ES2535087T3 - Estructura tridimensional de tejido - Google Patents

Abstract

Una estructura tridimensional aplicable al corazón, que comprende una célula madre mesenquimatosa derivada de una parte distinta al miocardio de un adulto, donde la estructura tridimensional se puede obtener mediante un método que comprende las etapas de: a) cultivar la célula madre mesenquimatosa derivada de la parte distinta al miocardio de un adulto sobre un soporte de cultivo celular injertado con una macromolécula respondedora a la temperatura que tiene una temperatura de solución crítica límite superior o una temperatura de solución crítica límite inferior con el agua de 0 ºC a 80 ºC; b) fijar una temperatura media del cultivo a la temperatura de la solución del límite superior o más o a la temperatura de la solución del límite inferior o menos; y c) desprender la célula cultivada como una estructura tridimensional.

Description

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La Figura 30D muestra la comparación de los niveles de expresión de β-sarcoglicano (la implantación de la lámina de mioblastos potencia la expresión de β-sarcoglicano).

La Figure 31 muestra una tasa de supervivencia de hámsteres cardiomiopático en los que se ha implantado un 5 tejido protésico (lámina) que comprende mioblastos de la presente invención. La inyección de células como tales se compara con la administración de un tejido protésico.

La Figura 32 muestra las características eléctricas tras la implantación de un tejido protésico de la presente invención. La parte izquierda muestra un tejido protésico que comprende cardiomiocitos, mientras que la parte 10 derecha muestra un tejido protésico que comprende mioblastos.

La Figura 33A muestra una terapia para hámster con miocardiopatía dilatada usando un tejido protésico de la presente invención. La parte izquierda muestra la FE, mientras que la parte derecha muestra la tinción con HE. La parte inferior derecha muestra la tinción tricrómica de Masson.

15 La Figura 33B muestra un resultado de la ecocardiografía 48 semanas después de la implantación (la implantación de láminas de mioblastos mejora la función cardíaca de un corazón con miocardiopatía dilatada).

La Figura 33C muestra un resultado de la ecocardiografía (la contractilidad de un ventrículo izquierdo) 48 20 semanas después de la implantación (la implantación de láminas de mioblastos mejora la contractilidad del ventrículo izquierdo con miocardiopatía dilatada).

La Figure 34 muestra un ejemplo de una terapia para un modelo de infarto en cerdos usando un tejido protésico de la presente invención.

25 La Figure 35 muestra un efecto terapéutico (contractilidad) en un modelo de infarto en cerdos usando un tejido protésico de la presente invención.

La Figure 36 muestra un efecto terapéutico (expansibilidad) en un modelo de infarto en cerdos usando un tejido 30 protésico de la presente invención.

La Figura 37 muestra una lámina producida mediante un método de producción de tejido protésico sin ácido ascórbico.

35 La Figura 38 muestra una lámina producida mediante un método de producción de tejido protésico con ácido ascórbico de acuerdo con la presente invención.

La Figura 39 muestra una lámina producida mediante un método de producción de tejido protésico con ácido ascórbico de acuerdo con la presente invención (tinción con HE).

40 La Figura 40 muestra una técnica para medir las características de tensión y distorsión para determinar la resistencia a la tracción.

La Figura 41 muestra un método para obtener una carga/eliminación de una curva de carga.

45 La Figura 42 muestra un estado de un tejido obtenido cultivando células sinoviales en presencia de ácido ascórbico 2-fosfato.

(Descripción del listado de secuencias)

50 La SEC ID Nº 1 expone una secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de miosina IIa (humana: Nº de acceso NM_017534).

La SEC ID Nº 2 expone una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de miosina IIa (humana: Nº de 55 acceso NM_017534).

La SEC ID Nº 3 expone una secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de miosina IIb (humana: Nº de acceso NM_017533).

60 La SEC ID Nº 4 expone una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de miosina IIb (humana: Nº de acceso NM_017533).

La SEC ID Nº 5 expone una secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada de miosina IId (IIx) (humana: Nº de acceso NM_005963). 65

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La SEC ID Nº 6 expone una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de miosina IId (IIx) (humana: Nº de acceso NM_005963).

La SEC ID Nº 7 expone una secuencia de ácido nucleico de la CD56 (humana: Nº de acceso U63041). 5 La SEC ID Nº 8 expone una secuencia de aminoácidos de la CD56 (humana: Nº de acceso U63041).

La SEC ID Nº 9 expone una secuencia de ácido nucleico de MyoD humana (nº de acceso en GENBANK X56677).

La SEC ID Nº 10 expone una secuencia de polipéptidos codificada por la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº 2.

La SEC ID Nº 11 expone una secuencia de ácido nucleico del factor 5 miogénico humano (nº de acceso en 15 GENBANK NM_005593).

. La SEC ID Nº 12 expone una secuencia de polipéptidos codificada por la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº 3.

La SEC ID Nº 13 expone una secuencia de ácido nucleico de la miogenina humana (factor biogénico 4) (nº de acceso en GENBANK BT007233).

La SEC ID Nº 14 expone una secuencia de polipéptidos codificada por la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº 5.

25 La SEC ID Nº 15 expone un cebador directo en la RT-PCR para SRY.

La SEC ID Nº 16 expone un cebador inverso en la RT-PCR para SRY.

La SEC ID Nº 17 expone una sonda en la RT-PCR para SRY.

La SEC ID Nº 18 expone un cebador directo en la RT-PCR para IL2.

La SEC ID Nº 19 expone un cebador inverso en la RT-PCR para IL3.

35 La SEC ID Nº 20 expone una sonda en la RT-PCR para IL2.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se describirá a continuación. Debe entenderse a lo largo de la presente memoria descriptiva que los artículos para las formas en singular incluyen el concepto de su pluralidad a menos que se mencione lo contrario. Por tanto, los artículos o adjetivos par alas formas en singular (por ejemplo, “un/uno”, “una”, “el/la” y similares) incluyen el concepto de su pluralidad a menos que se especifique lo contrario. Asimismo, debe entenderse que los términos como se usan en el presente documento tienen las definiciones usadas habitualmente en la técnica

45 a menos que se mencione lo contrario. Por tanto, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entienden habitualmente los expertos en la técnica relevante. Por el contrario, la presente solicitud (incluyendo las definiciones) tiene prioridad.

(Definición de los términos)

Las definiciones de los términos específicos usados en el presente documento se describen más adelante.

