JP2010029680A - 三次元組織構造体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特に、心筋以外の部分に由来する細胞を材料として移植手術に耐え得る人工組織を作製する。一部、特定の培養条件によって細胞を培養することによって予想外に組織化が進展し、かつ、培養皿から剥離し易いという性質をもつ人工組織を得ることにより達成される。さらには、スキャフォルドを用いず、成体の心臓を構成する心筋組織以外の部分に由来する筋芽細胞からなる、心臓疾患に適用するためのシート状三次元構造体が適用される。
【選択図】なし
Description
臓器(例えば、心臓、血管など)の移植に外来性組織を使用する際の主な障害は免疫拒絶反応である。同種異系移植片(または同種移植片、all0graft)と異種移植片(xen0graft)で起こる変化が最初に記述されたのは90年以上前のことである(Carrel A., 1907, J Exp Med 9:226-8; Carrel A., 1912., J Exp Med 9:389-92; Calne RY., 1970, Transplant Pr0c 2:550およびAuchincl0ss 1988, Transplantati0n 46: 1)。動脈移植片の拒絶反応は、病理学的には移植片の拡張(破裂に至る)または閉塞のいずれかを招く.前者の場合、細胞外マトリクスの分解により生じ、一方、後者は血管内細胞の増殖により起こる(Uretsky BF, Mulari S, Reddy S, et al., 1987, Circulati0n 76:827-34)。このような移植片の使用は、材料として非生体物質を使用することが多いことから、このような副作用という弊害がある。
従って、本発明は以下を提供する。
(1)成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む、心臓に適用可能な三次元構造体。
(2)上記細胞は幹細胞または分化細胞である、項目1に記載の三次元構造体。
(3)上記細胞は間葉系細胞である、項目1に記載の三次元構造体。
(4)上記細胞が筋芽細胞に由来する、項目1に記載の三次元構造体。
(5)上記筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、項目4に記載の三次元構造体。
(6)上記細胞が線維芽細胞である、項目1に記載の三次元構造体。
(7)上記細胞が滑膜細胞である、項目1に記載の三次元構造体。
(8)上記細胞が幹細胞に由来する、項目1に記載の三次元構造体。
(9)上記細胞は、上記三次元構造体が適用される被験体に由来する、項目1に記載の三次元構造体。
(10)上記細胞は、上記三次元構造体が適用される被験体に由来しない、項目1に記載の三次元構造体。
(11)上記三次元構造体は、ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖IId(IIx)、CD56、My0D、Myf5、my0geninおよびMRF4からなる群より選択される少なくとも1つの非成体心臓マーカーを発現する、項目1に記載の三次元構造体。
(12)上記構造体における非成体心臓マーカーは、骨格筋芽細胞における非心臓マーカーが発現するレベルの少なくとも50%のレベルで存在する、請求項11に記載の三次元構造体。
(13)上記三次元構造体は、ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖IId(IIx)、CD56、My0D、Myf5およびmy0geninをすべて発現する、項目1に記載の三次元構造体。
(14)上記ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖IId(IIx)、CD56、My0D、Myf5およびmy0geninはいずれも、骨格筋芽細胞が発現するレベルの少なくとも約50%以上のレベルで存在する、項目13に記載の三次元構造体。
(15)上記ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖IId(IIx)、CD56、My0D、Myf5およびmy0geninはいずれも、骨格筋芽細胞が発現するレベルの少なくとも約100%以上のレベルで存在する、項目13に記載の三次元構造体。
(16)上記心筋以外の細胞は、心臓に由来しない細胞である、項目1に記載の三次元構造体。
(17)上記心臓への適用可能性は心筋への適用可能性を含む、項目1に記載の三次元構造体。
(18)単層の細胞シートを含む、項目1に記載の三次元構造体。
(19)複数の層の細胞シートを含む、項目1に記載の三次元構造体。
(20)上記複数の層の細胞シートは、生物学的に結合している、項目19に記載の三次元構造体。
(21)上記生物学的結合は、細胞外マトリクスによる結合、電気的結合およびスキャフォルドなしでの結合からなる群より選択される、項目20に記載の三次元構造体。
(22)項目1〜21に記載の三次元構造体を含む医薬。
(23)上記心臓は、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う、項目22に記載の医薬。
(24)成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む、心臓に適用可能な三次元構造体を製造する方法であって、
a)水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性高分子がグラフティングされた細胞培養支持体上で、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を培養する工程;
b)培養液温度を、上記上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とする工程;および
c)上記培養した細胞を、三次元構造体として剥離する工程;を包含する、方法。
(25)上記剥離時またはその前に、タンパク質分解酵素による処理がなされない、項目24に記載の方法。
(26)上記温度応答性高分子が、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、項目24に記載の方法。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
(再生医療)
