JP2020520630A - Hla−gタンパク質を常に分泌発現する細胞株及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、現在の幹細胞培養液は人体の脂肪などから分離した幹細胞を一般的な培養法で培養して生産されており、前記培養液に含まれうる物質は制限的であり、これによる効果も多様ではない状況であった。
本発明のもう一つの目的は、HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞及び幹細胞を共培養する段階;及び前記培養された幹細胞を継代培養する段階を含むHLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法で製造されたHLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液の製造方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液の製造方法で製造されたHLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記培養液を有効成分として含む抗老化または抗酸化用組成物を提供することにある。
本発明のHLA−Gタンパク質を常に分泌発現する新規栄養膜細胞は、人体内細胞の成長環境、温度変化、運動性などの多様な生理的な特性を反映して培養されることによって、免疫寛容の特性を示しうるHLA−Gタンパク質を持続的に分泌発現する特性を有しうる。
本発明の用語、「基礎体温法」は、女性の基礎体温を用いた妊娠調節法を意味する。基礎体温は呼吸以外のすべての活動が止まった瞬間の体温を意味し、一般的には朝目覚めてすぐに測った体温である。生理周期にしたがって基礎体温は低温期及び高温期が2週間隔で反復されるが、特に最も低い温度(36.3℃)を示す排卵日以後の2週間高温期が維持され、生理が始まると再び体温が下がることになる。このような基礎体温は個人差があり、前記36.3℃〜37.2℃の範囲内で変化するものであれば、温度条件は当業者が適切に調節してもよい。
本発明の用語、「細胞外基質」は、細胞と組織の間の空間を詰めることで細胞を保護し支持する役割を果たす、細胞によって生成されるものである。具体的には、前記細胞外基質は、コラーゲン、フィブロネクチン及びプロコラーゲンからなる群から選択される1つ以上のものであってもよい。
具体的には、前記細胞外基質は、線維芽細胞を18,000〜22,000細胞/cm2の密度で接種する段階;(b)前記線維芽細胞を無血清培地で培養する段階;及び(c)培養して114〜126時間経過後に線維芽細胞の培養液を収得する段階を介して製造されるものであって、前記無血清培地はヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質を15〜25%(v/v)で含むものであってもよい。前記の条件で線維芽細胞を培養する場合、細胞外基質を最大の生産量で収得することができる。
具体的には、前記タンパク質は、ヒト間葉系幹細胞由来の成長因子またはサイトカインを含んでもよく、より具体的には、AR、BDNF、bFGF、BMP−4、BMP−5、BMP−7、b−NGF、EGF−R、FGF−4、FGF−7、GDF−15、GDNF、HGF、IGFBP−1、IGFBP−2、IGFBP−3、IGFBP−4、IGFBP−6、IGF−1、インスリン、MCSF、MCSF−R、NGF−R、NT−3、NT−4、OPG、PDGF−AA、PIGF、SCF、SCF−R、TGF−α、TGF−β1、VEGF、VEGF−R3、ICAM−1、G−CSF、IL−1α、IL−2、IL−5、IL−6、IL−8、IL−11、MCP−1、MIG、MIP−1a、MIP−b、MIP−d、TIMP−1、TIMP−2、TNFα、TNFβ、TNF−R1またはTNF−R11を含んでもよいが、これに制限されない。
また、前記方法によって製造された栄養膜細胞は、HLA−G5タンパク質を分泌することを確認して、HLA−Gタンパク質を細胞外部に分泌しうることを確認し、継代培養をすればするほどHLA−G5の量が増加することを確認して前記栄養膜細胞はHLA−G5を常に分泌発現することを確認できた(図12)。
これは、前記栄養膜細胞株は、免疫寛容の特性を示すHLA−Gタンパク質を常に分泌発現するため、免疫寛容の特性が要求される細胞治療剤または新規細胞株の開発などに有利に活用できることを示唆する。
もう一つの様態は、前記HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法で製造された、HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞を提供する。
ここで、前記「HLA−Gタンパク質」及び「栄養膜細胞」に対する説明は前述した通りである。
本発明の用語、「間葉系幹細胞」は、軟骨、骨、脂肪、骨髄間質、筋肉、神経などを作るのに元になる細胞であって、成人には一般的に骨髄に留まっているが臍帯血、抹消血液、脂肪、羊水などのその他の組織などにも存在し、これらから収得できる幹細胞を意味する。具体的には、前記間葉系幹細胞は脂肪、骨髄、臍帯血、羊水または羊膜由来であってもよいが、これに制限されるものではない。また、前記間葉系幹細胞はヒトまたはヒトを含む哺乳類から由来したものであってもよい。
