

(Medición de la función cardíaca del corazón de rata)

Se anestesió a las ratas con pentobarbital sódico. La anestesia se suplemento con etanol para mantener una anestesia ligera. Las ratas se aseguraron ligeramente en una posición supina y se afeitaron los precordios de las ratas. Se realizó una ultrasonografía del corazón usando un ecocardiógrafo disponible comercialmente SONOS 5500 35 (PHILIPS Medical Systems, EE.UU.). Se colocó un transductor de matriz anular de 12 MHz en una capa de gel acoplador acústico aplicada sobre el hemitórax izquierdo. Se hizo que el transductor se pusiera cuidadosamente en contacto adecuado con el tórax al tiempo que se evita un nivel excesivo de presión en el tórax. Se realizaron imágenes de las ratas en posición de decúbito lateral izquierdo. Primero se obtuvieron imágenes del corazón en un modo bidimensional en una sección transversal del eje corto a un nivel del diámetro mayor del ventrículo izquierdo 40 (VI). El área del ventrículo izquierdo (VI) sistólico y el área del ventrículo izquierdo (VI) diastólica se determinaron al mismo tiempo. El volumen del ventrículo izquierdo (VI) se Estimó en base al área del eje corto del ventrículo izquierdo (VI) Gorcsan J. 3rd, Morita S., Mandarino W.A., Deneault L.G., Kawai A., Kormos R.L., Griffith B.P., Pinsky M. R., Two-dimensional Echocardiographic Automated Border Detection Accurately Reflects Changes in Left ventricular Volume, J. Am. Soc. Echocardiogr., 1993; 6: 482-9). La imagen resultante se usó para localizar un cursor 45 en modo M perpendicular a la pared anterior del ventrículo izquierdo (VI) y la pared posterior del ventrículo izquierdo (VI). Todas las mediciones se realizan on line usando un monitor. Las mediciones diastólicas se realizaron en el momento de una dimensión diastólica máxima del ventrículo izquierdo (VI) máxima aparente. Una dimensión telesistólica del ventrículo izquierdo (VI) se midió en el momento de la desviación sistólica más anterior de la posterior del ventrículo izquierdo (VI). Se midieron la dimensión del ventrículo izquierdo (VI) en la diástole (LVDd) y 50 la dimensión del ventrículo izquierdo (VI) del ventrículo izquierdo (VI) en la sístole. Los datos de dimensión y los datos del área se representaron mediante promedio de los valores medidos de dos o tres latidos seleccionados. Una fracción de eyección (FE) del ventrículo izquierdo (VI) se calculó mediante:

LVEF (%) = [ (LVDd3 - LVDs3) / LVDd3 ] x 100 55

El acortamiento fraccional (FS) del VI % se calculó mediante:

LV %FS = [ (LVDd - LVDs) / LVDd ] x 100

(Cuantificación mediante endocardiografía del movimiento de la pared del ventrículo izquierdo regional usando 60 cinesia)

La cinesia en color es una extensión de esta tecnología, que compara los valores de retrodispersión tisular entre sucesivos marcos acústicos como medio para rastrear automáticamente y mostrar el movimiento del endocardio en tiempo real. La cinesia en color se incorporó en un sistema de ultrasonidos disponible comercialmente (SONOS 65 5500, PHILIPS Medical Systems, EE.UU.) (Auchincloss 1988, Transplantation 46:1; Robert M. L., Philippe V., Lynn

W., James B., Claudia K., Joanne S., Rick K., David P., Victor M. A., et al., "Echocardiographic quantification of regional left ventricular wall motion with color kinesis", Circulation, 1996, 93:1877-1885).

En todos los sujetos del estudio se realizaron ecografías con un transductor de la matriz anular de 12-MHz. El eje corto paraesternal mediopapilar se obtuvo durante y después de espirar en la posición de decúbito lateral. Después 5 de optimizar la calidad de las imágenes, se activó el sistema de cuantificación acústica para la detección de los límites endocárdicos. El control de la ganancia (ganancia total y lateral, concentración de la ganancia con el tiempo) se ajustó para optimizar el rastreo de la interfaz sangre-endocardio en una región predefinida de interés. Después, la cinesia en color se activó para la codificación por colores in line de desviaciones endocárdicas durante la sístole. Las secuencias de las imágenes que contenían datos de cinesia en color se obtuvieron a través del círculo cardíaco y se 10 almacenan en un formato digital de discos ópticos para el análisis-OFF-LINE.

(Histopatología)

Se obtuvieron muestras del miocardio del ventrículo izquierdo a las 2 y 8 semanas de la implantación de la lámina de 15 cardiomiocitos. Cada muestra se introdujo en formaldehído neutro al 10 % y se incluyó en parafina. De cada muestra se contaron unas pocas secciones en serie y se tiñeron con hematoxilina y eosina para su inspección al microscopio óptico.

Para marcar las células endoteliales vasculares se realizó una tinción inmunohistoquímica del antígeno relacionado 20 con el factor VIII. Las secciones congeladas se fijaron con solución de paraformaldehído al 2 % en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente, se sumergieron en metanol con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 15 minutos, después se lavaron con PBS. Las muestras se cubrieron con una solución de seroalbúmina bovina (DAKO LSAB Kit DAKO CORPORATION, Dinamarca) durante 10 minutos para bloquear las reacciones inespecíficas. Las muestras se incubaron durante la noche con el anticuerpo conjugado con EPOS contra el antígeno relacionado con el factor 25 VIII acoplado con HRP (DAKO EPOS factor de Von Wille Brand antihumano/HRP, DAKO Dinamarca), Después de lavar las muestras con PES, se sumergieron en una solución de diaminobencidina (0,3 mg/ml de diaminobencidina en PBS) para obtener una tinción positiva.

Para detectar conexina 43, se realizó la tinción inmunohistoquímica del antígeno relacionado con la conexina 43. Las 30 secciones congeladas se sumergieron en metanol con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 5 minutos y después se lavaron con PBS. Las muestras se incubaron durante 20 minutos con un anticuerpo monoclonal de ratón frente a conexina 43 (CHEMICON International, Inc. EE.UU.). Después de lavar las muestras con PBS, se sumergieron en inmunoglobulinas antiratón biotiniladas (DAKO Dinamarca) durante 10 minutos y después se lavaron con PBS. Las muestras se sumergieron en estreptavidina conjugada con peroxidasa (DAKO Dinamarca) durante 10 minutos. 35 Después de lavar las muestras con PBS, se sumergieron en una solución de diaminobencidina (0,3 mg/ml de diaminobencidina en PBS) para obtener una tinción positiva.

(Análisis electrofisiológico)

40

Un microelectrodo (de 100 µm de diámetro, Unique Medical Co., Ltd., Tokio) para capturar los potenciales eléctricos se colocó sobre una cicatriz donde se han implantado láminas de cardiomiocitos, una cicatriz donde se han implantado láminas de fibroblastos o una cicatriz sin tratamiento. Los otros dos electrodos se colocaron sobre la región subcostal izquierda y femoral derecha. Para la estimulación del miocardio del huésped se colocaron dos microelectrodos sobre una aurícula. Para la detección del electrocardiograma del huésped de fijaron tres electrodos 45 sobre las regiones de la mama superior derecha, subcostal izquierda y femoral derecha. Ambos electrogramas se amplificaron mediante amplificadores bioeléctricos (UA-102, Unique Medical Co., Ltd., Tokio) y se registraron mediante un sistema de adquisición de datos (UAS-108S, Unique Medical Co., Ltd., Tokio). La aurícula se estimuló al ritmo de 300 lpm mediante un estimulador (NIHON KODEN Japón). Después se capturó el potencial eléctrico en las regiones de interés. 50

A continuación, con el fin de analizar el umbral, se colocaron dos microelectrodos para estimulación sobre la cicatriz sin tratamiento, la cicatriz donde se ha implantado la lámina de cardiomiocitos o la cicatriz donde se ha implantado la lámina de fibroblastos. Para la detección de un electrocardiograma del huésped al ritmo, se fijó un electrodo sobre un miocardio normal y los otros dos electrodos se colocaron en las regiones subcostal izquierda y femoral derecha. 55 Después, los presentes inventores estimularon la cicatriz sin tratamiento, la cicatriz donde se ha implantado la lámina de cardiomiocitos o la cicatriz donde se ha implantado la lámina de fibroblastos al ritmo de 300 lpm mediante el mismo estimulador.

(Análisis de datos) 60

Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar (SD). Con el fin de evaluar la significación de las diferencias entre los grupos individuales, la evaluación estadística se realizó con la prueba no paramétrica de Mann-Whitney de dos muestras. La significación estadística se determinó como un valor de p inferior a 0,05.