本明細書において使用される「再生」(regenerati0n)とは,個体の組織の一部が失われた際に残った組織が増殖して復元される現象をいう。動物種間または同一個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動する。ヒト組織の多くはその再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望めない。大きな傷害では、失われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し、不完全に組織が再生され機能が回復できない状態で終わる不完全再生が起こり得る。この場合には、生体内吸収性材料からなる構造物を用いて、組織欠損部への増殖力の強い組織の侵入を阻止することで本来の組織が増殖できる空間を確保し、さらに細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を高める再生医療が行われている。この例として、軟骨、骨および末梢神経の再生医療がある。神経細胞および心筋は再生能力がないかまたは著しく低いとこれまでは考えられてきた。近年、これらの組織へ分化し得る能力および自己増殖能を併せ持った組織幹細胞(体性幹細胞)の存在が報告され、組織幹細胞を用いる再生医療への期待が高まっている。胚性幹細胞(ES細胞)はすべての組織に分化する能力をもった細胞であり、それを用いた腎臓、肝臓などの複雑な臓器の再生が試みられているが実現には至っていない・
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明の方法においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使用される「細胞」の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシリンーエオシン(HE)染色を行うことにより細胞外マトリクス(例えば、エラスチンまたはコラーゲン)および細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積(例えば、200μm×200μm)あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞(例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞)であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において生体内で「石灰化する」かどうかは、カルシウム濃度を測定することによって判定することができ、移植組織を取り出し、酸処理などにより組織切片を溶解させ、その溶液を原子吸光度などの微量元素定量装置により測定し、定量することができる。
Ln(P/Ps)=β(D/Ds−1) (1)
で算出することができる。PsおよびDsは、100mmHgでの標準値を示す。PおよびD各々のP(圧力)における直径(D)の値を示す。
本発明の人工組織、三次元構造体、組織グラフトで必要に応じて使用される細胞は、同系由来(自己(自家)由来)でも、同種異系由来(他個体(他家)由来)でも、異種由来でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由来の細胞が好ましいが、拒絶反応が問題でない場合同種異系由来であってもよい。また、拒絶反応を起こすものも必要に応じて拒絶反応を解消する処置を行うことにより利用することができる。拒絶反応を回避する手順は当該分野において公知であり、例えば、新外科学体系、第12巻、臓器移植(心臓移植・肺移植技術的,倫理的整備から実施に向けて)(改訂第3版)、中山書店に記載されている。そのような方法としては、例えば、免疫抑制剤、ステロイド剤の使用などの方法が挙げられる。拒絶反応を予防する免疫抑制剤は、現在、「シクロスポリン」(サンディミュン/ネオーラル)、「タクロリムス」(プログラフ)、「アザチオプリン」(イムラン)、「ステロイドホルモン」(プレドニン、メチルプレドニン)、「T細胞抗体」(0KT3、ATGなど)があり、予防的免疫抑制療法として世界の多くの施設で行われている方法は、「シクロスポリン、アザチオプリン、ステロイドホルモン」の3剤併用である。免疫抑制剤は、本発明の医薬と同時期に投与されることが望ましいが、必ずしも必要ではない。従って、免疫抑制効果が達成される限り免疫抑制剤は本発明の再生・治療方法の前または後にも投与され得る。
従って、本発明が対象とする動物は、臓器または器官を有するものであれば、どの生物(例えば、動物(たとえば、脊椎動物、無脊椎動物))でもよい。好ましくは、脊椎動物(たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など)であり、より好ましくは、哺乳動物(例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、趨歯類、ウサギ目など)であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類(たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト)が用いられる。最も好ましくはヒトが対象とされ得る。移植治療において限界があるからである。
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人(患者本人であり得る)に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁(例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局(FDA)など)が規定した様式に従って作製され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書(package insert)であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体(例えば、インターネットで提供されるホームページ(ウェブサイト)、電子メール)のような形態でも提供され得る。
本明細書において「規則的配列」フィルムとは、ある一定の規則によって配列される構造を有するフィルムをいう。このようなフィルムには、ハニカム構造、ライン構造、ドット構造などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の人工組織は、好ましくは、このような規則的配列を用いて生産される。このようなフィルムは、生分解性材料(例えば、ポリ−L−乳酸(PLLA)など)を用いて構成することができる。伸展性のフィルムを作製するためには、ポリ(5−カプロラクトン)(PCL)などを使用することができる。
本発明において使用される間葉系細胞としては、例えば、骨髄、脂肪細胞、滑膜細胞、などが挙げられるがそれらに限定されない。
別の実施形態において、本発明において使用される細胞は、線維芽細胞であってもよい。線維芽細胞もまた、三次元構造体において三次元方向に生物学的結合を有することが確認されたからである。ただし、線維芽細胞を用いた三次元構造体は、心臓用途に使用することができる。あるいは、このような滑膜細胞から構成される三次元構造体は、心臓用途以外にも補強に使用することができる。