(Medicina regeneradora)

55 Como se usa en el presente documento, el término “regeneración” hace referencia a un fenómeno donde cuando un organismo individual pierde una parte de tejido, el tejido restante crece y se recupera. La extensión o modo de regeneración varía en función de la especie animal o entre los tejidos en el mismo individuo. La mayoría de los tejidos humanos tienen una capacidad de regeneración limitada y, por tanto, no se espera que se produzca la regeneración completa si se pierde una gran parte de tejido. En el caso de daños graves, puede crecer un tejido que tiene una fuerte capacidad de proliferación diferente de la del tejido perdido, lo que tiene como resultad una regeneración incompleta cuando el tejido dañado se regenera de forma incompleta y la función del tejido no se puede recuperar. En este caso, se usa una estructura hecha de un material bioabsorbible para prevenir que un tejido que tenga una fuerte capacidad de proliferación infiltre la parte defectuosa del tejido para asegurar un espacio para la proliferación del tejido dañado. Además, suplementando con un factor de crecimiento celular, se potencia la

65 capacidad de regeneración del tejido dañado. Dicha técnica de regeneración se aplica a cartílagos, huesos y nervios periféricos, por ejemplo. Hasta ahora se ha creído que las células nerviosas y los músculos cardíacos tienen nula o

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mala capacidad de regeneración. Recientemente se ha notificado que existen células madre de tejido (células madre somáticas), que tienen ambas la capacidad de diferenciarse en estos tejidos y capacidad de autoproliferación. Las expectativas son muy altas para la medicina regenerativa usando células madre de tejido. Las células madre embrionarias (células ME) son células que tienen la capacidad de diferenciarse en todos los tejidos. Se han

5 efectuado esfuerzos para usar células ME para la regeneración de órganos complicados, tales como de riñón, de hígado y similares, pero todavía no se han realizado.

El término “célula” se usa en el presente documento en su sentido más amplio en la técnica, haciendo referencia a una unidad estructural de tejido de un organismo multicelular, que es capaz de autorreplicarse, tiene información genética y un mecanismo para expresarla y está rodeada por una estructura de membrana que aísla el cuerpo vivo del exterior. En el método de la presente invención se puede usar cualquier célula como sujeto. El número de células usadas en la presente invención se puede contar mediante un microscopio óptico. Al contra usando un microscopio óptico se cuenta el número de núcleos. Los tejidos se laminan en secciones de tejido que después se tiñen con hematoxilina-eosina (HE) para variegar los núcleos derivados de matrices extracelulares (por ejemplo, elastina o

15 colágeno) y células. Estas secciones de tejido se observan bajo un microscopio óptico y se puede estimar que el número de núcleos en un área concreta (por ejemplo, 200 µm × 200 µm) es el número de células. Las células usadas en el presente documento pueden ser células de origen natural o células modificadas artificialmente (por ejemplo, células de fusión, células modificadas genéticamente etc.). Ejemplos de fuentes de células incluyen, entre otros, un cultivo de una sola célula, o tejido corporal de un animal transgénico que ha crecido normalmente; una mezcla de células derivadas de líneas celulares cultivadas normalmente, y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión “célula madre” hace referencia a una célula capaz de autorreplicarse y pluripotencia. El término “célula madre” excluirá las células madre embrionarias humanas. Las células madre tisulares tienen un nivel relativamente limitado de diferenciación, al contrario que las células madre

25 embrionarias. Las células madre tisulares están presentes en los tejidos y tienen una estructura intracelular indiferenciada. Las células madre tisulares tienen una proparte núcleo/citoplasma más alta y tienen menos orgánulos intracelulares. La mayoría de las células madre tisulares tienen pluripotencia, un ciclo celular largo y capacidad de proliferación más allá de la vida del individuo. Como se usa en el presente documento, las células madre tisulares también se pueden usar dependiendo de la circunstancia.

Las células madre tisulares se clasifican en categorías de sitios de los que derivan las células, tales como el sistema dérmico, el sistema digestivo, el sistema de la médula ósea, el sistema nervioso y similares. Las células madre tisulares en el sistema dérmico incluyen células madre epidérmicas, células madre del folículo piloso y similares. Las células madre tisulares en el sistema digestivo incluyen células madre pancreáticas (habituales), células madre

35 hepáticas y similares. Las células madre tisulares en el sistema de la médula ósea incluyen células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimatosas y similares. Las células madre tisulares en el sistema nervioso incluyen células madre neurales, células madre retinianas y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión “célula somática” hace referencia a cualquier célula que no sea una célula germinal, tal como un huevo, un espermatozoide o similares, que no transfiere su ADN a la siguiente generación. Normalmente, las células somáticas tienen nula o limitada pluripotencia. Las células somáticas usadas en el presente documento pueden ser de origen natural o estar modificadas genéticamente siempre que puedan alcanzar el tratamiento indicado.

45 El origen de una célula madre se clasifica en el ectodermo, endodermo o mesodermo. Las células madre de origen ectodérmico están principalmente presentes en el cerebro, incluidas las células madre neurales. Las células madre de origen endodérmico están principalmente presentes en la médula ósea, incluidas las células madre de los vasos sanguíneos, las células madre hematopoyéticas, las células madre mesenquimatosas y similares. Las células madre de origen mesodérmico están principalmente presentes en los órganos, incluyendo las células madre hepáticas, las células madre pancreáticas, y similares. Como se usa en el presente documento, las células somáticas pueden derivar de cualquier mesénquima. Preferentemente, se pueden usar las células somáticas derivadas del mesénquima.

Las células para usar en la construcción de un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención 55 incluyen células madre mesenquimatosas.

Como se usa en el presente documento, la expresión “célula madre mesenquimatosa” hace referencia a una célula madre hallada en el mesénquima. La expresión “célula madre mesenquimatosa” puede abreviarse en el presente documento a “CMM”. Mesénquima hace referencia a una población de células libres que están en forma asteroide o tienen proyecciones irregulares y unen huecos entre los tejidos epiteliales y que son reconocidas en cada etapa de desarrollo de animales multicelulares. El mesenquimal también se refiere al tejido formado con cemento intracelular asociado con las células. Las células madre mesenquimatosas tienen capacidad de proliferación y la capacidad para diferenciarse en células óseas, células de cartílago, células musculares, células estromales, células de tendones y células grasas. Las células madre mesenquimatosas se usan con el fin de cultivar o hacer crecer células de la 65 médula ósea o similares extraídas de pacientes o diferenciarlas en células de cartílago u osteoblastos. Las células madre mesenquimatosas también se usan como material de reconstrucción, tales como huesos alveolares, huesos,

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ejemplo, resistencia a la tracción) es al menos aproximadamente un 50 % de la resistencia natural de una parte dirigida por la implantación, preferentemente al menos aproximadamente un 60 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 70 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente un 80 % y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 100 %. La resistencia se puede medir midiendo las características

5 de resistencia o de distorsión o realizando una prueba de indentación de las características de deslizamiento como se describe más adelante.