65 (Resultados)

(Características de los injertos cardiacos)

Las láminas de cardiomiocitos desprendidas redujeron su tamaño 5,76 cm2 a 1,11 ± 0,05 cm2 (n=3) en la zona debido a la reorganización del citoesqueleto. Por otro lado, el espesor se incrementó de 20,1 ± 0,9 µm a 52,4 ± 6,0 5 µm (n=3). Las láminas cardíacas se contrajeron espontáneamente mediante observación macroscópica.

(Evaluación histológica)

Los presentes inventores pudieron desprender una lámina monocapa de cardiomiocitos a baja temperatura (Figura 6, parte superior izquierda). La lámina de cardiomiocitos se fijó sobre un miocardio infartado inmediatamente 10 después de la implantación sin ligadura (Figura 6, parte superior derecha). 2 semanas después de la implantación, el examen histológico de la tinción con hematoxilina-eosina (HE) de la lámina de cardiomiocitos implantada mostró una buena fijación en alineación sobre el miocardio infartado y sin acumulación de células inflamatorias. La flecha amarilla indica una lámina de colágeno, que es necesaria para liberar la lámina de cardiomiocitos en el miocardio infartado (Figura 7). La inspección visual de la lámina de cardiomiocitos implantada a las ocho semanas de la 15 implantación reveló la unión íntima entre la lámina de cardiomiocitos implantada y un corazón receptor. La tinción con de la lámina de cardiomiocitos implantada después de ocho semanas desde la implantación demostró la integración de la lámina de cardiomiocitos con el miocardio huésped alineación en el centro de la cicatriz (Figura 7, parte inferior derecha). La tinción inmunohistoquímica mostró conexina 43 orientada al azar en la lámina de cardiomiocitos implantada y alrededor de una región de contacto entre la lámina de cardiomiocitos implantada y el 20 corazón receptor (Figura 7, parte central inferior). La tinción inmunohistoquímica con el factor VIII demostró muchas células positivas para el Factor VIII en y alrededor de la lámina de cardiomiocitos implantada (Figura 7, parte inferior izquierda).

(Recuperación funcional del miocardio infartado) 25

El análisis en modo B mostró que la dilatación del ventrículo izquierdo se había suprimido bien y el movimiento de la pared global estaba bien conservado en el grupo T en comparación con el grupo C (Figura 8). Una fracción de eyección (FE), un acortamiento fraccional (FS) y una zona telediastólica ventricular izquierda (LVESA) basal no fueron significativamente diferentes entre los tres grupos. 30

2 y 4 semanas después de la implantación, la endocardiografía 2D mostró una mejora significativa de la FE y el FS en el grupo T en comparación con los de los otros grupos. La LVESA fue significativamente menor en el grupo T que en los otros grupos. Estas mejoras funcionales se conservaron 8 semanas después de la implantación (Figura 9).

35

(Experimentos electrofisiológicos)

Los experimentos electrofisiológicos mostraron el componente de un pico de la onda QRS de la zona de la cicatriz tratada en el grupo T, a pesar de dos picos de la onda QRS como bloques de ramificación en el grupo C (Figura 11). Se observó un efecto en el grupo F, aunque el nivel del efecto fue menor que el del grupo T. Adicionalmente, los 40 experimentos electrofisiológicos demostraron una mejora de la amplitud (voltios) del complejo QRS en el grupo T, a pesar de la baja amplitud en los grupos F y C (grupo C frente al grupo T: 2,79 ± 0,9 V frente a 0,83 ± 0,64 V, P<0,05) (Figura 11).

En el grupo T, cuando se estimuló una aurícula a la frecuencia de 300 lpm mediante un estimulador, se detectaron 45 picos eléctricos simultáneos en el área implantada (Figura 10, parte inferior izquierda). Adicionalmente, un umbral para marcar un corazón receptor fue menor en el grupo T que en los grupos F y C (grupo C frente al grupo F frente al grupo T: 4,9 ± 0,9 V vs 3. 0 ± 0. 7 V vs 1,7 ± 0,5 V, P<0,05) (Figura 10, parte derecha).

(Resultados) 50

Un dominio respondedor a la temperatura hecho de poli(N-isopropilacrilamida) se injertó en superficies de cultivo celular de poliestireno. Se cultivaron cardiomiocitos de rata recién nacida en estas placas y se desprendieron como una lámina rectangular de células por debajo de 20 ° C sin tripsina. Dos láminas se apilaron para hacer los injertos cardiacos más gruesos. Estas láminas de cardiomiocitos se contrajeron espontáneamente. La observación 55 transversal de las dos láminas demostró una íntima conexión y tejido homogéneo de tipo corazón.

Dos semanas después de la ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (ADI) se realizaron dos tratamientos diferentes: 1) implantación de la lámina de cardiomiocitos (grupo T, n = 10); y 2) implantación de la lámina de fibroblastos (grupo F, n = 10). El grupo control no se trató (grupo C, n = 10). La endocardiografía demostró 60 que la función cardiaca mejoró significativamente en el grupo T dos, cuatro, y 8 semanas después de la implantación. La cinesia en color demostró que el movimiento de la pared sistólica regional se recuperaba de manera excelente en comparación con los valores anteriores a la implantación. Las láminas de cardiomiocitos fijadas sobre el miocardio infartado estaban en alineación y parecían ser tejido homogéneo en el miocardio. La tinción inmunohistoquímica demostró neoangiogénesis y conexina 43 orientada al azar en las láminas de cardiomiocitos 65 implantadas. Los experimentos electrofisiológicos mostraron la mejora de la onda R y el componente de un pico del

complejo QRS en el área de la cicatriz tratada en el grupo T, a pesar de los componentes de dos picos del complejo QRS como bloqueo de la rama en los grupos F y C. Adicionalmente, un umbral para marcar un corazón receptor fue menor en el grupo T que en los grupos F y C (grupo C frente al grupo F frente al grupo T: 4,9 ± 0,9 V frente a 3,0 ± 0,7 V frente a 1,7 ± 0,5 V, P<0,05).

(Discusión) 5

El reciente desarrollo de miocardiopatía celular introducido mediante inyección con aguja ha proporcionado un nuevo abordaje a la restauración de la función cardiaca deteriorada (Taylor D. A., Atkins B. Z., Hungspreugs P., Jones T. R., Reedy M. C., Hutcheson K. A., Glower D. D., Kraus W. E., Regeneration of Functional Myocardium: Improved Performance after Skeletal Myoblast Transplantation, Nature Med., 1998; 4:929-933). Potenciales ventajas 10 adicionales del método de implantación de la lámina de cardiomiocitos son un mejor control del proceso de formación de tejido (la forma, el tamaño, y la consistencia de un injerto), una técnica de implantación fácil, y la implantación de una serie de células con mínima pérdida de células. Por el contrario, un método de inyección proporciona una pérdida de una determinada cantidad de células o de su proteína de la superficie (por ejemplo, conexina 43) por medio de tratamiento con tripsina. Además del infarto de miocardio, el método de implantación de 15 la lámina de cardiomiocitos puede ser útil para la reparación de la disfunción miocárdica mundial (en, miocardiopatía dilatada). Para lograr aplicaciones clínicas, la masa de tejido de miocardio implantado total es de importancia crucial para la reparación del miocardio deteriorado y la mejora de la angiogénesis puede hacer posible que las láminas cardíacas sean más gruesas y liberen más células en el miocardio deteriorado.

20

En este ejemplo, los presentes inventores han desarrollado una lámina de cardiomiocitos contráctiles sin un armazón y han analizado la función cardiaca y la evaluación histológica después de la implantación. La lámina de cardiomiocitos se ha fijado a un miocardio infartado acompañado de angiogénesis. La lámina de cardiomiocitos parecía tejido de miocitos homogéneo que expresa conexina 43 y se contrajo de forma simultánea in vivo. Los cardiomiocitos en lámina de cardiomiocitos exhibieron alineación y pocas células inflamatorias acumuladas en la 25 lámina de cardiomiocitos implantada. La implantación de la lámina de cardiomiocitos prometió una mejora excelente del funcionamiento cardíaco sistólico y diastólico. Los experimentos electrofisiológicos revelaron que la lámina de cardiomiocitos mejora la conductividad eléctrica en la cicatriz y reconstruye el componente de un pico del complejo QRS en el área de la cicatriz tratada. Estos datos demostraron la hipótesis de los presentes inventores de que las láminas de cardiomiocitos contráctiles exhiben integración histológica y eléctrica con el miocardio deteriorado 30 acompañada de angiogénesis y expresión de conexina 43 e induce la mejora significativa de rendimiento cardíaco. Según el mejor conocimiento de los presentes inventores, este es el primer informe donde la terapia de regeneración miocárdica tuvo éxito en el miocardio deteriorado usando una lámina cardiaca de ingeniería tisular.