1つの実施形態において、本発明の三次元構造体は、少なくとも単層の細胞シートを含み、ある実施形態では、本発明の三次元構造体は、単層の細胞シートによって構成される。細胞シートが含まれることによって、本発明の三次元構造体は、無傷であることが保証され、あるいは、無孔性が保証されるからである。従って、細胞シートを少なくとも単層で持つ本発明の三次元構造体は、損傷部位を覆う用途において有用である。
別の局面において、本発明は、人工組織を生産するための方法を提供する。この人工組織生産法は、A)細胞を提供する工程;B)該細胞を、三次元化促進因子を含む細胞培養液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置する工程;およびC)該容器中の該細胞を、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形成するに十分な時間培養する工程、を包含する。
好ましい実施形態では、本発明の人工組織生産法では、培養した工程に続き、D)人工組織を剥離させ自己収縮させる工程、をさらに含む。剥離は、物理的な刺激(例えば、容器の角に棒などで物理的刺激を与えるなど)を行うことによって促進することができる。温度応答性高分子を用いる場合、その臨界溶解温度よりも高いまたは低い温度に環境を操作することによって、剥離を促進することができる。自己収縮は、このような剥離の後自然に起こる。自己収縮により、特に第三次元方向(シート上の組織に関する場合、二次元方向と鉛直な方向)の生物学的結合が促進される。このようにして製造されることから、本発明の人工組織は、三次元構造体という形態をとるといえる。
好ましい実施形態では、本発明の人工組織は、三次元方向に生物学的に結合されている。ここで、生物学的結合は、本明細書において他の場所において説明されており、例えば、細胞外マトリクスによる物理的結合、電気的結合などが挙げられるがそれらに限定されない・本発明では特に、組織の強度という点から細胞外マトリクスによる物理的結合が重要である。
好ましくは、本発明の人工組織は、実質的に細胞または該細胞に由来する物質から構成される。実質的に細胞および細胞に由来する物質(例えば、細胞外マトリクス)のみから構成されることによって、生体適合性および生体定着性を上げることができる。ここで、細胞に由来する物質は、代表的に細胞外マトリクスを含む。特に、人工組織では、細胞と細胞外マトリクスが適切な割合で含まれていることが好ましい。そのような適切な割合とは、例えば、細胞と細胞外マトリクスとの比が1:9〜9:1、好ましくは、3:7〜73、より好ましくは3:7〜5:5程度である。好ましい比率は、目的とする処置によって変動するが、そのような変動は、当業者には自明であり、目的とする臓器における細胞および細胞外マトリクスの比率を調査することによって、推定することができる。
別の実施形態において、本発明の人工組織は、可擁性である。可擁性であることによって、特に、運動性の臓器の補強に適切となる。そのような臓器としては、例えば、心臓、血管、筋肉などが挙げられるがそれらに限定されない・
別の実施形態において、本発明の人工組織は、伸縮性を有する。伸縮性を有することによって、伸び縮みする臓器、例えば、心臓、筋肉などにおける適用が可能となる。このような伸縮性は、従来の方法で調製された細胞シートなどでは達成されなかった性質である。好ましくは、本発明の人工組織は、心臓の拍動運動に耐え得る強度を有する。そのような拍動運動に耐え得る強度とは、例えば、少なくとも天然の心筋が有する強度の少なくとも約50%以上、好ましくは少なくとも約75%以上、より好ましくは少なくとも約100%以上であることが挙げられるがそれらに限定されない・
好ましい実施形態において、本発明の人工組織は、三次元方向すべてに生物学的結合がある。従来の方法で調製された人工組織は、二次元方向には生物学的結合がある程度見られるものがあったが、三次元方向にあった組織は調製されていない。従って、本発明の人工組織は、このように三次元方向すべての生物学的結合を有することによって、どのような用途においても実質的に移植可能という性質がもたらされる。
別の局面において、本発明は、細胞から人工組織を生産するための細胞培養組成物を提
整理番号=FI05040CIVPCT/P2004/00I024提出日=平成18年1月17日34供する。この細胞培養組成物は、細胞を維持または増殖させるための成分(例えば、市販される培地など);および三次元化促進因子を含む。このような三次元化促進因子に関する説明は、上述の人工組織生産法において詳述した。従って、この三次元化促進因子は、アスコルビン酸またはその誘導体(例えば、アスコルビン酸1リン酸またはその塩、アスコルビン酸2リン酸またはその塩、L一アスコルビン酸またはその塩など)を含む。ここで、本発明の培養組成物において含まれるアスコルビン酸2リン酸またはその塩は、少なくとも0。1mMで存在するか、あるいは濃縮培養組成物の場合は、調製時に少なくとも0。1mMとなるように含まれている。あるいは、この最低限度の濃度は、0。01mM、0。05mMであり得、または0。2mM、もしくは0。3mMであり得る。さらに好ましくは最低限度の濃度は、0。5mMであり得、あるいは1。0mMであり得る。
本発明において使用されるアスコルビン酸2リン酸は、アスコルビン酸1リン酸と共存して用いられる。この場合、使用されるアスコルビン酸1リン酸とアスコルビン酸2リン酸とは、特定の比率で用いることが好ましくあり得る。そのような好ましい比率としては、例えば、1:10〜10:1の範囲内が挙げられる。あるいは、好ましい比率としては、アスコルビン酸1リン酸のモル量がアスコルビン酸2リン酸よりも少ないという関係を挙げることができる。
本発明の特定の実施形態において、上記補強は、上記部分を覆うように本発明の人工組織を配置することによって達成され得る。従来の方法で提供される人工組織は、このような覆うことによる処置(すなわち、「巻く」用法)が不可能であったことから、本発明の人工組織は、従来技術で達成不可能であった用途を提供することになる。
好ましい実施形態において、本発明の人工組織は、生物学的結合を有することが有利である。
別の好ましい実施形態において、本発明の補強用人工組織は、三次元化促進因子の存在下で細胞を培養することによって形成される。