前記共培養はヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質及び植物抽出物が、1:0.5〜 1:1.5の比率で混合された混合物を含む培地で行われるものであってもよい。
この時、前記「ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質」に対する説明は、前述した通りである。
また、前記混合物は、前記ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質及び植物抽出物が、1:0.5〜1:1.5の比率、具体的には、1:1の比率で混合されるものであってもよいが、これに制限されない。
また、前記HLA−Gタンパク質は20ng/ml以上に維持されるものであってもよく、具体的には、20〜30ng/mlに維持されるものであってもよいが、これに制限されない。
また、本発明の一実施例で、前記幹細胞がHLA−G5を分泌することを確認し、細胞外部にHLA−Gタンパク質を分泌発現することを確認することができ、継代培養すればするほどHLA−G5タンパク質の量が増加することを確認して、前記幹細胞はHLA−G5タンパク質を常に分泌発現することが確認できた(図13)。
これは、前記幹細胞株は免疫寛容の特性を示すHLA−Gタンパク質を常に分泌発現するため、免疫寛容の特性が要求される細胞治療剤または新規細胞株の開発、免疫寛容の特性を有する細胞外小胞体の治療剤及び免疫抑制剤の開発などに有利に活用されうることを示唆する。
もう一つの様態は、前記HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞培養液の製造方法で製造された、HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液を提供する。
この時、前記「ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質」に関する説明は前述の通りである。
本発明の用語、「培養液」(culture media)は、インビトロ(in vitro)上で細胞の成長及び生存を支持できるような培地を意味し、細胞培養に適切な当分野で用いる通常の培地をすべて含む。
本発明の一具体例において、前記製造された幹細胞の培養液は幹細胞から細胞外部に分泌発現されたHLA−Gタンパク質及びHLA−Gタンパク質を含有する細胞外小胞体を含んでもよく、この時、前記HLA−Gタンパク質はHLA−G5タンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。
前記用語、「アポトーシス小体」は、直径1,000nm以上であり、細胞のアポトーシスが起こる時、細胞の核の断片または小器官などが細胞膜に付いている形態で起こる小胞体である。
また、前記用語、「エキソソーム(Exosome)」は、直径30〜150nm程度であり、細胞内で原形質膜と多胞性小体が結合されたエンドソームの形態が細胞膜との融合機序を介して細胞外部に分泌される小胞体である。
また、前記用語、「微細小胞体(Microvesicle)」は、直径50〜1,000nm程度であり、細胞の原形質膜の外側の方に直接分泌される小胞体である。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、免疫寛容の特性を示す前述したタンパク質を大量に含むため、前記培養液は自己免疫関連疾患の予防及び/または治療に有用に用いられてもよい。また、細胞、組織の機能復元、再生、治療などを目的で自家、他家の細胞、組織、臓器または細胞外小胞体などを移植する過程で発生する免疫拒絶反応を抑制するのに有利に用いられてもよい。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、プロテアソーム機能正常化の特性を示す前述したタンパク質を大量に含んでいるため、前記培養液はプロテアソーム機能異常関連疾患の予防及び/または治療に有用に用いられてもよい。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、オートファジー機能正常化の特性を示す前述したタンパク質を大量に含んでいるため、オートファジー機能異常関連疾患の予防及び/または治療に有用に用いられてもよい。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、マクロファージ捕食機能正常化の特性を示す前述したタンパク質を大量に含んでいるため、マクロファージ捕食機能異常関連疾患の予防及び/または治療に有用に用いられてもよい。また、前記マクロファージ捕食機能は活性酸素種/活性窒素種の除去にも関与するため、酸化的ストレス関連疾患の予防及び/または治療に有用に用いられてもよい。
従って、本発明によって製造された幹細胞培養液は、細胞内信号伝達恒常性維持の特性を示す前述したタンパク質を大量に含んでいるため、前記培養液は細胞内信号伝達恒常性維持機能の異常または細胞内の過度な信号伝達に関連された疾患の予防及び/または治療に有用に用いられてもよい。
これは、前記培養液は多様な生体機能を正常化させるタンパク質を大量に含んでいるため、このような機能異常によって発病される疾患の治療に有利に用いられることを示唆する。
この時、前記「培養液」に関する説明は前述の通りである。