Los principales factores de integración en la terapia regenerativa son integración dinámica, integración eléctrica e 35 integración histológica.

Respecto a la integración dinámica, los cardiomiocitos de la lámina de cardiomiocitos implantada mostraron alineación y estimularon una mejoría significativa de la función sistólica regional y global en el miocardio infartado. La remodelación deteriorada es responsable de la deformación estructural cardíaca y el deterioro de la función 40 cardiaca en un corazón infartado (Tyagi S.C., Extracellular Matrix Dynamics in Heart Failure: A Prospect for Gene Therapy, J. Cell. Biochem., 1998, 68:403-410). Kelley et al. mostraron que la restricción de la dilatación de un ventrículo izquierdo (VI) con una malla colocada sobre un miocardio infartado conserva la geometría del ventrículo izquierdo (VI) y la función de reposo un modelo de infarto de miocardio en ovejas (Kelley S.T., Malekan R., Gorman J. H. et al., Restraining Infarct Expansion Preserves Left Ventricular Geometry and Function after Acute Anteroapical 45 Infarction, Circulation, 1999, 99:135-142). Aunque tanto la preservación de la geometría del ventrículo izquierdo (VI) como la mejora de una función sistólica regional en tejidos con la función alterada pueden ser esenciales para la reparación de la función sistólica en un corazón deteriorado, solo la atenuación de la dilatación del ventrículo izquierdo (VI) no es un tratamiento adecuado. Los datos de los presentes inventores, en los que las láminas no contráctiles no mejoraron la función sistólica en comparación con las láminas contráctiles apoyan esta conclusión. 50 Además, los datos de los presentes inventores demostraron una angiogénesis significativa en el miocardio infartado. Uno de los mecanismos para la mejora de la función cardiaca puede ser la angiogénesis inducida por una lámina de cardiomiocitos implantada. En resumen, la mejora significativa de la función sistólica inducida por una lámina de cardiomiocitos implantada es responsable de la preservación de la geometría del ventrículo izquierdo (VI), la mejora de la función sistólica regional y la inducción de angiogénesis. 55

Respecto a la integración eléctrica, el estudio de los presentes inventores demostró que un conductor eléctrico conductividad (es decir, una lámina de cardiomiocitos que expresan conexina 43) estimuló la conductividad en la cicatriz, lo que conduce a la mejora de la amplitud del complejo QRS y la reparación de los componentes de dos picos del bloqueo de rama del complejo QRS en el miocardio infartado. Los patrones de bloqueo de rama es 60 probable que estén relacionados con fibrosis o necrosis en el miocardio (Agarwal A. K., Venugopalan P., Right Bundle Branch Block: Varying Electrocardiogram Patterns., An Etiological Correlation, Mechanisms and Electrophysiology, International Journal of Cardiology, 1999, 71:33-39). El cambio histológico se reflejó a la amplitud del complejo QRS en el registro electrocardiográfico (Sakamoto A., Ono K., Abe M., Jasmin G., Eki T., Murakami Y., Masaki T., Toyo-oka T., Hanaoka F., Both Hypertrophic and Dilated Cardiomyopathies Are Caused by Mutation of 65 the Same Gene, delta-sarcoglycan, en Hamster: An Animal Model of Disrupted Dystrophin-associated Glycoprotein

Complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Dec 9, 1997, 94 (25):13873-8). Los hechos del movimiento simultáneo de la pared demostrados en EE.UU., la reparación de los componentes de dos picos del bloqueo de rama de tipo complejo QRS y la disminución de un umbral en la cicatriz podrían revelar una conexión eléctrica entre una lámina de cardiomiocitos implantada y un miocardio huésped. Por esta razón, las láminas de células mantuvieron una buena condición de la superficie con la conexina 43, cuando los presentes inventores usaron placas respondedoras 5 a la temperatura, y no tripsina, para desprender las láminas de células de las placas de cultivo.

Respecto a la integración histológica, las láminas de cardiomiocitos implantadas mostraron una buena fijación con el miocardio infartado con angiogénesis. Ya, los presentes inventores demostraron que la integración histológica mediante la mejora de las interacciones célula / célula y célula / MEC por un factor de crecimiento en la sangre es 10 esencial para la regeneración miocárdica del miocardio infartado (Miyagawa S., Sawa Y., Taketani S., Kawaguchi N., Nakamura T., Matsuura N., Matsuda H., Myocardial Regeneration Therapy for Heart Failure, Hepatocyte Growth Factor Enhances the Effect of Cellular Cardiomyoplasty, Circulation, 2002, 105: 2556-2561). Kushida et al. informaron de que los agentes adhesivos en las láminas de células estaban bien conservados después del desprendimiento de las placas respondedoras a la temperatura (Kushida A., Yamato M., Konno C., Kikuchi A., 15 Sakurai Y., Okano T., J. Biomed. Mater. Res. 45:355-362, 1999). Por lo tanto, estas láminas muestran una buena fijación e integración con varios órganos con una buena preservación de las moléculas adhesivas en su superficie (Shimizu T., Yamato M., Kikuchi A., et al., Two-dimensional Manipulation of Cardiac Myocyte Sheets Utilizing Temperature-responsive Culture Dishes Augments the Pulsatile Amplitude, Tissue Eng., 2001, 7(2):141-51, 24; y von Recum H.A., Kim S.W., Kikuchi A., Okuhara M., Sakurai Y., Okano T., Retinal Pigmented Epithelium Culture on 20 Thermally Responsive Polymer Porous Substrates, J. Biomater. Sci. Polym. Ed 9: 1998, 1241-1254). Además, la liberación de células con preservación de la comunidad celular puede ser importante para la supervivencia y la viabilidad de las células en contraste con la liberación de las células a través de un método de inyección. Estos resultados indican que las láminas de cardiomiocitos sin armazones hacen un sincitio con un miocardio huésped.

25

Una fuente de células para las láminas es un asunto muy importante en aplicaciones clínicas. Recientemente, los mioblastos son los más ampliamente utilizados para aplicaciones clínicas de trasplante de células. Los mioblastos tienen un potencial de tolerancia isquémica en lugar de los cardiomiocitos. Por lo tanto, los mioblastos son una de las fuentes de células adecuadas para la implantación de láminas de células en aplicaciones clínicas en la actualidad. 30

En conclusión, los presentes inventores han demostrado que las láminas de cardiomiocitos contráctiles integrados con un miocardio deteriorado dinámicamente, eléctricamente e histológicamente.

La implantación de láminas de cardiomiocitos puede ser una nueva y prometedora estrategia para la reparación del 35 rendimiento funcional y la estructura cardíaca en el miocardio deteriorado.

Las láminas de fibroblastos también proporcionan una ligera mejora que es menor que la de las láminas de las células del corazón. Por tanto, se demostró que las láminas de fibroblastos tienen un potencial de uso al menos para primer auxilio. 40

(Conclusión)

Un tejido protésico utilizando cardiomiocitos de rata recién nacida integrado con miocardio alterado y mejoró la función cardíaca en un modelo cardiaco de isquemia. Aunque los presentes inventores en el presente documento 45 utilizaron cardiomiocitos, un tejido protésico organizado utilizando una técnica de lámina de células introduce un nuevo concepto de implantación de tejido y es útil en el campo de la medicina regenerativa. Esta técnica se muestra esquemáticamente en las Figuras 1A y 1B.

(Ejemplo 2 (Referencia)) 50 (La lámina de mioblastos autoderivada regenera el miocardio deteriorado: Un camino a la aplicación clínica, ejemplos demostrativos usando ratas)

Es probable que los recientes avances en la ingeniería de tejidos proporcionen un tejido funcional implantable que 55 comprende varias células distintas de las células miocárdicas, y matrices extracelulares. Los presentes inventores diseñaron láminas de mioblastos autólogos. Los presentes inventores consideraron que estas láminas son beneficiosas para aplicaciones clínicas. Por tanto, en este ejemplo, los mioblastos se utilizaron como material para la construcción de un tejido protésico o estructura tridimensional y se demostró un efecto del tejido protésico o estructura tridimensional en aplicaciones clínicas. 60

(Métodos)

Se creó un corazón deteriorado en 28 ratas mediante ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (DAI) durante 2 semanas. Un dominio respondedor a la temperatura hecho de un polímero de (N-isopropilacrilamida) se 65 recubrió en placas de cultivo. Mioblastos esqueléticos (ME) aislados del músculo de la pierna se cultivaron y se

desprendieron de las placas como una lámina de células en monocapa (tejido) a 20 °C (Figura 13). Se implantaron dos láminas de mioblastos en nueve ratas (grupo (S) de la lámina de mioblastos = 107 células). Las células mioblastos se inyectaron en 9 ratas (grupo I = 107 células). Se realizó una terapia no celular en 10 ratas (grupo C = solo se inyectó medio).