本発明で使用されるサイトカインはすでに市販されているが(例えば、東洋紡(株)HGF−101等)、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる.HGFを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該HGFを得ることもできる.或いは、遺伝子工学的手法によりHGFをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組み換えHGFを得ることができる(例えば、Nature、342、440(1989)、特開平5−111383号公報、Bi0chem-Bi0phys. Res. C0mmun., 163;967(1989)等を参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物細胞一などを用いることができる。このようにして得られたHGFは、天然型HGFと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/または付加されていてもよい。患者への導入方法としては、例えば、本発明においてHGFの導入方法として、安全かつ効率の良い遺伝子導入法であるセンダイ・ウィルス(HVJ)リポソーム法(M0lecular Medicine、30、1440-1448(1993)、実験医学、12、1822−‡826(1994))、電気的遺伝子導入法、ショットガン方式遺伝子導入法等があげられる。好ましくは、HVJリポソーム法が使用される。
(実施例1:心筋細胞シートでの人工組織および三次元構造体の作製および利用一組織操作した収縮性心筋細胞シートは、障害心筋層を再生する一)(生体操作した収縮性心筋細胞シートは、梗塞心筋層と統合してこれを再生する)本実施例において、本発明者らは、(1)心筋細胞シート(人工組織)は、移植後に生存し、かつ障害心筋層との組織学的電気的結合を示すか否か;(2)移植した心筋細胞シート(人工組織)は、心機能の改善を誘導し得るか否かという特定の課題について検証し、それぞれ、電気的結合を示すことおよび心機能改善をもたらすことを実証した。
(心筋梗塞モデル)
30匹のLewis系統の雄性ラット(300g、8週齢;Seac Y0shit0mi Ltd, Fuku0ka, Japan)を、本研究のために使用した。人道的な動物の世話は、Nati0nal S0city f0r Medical researchにより規定された「Principles 0f Lab0rat0ry Animal Care」およびInstitute 0f Lab0rat0ry Animal Res0urceにより準備されNati0nal Institute 0f Healthにより刊行された「Guide f0r the Care and Use 0f Lab0rat0ry Animals」(NIH Publicati0n N0.86-23、1985年改訂)に従った。急性心筋梗塞を、他所[Weisman HF, Bush DE, Mannisi JA, Weisfeldt ML, HealyB. Cellular mechanism 0f my0cardial infarct expansi0n. Circulati0n. 1988;78: 186-201]で記載されたようにして誘導した.簡単に述べると、ラットを、ペントバルビタールナトリウムで麻酔し、そして気管内チューブを通して、陽圧呼吸を適用した。第4左肋間隙にて胸郭を開胸し、8−0ポリプロピレン結紮糸によって、LADの起点から3mm遠位にて、LADを完全に結紮した。
初代線維芽細胞を、以前に刊行された手順[Z. Yabl0nka-Reuveni, M. Namer0ff. Skel et al muscle cell p0pulati0ns. Separati0n and partial characterizati0n 0f fibr0blast-likecellsfr0membry0nictissueusingdensitycentrifugati0n.Hist0chemistry.1987;87=27-38]に従って調製した.簡単に述べると、8週齢のLewisラットの脚の筋肉由来の細胞懸濁物を、Perc0ll TM(Amersham Bi0sciences Sweden)密度遠心分離により、線維芽細胞と筋細胞とに分離した。単離した線維芽細胞を、コントロール線維芽細胞シートのために使用した。
単離した新生児ラットの心筋細胞を、矩形に設計したPIPAAmグラフティングポリスチレン細胞培養皿上で培養し、そして温度を20℃まで低下させることによって矩形の細胞シートとして剥離させた。そして2つの心筋細胞シートを重層して、より厚い心臓移植片を作製した。二重層心臓シートの断面観察は、密接した結合と均質な心臓様組織を示した。四重層心筋細胞シートの同期した運動が、肉眼で検出された(データは示さず)。線維芽細胞シートの場合、単離した線維芽細胞を、同じ皿上で2日間培養し、そして同じ方法によって、矩形の細胞シートとして剥離した。
移植した心筋細胞シートの同定のために、EGFP新生児ラット心筋細胞を、同じプロトコルにより単離し、そして心筋細胞シートを作製した。本発明者らは、EGFP新生児ラット心筋細胞シートを、ヌードラットの梗塞心筋層に移植した。本発明者らは、その梗塞心筋層において、EGFP陽性心筋細胞を検出し得た(図6左下および右下)。
ラットに、ペントバルビタールナトリウムで麻酔した。麻酔にエタノールを補充して、軽度の麻酔を維持した。ラットを、仰臥位で軽く固定し、前胸部を剃毛した。心臓超音波検査を、市販の心エコーS0N0S5500(PHILIPS Medical Systems, USA)を用いて実施した。12MHzの環状アレイ変換器を、左半胸郭に適用した音響カップラーゲル層上に配置した。胸部への過度の圧力を避けつつその変換きが胸部との十分な接触を維持するように、注意を払った。上述のラットを、浅い左側面位で画像化した。まず、心臓を、最大左心室(LV)直径のレベルで、短軸断面にて2次元モードで画像化した。収縮左心室(LV)面積および拡張左心室(LV)面積を、同じ時間で決定した。左心室(LV)容量を、左心室(LV)短軸面積により評価した[G0rcsan J 3rd, M0rita S, Mandarin0 WA, Deneault LG, Kawai A, K0rm0s RL, Griffith BP, Pinsky MR. Tw0-dimensi0nal Ech0cardi0graphic Aut0mated B0rder Detecti0n Accurately Reflects Changesin Leftventricular V0lume. J Am S0c Ech0cardi0gr. 1993;6:482-9]。得られた画像は、左心室(LV)前壁および左心室(LV)後壁に対して垂直にMモードカーソルを位置付けるために使用した。すべての測定は、モニターを使用してオンラインで行った。拡張測定は、見かけの最大左心室(LV)拡張寸法の時期に行った。左心室(LV)収縮末期寸法を、左心室(LV)後壁の最も前方に収縮した軌跡の時期に測定した。左心室(LV)拡張寸法(LVDd)および左心室(LV)収縮寸法(LVDs)を測定した。寸法データおよび面積データは、選択した2拍動または3拍動の測定値の平均として表す。左心室(LV)駆出率(EF)を、LVEF(%)ニ[(LVDd3−LVDs3)/LVDd3]×100として計算した。LV%内径短縮率(FS)を、LV%FSニ[(LVDd−LVDs)/LVDd]×100として計算した。