El tamaño suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida por la implantación, pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. No obstante, un tejido protésico implantable tiene, preferentemente, al menos un nivel determinado tamaño. Dicho tamaño (por ejemplo, área) es al menos 1 cm2, preferentemente al menos 2 cm2, más preferentemente al menos 3 cm2, incluso más preferentemente al menos 4 cm2, al menos 5 cm2, al menos 6 cm2, al menos 7 cm2, al menos 8 cm2, al menos 9 cm2, al menos 10 cm2, al menos 15 cm2, o al menos 20 cm2.

15 La no porosidad suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida por la implantación, pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. Como se usa en el presente documento, el término “no porosidad” hace referencia a un estado que carece de poro(s). En el presente documento, el poro se refiere a un agujero que tiene un tamaño sustancial de un modo tal que el fluido corporal o su equivalente (por ejemplo, una solución acuosa etc.) se fuga de un tejido protésico. Por tanto, la no porosidad se puede determinar del siguiente modo. Un tejido protésico se coloca horizontalmente. El fluido corporal o su equivalente se coloca sobre el tejido. Se observa si el fluido corporal o su equivalente se sale o no del tejido. Si no hay fuga, se considera que el tejido tiene no porosidad.

El espesor suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida por la implantación,

25 pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. No obstante, un tejido protésico implantable tiene, preferentemente, al menos un nivel determinado espesor. Dicho espesor normalmente es de aproximadamente al menos 50 µm, preferentemente al menos aproximadamente 100 µm, más preferentemente aproximadamente 150 µm, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 200 µm, al menos aproximadamente 300 µm, al menos aproximadamente 400 µm, al menos aproximadamente 500 µm, al menos aproximadamente 600 µm, al menos aproximadamente 700 µm, al menos aproximadamente 800 µm, al menos aproximadamente 900 µm, al menos aproximadamente 1 mm. Cuando un tejido protésico implantable se implanta en el corazón, el tejido puede tener solo estos espesores mínimos. Cuando se usa tejido protésico implantable en otras aplicaciones, el tejido puede tener, preferentemente, un espesor mayor. En este caso, por ejemplo, el tejido protésico implantable tiene, preferentemente, un espesor de al menos 2 mm, más preferentemente de al menos 3

35 mm e incluso más preferentemente de 5 mm.

La biocompatibilidad suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida por la implantación, pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. No obstante, un tejido protésico implantable tiene, preferentemente, al menos un nivel determinado de biocompatibilidad. Normalmente, un nivel deseado de biocompatibilidad es, por ejemplo, tal que se alcanza la conexión biológica con los tejidos circundantes sin ninguna inflamación, ninguna reacción inmunitaria o similar. La presente invención no está limitada a esto. En algunos casos (por ejemplo, córneas etc.), es menos probable que se produzca una reacción inmunológica. Por tanto, un tejido protésico implantable tiene biocompatibilidad en cierta medida, que alcanza el objeto de la presente invención incluso cuando es probable que se produzca una reacción inmunológica en otros 45 órganos. Ejemplos de parámetros que indican biocompatibilidad incluyen, entre otros, la presencia o ausencia de una matriz extracelular, la presencia o ausencia de una reacción inmunológica, el grado de inflamación y similares. Dicha biocompatibilidad se puede determinar investigando la compatibilidad de un tejido protésico en un lugar de implantación tras la implantación (por ejemplo, confirmando que no se destruye un tejido protésico implantado). Véase "Hito Ishoku Zoki Kyozetsu Hanno no Byori Soshiki Shindan Kijyun Kanbetsu Shindan to Seiken Hyohon no Toriatsukai (Zufu) Jinzo Ishoku, Kanzo Ishoku Oyobi Shinzo Ishoku [Pathological Tissue Diagnosis Criterion for Human Transplanted Organ Rejection Reaction Handling of Differential Diagnosis and Biopsy Specimen (Illustrated Book) Kidney Transplantation, Liver Transplantation and Heart Transplantation]" The Japan Society for Transplantation and The Japanese Society for Pathology editores, Kanehara Shuppan Kabushiki Kaisha (1998). De acuerdo con este documento, la biocompatibilidad se divide en de grado 0, 1A, 1B, 2, 3A, 3B y 4. En el grado 0 (sin 55 rechazo agudo), en las muestras de biopsia no se encuentran reacciones de rechazo agudo, fallo de los cardiomiocitos o similares. En el Grado 1A (rechazo agudo leve focal), existe infiltración focal de linfocitos grandes alrededor de los vasos sanguíneos o en el tejido intersticial, mientras que no hay daños en los cardiomiocitos. Esta observación se obtiene en una o una pluralidad de muestras de biopsia. En el Grado 1B (rechazo agudo leve difuso), existe infiltración difusa de linfocitos grandes alrededor de los vasos sanguíneos o en el tejido intersticial, o en ambos, mientras que no hay daños en los cardiomiocitos. En el Grado 2 (rechazo agudo moderado focal), se observa un único foco de infiltración de células inflamatorias que claramente bordean las porciones circundantes. Las células de inflamación son linfocitos grandes activados y pueden incluir eosinófilos. En las lesiones se observan daños en los cardiomiocitos asociados con la modificación de músculo cardíaco. En el Grado 3A (rechazo agudo moderado multifocal) existen múltiples focos de infiltración de células inflamatorias que son linfocitos grandes 65 activados y pueden incluir eosinófilos. Do o más de los múltiples focos de infiltración inflamatoria de células inflamatorias tienen daños en los cardiomiocitos. En algunos casos, también hay una infiltración irregular de células

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inflamatorias en el endocardio. Los focos de infiltración se observan en una o una pluralidad de muestras de biopsia. En el Grado 3B (rechazo agudo grave límite y multifocal), existen más focos de infiltración confluente y difusa de células inflamatorias que se encuentran en más muestras de biopsia que los observados en el Grado 3A. Existe infiltración de células inflamatorias, incluyendo linfocitos grandes y eosinófilos, en algunos casos neutrófilos, así

5 como daños en los cardiomiocitos. No existe hemorragia. En el grado 4 (rechazo agudo grave), existe infiltración de varias células inflamatorias, incluyendo linfocitos activados, eosinófilos y neutrófilos. Siempre se producen daños a los cardiomiocitos y necrosis de cardiomiocitos. Normalmente también se observa edema, hemorragia y/o angeítis. Normalmente se observa infiltración de células inflamatorias en el endocardio, diferente del efecto de "acolchamiento". Cuando se administra una fuerte terapia usando un inmunosupresor durante un periodo de tiempo considerablemente largo, el edema y la hemorragia pueden ser más significativos que la infiltración.