5

(Medición de la función cardíaca)

Se operó a las ratas con anestesia. La función cardiaca se monitorizó los días 14 y 28 después de la operación. Se usó un dispositivo de ultrasonidos (SONOS 5500) con un transductor de matriz anular de 12 MHz para realizar una endocardiografía (Figura 18). Se realizaron imágenes en el eje corto paraesternal e imágenes en el eje largo 10 paraesternal en los modos de obtención de imágenes B y M. Además de la presión de la pared anterior, se midieron los parámetros globales (por ejemplo, el diámetro telediastólico del ventrículo izquierdo, el diámetro telesistólico del ventrículo izquierdo, el acortamiento fraccional y la fracción de eyección) (Figura 14).

(Histología) 15

2 y 4 semanas después, se sacrificó a las ratas con exceso de pentobarbital y se extirparon los corazones. Los corazones se fijaron con formaldehído al 10 % y se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones en serie de 5 mm de espesor desde la base a la punta del corazón a lo largo de un eje longitudinal del mismo usando un baño de baja temperatura. A continuación, se realizó un tratamiento para histología estándar (como se muestra en las Figuras 15 20 y 17, la tinción con hematoxilina-eosina se realizó para la visualización de los músculos y la tinción tricrómica de Masson para evaluar el contenido de colágeno se realizó para la evaluación del contenido de colágeno).

(Resultados) 25 (Efecto de la implantación de mioblastos sobre la función cardíaca)

Según los experimentos, el infarto de miocardio tuvo como resultado una mortalidad aguda de menos del 20 % en un plazo de 24 horas después de la operación. El procedimiento de implantación de células no causó la muerte de más animales. 30

La remodelación ventricular causó característicamente un aumento de tamaño global de la cavidad cardiaca y fallo de la bomba. A las 2, 4 y 8 semanas de la operación, el grupo de tejido (grupo ME) y el grupo de IM sufrieron una disminución significativa del diámetro del ventrículo izquierdo y tanto la zona telediastólica ventricular izquierda (LVEDA) como la zona telesistólica ventricular izquierda (LVESA) mejoraron después del tratamiento. Además, el 35 valor de la fracción de eyección (FE) de valor y el valor del acortamiento fraccional (FS) del grupo de la lámina de mioblastos también fueron elevados en comparación con los del grupo de IM (Figura 19).

Los corazones en el grupo de control que no fueron sometidos a la terapia celular mostraron una dilatación adicional de un ventrículo, hipertrofia de una pared anterior, y valores claramente bajos de la fracción de eyección (FE) y del 40 acortamiento fraccional (FS).

(Observaciones histológicas)

La histología reveló que los corazones deteriorados del grupo de IM tenían una pared dilatada con un espesor no 45 uniforme (Figura 20), y no contenían sustancialmente parches de células implantadas (Figura 21). En contraste con ello, el corazón infartado con la lámina implantada tenía una pared que no dilataba y era uniformemente gruesa, y estaba celularizada adecuadamente, y no tenía cicatrices. La supervivencia de la lámina implantada se identificó a las 2, 4 y 8 semanas después de la implantación.

50

La pérdida técnica de células de implantación se analizó mediante RT-PCR basada en la presencia del cromosoma Y. Como resultado, la pérdida fue menor a los 15 minutos y 1 día después de la operación en el grupo ME que en el grupo IM (3,7 ± 0,5 % frente a 1,7 ± 0,5 % del número total de células del corazón).

(Fotografías secuenciales) 55

Al tomar una imagen en movimiento, se confirmó que la implantación de mioblastos de la presente invención realmente causaba pulsación (Figuras 22A-F a 29).

Las figuras 22A a 22F muestran una representación de imagen en movimiento de un resultado de un examen 60 electrofisiológico, presentando marcos representativos (imágenes fijas). Las figuras 22A a 22C indican el control, y las Figuras 22D a 22F indican los resultados de una lámina de mioblastos de la presente invención.

Las figuras 23A a 23C muestran una representación de imagen en movimiento de la expresión de GFP, presentando marcos representativos (imágenes fijas). Se observa que una lámina de mioblastos de la presente invención en 65 realidad era pulsátil.

Las figuras 24A a 24C muestran una representación de imágenes en movimiento de una ultraecografía de un corazón infartado tratado de acuerdo con la presente invención, presentando marcos representativos (imágenes fijas).

5

Las figuras 25A a 25C también muestran una representación de imágenes en movimiento de una ultraecografía de un corazón infartado tratado de acuerdo con la presente invención, presentando marcos representativos (imágenes fijas). La parte izquierda de la figura muestra un corazón infartado control, mientras que la parte derecha muestra un resultado de una lámina de mioblastos de la presente invención. Como puede verse en la figura, la presente invención curó sustancialmente el infarto, de forma que el corazón latía sustancialmente con normalidad. 10

Las Figuras 26A a 26C es una fotografía que muestra la misma muestra que en las Figuras 25A a 25C a diferentes puntos de tiempo. Como puede verse a partir de estas figuras, el corazón infartado se curó sustancialmente por la presente invención.

15

Las figuras 27A a 27C muestran una representación de imágenes en movimiento de una ultraecografía de un corazón infartado tratado de acuerdo con la presente invención, presentando marcos representativos (imágenes fijas). Como puede verse en la figura, el infarto se curó mediante el tratamiento de la presente invención.

(RT-PCR) 20

A continuación, con el fin de mostrar afinidad celular, el número de células implantadas se cuantificó mediante RT-PCR. En este ejemplo, el número de copias de genes se evaluó mediante el ensayo de TaqMan para SRYe IL 2.

La RT-PCR se realizó usando un cebador que era una parte de un gen derivado del cromosoma Y en las células 25 masculinas. Al medir la cantidad del gen en los cromosomas de un huésped femenino, se confirmó la afinidad.

Se usó el siguiente cebador.

Como una solución de reacción se utilizó la siguiente solución de reacción mixta para PCR. 30

Mezcla universal (proporcionada por el fabricante): 12,5 µl

Cebador directo (100 µM): 0,05 µl

Cebador inverso (100 µM): 0,05 µl

Sonda (50 µM): 0,1 µl

dH2O: 10,3 µl

Molde (ADN): 2,0 µl

Las secuencias de los cebadores y la sonda se describen a continuación.

SRY (cebador directo) GCC TCA GGA CAT ATT AAT CTC TGG AG (SEC ID Nº 15) 35

(cebador inverso) GCT GAT CTC TGA ATT CTG CAT GC (SEC ID Nº 16)

(sonda) AGGCGCAAGTTGGCTCAA CAG AAT CC (SEC ID Nº 17)

IL2 (cebador directo) GCC TTG TGT GTT ATA AGT AGG AGG C (SEC ID Nº 18)

(cebador inverso) AGT GCC AAT TCG ATG ATG AGC (SEC ID Nº 19)

(sonda) TCT CCT CAG AAA TTC CAC CAC AGT TGC TG (SEC ID Nº 20) 40

Se usaron 100 ng de cada ADN genómico para realizar la PCR. La solución de reacción mezclada se introdujo en pocillos de placas de reacción MicroAmp Optical de 96 pocillos. Los pocillos se taparon con patas MicroAmp Optical Caps. Las burbujas de aire se eliminaron brevemente y se recogió el líquido presente en el fondo de cada pocillo. Cada gen se midió por triplicado. La PCR se realizó utilizando el sistema de detección de secuencias ABI Prism 45 7700.

El ADN estándar fue el siguiente: (200 ng. 40 ng. 8 ng, 1,6 ng 0,32 ng 0,064 ng); (SRY 200 ng = 3×104 copias; IL2 200 ng = 6×104 copias).

50

Los parámetros para el ciclado térmico se describieron a continuación.

Etapa 1: Etapa 2 Etapa 3

50 °C/2 min: 95 °C/10 min 40 ciclos de 95 °C/15 s - 60 °C/1 min

El índice de células masculinas se obtuvo mediante la siguiente expresión:

(2 x SRY / IL2) x 100

Como resultado, como se muestra en la Figura 28, se demostró que la implantación de la lámina (tejido tridimensional) tiene un nivel más satisfactorio de afinidad que la de la implantación de aguja (la propia célula). 5

(Demostración de celularidad)

Se examinó en qué tipo de células contenidas en una lámina de cardiomiocitos implantada se diferenciaban.