カラーキネシスは、この技術の拡大部分である。カラーキネシスは、リアルタイムで心臓内運動を自動的に探知しそして提示する手段として、連続的音波フレーム間の組織の後方散乱値を比較する。カラーキネシスを、市販の超音波システム(S0N0S5500, PHILIPS Medical Systems, USA)に組み込んだ[Auchincl0ss 1988, Transplantati0n 46:1: R0bert ML, Philippe V, Lynn W, James B, Claudia K, J0anne S, Rick K, David P, Vict0r MA, et al. Ech0cardi0graphic quantificati0n 0f regi0nal left ventricular wall m0ti0n with c0l0r kinesis. Circulati0n. 1996;93:1877-1885]。
左心室心筋層検体を、心筋細胞シート移植後2週間目および8週間目に得た。各検体を、10%中性ホルムアルデヒド中に配置し、そしてパラフィン中に包埋した。各検体から、2〜3個の連続切片を切断し、そして光学顕微鏡検査のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
データを、平均±標準偏差(SD)として表す。個々の群の間の差異の有意性を評価するために、ノンパラメトリック・マン−ホイットニー二標本検定を用いて、統計学的評価を実施した。統計学的有意性は、0.05未満のp値と決定した。
(心臓移植片の特徴)
剥離した心筋細胞シートは、細胞骨格再構成に起因して、面積が5.76cm2から111±0.05cm2へと縮んだ(n=3)。一方、その厚さは、20.1±0.9μmから52。4±6.0μmへと増加した(n=3)。この心臓シートは、巨視的観察によると、自然に収縮した。
本発明者らは、低温度下で単層心筋細胞シートを得ることができた(図6の左上)。心筋細胞シートは、移植後に結紮糸を用いずに、梗塞心筋層上にじかに付着させた(図6右上)。移植の2週間後、移植した心筋細胞シートのヘマトキシリンーエオシン(HE)染色の組織学的検査により、炎症細胞が蓄積することなく、梗塞心筋層上に整列して十分に付着したことが示された。黄色の矢印は、コラーゲンシートを示し、これは、心筋細胞シートを梗塞心筋層に送達するために必要である(図7)。移植した心筋細胞シートを移植後8週目に目視すると、移植した心筋細胞シートとレシピエント心臓との間が密接に付着していることが明らかになった。移植の8週間後の移植した心筋細胞シートのHE染色により、心筋細胞シートと宿主心筋層とが療痕の中心に整列して統合したことが示された(図7右下)。免疫組織化学染色により、移植した心筋細胞シート中、および移植した心筋細胞シートとレシピエント心臓との間の接触領域周辺にある、不規則な方向のコネキシン43が示された(図7中下)。第VIII因子免疫組織化学染色により、移植した心筋細胞シート中またはこのシートの周辺にある、多くの第VIII因子陽性細胞が示された(図7左下)。
Bモード分析により、C群と比較してT群において、左心室の拡張が十分に抑制されたこと、および全体的壁運動が十分に保存されたことが、示された(図8)。ベースラインでの駆出率(EF)、内径短縮率(FS)、左心室収縮末期面積(LVESA)は、3つの群の間で有意には異ならなかった。
電気生理学的実験は、C群において脚ブロックのようなQRS波の2つのピークを示したにも関わらず、T群において、処置した療痕領域のQRS波の1つのピーク成分を示した(図11)。F群もまた、T群ほどではないが効果が観察された。さらに、電気生理学的実験は、F群およびC群において低振幅を示したにも関わらず、T群において、QRS群の振幅(ボルト)の改善を示した(C群対T群:2.79±0.9V対0.83±0.64V、P<0.05)(図11)。
針注入により導入される細胞性心筋症の近年の発達により、損傷した心機能を回復するための新規なアプローチが提供された[Tayl0r DA, Atkins BZ, Hungspreugs P, J0nes TR, Reedy MC, Hutches0n KA, Gl0wer DD, Kraus WE. Regenerati0n 0f functi0nal my0cardium: Impr0ved perf0rmance after skeletal my0blast transplantati0n. Nature Med. 1998; 4: 929-933]。心筋細胞シート移植法の付加された潜在的利点は、組織形成プロセス(移植片の形状、サイズ、および一貫性)の良好な制御、容易な移植技術、ならびに最小の細胞損失で多数の細胞を移植することであり、一方、注射法は、トリプシン処理によって一定量の細胞または細胞表面タンパク質(例えば、コネキシン43)の損失をもたらす。心筋細胞シート移植法は、心筋梗塞に加えて、全体的な心筋機能不全(例えば、拡張型心筋症)の修復のために有用であり得る。臨床的適用を達成するために、移植した全心筋組織量は、障害心筋層の修復のために極めて重要であり、そして新脈管形成の増強により、心臓シートをより厚くすること、およびより多くの細胞を障害心筋層に送達することが、可能になり得る。
動的統合に関して、移植した心筋細胞シートの心筋細胞は、梗塞心筋層において整列を示し、そして局所的および全体的な収縮機能の有意な改善を促進した。損なわれたリモデリングは、梗塞心臓における心臓の構造的変形および心機能の劣化の原因である[Tyagi SC. Extracellular matrix dynamics in heart failure: A pr0spect f0r gene therapy. J. Cell. Bi0chem. 1998; 68: 403-410]。Kelleyらは、梗塞心筋層上にメッシュを配置された左心室(LV)の拡張の制限が、ヒツジ心筋梗塞モデルにおいて左心室(LV)の構成および休止機能を保存することを示した[Kelley ST, Malekan R, G0rman JHら、Restraining infarct expansi0n preserves left ventricular ge0metry and functi0n after acute anter0apical infarcti0n. Circulati0n. 1999; 99: 135-142]。機能不全組織における左心室(LV)構成の保存および局所的収縮機能の改善の両方が、損傷した心臓における収縮性能を修復するために必須であり得るが、それゆえ、左心室(LV)拡張の減弱のみでは、不十分な処置である。非収縮シートが収縮シートと比較して収縮性能を改善しなかった本発明者らのデータは、この所見を支持する。さらに、本発明者らのデータは、梗塞心筋層において有意な新脈管形成を示した。心臓機能の改善に関する機構の1つは、移植した心筋細胞シートにより誘導される新脈管形成であり得る。総括すると、心筋細胞シート移植により誘導される収縮機能の有意な改善は、左心室(LV)構成の保存、局所的収縮機能の改善、および新脈管形成の誘導を担う。