La afinidad suficiente de un tejido protésico implantable varía en función de una parte dirigida mediante implantación, pero los expertos en la técnica pueden determinarla según sea adecuado. Ejemplos de parámetros para la afinidad incluyen, entre otros, capacidad de realizar conexión biológica entre un tejido protésico implantado y su lugar de

15 implantación, y similares. Dicha afinidad se puede determinar en base a la presencia de conexión biológica en un lugar de implantación tras la implantación. La afinidad preferible es tal en el presente documento que un tejido protésico implantado tenga la misma función que la de un lugar donde se implanta el tejido, por ejemplo.

Como se usa en el presente documento, la expresión “tejido membranoso” hace referencia a un tejido en forma de membrana y también se denomina “tejido planar”. Ejemplos de tejido membranoso incluyen una parte de tejido que tiene una determinada zona de un órgano (por ejemplo, pericardio, duramadre, córnea etc.) o tejido en forma de bolsa y similares.

Como se usa en el presente documento, el término “órgano” hace referencia a una estructura que es una parte

25 específica de un organismo individual donde una determinada función del organismo individual se realiza localmente y que es morfológicamente independiente. En general, en organismos multicelulares (por ejemplo, animales y plantas), los órganos están hechos de varios tejidos en una disposición espacial específica y el tejido está hecho de una serie de células. Ejemplos de dichos órganos incluyen, entre otros, piel, vaso sanguíneo, córnea, riñón, corazón, hígado, cordón umbilical, intestino, nervio, pulmón, placenta, páncreas, cerebro, articulación, hueso, cartílago, extremidades periféricas, retina y similares. Ejemplos de dichos órganos incluyen, entre otros, órganos del sistema de la piel, el sistema pancreático parenquimatoso, el sistema ductal pancreático, el sistema hepático, el sistema sanguíneo, el sistema del miocardio, el sistema muscular esquelético, el sistema de los osteoblastos, el sistema de mioblastos esqueléticos, el sistema nervioso, el sistema endotelial de los vasos sanguíneos, el sistema pigmentario, el sistema de músculo liso, el sistema graso, el sistema óseo, el sistema de cartílago y similares.

35 Como se usa en el presente documento, la expresión “órgano en forma de bolsa” hace referencia a un órgano que tiene una expansión tridimensional y cuyo interior puede estar conectado a través de un tejido tubular con el exterior. Ejemplos de órganos con forma de bolsa incluyen, entre otros, corazón, hígado, riñón, estómago, bazo y similares.

En una realización, la presente invención está dirigida a órganos relacionados con el sistema vascular y, preferentemente, a órganos isquémicos (por ejemplo, corazón que tiene infarto de miocardio, corazón que tiene isquemia etc.). En una realización preferida, la presente invención está dirigida a vasos sanguíneos, tejido de tipo vaso sanguíneo, válvulas cardiacas, pericardio, duramadre, córnea y huesos. En otra realización preferida, la presente invención está dirigida al corazón, las válvulas cardíacas, el pericardio y los vasos sanguíneos.

45 Como se usa en el presente documento, el término “envuelve” en relación con un tejido protésico, una estructura tridimensional o similares que envuelve una parte determinada (por ejemplo, un lugar dañado, etc.) significa que el tejido protésico o similar está dispuesto de un modo tal que cubre la parte (es decir, oculta una lesión o similar). Los términos “envuelve(n)” y “dispone(n) (o localiza(n)) de modo que cubre(n)” se usan de forma intercambiable. Observando la relación especial entre la parte y el tejido protésico o similar se puede determinar si la parte está o no cubierta por el tejido protésico o similar. En una realización preferida, en una etapa de envoltura, un tejido protésico

o similar puede envolver con un giro un determinado sitio.

Un “tiempo suficiente requerido para que un tejido protésico se una biológicamente a una parte” en el presente

55 documento varía en función de una combinación de la parte y el tejido protésico, pero los expertos en la técnica pueden determinarlo según se adecuado en base a la combinación. Ejemplos de dicho tiempo incluyen, entre otros, 2 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año y similares, tras la operación. En la presente invención, un tejido protésico comprende, preferentemente, sustancialmente solo células y materiales derivados de las células y, por tanto, no existe material concreto que necesite extraerse después de la operación. Por tanto, el límite inferior del tiempo suficiente no es particularmente importante. Por tanto, en este caso, es más preferible un tiempo más prolongado. Si el tiempo es sustancialmente extremadamente largo, el refuerzo se completa sustancialmente.

Como se usa en el presente documento, la expresión “reacción inmunológica” hace referencia a una reacción debido

65 a la disfunción de la tolerancia inmunológica entre un injerto y un huésped. Ejemplos de reacciones inmunológicas incluyen, entre otros, una reacción de rechazo hiperagudo (en varios minutos desde la implantación) (reacción

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inmunológica causada por anticuerpos, tal como β-Gal o similar), una reacción de rechazo agudo (reacción causada por la inmunidad celular aproximadamente de 7 a 21 días después de la implantación), una reacción de rechazo crónico (reacción de rechazo causada por la inmunidad celular 3 o más meses después de la operación) y similares.

5 Como se usa en el presente documento, la provocación de una reacción inmunológica se puede confirmar mediante análisis patológico e histológico del tipo, el número o similar de la infiltración de células (inmunológicas) en tejido implantado usando tinción (por ejemplo, tinción con HE etc.), tinción inmunológica o inspección microscópica de secciones tisulares.

Como se usa en el presente documento, el término “calcificación” hace referencia a la precipitación de sustancias calcáreas en organismos.

Como se usa en el presente documento, la “calcificación” in vivo se puede determinar midiendo la concentración de calcio. Específicamente, se extrae el tejido implantado; la sección tisular se disuelve mediante tratamiento ácido o

15 similar y la absorción atómica de la solución se mide mediante un dispositivo de cuantificación de oligoelementos.

Como se usa en el presente documento, la expresión “dentro del o los organismos” o "in vivo" hace referencia a la parte interna del o los organismos. En un contexto específico, “dentro del o los organismos” hace referencia a una posición en la cual se coloca un tejido u órgano sujeto.

Como se usa en el presente documento, "in vitro" indica que una parte de un organismo se extrae o libera fuera del organismo para varios fines de investigación (por ejemplo, en un tubo de ensayo). El término in vitro contrasta con el término in vivo.

25 Como se usa en el presente documento, el término "ex vivo" hace referencia a una serie de operaciones en las que las células diana en las que se va a introducir un gen se extraen de un sujeto, se introduce un gen terapéutico in vitro en las células y las células se devuelven al mismo sujeto.