本発明に係るHLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞培養液は、免疫寛容の特性を示すHLA−Gタンパク質だけではなく、その他の免疫寛容関連タンパク質、プロテアソーム機能正常化関連タンパク質、オートファジー機能正常化関連タンパク質、マクロファージ捕食機能正常化関連抗酸化タンパク質、細胞内信号伝達恒常性維持関連タンパク質などを高い含量で含んでおり、同時に多様な細胞外小胞体も含むため、抗老化、抗酸化などのような有利な生理活性を示すことができる。
具体的には、前記抗老化または抗酸化用組成物は、健康機能食品、化粧料、医薬部外品または飼料組成物であってもよい。
本発明の用語、「化粧料」は、人体を清潔、美化し魅力を重ね容貌を明るく変化させたり、皮膚、毛髪の健康を維持または増進するために人体に用いられる物品であって、人体に対する作用が軽微なものを意味する。皮膚の美白の助けになったり、皮膚のしわの改善に役に立ったり、肌をきれいに日焼けしたり、紫外線から肌を保護するのに役に立つ機能性化粧品の意味も含まれる。
本発明の用語、「医薬部外品」はヒトや動物の疾病を診断、治療、改善、軽減、処置または予防する目的で用いられる物品の中で、医薬品より作用が軽微な物品を意味する。例えば、薬事法に基づく医薬部外品は、医薬品の用途と用いられる物品を除くものであって、ヒト/動物の疾患治療や予防に用いる製品、人体に対する作用が軽微であったり直接作用しない製品などが含まれる。
本発明の用語、「飼料」は、動物が食べて、摂取し、消化するための、またはこれに適当な任意の天然または人工規定食、一食式などまたは前記一食式の成分を意味する。
これは、前記培養液を含む本発明の組成物は、優秀な抗老化、抗酸化などの効果を示すため、健康機能食品、化粧品、医薬部外品、飼料組成物などの形態で有利に活用できることを示唆する。
免疫寛容の特性が誘導された新規幹細胞株を製造するために、細胞の培養時にインビボと類似した環境を提供した。
具体的には、間葉系幹細胞から分泌されたタンパク質を用いてヒト線維芽細胞を培養し、前記ヒト線維芽細胞から細胞外基質(プロコラーゲン、フィブロネクチン、コラーゲン)を分泌させ直接製造して用いた。
培養完了後に、hPC濃度に伴うそれぞれの培養上澄み液に対してプロコラーゲン(コラーゲン前駆物質)、フィブロネクチン(細胞付着性糖タンパク質)、コラーゲン(線維性タンパク質)の含有量を既存に公知された方法に沿って測定し、その結果は下記の表1〜3に示した。
従って、前記方法で製造した細胞外基質を以後の細胞培養に用いた。
免疫寛容の特性が誘導された新規幹細胞株を製造するために、HLA−Gタンパク質を用いた。
HLA−Gタンパク質は、NK細胞から細胞を保護し、抹消血液内のT細胞による同種免疫反応を媒介しないなどの免疫寛容及び免疫調節機能をするタンパク質である。胎盤を形成する栄養膜細胞(Trophoblast)で主に発現され、着床初期に産婦の免疫体系から受精された胚芽を保護する免疫寛容を起こし、成功的な着床誘導及び正常的な妊娠を維持させる役割を果たす。
従って、本発明者は、人体内で最も高い水準でHLA−Gタンパク質を分泌発現する栄養膜細胞の免疫寛容の特性及び多様な信号伝達の特性に注目し、持続的にHLA−Gタンパク質を分泌発現できる栄養膜細胞を製造するため、その培養条件を確立し、確立された前記栄養膜細胞株と幹細胞を共培養することにより、免疫寛容の特性が誘導されて、より向上された信号伝達能力を有する新しい幹細胞株を確立した。
まず、継代培養を介して免疫寛容の特性を有するようにするHLA−Gタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞を製造した。
これは、基礎体温法を用いた。基礎体温は呼吸の他にすべての活動が止まった瞬間の体温を意味し、一般的に朝目覚めてすぐに測る体温である。基礎体温の変化測定を介して女性の排卵時期及び妊娠可否を分かることもあり、生理周期にしたがって基礎体温は低温期及び高温期が2週間隔で反復するが、特に最も低い温度(36.4℃)を示す排卵日以後の2週間高温期が維持され、生理が始まると再び体温が下がることになる。本発明者はこのような基礎体温の変化が排卵と受精、妊娠及び着床、そしてこのような一連の過程で重要な役割を果たす栄養膜細胞及び体内免疫体系の特性にも密接な関連があることに着目した。
従って、培養時、基礎体温法に基盤する温度プロファイリング、微細振動培養条件及び細胞外基質を用いる場合、HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞を製造しうることが分かった。
前記実施例2を介してHLA−Gを常に分泌発現することにより免疫寛容の特性を有する栄養膜細胞を製造し、これを免疫寛容の特性が誘導された幹細胞株の製造に用いた。
まず、実施例1で製造した細胞外基質でコーティングした6ウェルプレートに栄養膜細胞を培養した。この時、培地条件としては無血清DMEM Low培地を用い、これに表4のような総30種の混合植物抽出物及びhPCを1:1で混合した混合組成物(SigGrowTM、Stemmedicare Inc.、Korea)を全体培地に対して1.0〜10重量%で添加して用いた。