心筋細胞シート移植は、障害心筋層における機能的性能および心臓構造を修復するための、新規かつ有望なストラテジーであり得る。
新生児ラットの心筋細胞を使用する人工組織は、障害心筋層と統合し、虚血心筋層モデルにおいて心機能を改善した。本発明者らは心筋細胞を使用したが、細胞シート技術を使用して組織化した人工組織は、組織移植の新規な概念として、再生医療の分野において有用である。この方法を、図1に模式化して示す。
(自己由来筋芽細胞シートは、障害心筋層を再生する:臨床適用への道−ラットを用いた実証例)
組織工学における最近の進歩は、心筋以外の種々の細胞および細胞外基質から構成される、移植可能な機能的組織を提供する可能性がある。本発明者らは、自己由来筋芽細胞シートを設計した。これらのシートが、臨床適用の点で有益であり得ると、本発明者らは考え、本実施例では、筋芽細胞を材料として用いて人工組織または三次元構造体を構築し、その医療応用における効果を実証した。
左前下行枝(LAD)を2週間結紮することによって、28匹のラットにおいて、損傷心臓を作製した。高分子(N−イソプロピルアクリルアミド)製の温度応答性ドメインで、培養皿上をコーティングした。脚筋肉から単離した骨格筋芽細胞(SM)を培養し(図12を参照)、20℃にて単一の単層細胞シート(組織)として皿から脱着した(図13)。9匹のラットにおいて2つの筋芽細胞シート移植(筋芽細胞シート(S)群=107細胞)を行った;9匹のラットにおいて筋芽細胞注入(1群=107細胞)を行った;10匹のラットにおいて非細胞治療(C群=培地のみの注入)を行った(図14および16を参照)。
ラットを麻酔し、手術後14日目および28日目に、心機能をモニターした。12MHzで操作する環状アレイ変換器を備えた超音波機器(S0n0s 5500)を使用して、エンドカルジオグラフィを実施した(図18)。B画像化モードおよびM画像化モードにおける胸骨傍短軸画像および胸骨傍長軸画像を実施した。前壁圧に加えて、全体的パラメーター(例えば、左心室拡張末期直径、左心室収縮末期直径、内径短縮率および駆出率)を測定した(図14を参照)。
2週間後および4週間後、過量のペントバルビタールによってラットを屠殺し、その心臓を摘出し、10%ホルマリンで固定し、そしてパラフィン中に包埋した。低温槽を使用することによって、心臓の長手軸方向に沿って心底から心尖まで、一連の5mm厚切片を調製し、その後、標準的組織学のために処理した(図15および17に示されるように、筋肉の可視化のためのヘマトキシリンおよびエオシン染色およびコラーゲン含量を評価するためのマッソン−トリクローム染色を行った)。
(心機能に対する筋芽細胞移植の効果)
実験により、手術の24時間以内に、心筋梗塞は20%未満の急性死亡率を生じた。一方、この細胞移植手順は、さらなる動物の死亡を引き起こさなかった。
(組織学的知見)
MI群の損傷心臓が、拡張して不均一に厚くなった壁を有したこと(図20を参照)、および移植細胞のパッチをほとんど含まなかったことが、組織学によって明らかになった(図21)。対照的に、シート移植物を含む梗塞心臓は、拡張せず、均一に厚くなった壁を有し、十分に細胞化し、そして療痕を有さなかった。移植物の生存を、移植後2週間目、4週間目、および8週間目に同定した。
図22A〜図22Fは、電気生理学的試験の結果を動画表示し、その中で代表的なコマを静止画として表したものである。図22A〜Cは、コントロールであり、図22D〜図22Fは、本発明の筋芽細胞シートによる結果である。
図25A〜図25Cもまた、超音波エコー図の結果を動画表示し、その中で代表的なコマを静止画として表したものである。左側は梗塞心のコントロールであり、右側は本発明の筋芽細胞シートでの結果を示す。示されるように、本発明によって、梗塞がほぼ治癒し、ほぼ正常に拍動している様子がわかる。
図27A〜27Cもまた、本発明の処置による梗塞心の超音波エコー図の結果を動画表示し、その中で代表的なコマを静止画として表したものである。このように、梗塞が本発明の処置により治癒していることがわかる。
Universal Mix(製造業者が提供) 12.5μl
プライマー(100μM)フォワード 0.05μl
プライマー(100μM)リバース 0.05μl
プローブ(50μM) 0.1μl
dH20 10.3μl
テンプレート(DNA) 2.0μl
プライマーおよびプローブ配列は以下のとおりである。
SRY(フォワードプライマー)GCC TCA GGA CAT ATT AAT CTC TGG AG(配列番号15)
(リバースプライマー) GCT GAT CTC TGA ATT CTG CAT GC(配列番号16)
(プローブ) AGG CGC AAG TTG GCT CAA CAG AAT CC(配列番号17)
IL2(フォワードプライマー)GCC TTG TGT GTT ATA AGT AGG AGG C(配列番号18)
(リバースプライマー) AGT GCC AAT TCG ATG ATG AGC(配列番号19)
(プローブ) TCT CCT CAG AAA TTC CAC CAC AGT TGC TG(配列番号20).
100ngの各ゲノムDNAを用いてPCRを行った。その反応混合液を、Micr0Amp 0ptical 96ウェル反応プレートのウェル中に入れた。Micr0Amp 0ptical Capsを用いてウェルにキャップをし、手短に気泡を抜き、これらのウェル中の底にある液体を集めた。各々の遺伝子についての測定は、3連で行った。PCRは、ABI Prism 7700 Sequence Detecti0n Systemを用いて行った。
ステージ1 ステージ2 ステージ3
50℃/2分 95℃/10分 95℃/15秒−−60℃/1分
これを40サイクル反復雄性細胞の指標、以下の式で求めた。
その結果、図28に示すように、シート(三次元組織体)移植は、針移植(細胞そのもの)より良好な細胞生着性を示すことが明らかになった。
移植筋芽細胞シートが移植後にどのような細胞種に分化しているかどうかを検証した。
そこで、マッソントリクローム染色HE(ヘマトキシリンーエオシン)染色MHC速筋(MHC fast)染色およびMHC遅筋(MHC sl0w)染色を行った。
<マッソントリクローム染色>
マッソントリクローム染色法は以下のとおりである:マッソントリクローム染色では、鉄ヘマトキシリンで核が染められ、その後に拡散速度の大きい小色素分子(酸フクシン、ポンソーキシリジン)が細胞の細網孔へ浸透し、次いで拡散速度の小さい大色素分子(アニリン青)が膠原線維の粗構造に入り込み青色に染め出す。
A)媒染剤
10%トリクロル酢酸水溶液 1容
10%重クロム酸カリウム水溶液 1容
B)ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液(使用時に1液と2液を等量混合)
1液
ヘマトキシリン 1g
100%エタノール 100ml
2液
塩化第二鉄 2.0g
塩酸(25%) 1ml
蒸留水 95ml
C)1%塩酸70%アルコール