Como se usa en el presente documento, la expresión “material derivado de célula(s)” hace referencia a cualquier material procedente de la(s) célula(s), incluyendo, entre otros, materiales que constituyen la(s) célula(s), materiales secretados por la(s) célula(s), materiales metabolizados por la(s) célula(s) o similares. Ejemplos representativos de materiales derivados de las células incluyen, entre otros, matrices extracelulares, hormonas, citocinas y similares. Los materiales derivados de las células normalmente no tienen sustancialmente efectos adversos sobre las células y sus huéspedes. Por tanto, cuando el material está contenido en un tejido protésico, una estructura tridimensional o

35 similar, el material normalmente carece sustancialmente de efectos adversos sobre el tejido protésico, la estructura tridimensional o similar.

Como se usa en el presente documento, la expresión “matriz extracelular” (MEC) hace referencia a una sustancia que existe entre las células somáticas con independencia de si las células son células epiteliales o células no epiteliales. Las matrices extracelulares normalmente son producidas por las células y, por tanto, son materiales biológicos. Las matrices extracelulares están implicadas en el soporte de tejido, así como en la estructura ambiental interna esencial para la supervivencia de todas las células somáticas. Las matrices extracelulares generalmente son producidas por las células del tejido conjuntivo. Algunas matrices extracelulares se secretan de las células que poseen membrana basal, tales como células epiteliales o células endoteliales. Las matrices extracelulares se dividen 45 aproximadamente en componentes fibrosos y matrices que los llenan. Los componentes fibrosos incluyen fibras de colágeno y fibras elásticas. Un componente básico de las matrices es el glucosaminoglucano (mucopolisacárido ácido), la mayor parte del cual está unido a proteínas no colagenosas para formar un polímero de un proteoglicano (complejo mucopolisacárido ácido-proteína). Además, las matrices incluyen glucoproteínas, tales como laminina de la membrana basal, microfibrillas alrededor de las fibras elásticas, fibronectinas sobre las superficies celulares y similares. Tejido particularmente diferenciado tiene la misma estructura básica. Por ejemplo, en el cartílago hialino, los condroblastos producen característicamente una gran cantidad de matrices cartilaginosas, incluyendo proteoglicanos. En los huesos, los osteoblastos producen matrices óseas que producen calcificación. En una realización de la presente invención, el tejido protésico, la estructura tridimensional o similar de la presente invención pueden ser ventajosamente similares a la composición de una matriz extracelular (por ejemplo, elastina, colágeno 55 (por ejemplo de tipo I, de tipo IV etc.), laminina etc.) de un sitio de un órgano para el que se pretende la implantación. En la presente invención, las matrices extracelulares incluyen moléculas de adhesión celular. Como se usa en el presente documento, las expresiones “molécula de adhesión celular” y “molécula de adhesión” se usan de forma intercambiable, en referencia a una molécula capaz de mediar la unión de dos o más células (adhesión celular) o adhesión entre un sustrato y una célula. En general, las moléculas de adhesión celular se dividen en dos grupos: Moléculas implicadas en la adhesión célula-célula (adhesión intercelular) (moléculas de adhesión célulacélula) y moléculas implicadas en la adhesión célula-matriz extracelular (adhesión célula-sustrato) (moléculas de adhesión célula-sustrato). Un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención normalmente comprende dicha molécula de adhesión celular. Por tanto, las moléculas de adhesión celular en el presente documento incluyen una proteína de un sustrato y una proteína de una célula (por ejemplo, integrina etc.) en una

65 adhesión célula-sustrato. Una molécula distinta a las proteínas entra dentro del concepto de molécula de adhesión celular siempre que pueda participar en la adhesión celular.

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sustancias celulares fisiológicamente activas son normalmente proteínas. En la presente invención, una sustancia fisiológicamente activa puede usarse, por ejemplo, para estimular la afinidad de un tejido protésico implantado de la presente invención.

5 El término “citocina” se usa en el presente documento en el sentido más amplio en la técnica y hace referencia a una sustancia fisiológicamente activa que se produce en una célula y actúa en la misma célula o en una diferente. Generalmente, las citocinas son proteínas o polipéptidos que tienen una función de controlar una respuesta inmunológica, regular el sistema endocrino, regular el sistema nervioso, actuar contra un tumor, actuar contra un virus, regular el crecimiento celular, regular la diferenciación celular o similares. En el presente documento, las citocinas están en forma de una proteína o un ácido nucleico o en otras formas. En la práctica real, las citocinas normalmente son proteínas.

Las expresiones “factor de crecimiento” o “factor de crecimiento celular” se usan en el presente documento de forma intercambiable y cada una hace referencia a una sustancia que estimula o controla el crecimiento celular. Los

15 factores de crecimiento también se denominan “factores de proliferación” o “factores de desarrollo”. Los factores de crecimiento pueden añadirse al medio de cultivo celular o tisular sustituyendo por macromoléculas séricas. Se ha revelado que una serie de factores de crecimiento tienen una función de controlar la diferenciación además de una función de estimular el crecimiento celular.

Ejemplos de citocinas incluyen de forma representativa, entre otros, interleucinas, quimiocinas, factores hematopoyéticos tales como factores estimulantes de las colonias, un factor de necrosis tumoral, interferones, un factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un factor de crecimiento endotelial (VEGF), cardiotrofina y similares, que tienen actividad de proliferación.

25 Las sustancias celulares fisiológicamente activas, tales como citocinas, factores de crecimiento y similares normalmente tienen redundancia de su función. De acuerdo con lo anterior, la referencia en el presente documento a una citocina o factor de crecimiento concreto mediante un nombre o función también incluye cualquier otro nombre o función por el cual lo conocen los expertos en la técnica, siempre que el factor tenga la actividad de una sustancia celular fisiológicamente activa para su uso en la presente invención. Las citocinas o factores de crecimiento se pueden usar en un agente terapéutico o farmacéutico de acuerdo con una realización preferida de la presente invención, siempre que tengan actividad preferible como se describe en el presente documento.

Por tanto, en una realización de la presente invención se reveló que cuando dicha citocina o factor de crecimiento

35 (por ejemplo, HGF) se proporciona a un lugar de implantación (por ejemplo, un lugar de implantación del miocardio etc.) junto con un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención, se observan la afinidad del tejido protésico o estructura tridimensional y una mejora de la función del lugar de implantación. Por tanto, la presente invención también proporciona dicha terapia combinada.