その後、前記のような継代培養時に回収されたヒト由来幹細胞からHLA−Gタンパク質が分泌発現されたかどうかを次のような方法で確認した。前記幹細胞をD−PBSで2〜3回洗濯した後に1,000rpmで5分間遠心分離し、すべての培地成分を除去した。新しいフラスコに無血清培地であるDMEM/F12を添加し、細胞密度を18,000〜22,000細胞/cm2で接種した後、37℃、5% CO2インキュベーターで培養して、120時間後に培養上澄み液を回収した。実施例2のような方法でそれぞれの培養上澄み液内に存在するHLA−G分子の濃度をHumanHLA−G ELISAキットを用いて定量した。
前記結果を介して、前記実施例2で製造されたHLA−G分子を常に分泌発現する栄養膜細胞と幹細胞を前記方法によって共培養する場合、HLA−Gタンパク質を常に分泌発現し、免疫寛容の特性が誘導された新規幹細胞株(以下、MBTC−CellTMと命名する)を製造できることが分かった。
前記実施例3を介して製造したHLA−Gタンパク質を常に分泌発現し免疫寛容の特性が誘導された新規幹細胞株MBTC−CellTM由来の細胞外小胞体及びタンパク質組成物、すなわち、培養液を製造した。
細胞外小胞体(Extracellular Vesicle)は、幹細胞を始めとするほとんどの動植物の細胞から細胞外部に分泌できる膜小胞体であって、大きさ及び分泌機序によってアポトーシス小体(Apoptotic Body)、微細小胞体(Microvesicle)及びエキソソーム(Exosome)などに区分される。細胞外小胞体は親細胞の特性によって多様なmiRNA及びmRNA、サイトカインなどを含有し、これを介して細胞間信号伝達及び代謝作用に重要な役割を果たすのと同時に、それ自体でも治療効果を有しているという研究結果が報告されてから、免疫拒絶反応という難題を解決できない細胞治療剤の代案として注目されている。しかし、未だに血液などに微量存在するエキソソームを用いた疾病の診断分野だけで制限的に活用されているなど、エキソソーム及び微細小胞体を用いた本格的な治療剤開発のための研究は実験室水準で制限された不備な実情である。また、臨床的に適用可能な水準の純度のエキソソームを分離するにはほぼ不可能であり、臨床的で活用可能な微細小胞体のみを分離できる方法は開発すらされてない状況である。また、治療目的で細胞外小胞体を適用する時にも親細胞の特性を保有している細胞外小胞体の膜に存在する多様な抗原表示因子による免疫拒絶反応が発生する可能性もあるため、これを解消するために本発明者は前記実施例3で製造した、新規幹細胞株から由来した培養液に含まれた細胞外小胞体の免疫寛容の特性を確認した。
この微生物及びウイルスなどの汚染有無を確認するために食品医薬品安全処の細胞治療剤の許可基準に適合する外来性ウイルス不定実験及び微生物残留検査(Adventitious Virus Test and Microbial Residual Test)を行った結果、前記MBTC−CellTM由来細胞外小胞体(MBTC-EVTM)及びタンパク質組成物に外来性ウイルス及び微生物が含まれないことを確認した。
また、図5で見られるように、前記MBTC−CellTM由来培養液を走査電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope(SEM)、Hitachi S-4800)で観察した結果、多様な大きさを有する微細小胞体及びエキソソームが共存することを確認した。
前記実施例4を介して製造したMBTC−CellTM由来培養液に含まれる成分をさらに詳しく確認するために、これに含まれたタンパク質に対して定量及び定性分析を行った。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液を用いた。
具体的には、対照群及び試験群に対してそれぞれBCA定量法を用いてタンパク質を定量し、100μgを取って凍結乾燥を行った後に質量分析を行った。質量分析を介して得られた結果は、ProteinLynx Global Server(PLGS) Ver. 3.0を用いてタンパク質同定及び絶対定量を行った。タンパク質同定はInternational Protein IndexのHuman Database(Ver. 3.87)を用いて行い、絶対定量は標準品BSA(SwissProt P2769)の質量値の情報に基づいて行った。
また、図7で見られるように、各由来のMBTC−CellTMの培養液に対する定性分析を行った結果、同一のタンパク質成分が約520種含まれていて、それ以外の600余種のタンパク質も互いに類似した種類であることを確認した。
前記結果を介して、MBTC−CellTM由来の培養液は、一般的な幹細胞培養液に比べて、これに含まれる総タンパク質の含量が著しく多く、幹細胞の由来が異なっ
ても互いに類似した種類のタンパク質を分泌することが分かった。
実施例6-1:免疫寛容関連タンパク質
前記実施例5で製造したMBTC−CellTM由来培養液(試験群)に含まれた総タンパク質の中で、まず免疫寛容と関連したタンパク質が含まれているかどうかを確認した。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液を用いた。
具体的には、前記対照群及び試験群に対してそれぞれBCA定量法を用いてタンパク質を定量し、100μgを取って凍結乾燥を行った後、質量分析を行った。
その結果、下記表5で見られるように、対照群に比べて試験群に約4倍〜8倍のより高い含量で免疫寛容と関連したタンパク質が含有されていることを確認した。
実施例6−2:プロテアソーム機能正常化関連タンパク質の分析
具体的には、対照群及び試験群に対して、前記実施例6−1に沿った方法でタンパク質の質量分析を行った。