10

Por lo tanto, se realizaron tinción tricrómica de Masson, tinción con HE (hematoxilina-eosina), tinción rápida de MHC y tinción lenta de MHC.

Estos procedimientos se realizaron del siguiente modo.

15

<Tinción tricrómica de Masson>

La tinción tricrómica de Masson se realiza del siguiente modo. La tinción tricrómica de Masson tiñe los núcleos con hematoxilina férrica. Después, las pequeñas moléculas de pigmento (fucsina ácida, xilidina de ponceau) que tienen una velocidad de difusión alta entran en los canales reticulares y, después, las moléculas grandes de pigmento (azul 20 anilina) que tienen una velocidad de difusión baja entran en la estructura en bruto de las fibras de colágeno, tiñendo de este modo la célula de azul.

La tinción tricrómica de Masson utiliza los siguientes reactivos.

A) Colorante mordiente 25

solución acuosa de ácido tricloroacético al 10 % 1 parte

solución acuosa de dicromato potásico al 10 % 1 parte

B) Solución de hematoxilina férrica de Weigert (cantidades iguales de la solución 1 y la solución 2 se mezclan en uso)

30

Solución 1

hematoxilina: 1 g

etanol al 100 %: 100 ml

Solución 2

cloruro férrico: 2,0 g

ácido clorhídrico (25 %): 1 ml

agua destilada: 95 ml

C) Ácido clorhídrico al 1 % y alcohol al 70 %

D) Solución I

1 % de rojo Biebrich: 90 ml

1 % de fuccsina ácida: 10 ml

ácido acético: 1 ml

E) Solución II 35

Ácido fosfomolíbdico: 5 g

Ácido fosfotúngstico: 5 g

agua destilada: 200 ml

F) Solución III

Azul anilina: 2,5 g

ácido acético: 2 ml

agua destilada: 100 ml

G) Agua ácido acético al 1 %

40

Procedimiento para la tinción tricrómica de Masson:

1. Desparafinación, lavado con agua, el agua destilada;

2. Aplicación de mordiente (de 10 a 15 minutos);

3. Lavado con agua (5 minutos); 45

4. Solución de hematoxilina férrica de Weigert (5 minutos);

5. Lavado ligero con el agua;

6. Separación con ácido clorhídrico al 1 % y alcohol al 70 %;

7. Desarrollo de color, lavado con agua (10 minutos);

8. Agua destilada; 50

9. Solución I (de 2 a 5 minutos);

10. Lavado ligero con el agua;

11. Solución II (30 minutos o más);

12. Lavado ligero con el agua;

13. Solución III (5 minutos); 5

14. Lavado ligero con el agua;

15. Ácido acético al 1 % /agua (5 minutos);

16. Lavado con agua (rápido); y

17. Deshidratación, limpieza, montaje.

10

Con la tinción tricrómica de Masson, las fibras de colágeno, las fibras reticulares y la membrana basal glomerular se tiñen intensamente de azul, los núcleos se tiñen de negro-violeta, el plasma se tiñe de rojo claro, los eritrocitos se tiñen de color naranja-amarillo a rojo intenso, el moco se tiñe de azul, los gránulos basófilos se tiñen de azul y los gránulos eosinófilos se tiñen de rojo, y la fibrina se tiñen de color rojo. Por lo tanto, un área teñida de azul se puede calcular como un sitio fibroso. 15

<Tinción con hematoxilina-Eosina (HE)>

La aceptación o desaparición de células en una lámina se observó mediante tinción con HE. El procedimiento se describe del siguiente modo. Una muestra se desparafina opcionalmente (por ejemplo, con etanol puro), seguido de 20 lavado con agua. La muestra se sumerge en hematoxilina de Omni durante 10 minutos. Posteriormente, la muestra se lava con agua corriente, seguido de desarrollo del color con agua de amoniaco durante 30 segundos. Posteriormente, la muestra se lava con agua corriente durante 5 minutos y se tiñe con una solución de clorhidrato de eosina durante 2 minutos, seguido de deshidratación, limpieza y montaje.

25

<Tinción rápida con MHC>

MIOSINA MONOCLONAL ANTI-ESQUELÉTICA (RÁPIDA)

CADENA PESADA DE LA MIOSINA: MY-32 (mioblastos esqueléticos)

30

Reactividad específica con ratas y seres humanos

1. Se preparan secciones de 5 um de espesor a partir del bloque congelado.

2. Las secciones se fijan en acetona a -20 °C durante 5-10 minutos.

(Los bloques de parafina deben desparafinarse y rehidratarse). 35

3. La actividad de peroxidasa endógena se bloquea en 0,3 % de H2O2 en metanol durante 20 minutos a TA.

(1 ml de 30 % de H2O2+ 99 ml de metanol)

4. Se lava con PBS (3 × 5 minutos).

5. Se incuban con el anticuerpo monoclonal primario (MY-32) en la cámara húmeda a 4 °C durante toda la noche (1 µl de anticuerpos + 200 µl de PBS por portaobjetos). 40

6. Al día siguiente, se lavan con PBS (3×5 minutos).

7. Se aplica link biotinilado anti-ratón y anticonejo nº 1 durante 30 minutos -1 hora a TA.

(se aplican aproximadamente 3 gotas directamente sobre el portaobjetos).

8. Se lava con PBS (3 × 5 minutos).

9. Se aplican aproximadamente 3 gotas directamente de estreptavidina GRP Nº 2 para LSAB. 10-15 minutos. 45

10. Se lava con PBS (3 × 5 minutos).

11. Se aplica DAB (5 ml de DAB+5 µl de H2O2).

12. Se observa al microscopio para ver un color parduzco.

13. Se sumergen en agua durante 5 minutos.

14. Se aplica HE durante 30 segundos-1 minuto. 50

15. Se lavan unas veces.

16. Intercambio iónico se lava con agua 1 vez.

17. Se lava con etanol al 80 % durante 1 minuto.

18. Se lava con etanol al 90 % durante 1 minuto.

19. Se lava con etanol al 100 % durante 1 minuto (3 veces). 55

20. Se lava con xileno durante 1 minuto (3 veces). Cubreobjetos.

21. Se examina el desarrollo de color.

<Tinción lenta con MHC>

60

Antimiosina monoclonal: (esquelético lento)

Reactividad específica con perros, ratas y seres humanos

1. Se elaboran secciones de 5 um de espesor a partir del bloque congelado. 65

2. Las secciones se fijaron en acetona a -20 °C durante 5-10 minutos.

(Los bloques de parafina deben desparafinarse y rehidratarse).

(1 ml de 30 % de H2O2+ 99 ml de metanol)

4. Se lava con PBS (3 × 5 minutos).

5. Se incuban con el anticuerpo monoclonal primario NOQ7 en la cámara húmeda a 4 °C durante toda la noche (1 µl 5 de anticuerpos + 200 µl de PBS por portaobjetos).

6. Al día siguiente se lava con PBS (3 × 5 minutos).

7. Se aplica una unión biotinilada anti-ratón y anticonejo nº 1 durante 30 minutos -1 hora a TA.

(se aplican aproximadamente 3 gotas directamente sobre el portaobjetos).

8. Se lava con PBS (3 × 5 minutos). 10

9. Se aplican aproximadamente 3 gotas directamente de estreptavidina GRP Nº 2 para LSAB. 10-15 minutos.

10. Se lava con PBS (3 × 5 minutos).

11. Se aplica DAB (5 ml de DAB + 5 µl de H2O2).

12. Se observa al microscopio para ver un color parduzco.

13. Se sumergen en agua durante 5 minutos. 15

14. Se aplica HE durante 30 segundos-1 minuto.

15. Se lavan unas veces.

16. Intercambio iónico se lava con agua 1 vez.

17. Se lava con etanol al 80 % durante 1 minuto.

18. Se lava con etanol al 90 % durante 1 minuto. 20

19. Se lava con etanol al 100 % durante 1 minuto (3 veces).

20. Se lava con xileno durante 1 minuto (3 veces). Cubreobjetos.

21. Se examina el desarrollo de color.

Como resultado, como se muestra en la Figura 29, se demostró que la lámina de mioblastos implantada se 25 diferenciaba desde fibras rápidas a fibras lentas. Estos marcadores se pueden usar para identificar una estructura de tejido tridimensional de la presente invención.

(Conclusión)

30

La implantación de mioblastos esqueléticos atenuó la remodelación del corazón y regeneró el miocardio deteriorado para mejorar la función cardíaca global, en comparación con la implantación de células. Este hallazgo sugiere una estrategia prometedora para la terapia regenerativa de miocardio.