Como se usa en el presente documento, el término “diferenciación” hace referencia a un proceso de desarrollo del estado de las partes compuestas de organismos, tales como células, tejidos u órganos, y un proceso en el cual se forma un tejido u órgano característico. El término “diferenciación” se usa principalmente en embriología, biología del desarrollo y similares. En los organismos se forman varios tejidos y órganos a partir de divisiones de un huevo fertilizado (una única célula) hasta un adulto. En estadios tempranos del desarrollo (es decir, antes de la división

45 celular o después de una división celular insuficiente), cada célula o grupo celular no tiene una característica morfológica o funcional y no es muy distinguible. Dicho estado se denomina “indiferenciado”. La “diferenciación” se puede producir a nivel de órganos. Una célula que constituye un organo se puede desarrollar en varias células o grupos de células que tienen diferentes características. Este fenómeno también se denomina diferenciación en un órgano en la formación del órgano. Por tanto, un tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención puede comprender un tejido que incluye células diferenciadas.

Como se usa en el presente documento, los términos “implante”, “injerto” e “injerto tisular” se usan de forma intercambiable en relación con tejido homólogo o heterólogo o un grupo celular o un material artificial, que se inserta en un sitio concreto de un cuerpo y, después, forma una parte del cuerpo. Por tanto, un tejido protésico o estructura

55 tridimensional de la presente invención se puede usar como implante. Entre los ejemplos de injertos convencionales se incluyen órganos o partes de órganos, vasos sanguíneos, tejido de tipo vaso sanguíneo, corazón, válvulas cardíacas, pericardio y similares. Por tanto, los injertos abarcan uno cualquier de estos que se inserta en una parte deficiente para compensar la deficiencia. Los injertos incluyen, entre otros, autoinjertos, aloinjertos y xenoinjertos, que dependen del tipo de su donante.

Como se usa en el presente documento, el término “autoinjerto” (un tejido, una célula, un órgano etc.) hace referencia a un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) que se implanta en el mismo individuo del que deriva el injerto. Como se usa en el presente documento, el término “autoinjerto” (un tejido, una célula, un órgano etc.) puede abarcar un injerto de un individuo genéticamente idéntico (por ejemplo, un gemelo idéntico) en un sentido amplio. 65 Como se usa en el presente documento, los términos “autólogo” y “derivado de un sujeto" se usan de forma intercambiable. Por tanto, la expresión “no derivado de un sujeto” en relación con un injerto indica que el injerto no

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es antólogo (es decir, heterólogo).

Como se usa en el presente documento, el término “aloinjerto” (un tejido, una célula, un órgano etc.) hace referencia a un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) que se implanta en un individuo que es de la misma especie pero

5 es genéticamente diferente del que deriva el injerto. Dado que un aloinjerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) es genéticamente diferente de un individuo (receptor) donde se implanta el injerto, el injerto puede provocar una reacción inmunológica. Dicho injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) incluye, entre otros, por ejemplo, un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) derivado de un padre.

Como se usa en el presente documento, el término “xenoinjerto” (un tejido, una célula, un órgano etc.) hace referencia a un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) que se implanta de una especie diferente. Por tanto, por ejemplo, cuando un ser humano es un receptor, un injerto derivado de porcino (un tejido, una célula, un órgano etc.) se denomina xenoinjerto (un tejido, una célula, un órgano etc.).

15 Como se usa en el presente documento, “receptor” (aceptor) hace referencia a un individuo que recibe un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) o materia implantada (un tejido, una célula, un órgano etc.) y también se denomina “huésped”. Por el contrario, un individuo que proporciona un injerto (un tejido, una célula, un órgano etc.) o materia implantada (un tejido, una célula, un órgano etc.) se denomina “donante” (proveedor).

Con una técnica de formación de tejido protésico de la presente invención se puede usar un tejido protésico derivado de células madre mesenquimatosas. Esto es porque un tejido protésico (por ejemplo, tejidos membranosos, órganos etc.) formado mediante el método de la presente invención puede exhibir una función deseada mientras que la tasa de lesión tisular se mantiene a un nivel que no interfiere con la terapia (es decir, un nivel bajo). Convencionalmente, los tejidos u órganos se usan como injertos sin modificar. Por el contrario, la presente invención proporciona un

25 tejido que comprende células conectadas tridimensionalmente. Dicho tejido protésico tridimensional no se puede conseguir mediante técnicas convencionales y, por tanto, constituye un efecto significativo de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” hace referencia a un organismo al que se aplica el tratamiento de la presente invención y también se denomina “paciente”. Un paciente o sujeto puede ser, preferentemente, un ser humano.

Las células usadas opcionalmente en un tejido protésico, estructura tridimensional o injerto tisular de la presente invención pueden derivar de un origen singeneico (origen propio=, un origen alogénico (origen no propio) o un origen heterólogo. En vista de las reacciones de rechazo, son preferibles las células singeneicas. Si las reacciones de 35 rechazo no producen problemas se pueden usar células alogénicas. Las células que provocan reacciones de rechazo se pueden usar tratando opcionalmente las células de un modo que superen las reacciones de rechazo. Los procedimientos para evitar reacciones de rechazo se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Shin Gekagaku Taikei, Dai 12 Kan, Zoki Ishoku (Shinzo Ishoku Hai Ishoku Gijutsuteki, Rinriteki Seibi kara Jisshi ni Mukete [New Whole Surgery, Vol. 12, Organ Transplantation (Heart Transplantation Lung Transplantation From Technical and Ethical Improvements to Practice)" (3ª edición revisada.), Nakayama Shoten]. Entre los ejemplos de dichos métodos se incluyen un método que usa inmunosupresores o fármacos esteroideos y similares. Por ejemplo, actualmente existen los siguientes inmunosupresores para prevenir las reacciones de rechazo: "ciclosporina" (SANDIMMUNE/NEORAL); "tacrolimus" (PROGRAF); "azatioprina" (IMURAN); "hormona esteroidea" (prednina, metilprednina); y "anticuerpos frente a linfocitos T" (OKT3, ATG, etc.). Un método que se usa en todo el mundo como

45 terapia de inmunosupresión preventiva en muchas instalaciones es el uso simultáneo de tres fármacos: ciclosporina, azatioprina y hormona esteroidea. Un inmunosupresor se administra deseablemente de forma concurrente con un agente farmacéutico de la presente invención. La presente invención no está limitada a esto. Un inmunosupresor se puede administrar antes o después de un método de regeneración/terapéutico de la presente invención siempre que se pueda conseguir un efecto de inmunosupresión.