その結果、下記表6で見られるように、対照群に比べて試験群に約3倍〜16倍のより高い含量でプロテアソーム機能正常化と関連されたタンパク質が含有されて、対照群には含有されないタンパク質も新しく発現されることを確認した。
前記実施例5で製造したMBTC−CellTM由来培養液(試験群)に含まれたタンパク質の中で、オートファジー機能正常化と関連されたタンパク質が含まれているかどうかを確認した。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液を用いた。
具体的には、対照群及び試験群に対して、前記実施例6−1に沿った方法でタンパク質の質量分析を行った。
その結果、下記表7で見られるように、対照群に比べて試験群に約4倍 〜27倍のより高い含量でオートファジー機能正常化と関連されたタンパク質が含有されていて、対照群には含有されないタンパク質も新しく発現されることを確認した。
前記実施例5で製造したMBTC−CellTM由来培養液(試験群)に含まれたタンパク質の中で、マクロファージ捕食機能正常化と関連されたタンパク質が含まれているかどうかを確認した。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液を用いた。
具体的には、対照群及び試験群に対して、前記実施例6−1に沿った方法で質量分析を行った。
その結果、下記表8で見られるように、対照群に比べて試験群に約7倍〜45倍のより高い含量でマクロファージ捕食機能正常化と関連されたタンパク質が含有されていて、対照群には含有されないタンパク質も新しく発現されることを確認した。
前記実施例5で製造したMBTC−CellTM由来培養液(試験群)に含まれているタンパク質の中で、細胞内の信号伝達恒常性維持に関連するタンパク質が含まれているかどうかを確認した。一方、対照群は前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養されたものの培養液を用いた。
具体的には、対照群及び試験群に対して、前記実施例6−1に沿った方法でタンパク質の質量分析を行った。
その結果、下記表9で見られるように、対照群に比べて試験群に約49倍のより高い含量で細胞内の信号伝達恒常性維持に関連されるタンパク質が含まれていて、対照群には含有されないタンパク質も新しく発現されることを確認した。
実施例7−1:抗老化効能の検証
前記実施例5で製造したMBTC−CellTM由来培養液には免疫寛容、プロテアソーム機能正常化、オートファジー機能正常化、マクロファージ捕食機能正常化及び細胞内信号伝達恒常性維持の効能を示すタンパク質などが著しく大量に含まれていることを確認し、これを介して抗老化などの生理効果を示すかどうかを確認した。
具体的には、対照群としては、0.9%食塩水;実験群1としては、前記ヒト由来間葉系幹細胞を単独で培養したものの培養液;実験群2としては、MBTC−CellTM由来培養液を用いた。各群当たり4匹のマウスを用い、マウス当たり試料を100μlずつ静脈投与した後3日間の体重、飲水量及び給餌量を測定し、3日後解部を介して肉眼検査及び血液検査により抗老化効能を確認した。
その結果、図8で見られるように、対照群及び試験群1、試験群2で試料投与による体重、飲水及び飼料摂取の有意な変化は観察されず、正常的な範囲内での増減が観察された。また、剖検の結果、前記対照群及び実験群の両方で異常症状は発見できなかった。
また、図9で見られるように、体表的な抗老化関連バイオマーカーである成長ホルモン(Growth Hormone)及びインスリン様成長因子1(Insulin-like Growth Factor 1: IGF−1)の発現程度を比較した結果、対照群及び実験群1に比べ実験群2で約20〜30%の著しい増加が確認できた。
前記結果を介して、MBTC−CellTM由来の培養液は優秀な抗老化効果を示すことが分かった。
また、前記MBTC−CellTM由来培養液の抗酸化効能を確認した。
具体的には、前記実施例7−1と同様の方法で、対照群、実験群1及び実験群2を設定し、これをマウスに投与した後に体表的な抗酸化関連バイオマーカーである血中内のGSH/GSSH比率を測定した。
その結果、図10で見られるように、血中内のGSH/GSSH(glutathione/glutathione disulfide)の比率は対照群及び実験群1に比べて実験群2で約10%の著しい増加が確認できた。
前記結果を介して、MBTC−CellTM由来の培養液は優秀な抗酸化効果を示すことが分かった。
また、前記MBTC−CellTM由来の培養液のマクロファージ捕食機能正常化効能を確認した。
具体的には、前記実施例7−1と同様の方法で、対照群、実験群1及び実験群2を設定し、これをマウスに投与した後に、体表的なマクロファージ捕食機能正常化関連バイオマーカーである血中内のLDLコレステロール及びHDLコレステロールの濃度を測定した。これは、 LDLコレステロール試薬(Bayer、USA)、ダイレクトHDLコレステロール試薬(Bayer、USA)を用いて、自動血液分析機(ADVIA 1650、Bayer、Japan)で測定した。
その結果、図11で見られるように、血中内LDLコレステロールの濃度は対照群及び実験群1に比べて実験群2でそれぞれ約2.88及び2.55mg/dLで著しく減少し、HDLコレステロールの濃度は対照群及び実験群1に比べて実験群2でそれぞれ約3.83及び3.1mg/dLの著しく増加したことが確認できた。