D)I液
1%ビーブリッヒスカーレット 90ml
1%酸性フクシン 10ml
酢酸 1ml
E)II液
リンモリブデン酸 5g
リンタングステン酸 5g
蒸留水 200ml
F)III液
アニリン青 2.5g
酢酸 2ml
蒸留水 100ml
G)1%酢酸水
マッソントリクローム染色法の手順
1.脱パラ、水洗、蒸留水
2.媒染(10〜15分)
3.水洗(5分)
4.ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液(5分)
5.軽く水洗
6.1%塩酸70%アルコールで分別
7.色出し、水洗(10分)
8.蒸留水
9.I液(2〜5分)
10.軽く水洗
11.II液(30分以上)
12.軽く水洗
13.III液(5分)
14.軽く水洗
15.1%酢酸水(5分)
16.水洗(すばやく)
17.脱水、透徹、封入。
細胞における支持体の定着・消長を観察するために、HE染色を行った。その手順は以下のとおりである。必要に応じて脱パラフィン(例えば、純エタノールにて)、水洗を行い、オムニのヘマトキシリンでサンプルを10分浸した。その後流水水洗し、アンモニア水で色出しを30秒間行った。その後、流水水洗を5分行い、塩酸エオジン10倍希釈液で2分間染色し、脱水し、透徹し、封入する。
モノクローナル抗骨格筋ミオシン(FAST)
ミオシン重鎖:MY−32(骨格筋芽細胞)
ラットおよびヒトとの比反応性
1)凍結ストックから、5μm厚の切片を作製する。
3)内因性ペルオキシド活性は、メタノール中0.3%H202中で20分間室温でブロックする(1ml 30%H202+99mlメタノール)
4)PBSで洗浄する(3×5分)。
6)翌日PBSで洗浄する(3×5分)。
8)PBSで洗浄する(3×5分)。
10)PBSで洗浄する(3×5分)。
12)茶っぽい色を顕微鏡で観察する。
13)水中に5分ほど浸す。
15)数回洗浄する。
16)イオン交換水で1回洗浄する。
18)90%エタノールで1分洗浄する。
19)100%エタノールで1分洗浄する。(3回)
20)キシレンで3回×1分間洗浄する。その後カバースリップをかける。
(MHC sl0w染色)
モノクローナル抗ミオシン:骨格筋遅筋
イヌ、ラットおよびヒトでの、比反応性
1)凍結ストックから、5μm厚の切片を作製する。
3)内因性ペルオキシド活性は、メタノール中0.3%H202中で20分間室温でブロックする(1ml 30%H202+99mlメタノール)
4)PBSで洗浄する(3×5分)。
6)翌日PBSで洗浄する(3×5分)。
8)PBSで洗浄する(3×5分)。
10)PBSで洗浄する(3×5分)。
12)茶っぽい色を顕微鏡で観察する。
13)水中に5分ほど浸す。
15)数回洗浄する。
16)イオン交換水で1回洗浄する。
18)90%エタノールで1分洗浄する。
19)100%エタノールで1分洗浄する。(3回)
20)キシレンで3回×1分間洗浄する。その後カバースリップをかける。
その結果、図29に示すように、移植した筋芽細胞シートは、速筋繊維(fast fiber)から遅筋線維(sl0w fiber)に分化していたことが明らかになった。これらのマーカーは、本発明の三次元組織構造体を識別するために使用することができる。
骨格筋芽細胞移植は、心臓リモデリングを減弱させそして損傷心筋層を再生させることによって、細胞移植と比較して、全体的心機能を改善した。このことは、心筋再生治療のための有望なストラテジーを示唆する。
(実施例3:骨格筋芽細胞−組織操作した筋芽細胞シートの移植は、心筋症ハムスターにおいて、心臓リモデリングの減弱によって心機能を改善する−ハムスターでの例)次に、骨格筋芽細胞を用いて作製した人工組織または三次元構造体が心筋症が改善するかどうかを実証した。
(梗塞心筋層の機能的回復)
Bモード分析により、C群と比較してT群において、左心室の拡張が十分に抑制されたこと、および全体的壁運動が十分に保存されたことが、示された(図18)。
筋芽細胞シート移植は、拡張型心筋症(DCM)心臓において、心臓拡張の進行を減少させ、心機能を改善した。筋芽細胞シート移植は、拡張型心筋症(DCM)心臓における心臓リモデリングの減弱により心機能を回復させるための有望な方法であり得る。
本実施例では、より臨床での知見をめざし大動物心筋梗塞モデルに骨格筋芽細胞シートを移植し、その心機能改善を検討した。
30kgのブタを全身麻酔下、開胸を行い、LADを結紮することにより作製された心筋梗塞モデルに3つの異なる治療1)骨格筋芽細胞シート群2)骨格筋芽細胞注入群3)コントロール群を作製し、心機能、心筋組織の変化を検討した(図34)。骨格筋芽細胞は自己の大腿筋から採取し、分解液としてコラゲナーゼ、トリプシンEDTA、硫酸ゲンタマイシン、アンフォテリシンBを調製後、0.22μフィルターでろ過したものを使用し、初代培養液としてSkBM Basal Medium、ウシ胎児血清、EGF、リン酸デキサメタゾンナトリウム、硫酸ゲンタマイシン、アンフォテリシンBを調製後0.22μフィルターでろ過したものを使用した。この細胞をポリ(N−イソプロピルアミド製温度応答性高分子をグラフトした皿上で培養し、温度変化にて酵素処理することなく細胞シートを脱着した。
細胞シートを移植した群では心機能の収縮性、拡張性が改善している(図35および36)。さらに心筋梗塞部分に移植細胞の生着を確認した。
げっ歯類以外の動物の実験においても、本発明の筋芽細胞シートを使用して治療することにより心機能改善効果を認められた。
別の細胞で実証するために、組織幹を含む細胞として、滑膜細胞をシート状にし、心筋梗塞モデルに移植し、心機能改善効果があるか検討した。
8週齢ラットの膝関節を剥離し、関節内側面に滑膜組織を切離する。20%FBS、DMEM high gluc0seの培養液に貼り付け、細胞を培養する。得られた細胞をポリ(N−イソプロピルアミド製温度応答性高分子をグラフトした皿上で培養し、温度変化にて酵素処理することなく細胞シートを脱着した。LADの結紮することにより作製された心筋梗塞モデルに3つの異なる治療1)細胞シート群2)細胞注入群3)コントロール群を作製し、心機能、心筋組織の変化を検討した。
細胞シートを移植した群では心機能の収縮性、拡張性が改善している。さらに心筋梗塞部分に移植細胞の生着を確認した。
滑膜組織から得られた細胞から分化した細胞においても、シート化することにより心機能改善効果を認められる。
未分化細胞の例として、マウス胚性幹細胞から心筋細胞に分化する細胞があることが知られている。本実施例ではこの心筋細胞をシート状にし、心筋梗塞モデルに移植し、心機能改善効果があるか検討した。
細胞シートを移植した群では心機能の収縮性、拡張性が改善している。さらに心筋梗塞部分に移植細胞の生着を確認した。
胚性幹細胞から分化した細胞においても、シート化することにより心機能改善効果を認められる。
次に、アスコルビン酸またはその誘導体による人工組織作製への影響を検討した。