Las células usadas en la presente invención pueden derivarse de cualquier organismo (por ejemplo, vertebrados e invertebrados). Preferentemente se usan células derivadas de vertebrados. Más preferentemente se usan células derivadas de mamíferos (por ejemplo, primates, roedores etc.). Incluso más preferentemente se usan células derivadas de primates. Lo más preferentemente se usan células derivadas de un ser humano. Normalmente se

55 usan, preferentemente, células de la misma especie que el huésped.

Entre los ejemplos de un sujeto tratado mediante un tejido protésico de la presente invención se incluyen el corazón que sufre una cardiopatía (por ejemplo, insuficiencia cardíaca, cardiopatías isquémicas, infarto de miocardio, miocardiopatía, miocarditis, miocardiopatía hipertrófica, miocardiopatía hipertrófica dilatada y miocardiopatía dilatada), vasos sanguíneos en un parche pericárdico, miocardio infartado extremidades inferiores y superiores, y similares.

Los tejidos objeto de la presente invención pueden ser cualquier órgano de un organismo y pueden derivar de cualquier organismo. Los ejemplos de organismos dirigidos por la presente invención incluyen vertebrados e 65 invertebrados. Preferentemente, los organismos objetivo de la presente invención son mamíferos (por ejemplo, primates, roedores etc.). Más preferentemente, los organismos objeto de la presente invención son primates. Lo más

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marcadores de corazón adulto que no se especifican en el presente documento se pueden usar para identificar un tejido protésico de la presente invención siempre que estos marcadores puedan indicar células derivadas del corazón de adulto. Los ejemplos representativos de partes distintas del corazón de un adulto incluyen, entre otros, partes que contienen células madre mesenquimatosas o células derivadas de las mismas, otros tejidos, otros

5 órganos, mioblastos (por ejemplo, mioblastos esqueléticos), fibroblastos, células sinoviales y similares. Por tanto, identificando un marcador específico característico de otras partes distintas al corazón, se pueden confirmar las partes distintas al corazón de un adulto.

Una “parte distinta al miocardio de un adulto” y una “parte distinta del corazón de un adulto” se pueden identificar

10 usando marcadores característicos de células derivadas del miocardio de un adulto o del corazón de un adulto, incluyendo mioblastos esqueléticos, fibroblastos, células sinoviales, células madre o similares (en lo sucesivo en el presente documento denominado “marcador de miocardio no adulto” o “marcador de corazón no adulto”, respectivamente). Si el marcador se expresa en menos de aproximadamente el 100 %, preferentemente menos de aproximadamente el 80 %, más preferentemente menos de aproximadamente el 50 %, incluso más preferentemente

15 menos de aproximadamente el 25 %, en algunos casos menos de aproximadamente el 1 %, se pueden identificar las partes descritas anteriormente. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen, entre otros, cadena pesada IIa de la miosina, cadena pesada IIb de la miosina, cadena pesada IId de la miosina (IIx), CD56, MyoD, Myf5, miogenina y similares. Por tanto, los marcadores de miocardio no adulto que no se especifican en el presente documento se pueden usar para identificar un tejido protésico de la presente invención siempre que estos marcadores puedan

20 indicar células derivadas de partes distintas al miocardio de un adulto. Asimismo, los marcadores de corazón no adulto que no se especifican en el presente documento se pueden usar para identificar un tejido protésico de la presente invención siempre que estos marcadores puedan indicar células derivadas de partes distintas al corazón de un adulto.

25 cadena pesada IIa de la miosina (humana: Nº de acceso NM_017534; SEC ID Nº 1 y 2), cadena pesada IIb de la miosina (humana: Nº de acceso NM_017533; SEC ID Nº 3 y 4), cadena pesada IId (IIx) de la miosina (humana: Nº de acceso NM_005963; SEC ID Nº 5 y 6) son marcadores específicos de mioblastos (Havenith M.G., Visser R., Schrijvers-van Schendel J.M., Bosman F.T., "Muscle Fiber Typing in Routinely Processed Skeletal Muscle With Monoclonal Antibodies", Histochemistry, 1990; 93(5):497-499). Estos marcadores se pueden confirmar

30 principalmente observando la presencia de proteínas. Un anticuerpo contra la cadena pesada IIa de la miosina, la cadena pesada IIb de la miosina y la cadena pesada IId (IIx) de la miosina es, por ejemplo, MY-32 disponible en Sigma. Este anticuerpo es específico del músculo esquelético y no se une al miocardio (Webster C., Pavlath G.K., Parks D.R., Walsh F.S., Blau H.M., Exp. Cell. Res., 1988 Jan; 174(1):252-65; y Havenith M.G., Visser R., Schrijversvan Schendel J.M., Bosman F.T., Muscle Fiber Typing in Routinely Processed Skeletal Muscle with Monoclonal

35 Antibodies, Histochemistry, 1990, 93(5):497-499).

CD56 (humano: Nº de acceso U63041; SEC ID Nº 7 y 8) es un marcador específico de mioblastos. Este marcador se puede confirmar principalmente observando la presencia de ARNm.

40 MyoD (humano: Nº de acceso X56677; SEC ID Nº 9 y 10) es un marcador específico de mioblastos. Este marcador se puede confirmar principalmente observando la presencia de ARNm.

Myf5 (humano: Nº de acceso NM_005593; SEC ID Nº 11 y 12) es un marcador específico de mioblastos. Este marcador se puede confirmar principalmente observando la presencia de ARNm.

45 Miogenina (humana: Nº de acceso BT007233; SEC ID Nº 13 y 14) es un marcador específico de mioblastos. Este marcador se puede confirmar principalmente observando la presencia de ARNm.

En otras realizaciones se pueden usar otros marcadores específicos de otros tejidos. Los ejemplos de dichos

50 marcadores incluyen, entre otros, Oct-3/4, SSEA-1, Rex-1, Otx2, y similares para células madre embrionarias; VEcadherina, Flk-1, Tie-1, PECAM1, vWF, c-kit, CD34, Thy1, Sca-1, y similares para células endoteliales; α-actina de músculo esquelético además de los marcadores descritos anteriormente para músculos esqueléticos; Nestina, receptor de Glu, receptor de NMDA, GFAP, neuregulina-1, y similares para células nerviosas; c-kit, CD34, Thyl, Sca1, GATA-1, GATA-2, FOG, y similares para células hematopoyéticas.

55 Como se usa en el presente documento, el término “derivado” en relación con las células significa que las células se separan, aíslan o extraen de una masa celular, tejido u órgano donde las células han estado originalmente presentes

o que las células son inducidas por las células madre.