Por lo tanto, se demostró que cuando una lámina de mioblastos se implantaba como una estructura tridimensional, 35 la función cardiaca del miocardio deteriorado mejoraba. En este ejemplo, mediante el uso de inyección directa, la implantación de mioblastos esqueléticos (ME) autólogos se aplicó clínicamente. La pérdida de células implantadas y de la matriz extracelular (MEC) implantada debido a la inyección directa limita el número de mioblastos esqueléticos y la capacidad de los mioblastos esqueléticos.

40

En cuanto a las pruebas clínicas que utilizan una fuente de células autólogas, se utilizan preferentemente mioblastos autólogos. También se demostró que la implantación de tejido es más ventajosa para regenerar un corazón lesionado que la implantación de células.

(Ejemplo 3): Mioblastos esqueléticos- Implantación de lámina de mioblastos de ingeniería de tejidos mejora 45 la función cardíaca con atenuación de la remodelación cardiaca en hámsteres con miocardiopatía)

A continuación, se examinó si un tejido protésico o estructura tridimensional producida utilizando mioblastos esqueléticos mejora o no la miocardiopatía.

50

La terapia celular es una estrategia prometedora para la miocardiopatía isquémica. Sin embargo, los métodos de inyección directa parecen tener limitaciones para la liberación celular generalizada en la miocardiopatía dilatada (MCD). Teniendo en cuenta este conjunto de pruebas, los presentes inventores consideraron que una implantación de una lámina de mioblastos de ingeniería de tejidos podría ser un método superior y prometedor para mejorar la función cardíaca en la MCD. Por lo tanto, los presentes inventores llevaron a cabo este ejemplo. 55

(Método)

Se usaron hámsteres macho de 27 semanas de edad BIO A-2 (miocardiopatía dilatada (MCD)) que mostraban la remodelación cardiaca moderada como receptores. Los mioblastos aislados de los hámsteres BIO FIB (FIB) se cultivaron en placas injertadas con un polímero respondedor a la temperatura hecho de poli (N-isopropilacrilamida) y 60 se desprendieron como una lámina de células a 20 ° C sin tratamiento enzimático.

Se realizaron tres tratamientos diferentes: (1) Grupo de implantación de lámina de mioblastos (grupo S, n = 8); (2) grupo de inyección de mioblastos (aislados de FIB) (grupo T, n = 10); y (3) grupo de operación simulada (grupo C, n = 10). En el grupo S, se implantó una lámina de mioblastos en la pared del ventrículo izquierdo (VI). En el grupo T, 65 los mioblastos se inyectaron en la pared del ventrículo derecho (VD) y en la pared del ventrículo izquierdo (VI).

(Resultados)

(Recuperación funcional del miocardio infartado)

5

El análisis en modo B demostró que la dilatación del ventrículo izquierdo se había suprimido adecuadamente y el movimiento de la pared global estaba adecuadamente conservado en el grupo T en comparación con el grupo C (Figura 18).

Después de implantar la lámina de mioblastos, un ecograma de ultrasonidos demostró que la dimensión del VI 10 dilatado se redujo significativamente, mientras que los corazones de los grupos T y C mostraron una progresión de la dilatación del ventrículo izquierdo (VI) (Figura 33A). Seis semanas después de la operación, el acortamiento fraccional (FS) mejoró significativamente en los grupos S y T en comparación con el grupo C. Después de siete semanas, el FS en el grupo S se mantuvo en el nivel preoperatorio, mientras que el FS en los otros grupos disminuyó gradualmente. Aunque la velocidad máxima de la onda E en la válvula mitral en el grupo S disminuyó 15 ligeramente una semana después de la implantación de la lámina, se recuperó hasta el nivel preoperatorio 2 semanas después de la operación. El promedio de la onda E en los grupos S y T fue significativamente mayor que en el grupo C 4 semanas después de la operación y después de eso. Los exámenes histológicos en el grupo S demostraron que la lámina implantada casi cubría todo el corazón y el espesor de la pared del ventrículo izquierdo (VI) se incrementó con los mioblastos supervivientes (Figuras 30A a 30D). Como puede verse en la Figura 30B, los 20 mioblastos implantados, que constituyen una estructura de tejido, estaban íntimamente unidos a, y aceptados por, el corazón para ayudar a la función cardíaca. Las Figuras 30C y 30D muestran claramente que la expresión de α-sarcoglicano y β-sarcoglicano tenía una puntuación de 2 a 3 y aproximadamente 3, respectivamente, es decir, el corazón se había recuperado sustancialmente moderadamente, donde la expresión normal tiene una puntuación de 5 y los hámsteres DCM tienen una puntuación de aproximadamente 3.Se sabe que los hámsteres DCM tienen un 25 síntoma de miocardiopatía dilatada parcial causada por una disminución en la expresión de sarcoglicano. Se demostró que una estructura de tejido tridimensional de la presente invención tiene un efecto de suplementar dicha expresión génica.

La Figura 33B muestra claramente que el uso de la estructura de tejido tridimensional de la presente invención 30 permitía a los hámsteres DCM sobrevivir más allá de 48 semanas. Este es un efecto significativo e inesperado en comparación con la inyección (sólo las células) o el control (en cualquier caso, todos los hámsteres DCM murieron después de 38 a 40 semanas). Como se muestra en la Figura 33C, la contractilidad del ventrículo izquierdo con miocardiopatía dilatada mejoró significativamente. Este resultado muestra que la estructura de la presente invención se puede aplicar a los corazones. El resultado corresponde a aproximadamente una extensión de 25 años de 35 duración de la vida, lo que demuestra un efecto significativo de la estructura de tejido tridimensional de la presente invención. El promedio de vida de los hámsteres DCM fue de aproximadamente 40 semanas, mientras que la más larga vida útil de los hámsteres DCM que tienen una lámina implantada fue de aproximadamente 70 semanas. Suponiendo que el tiempo de vida de un hámster normal es de aproximadamente 2 años y la duración de la vida de un ser humano es de 80 años, el tiempo de vida del hámster implantado se prolongó en aproximadamente 30 40 semanas, que es equivalente a aproximadamente 25 años en un ser humano. Por lo tanto, se demostró que la estructura tridimensional de la presente invención tiene un efecto significativo sobre la miocardiopatía.

(Conclusión)

45

La implantación de láminas de mioblastos redujo la progresión de la hipertrofia cardíaca con una mejoría de la función cardiaca en corazones con miocardiopatía dilatada (MCD). La implantación de láminas de mioblastos puede ser un método prometedor para restaurar la función cardíaca con atenuación de la remodelación cardiaca en corazones de MCD.

50

(Ejemplo 4): Terapia para el modelo de infarto en cerdos)

En este ejemplo, de objetivo encontrar más hallazgos clínicos, se implantaron láminas de mioblastos esqueléticos se en un modelo de infarto de miocardio en un animal más grande para estudiar la mejora de la función cardíaca.

(Método) 55

Se realizó una toracotomía en cerdos de 30 kg de peso con anestesia general y la DAI se ligó para producir modelos de infarto de miocardio. Se realizaron tres tratamientos diferentes: 1) Grupo de lámina de mioblastos esqueléticos; 2) Grupo de inyección de mioblastos esqueléticos; y 3) grupo de control. Para estos grupos, los cambios en la función cardíaca y el tejido miocárdico se examinaron (Figura 34). Mioblastos esqueléticos se obtuvieron de músculo del 60 muslo antólogo. Se prepararon colagenasa, tripsina EDTA, sulfato de gentamicina y anfotericina B y se filtraron a través de un filtro de 0,22 µm para formular una solución de disociación. Se prepararon medio basal SkBM, suero bovino fetal, EGF, fosfato sódico de dexametasona, sulfato de gentamicina, y anfotericina B y se filtraron a través de un filtro de 0,22 µm para formular medio de cultivo primario. Las células disociadas se cultivaron en placas injertadas con una macromolécula respondedora a la temperatura hecha de poli (N-isopropilamida) y se desprendieron como 65 una lámina de células cambiando la temperatura en lugar del tratamiento enzimático.

(Resultados)

En el grupo con implantación de lámina de células mejoraron las funciones cardíacas, es decir, la contractilidad y la extensibilidad (Figuras 35 y 36). Además, se confirmó que las células implantadas fueron aceptadas por la parte de 5 infarto de miocardio.

(Conclusión)

En experimentos con animales distintos de los roedores, se confirmó que una terapia usando una lámina de 10 mioblastos de la presente invención se produjo un efecto de mejora de la función cardíaca.