筋芽細胞を十分量増殖させた後、5×106の細胞数を、10cmの温度応答性培養皿にて培養した。培養には、SkBM Basal Medium(Cl0netics(Cambrex))という培地を使用した。次に、アスコルビン酸2リン酸(0.5mM)、アスコルビン酸1リン酸マグネシウム塩(0.1mM)、L−アスコルビン酸Na(0.1mM)を投与し、培養開始4日後に20度にて、脱着させた。コントロールとして、アスコルビン酸類を添加しない培養系で培養した人工組織を作製した。
アスコルビン酸類を添加した場合は、無添加の培養系での人工組織よりも、脱着が格段に容易となっており、しかも、無添加の培養系では、数mm程度の大きさまでしか培養されず、それを超えると、割れ目などが入り、成長しなかった。しかも、はがすことが実質的に困難であり、移植可能な人工組織を提供できなかった。これに対し、本発明のアスコルビン酸類を添加した培地で培養した人工組織は、移植可能な程度の大きさに成長し、しかも、脱着が容易であり、孔も発生せず、傷もほとんど付けることなく人工組織を単離することができた。生物学的結合を見たところ、細胞外マトリクスによる相互作用がかなり進んでいることが判明した(図37〜39)。
次に、アスコルビン酸2リン酸酸による人工組織作製への影響を検討した。
滑膜細胞および筋芽細胞を十分量増殖させた後、5×106の細胞数を、10cmの温度応答性培養皿にて培養した。培養には、アスコルビン酸2リン酸(1mM)を含むSkBM Basal Medium(筋芽細胞)またはアスコルビン酸2リン酸(1mM)を含むDMEM(滑膜細胞)という培地を使用した。コントロールとして、アスコルビン酸類を添加しない同じ培地を含む培養系および通常使用されるアスコルビン酸1リン酸(1mM)を含む同じ培地を含む培養系で培養した人工組織を作製した。
収縮した組織をHE染色などの組織学分析を行ったところ(図42、滑膜細胞)、細胞は10層以上になり、マトリクスはコラーゲンのメッシュまたはスポンジ状となっており、ピンセットで容易につまめる硬さとなっていた。
アスコルビン酸2リン酸を添加した場合は、無添加の培養系での人工組織および通常使用されるアスコルビン酸1リン酸を含む系での人工組織よりも、脱着が格段に容易となっており、しかも、無添加の培養系では、数mm程度の大きさまでしか培養されず、それを超えると、割れ目などが入り、成長しなかった。通常使用されるアスコルビン酸1リン酸を含む系で培養したものも、大きさ、強度などの点で添加した系に及ばなかった。無添加コントロール系では、人工組織をはがすことが実質的に困難であり、移植可能な人工組織を提供できなかった。
実施例7および8においてアスコルビン酸類の存在下で作製した人工組織を、拡張型心筋症ハムスターに移植したところ、移植したハムスターすべてが完治し、通常のハムスターと同様の生存期間生存した。従って、本発明は、特定の三次元化促進因子の存在によって、従来難治性といわれた疾患をも完治させることができることが判明した。
上記実施例で作製されたシートと遺伝子治療の併用療法を施行した。これは併用療法によりシート移植部の血管新生を促進し、移植シートの生着促進、シート内部の細胞壊死を抑制する目的である。
センダイウイルス(HVJ)およびリポソーム複合体の調製は文献(Kaneda Y, Iwai K, Uchida T. Increased expressi0n 0f DNA c0-intr0duced with nuclear pr0tein in adult rat liver. Science. 1989; 243: 375-378)の記載に従っておこなった。以下に簡潔に示す。DNA溶液200μ1を加え、30秒間振盤し、37度恒温槽に30秒間静置する。これを8回繰り返す。5秒間超音波処理をし、30秒間振盤する。0.3mlのBSSを加え、37度恒温槽で振盤する。不活化したHVJを加え、氷上で10分間置く。37度恒温槽にて1時間振盤する。超遠心チューブに60%と30%のショ糖溶液をそれぞれ1ml、6mlで重層し、HVJリポソーム液をのせ、BSSをチューブの付近まで加える。62,800g、4度で1.5時間超遠心する。30%ショ糖溶液層のすぐ上を回収し、4度に保存し、遺伝子導入に用いた。
細胞シートを移植した群、併用療法群では心機能の収縮性、拡張性が改善している。さらに併用療法をした群では心筋梗塞部分に血管新生を認め、移植細胞の生着が改善していることが確認できる。
シート化した組織と遺伝子治療を併用することにより心機能改善効果とさらに血管新生効果と細胞保護効果があり、より心機能の改善が認められる。
Claims (10)
- スキャフォルドを用いず、成体の心臓を構成する心筋組織以外の部分に由来する筋芽細胞からなる、心臓疾患に適用するためのシート状三次元構造体。
- 筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、請求項1に記載のシート状三次元構造体。
- 前記細胞は、前記シート状三次元構造体が適用される被験体に由来する、請求項1、2のいずれか1項に記載のシート状三次元構造体。
- 複数の層の細胞シートを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のシート状三次元構造体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のシート状三次元構造体を含む心臓疾患に適用するための医薬。
- 前記心臓は、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う、請求項5に記載の医薬。
- スキャフォルドを用いず、成体の心臓を構成する心筋組織以外の部分に由来する筋芽細胞からなる、心臓疾患に適用するためのシート状三次元構造体を製造する方法であって、
a)水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性高分子がグラフティングされた細胞培養支持体上で、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を培養する工程;
b)培養液温度を、該上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とする工程;および
c)該培養した細胞を、シート状三次元構造体として剥離する工程;
を包含する、方法。 - 前記剥離前に、培地にアスコルビン酸またはその誘導体を加えることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記剥離時またはその前に、タンパク質分解酵素による処理がなされない、請求項7、8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記温度応答性高分子が、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
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