JP5757706B2 - 細胞シートの製造方法 - Google Patents
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項2 培地が、さらにアスコルビン酸を含有する上記項1に記載の製造方法。
項3 好酸球カチオン性タンパク質が、ヒト由来である上記項1に記載の製造方法。
項4 ヒト由来線維芽細胞が、表皮線維芽細胞又は歯肉線維芽細胞である上記項1に記載の製造方法。
項5 剥離性ポリマー層が、温度感受性ポリマーを含有する上記項1に記載の製造方法。
項6 温度感受性ポリマーが、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミドである上記項5に記載の製造方法。
本発明のECPとは、動物由来のものであれば特に限定はされないが、例えば、ヒト(NCBI Accession No. NP_002926)、チンパンジー(NCBI Accession No. AAC50150)、オランウータン(NCBI Accession No. AAC50147、カニクイザル(NCBI Accession No. AAC50146)、ゴリラ(NCBI Accession No. AAC50143)、ラット(NCBI Accession No. BAA13648)由来のECPが挙げられる。中でも、ヒト由来のECPが特に好ましい。
本発明の細胞シートの製造方法は、底面に剥離性ポリマー層を有する容器中で、好酸球カチオン性タンパク質(ECP)を含有する培地の存在下に、ヒト由来線維芽細胞を培養する細胞シートの製造方法である。
rhECPがヒト線維芽細胞に及ぼす増殖,活性および毒性の検討をヒト歯肉線維芽細胞およびヒト皮膚線維芽細胞を対象に検討した。なお、rhECPは上述した公知の方法により製造して入手したものを用いた。
健康なヒト歯肉組織から分離・培養した線維芽細胞様細胞を、ヒト歯肉線維芽細胞として用いた。ヒト歯肉線維芽細胞の分離・培養は公知の方法を採用することができ、特に限定されないが、本実験例では、Nishimuraらの記載(Journal of Dental Research. 1996. 75, 986−992)に従って行った。
上述の方法で培養したヒト歯肉あるいは皮膚線維芽細胞を、96-wellプレートに1.6×104 cells / wellの細胞密度で播種し、24時間培養した。その後、DMEM培地を、0.5%のFBSを含有する培地に交換し、さらに24時間培養した。その後、0〜10μg / mlのrhECPで24時間刺激を行った。なお、この段階で培地中には抗生剤を添加しなかった。刺激後、Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide(Sigma)を加え、4時間培養した後に上清を除き、HCl-isopropanolを加えて混和した後、各ウェルの595 nmの吸光度を測定し、解析を行った。結果を図1及び図2に示す。
ヒト皮膚線維芽細胞を対象に、rhECPによる刺激に応答して、細胞から産生されるbFGFの量を、ELISA法を用いて測定した。
口腔内常在菌であるStreptococcus sanguis(ATCC 10556)を被験菌とした。被験菌をLB培地で前培養し,4.0×104CFU / mlになるようにPBS(-)で調製した。各菌液に0〜100μg / mlのrhECPを添加し37℃で4時間培養を行った。その後、LB寒天平板培地に菌液を100μlずつ播種し、37℃で24時間培養の後、平板上のコロニー数を調べた。結果を図4に示す。
ヒト歯肉線維芽細胞シートを、市販の細胞シート回収用温度反応性細胞培養器材UpCell(登録商標 Cell Seed、Tokyo)を用いて作製した。
Claims (5)
- 底面に剥離性ポリマー層を有する容器中で、ヒト由来好酸球カチオン性タンパク質(ECP)を含有する培地の存在下に、ヒト由来線維芽細胞を培養する細胞シートの製造方法。
- 培地が、さらにアスコルビン酸を含有する請求項1に記載の製造方法。
- 線維芽細胞が、表皮線維芽細胞又は歯肉線維芽細胞である請求項1に記載の製造方法。
- 剥離性ポリマー層が、温度感受性ポリマーを含有する請求項1に記載の製造方法。
- 温度感受性ポリマーが、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミドである請求項4に記載の製造方法。
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