(Ejemplo 5 (Referencia): células sinoviales)

Para demostrar un efecto de la presente invención en el caso de otro tipo de células, se preparó una lámina de 15 células sinoviales (células que contienen células madre de tejido) y se implantó en modelos de infarto de miocardio para examinar un efecto de mejora de la función cardíaca.

(Métodos) 20

Se extrajeron las articulaciones de la rodilla de ratas de 8 semanas de edad. El tejido sinovial se cortó de la superficie interna de la articulación. El tejido se unió a un medio de cultivo que contiene 20 % de FCS y DMEM rico en glucosa para el cultivo celular. Las células resultantes se cultivaron en placas injertadas con una macromolécula respondedora a la temperatura hecha de poli (N-isopropilamida) y se desprendieron como una lámina de células cambiando la temperatura en lugar del tratamiento enzimático. Para los modelos de infarto de miocardio preparados 25 mediante ligadura de la ADI, se realizaron tres tratamientos diferentes: 1) grupo de lámina de células; 2) grupo de inyección de células; y 3) grupo de control. Para estos grupos, los cambios en la función cardíaca y el tejido miocárdico se examinaron.

(Resultados) 30

En el grupo con implantación de lámina de células mejoraron las funciones cardíacas, es decir, la contractilidad y la extensibilidad. Además, se confirmó que las células implantadas fueron aceptadas por la parte de infarto de miocardio.

35

(Conclusión)

En el caso de células diferenciadas a partir de células obtenidas de tejido sinovial, se confirmó que una lámina de tales células tenía un efecto de mejora de la función cardíaca.

40

(Ejemplo 6 (Referencia): células madre)

Como ejemplo de células no diferenciadas, existe una célula madre embrionaria de ratón que se sabe que es capaz de diferenciarse en un cardiomiocito. En este ejemplo, se preparó una lámina de tales cardiomiocitos y se implantó en modelos de infarto de miocardio para estudiar el efecto sobre la mejora de la función cardíaca. 45

(Métodos)

Un gen de resistencia se introdujo en un sitio promotor de un gen que expresa MHC en las células madre embrionarias de ratón. Las células se cultivaron en un cultivo selectivo que contiene una alta concentración de un 50 fármaco donde las células diferenciadas en algo distinto a los cardiomiocitos son destruidas, de manera que se seleccionaron los cardiomiocitos. Las células resultantes se cultivaron en placas injertadas con una macromolécula respondedora a la temperatura hecha de poli (N-isopropilamida) y se desprendieron como una lámina de células cambiando la temperatura en lugar del tratamiento enzimático. Para los modelos de infarto de miocardio preparados mediante ligadura de la ADI, se realizaron tres tratamientos diferentes: 1) grupo de lámina de células; 2) grupo de 55 inyección de células; y 3) grupo de control. Para estos grupos, los cambios en la función cardíaca y el tejido miocárdico se examinaron.

(Resultados)

60

(Conclusión) 65

(Ejemplo 7): Preparación de tejido prostático usando ácido ascórbico)

5

A continuación, se estudió la influencia de ácido ascórbico o de un derivado del mismo en la producción de un tejido protésico.

Después de producir una cantidad adecuada de mioblastos, se cultivaron 5 × 106 células en placas de cultivo de 10 cm respondedoras a la temperatura. Para el cultivo, se utilizó medio basal SkBM (Clonetics (Cambrex)). Después, al 10 medio se añadió ácido 2-fosfato-ascórbico (0,5 mM), ácido ascórbico de magnesio 1-fosfato (0,1 mM), y L-ascorbato de sodio (0,1 mM). 4 días después del inicio del cultivo se desprendieron las células a 20 ° C. Como control, se preparó un tejido protésico en un sistema de cultivo sin ácidos ascórbicos.

(Resultados) 15

Cuando se añadió el ácido ascórbico, el tejido protésico se desprendió mucho más fácilmente que en el sistema de cultivo sin ningún tipo de ácido ascórbico. Además, el tejido no se cultivó a un tamaño de varios milímetros en el sistema de cultivo sin ácidos ascórbicos. Si el tejido excede dicho tamaño, se producían grietas y el crecimiento se detuvo. También fue sustancialmente difícil desprender el tejido. Por lo tanto, no se pudo proporcionar tejido 20 protésico implantable. En contraste, un tejido protésico de la presente invención, que se cultivó en un medio suplementado con un ácido ascórbico, creció hasta un tamaño implantable, y fue fácil de desprender. Además, se aisló el tejido protésico, al tiempo que no se generó sustancialmente ningún agujero o cicatriz. La inspección de las conexiones biológicas demostró que la interacción mediada por la matriz extracelular era significativa (Figuras 37 a 39). 25

(Ejemplo 8): Efecto de la adición de ácido ascórbico 2-fosfato)

A continuación, se estudió la influencia de ácido ascórbico 2-fosfato o sobre la producción de un tejido protésico.

30

Después de producir una cantidad adecuada de células sinoviales o mioblastos, se cultivaron 5 × 106 células en placas de cultivo de 10 cm respondedoras a la temperatura. Para el cultivo, se utilizó medio basal SkBM (mioblastos) que contenía ácido ascórbico 2-fosfato (1 mM) o DMEM (células sinoviales) que contiene ácido ascórbico 2-fosfato (1 mM). Como control, se preparó un tejido protésico en un sistema de cultivo que tiene el mismo medio sin ácidos ascórbicos o en otro sistema de cultivo que tiene el mismo medio con ácido ascórbico 1-fosfato (1 mM). 35

9 días después del inicio del cultivo, el tejido se desprendió y se contrajo. El tejido se contrajo en un factor de aproximadamente 3.

El tejido contraído se analizó histológicamente mediante tinción HE o similar (Figura 42, células sinoviales). Se 40 encontró que las células construían 10 o más capas y la matriz estaba en forma de malla de colágeno o esponja La matriz tenía un una rigidez tal que la matriz podía pinzarse fácilmente con pinzas.

(Examen de distorsión por estrés (ensayo de tracción))

45

Para confirmar la resistencia se llevó a cabo un ensayo de tracción para obtener una curva del tiempo de carga (distorsión por estrés) donde se estira una muestra. Según esta curva se obtienen el límite de proporcionalidad, el módulo de elasticidad, el punto de rendimiento, la resistencia máxima, el punto de rotura, la energía elástica, y la tenacidad.

50

(Características de deslizamiento (ensayo de indentación))

El ensayo de indentación, que mide las características de deslizamiento, se llevó a cabo mediante la determinación de la viscoelasticidad. Es posible observar un fenómeno donde aumenta la distorsión. Un instrumento, tal como una varilla o similar, se empuja en un material de gel, y la deformación del material se controla. 55

(Resultados)

Un tejido protésico puede desprenderse mucho más fácilmente cuando se añade ácido ascórbico 2-fosfato que en un sistema de cultivo sin ácidos ascórbico y en un sistema de cultivo que contiene ácido ascórbico 1-fosfato de uso 60 habitual. Además, el tejido no se cultivó a un tamaño de varios milímetros en el sistema de cultivo sin ácidos ascórbicos. Si el tejido excede dicho tamaño, se producían grietas y el crecimiento se detuvo. El tamaño, la resistencia y similares son mayores en el sistema de cultivo con ácido ascórbico 2-fosfato que en el sistema de cultivo que contiene ácido ascórbico de uso habitual. En el sistema sin ácidos ascórbico, también fue sustancialmente difícil desprender el tejido. Por lo tanto, no se pudo proporcionar tejido protésico implantable. 65

Particularmente, el tejido protésico cultivado en el sistema que contiene ácido ascórbico 2-fosfato tenía una rigidez tal que se podía pinzar con pinzas. Los tejidos protésicos cultivados en otros sistemas tenían menos rigidez que el tejido protésico cultivado en el sistema 2que contiene ácido ascórbico 2-fosfato. El tejido protésico cultivado en medio que contiene ácido ascórbico 2-fosfato se cultivó hasta un tamaño implantable y fuera fácil de separar. Además, se aisló el tejido protésico, al tiempo que no se generó sustancialmente ningún agujero o cicatriz. La 5 inspección de la conexión biológica demostró que la interacción mediada por la matriz extracelular fue significativa.

(Ejemplo 9): Efecto del tejido protésico cultivado en presencia de ácidos ascórbicos)

El tejido protésico producido en la presencia de ácidos ascórbicos en los Ejemplos 7 y 8 se implantó en hámsteres 10 con miocardiopatía dilatada. Todos los ratones implantados se curaron y sobrevivieron tanto tiempo como los hámsteres normales. Por lo tanto, se demostró que la presente invención puede curar enfermedades, que se cree convencionalmente que son resistentes, proporcionando un agente estimulante tridimensional específico.