前記結果を介して、MBTC−CellTM由来の培養液は血中コレステロールを有利に調節するなどのマクロファージの捕食機能正常化効能があることが分かった。
本発明によって製造された栄養膜細胞の培養液に含有されたHLA−G5タンパク質の分泌特性を確認するために、前記実施例2と同様な方法によって栄養膜細胞を培養し、培養上澄み液に含まれているHLA−G5タンパク質をELISA分析方法によって分析した。また、栄養膜細胞の培養上澄み液は既存の方法で培養した細胞の培養液(対照群)と比較した。
この時、前記ELISA分析は細胞外に分泌発現されるHLA−G5タンパク質のみを選択的に検出できるように5A6G7抗体を用いたELISAキット(MBS267094、MyBiosource)を用い、その結果は図12に図示した。
その結果、図12で見られるように、通常的な培養方法で培養した栄養膜細胞の培養上澄み液に含有されたHLA−G5タンパク質の濃度は継代培養を進行すればするほど段々減少する反面、本願発明のヒト体内類似培養条件で培養した栄養膜細胞の培養上澄み液に含有されたHLA−G5タンパク質の濃度(試験群)は継代培養を 進行すればするほど段々増加することを確認することができた。
前記結果から本発明によって製造された栄養膜細胞の場合、栄養膜細胞の外部にHLA−G5タンパク質を分泌し、培養上澄み液には、継代培養をすればするほどタンパク質の量が増加することにより、HLA−G5タンパク質を常に分泌発現することが確認できた。
本発明のように、ヒト体内類似培養条件で培養された栄養膜細胞と共培養を介して免疫寛容の特性が誘導された幹細胞培養液に含有されたHLA−G5タンパク質の分泌特性を確認するために、前記実施例3と同様の方法によって間葉系幹細胞を培養し、培養上澄み液に含有されたHLA−G5タンパク質をELISA分析方法で分析した。この時、前記ELISA分析は細胞外部に分泌発現するELISAタンパク質のみ選択的に検出できるように5A6G7抗体を用いたELISAキット(MBS267094、MyBiosource)を用い、その結果は図13に図示した。
その結果、図13で見られるように、継代培養を進行すればするほど培養上澄み液に含有されたHLA−G5タンパク質の量が段々増加することが確認できた。
即ち、前記結果によって、本発明に従って製造された幹細胞から発現分泌された前記HLA−G5タンパク質は、細胞外部で分泌発現できる形態であってもよく、HLA−G5タンパク質を持続的に常に分泌発現できる特性を有することを確認できた。
Claims (37)
- ヒト体内類似培養条件下で栄養膜細胞を培養する段階であって、前記ヒト体内類似培養条件は36.3℃〜37.2℃の範囲内で変化される温度条件、10PRM〜30RPMの範囲内で変化される振動培養条件、及び細胞外基質を含有する細胞培養プレートを用いる条件である段階;及び
前記培養された栄養膜細胞を継代培養する段階を含む、HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞の製造方法。 - 前記温度条件が、基礎体温法に基づいた15日周期の温度変化条件である、請求項1に記載の栄養膜細胞の製造方法。
- 前記振動培養条件が、24時間周期の振動培養条件である、請求項1に記載の栄養膜細胞の製造方法。
- 前記細胞外基質が、コラーゲン、フィブロネクチン及びプロコラーゲンからなる群から選択される1つ以上である、請求項1に記載の栄養膜細胞の製造方法。
- 前記細胞外基質が、
(a)線維芽細胞を18,000〜22,000細胞/cm2の密度で接種する段階;
(b)前記線維芽細胞を無血清培地で培養する段階;及び
(c)培養して114〜126時間経過した後に、線維芽細胞の培養液を収得する段階を介して製造されるものであって、
前記無血清培地が、ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質を15〜25%(v/v)で含むものである、請求項1に記載の栄養膜細胞の製造方法。 - 前記ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質が、
(a)ヒト間葉系幹細胞を18,000〜22,000細胞/cm2の密度で接種する段階;
(b)前記幹細胞を無血清培地で培養する段階;及び
(c)培養して114〜126時間経過した後に、幹細胞の培養液を収得する段階を介して製造されるものである、請求項5に記載の栄養膜細胞の製造方法。 - 前記継代培養が、5継代〜15継代の間に継代培養されるものである、請求項1に記載の栄養膜細胞の製造方法。
- 前記HLA−Gタンパク質が、30ng/mL以上に維持されるものである、請求項1に記載の栄養膜細胞の製造方法。
- HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞及び幹細胞を共培養する段階;及び
前記培養された幹細胞を継代培養する段階を含む、
HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の製造方法。 - 前記HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する栄養膜細胞が、請求項1に記載の方法によって製造されたものである、請求項9に記載の幹細胞の製造方法。