(Ejemplo 10): Terapia combinada) 15

Una terapia combinada de una lámina tal como se preparó en los ejemplos descritos anteriormente, y la terapia génica, se llevó a cabo. La terapia combinada tiene como objetivo estimular la angiogénesis en los sitios en los que se han implantado láminas, lo que estimula la aceptación de láminas implantadas y suprime la necrosis celular dentro de las láminas. 20

(Métodos)

Se preparó un complejo de virus Sendai (HVJ) y un liposoma de acuerdo con la descripción de un documento (Kaneda Y., Iwai K., Uchida T., Increased Expression of DNA Co-introduced with Nuclear Protein in Adult Rat Liver, 25 Science, 1989, 243:375-378). En lo sucesivo en el presente documento se describirá brevemente este procedimiento. Se prepararon 200 µl de solución de ADN y se agitó durante 30 segundos. La solución se dejó en reposo en un baño de temperatura constante a 37 °C durante 30 segundos. Este procedimiento se realizó 8 veces. La solución se sometió a tratamiento ultrasónico durante 5 segundos y se agitó durante 30 segundos. Se añadieron 0,3 ml de BSS a la solución, seguido de agitación en un baño a temperatura constante a 37 °C. A la solución se 30 añadió HVJ inactivado, a que a su vez se colocó en hielo durante 10 minutos. La solución se agitó en un baño de temperatura constante a 37 ° C durante 1 hora. Se dispuso en capas 1 ml de la solución de sacarosa al 60 % y 6 ml de solución al 30 % de sacarosa en un tubo de ultracentrifugación. La solución de liposomas HVJ se colocó en la solución en capas. Al tubo se añadió BSS. El tubo se ultracentrifugó en 62, 800 x g 4 veces durante 1,5 horas. Una capa inmediatamente por encima de la capa de solución de sacarosa al 30 % se retiró y se conservó a 4 °C. Este 35 liposoma se utilizó para la introducción de genes.

Se inyectaron aproximadamente 0,2 ml del complejo liposoma del virus Sendai-plásmido (que contiene 15 µg de ADNc de HGF humano) en una región de infarto de miocardio. En un grupo control, se usó un vector vacío para la introducción de genes en el miocardio infartado. La concentración de HGF humano de tejido cardíaco se midió 40 mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) usando un anticuerpo monoclonal anti-HGF humano Institute of Immunology, Tokio, Japón)) (Ueda H., Sawa Y., Matsumoto K. et al., Gene Transfection of Hepatocyte Growth Factor Attenuates Reperfusion Injury in the Heart, Ann. Thorac. Surg., 1999, 67:1726-1731). Las células resultantes se cultivaron en placas injertadas con una macromolécula respondedora a la temperatura hecha de poli (N-isopropilamida) y se desprendieron como una lámina de células cambiando la temperatura en lugar del 45 tratamiento enzimático. Para los modelos de infarto de miocardio preparados mediante ligadura de la ADI, se realizaron tres tratamientos diferentes: 1) grupo de lámina de células; 2) grupo de terapia génica; 3) grupo de terapia combinada; y 4) grupo control. Para estos grupos, los cambios en la función cardíaca y el tejido miocárdico se examinaron.

50

(Resultados)

En el grupo con implantación de lámina de células y el en grupo de terapia combinada mejoraron las funciones cardíacas, es decir, la contractilidad y la extensibilidad. Además, se confirma que en el grupo de terapia combinada se observa angiogénesis y las células implantadas son aceptadas por la parte de infarto de miocardio. 55

(Conclusión)

Una combinación de tejido de lámina y terapia génica tiene un efecto de mejora de la función cardíaca, y un efecto de angiogénesis, y un efecto de protección celular. También se confirmó que la función cardíaca mejora 60 adicionalmente.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un método terapéutico radical, una técnica y un medicamento para enfermedades 65 que son difíciles de tratar mediante las terapias convencionales (en particular, las enfermedades cardíacas que

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una estructura tridimensional para su uso en un método para implantar en un corazón de ser humano para el tratamiento de miocardiopatía dilatada, miocardiopatía hipertrófica en fase dilatada o cardiopatía isquémica, que comprende una célula derivada de una parte distinta del miocardio de un adulto, donde la estructura tridimensional 5 carece de un armazón y tiene un área de al menos 6 cm2, y donde la célula es un mioblasto.
2. Una estructura de acuerdo con la reivindicación 1, donde el mioblasto es un mioblasto esquelético.
3. La estructura de acuerdo con la reivindicación 1, donde la célula deriva del sujeto al que se aplica la estructura. 10
4. La estructura de acuerdo con la reivindicación 1, donde la célula no deriva del sujeto al que se aplica la estructura.
5. La estructura de acuerdo con la reivindicación 1, donde la estructura expresa al menos un marcador de corazón no adulto seleccionado del grupo que consiste en la cadena IIa pesada de la miosina, la cadena IIb pesada de la 15 miosina, la cadena IId(IIx), pesada de la miosina, CD56, MyoD, Myf5 y miogenina.
6. La estructura de acuerdo con la reivindicación 4, donde el nivel de expresión del marcador de corazón no adulto en la estructura es al menos el 50 % de un nivel de expresión del marcador de corazón no adulto en mioblastos esqueléticos. 20
7. La estructura de acuerdo con la reivindicación 1, donde la estructura tridimensional expresa todas las cadena IIa pesada de la miosina, la cadena IIb pesada de la miosina, la cadena IId(IIx) pesada de la miosina, CD56, MyoD, Myf5 y miogenina.

25
8. La estructura de acuerdo con la reivindicación 6, donde un nivel de expresión de cada uno de las cadena IIa pesada de la miosina, la cadena IIb pesada de la miosina, la cadena IId(IIx) pesada de la miosina, CD56, MyoD, Myf5 y miogenina en la estructura es de al menos aproximadamente el 50 % de un nivel de expresión de la misma en mioblastos esqueléticos.

30
9. La estructura de acuerdo con la reivindicación 6, donde un nivel de expresión de cada uno de las cadena IIa pesada de la miosina, la cadena IIb pesada de la miosina, la cadena IId(IIx) pesada de la miosina, CD56, MyoD, Myf5 y miogenina en la estructura es de al menos aproximadamente el 100% de un nivel de expresión de la misma en mioblastos esqueléticos.

35
10. La estructura de acuerdo con la reivindicación 1, donde la célula derivada de una parte distinta al miocardio es una célula no derivada del corazón.
11. La estructura de acuerdo con la reivindicación 1, donde el corazón incluye miocardio.

40
12. La estructura de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una lámina de células en monocapa.
13. La estructura de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una lámina de células en multicapa.
14. La estructura de acuerdo con la reivindicación 12, donde la lámina de células en multicapas tiene conexión 45 biológica.
15. La estructura de acuerdo con la reivindicación 13, donde la conexión biológica se selecciona del grupo que consiste en:

conexión a través de la matriz extracelular, conexión eléctrica y conexión sin armazón. 50
16. Un método para producir una estructura tridimensional aplicable al corazón de un ser humano para el tratamiento de la miocardiopatía dilatada, la miocardiopatía hipertrófica en fase dilatada o la cardiopatía isquémica, donde no se utiliza un armazón, que tiene un área de al menos 6 cm2, y que comprende una célula derivada de una parte distinta del miocardio de un adulto, donde la célula un mioblasto y donde el método comprende las etapas de: 55

a) cultivar la célula derivada de la parte distinta al miocardio de un adulto en presencia de ácido ascórbico o un derivado del mismo sobre un soporte de cultivo celular injertado con una macromolécula respondedora a la temperatura que tiene una temperatura de solución crítica límite superior o una temperatura de solución crítica límite inferior con el agua de 0 ºC a 80 ºC, donde la célula es un mioblasto y la macromolécula respondedora a la 60 temperatura es poli(N-isopropilacrilamida);

b) fijar una temperatura media del cultivo a la temperatura de la solución del límite superior o más o a la temperatura de la solución del límite inferior o menos; y

c) desprender la célula cultivada como una estructura tridimensional.

65
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, donde la temperatura del medio de cultivo en b) se fija en 20 ºC

para la temperatura de solución crítica límite inferior al agua.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, donde el ácido ascórbico o un derivado del mismo se selecciona de ácido ascórbico 2-fosfato, ácido ascórbico 1-fosfato o L-ascorbato sódico.

5
19. El método de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, donde un tratamiento usando una enzima de degradación de proteínas no se realiza durante o antes de la etapa de desprendimiento.