- 前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項9に記載の幹細胞の製造方法。
- 前記間葉系幹細胞が、脂肪、臍帯血、羊水または羊膜由来である、請求項9に記載の幹細胞の製造方法。
- 前記継代培養が、10継代〜30継代の間に継代培養されるものである、請求項9に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
- 前記製造された間葉系幹細胞内のHLA−Gタンパク質が、培養上澄み液及び細胞外小胞体に存在するものである、請求項9に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
- 前記製造された間葉系幹細胞内のHLA−Gタンパク質が、20ng/mL以上に維持されるものである、請求項9に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
- 前記共培養が、ヒト間葉系幹細胞由来のタンパク質及び植物抽出物が1:0.5〜1:1.5の比率で混合された混合物を含む培地で行われるものである、請求項9に記載の幹細胞の製造方法。
- 前記植物抽出物が、ルイボス葉の抽出物、ニオイヒバ葉の抽出物、ティーツリー葉の抽出物、ローズマリー葉の抽出物、ツボクサの抽出物、サルビア葉の抽出物、タチジャコウソウの抽出物、レモンバームの抽出物、ヒソップの抽出物、オレガノ葉の抽出物、甘草の根の抽出物、オニノダケの根の抽出物、センキュウの根の抽出物、シャクヤクの根の抽出物、シソ葉の抽出物、ドクダミの抽出物、緑茶の抽出物、ブクリョウの抽出物、高麗人参の根の抽出物、クワの皮の抽出物、ライム抽出物、レモン抽出物、ブドウ抽出物、メロン抽出物、ブルーベリー抽出物、梅抽出物、コーヒー豆の抽出物、ムクロジの実の抽出物、オレンジ抽出物、パインアップル抽出物またはこれらの組み合わせである、請求項16に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
- 請求項9に記載の製造方法で製造された、HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞。
- 前記HLA−Gタンパク質が、HLA−G5を含むものである、請求項18に記載の幹細胞。
- 前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項18に記載の幹細胞。
- 前記間葉系幹細胞が、脂肪、臍帯血、羊水または羊膜由来である、請求項20に記載の幹細胞。
- 請求項9に記載の製造方法でHLA−Gタンパク質を常に分泌発現する間葉系幹細胞を製造する段階;及び
前記間葉系幹細胞の製造時の継代培養の際に収得された間葉系幹細胞を、
(a)18,000〜22,000細胞/cm2の密度で接種する段階;及び
(b)前記間葉系幹細胞を無血清培地で114〜126時間培養して培養上澄み液を収得する段階を含む、
HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する間葉系幹細胞の培養液の製造方法。 - 前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項22に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記HLA−Gタンパク質が、HLA−G5を含むものである、請求項22に記載の 間葉系幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記製造された幹細胞の培養液が、細胞外小胞体を含有するものである、請求項22に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記細胞外小胞体が、アポトーシス小体(Apoptotic Body)、微細小胞体(Microvesicle)及びエキソソーム(Exosome)からなる群から選択される1つ以上のものである、請求項25に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記製造された幹細胞の培養液が、総タンパク質の含量が増加されたものである、請求項25に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記タンパク質が、免疫寛容関連タンパク質、プロテアソーム機能正常化関連タンパク質、オートファジー機能正常化関連タンパク質、マクロファージ捕食機能正常化関連抗酸化タンパク質または細胞内信号伝達恒常性維持関連のタンパク質である、請求項27に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記免疫寛容関連タンパク質が、ファシン(Fascin)、ガレクチン−3(Galectin-3)、ガレクチン−3−結合タンパク質(Galectic-3-binding Protein)、ぺプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼB(Peptidylprolyl cis-trans isomerase B)、フォークヘッドボックスP3(Forkhead box P3)、インターロイキン−10(Interleukin-10)または形質転換成長因子β1(Transforming growth factor beta 1)である、請求項28に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記プロテアソーム機能正常化関連タンパク質が、26Sプロテアーゼ調節サブユニット8(26S protease regulatory subunit 8)、26Sプロテアソーム非ATPアーゼ調節サブユニット2(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2)、26Sプロテアソーム非ATPアーゼ調節サブユニット3、26Sプロテアソーム非ATPアーゼ調節サブユニット6、熱ショック70kDaタンパク質1L(Heat shock 70kDa protein 1L)、26Sプロテアーゼ調節サブユニットS10B、E3ユビキチン-タンパク質リガーゼBRE1B(E3 ubiquitin-protein ligase BRE1B)、熱ショック70kDaタンパク質6(Heat shock 70kDa protein 6)、熱ショック70kDaタンパク質90Bb(Heat shock 70kDa protein 90Bb)、熱ショックタンパク質β1(Heat shock 70kDa protein beta-1)、熱ショックタンパク質90β、熱ショック関連70kDaタンパク質2(Heat shock-related 70kDa protein 2)、熱ショック関連70kDaタンパク質8(Heat shock-related 70kDa protein 8)、26Sプロテアソーム非ATPアーゼ調節サブユニット1、プロテアソームサブユニットαタイプ1(Proteasome subunit alpha type-1)、プロテアソームサブユニットαタイプ2、プロテアソームサブユニットαタイプ5、プロテアソームサブユニットβタイプ4、プロテアソームサブユニットαタイプ6、プロテアソームサブユニットαタイプ7、プロテアソームサブユニットβタイプ5、プロテアソームサブユニットβタイプ8、プロテアソームサブユニットβタイプ1、プロテアソームサブユニットβタイプ2、プロテアソームサブユニットβタイプ3またはユビキチン様修飾活性化酵素1(Ubiquitin-like modifier Activating enzyme 1)である、請求項28に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記オートファジー機能正常化関連タンパク質が、 細胞死のBcl2関連アゴニスト(Bcl2-associated agonist of cell death)、NFκB必須調節子(NF-kappa-B essential modulator)、インスリン(Insulin)、プロ表皮成長因子(Pro-epidermal growth factor)、ソマトトロピン(Somatotropin)、形質転換成長因子β2(Transforming growth factor beta-2)、インターロイキン1β(Interleukin-1 beta)、リソソーム関連膜タンパク質2(Lysosomal associated membrane protein 2)、オートファジー関連タンパク質16−2(Autophagy-related protein 16-2)、オートファジー関連タンパク質9Aまたはマンノース−6リン酸(Mannose-6-phosphate)である、請求項28に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記マクロファージ捕食機能正常化関連抗酸化タンパク質が、グルタチオンS−トランスフェラーゼオメガ1(Glutathione S-transferase omega-1)、グルタチオンレダクターゼ(Glutathione reductase)、ペルオキシレドキシン−1(Peroxiredoxin-1)、ペルオキシレドキシン−2、ペルオキシレドキシン−4、ペルオキシレドキシン−6またはスーパーオキシドジスムターゼ(Superoxide dismutase)である、請求項28に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 前記細胞内信号伝達恒常性維持関連タンパク質が、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ(Phosphatase and tensin homolog)、SH2含有イノシトールホスファターゼ−1(SH2(Src homology 2)-containing inositol phosphatase-1)またはグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(Glycogen synthase kinase 3 beta)である、請求項28に記載の幹細胞の培養液の製造方法。
- 請求項22に記載の製造方法で製造された、HLA−Gタンパク質を常に分泌発現する幹細胞の培養液。
- 前記HLA−Gタンパク質が、HLA−G5を含むものである、請求項34に記載の幹細胞の培養液。
- 請求項34に記載の培養液を有効成分として含む、抗老化及び抗酸化用組成物。
- 前記抗老化または抗酸化用組成物が、健康機能食品、化粧料、医薬品、医薬部外品または飼料組成物である、請求項36に記載の組成物。
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