60 Como se usa en el presente documento, la expresión “aplicable al corazón” significa que el corazón aplicado tiene la capacidad de pulsar. Un tejido aplicable al corazón tiene una resistencia tal que el tejido puede aguantar la dilatación y la contracción del corazón pulsátil. En el presente documento, la aplicabilidad al corazón incluye la aplicabilidad al miocardio. La aplicabilidad al corazón se puede determinar confirmando que un receptor que tiene un injerto implantado sobrevive.

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introducción incluyen, entre otros, fijación directa, sutura tras fijación, inserción y similares. Por ejemplo, un tejido protésico y una estructura tridimensional de la presente invención se puede aplicar mediante los métodos descritos anteriormente en una zona deteriorada de tejido miocárdico isquémico causada por infarto de miocardio, angina de pecho o similares. Las combinaciones se pueden administrar de forma concomitante (por ejemplo como una mezcla)

5 por separado pero simultánea o concurrentemente, o de forma secuencial. Esto incluye presentaciones en las que los agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapéutica y, también, procedimientos en los cuales los agentes combinados se administran por separado pero de forma simultánea (por ejemplo, un tejido protésico o similar se proporciona directamente mediante operación mientras que otros agentes farmacéuticos se proporcionan mediante inyección intravenosa). La administración “en combinación” incluye además la administración separada de uno de los compuestos o agentes administrados primero, seguido del segundo.

Como se usa en el presente documento, el término “refuerzo” significa que se mejora la función de una parte objetivo de un organismo.

15 Como se usa en el presente documento, el término “instrucciones” describen un método de administrar un medicamento, un método para diagnóstico o similares de la presente invención para personas que administren, o a las que se administre, el medicamento o similar o para persona que diagnostiquen o que se le diagnostique (por ejemplo, médicos, pacientes y similares). Las instrucciones describen una declaración que indica un método adecuado para administrar un diagnóstico, un medicamento o similar de la presente invención. Las instrucciones se preparan de acuerdo con un formato definido por una autoridad de un país donde se pone en práctica la presente invención (por ejemplo el Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón, la Administración de Alimentos y Fármacos de EE.UU. (FDA) y similares), que describa explícitamente que las instrucciones están aprobados por la autoridad. Las instrucciones son la denominada ficha técnica y normalmente se proporcionan en medio de papel. Las instrucciones no están tan limitadas y se pueden proporcionar en forma de medios electrónicos (por ejemplo,

25 sitios web, correos electrónicos y similares proporcionados en Internet).

Como se usa en el presente documento, la expresión “macromolécula respondedora a estímulos” hace referencia a una macromolécula que cambia de forma y/o de propiedad en respuesta a un estímulo, es decir los cambios se producen entre antes y después del estímulo. Los ejemplos de dicho estímulo incluyen, entre otros, la exposición a la luz, la aplicación de campo eléctrico, un cambio en la temperatura, un cambio en el pH, la adición de una sustancia química, y similares. Los ejemplos de macromoléculas respondedoras a estímulo incluyen, entre otros, poli(N-isopropilacrilamida), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-ácido acrílico), copolímero de poli(Nisopropilacrilamida-metilmetacrilato), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-acrilato sódico), copolímero de poli(Nisopropilacrilamida-vinilferroceno), poli(vinilmetiléter) (PVME) expuesto a rayos γ, poli(oxietileno), una resina

35 obtenida incorporando un material biológico (por ejemplo, ácido nucleico, etc.) en una macromolécula, y un gel obtenido mediante reticulación de las macromoléculas descritas anteriormente con un agente de reticulación y similares.

Como se usa en el presente documento, la expresión “macromolécula respondedora a la temperatura” se refiere a una macromolécula que cambia su forma y/o propiedad en respuesta a la temperatura. Los ejemplos de macromoléculas respondedoras a la temperatura incluyen, entre otros, poli(N-isopropilacrilamida), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-ácido acrílico), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-metilmetacrilato), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-acrilato sódico), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-vinilferroceno), poli(vinilmetiléter) (PVME) expuesto a rayos γ, poli(oxietileno), y un gel obtenido mediante reticulación de las macromoléculas descritas

45 anteriormente con un agente de reticulación y similares. Los ejemplos preferidos de macromoléculas respondedoras a la temperatura incluyen, entre otros, poli(N-isopropilacrilamida), copolímero de poli(N-isopropilacrilamidametacrilato de metilo), copolímero de poli(N-isopropilacrilamida-acrilato sódico) y un gel obtenido mediante reticulación de las macromoléculas descritas anteriormente con un agente de reticulación y similares Por ejemplo, una macromolécula respondedora a la temperatura usada en el presente documento tiene una temperatura de solución crítica superior o inferior a la del agua de 0 ºC a 80 ºC. La presente invención no está limitada a esto. La expresión “temperatura de solución crítica” se refiere a un umbral de temperatura que cambia una forma y/o propiedad. Preferentemente, en el presente documento se puede usar poli(N-isopropilacrilamida).

Por ejemplo, el polivinilmetiléter expuesto a rayos γ forma un hidrato a temperatura ambiente en solución acuosa

55 que, a su vez, se hincha. Se sabe que a medida que la temperatura aumenta, la sustancia se deshidrata, de forma que la solución se contrae y se convierte en un gel de macromolécula sensible al calor. El gel de PVME, que es uniforme y transparente como una gelatina, se vuelve turbio (es decir, cambia su transparencia) si se calienta. Si el gel se proporciona con una estructura porosa o se conforma en fibras o partículas, el gen se puede extender o contraer a una velocidad alta. Se cree que un gel de PVME poroso y de tipo fibra puede extenderse o contraerse en menos de un segundo (véase http://www.aist.go.jp/NIMC/overview/v27-j.html, publicación japonesa abierta a consulta por el público nº 2001-213992 y publicación japonesa abierta a consulta por el público nº 2001-131249). El gen de N-isopropilacrilamida (es decir, poli(N-isopropilacrilamida) también se conoce como un gel respondedor a la temperatura. Si la poli(N-isopropilacrilamida) se copolimeriza con un monómero hidrofóbico, la temperatura que le permite cambiar su forma y/o propiedad se puede reducir. Si la poli(N-isopropilacrilamida) se copolimeriza con un

65 monómero hidrofílico, la temperatura que le permite cambiar su forma y/o propiedad se puede aumentar. Usando este carácter, es posible preparar una carga respondedora a une estímulo deseado. Dicha técnica se puede aplicar

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intervalo de temperatura baja de forma que las células cultivadas no puedan crecer y un intervalo de temperatura alta de forma que las células cultivadas sean destruidas es inadecuado. Las condiciones de cultivo distintas a la temperatura pueden ser aquellas bien conocidas en la técnica y no están particularmente limitadas. Por ejemplo, el medio se puede suplementar con suero bovino fetal (FCS) conocido o similares o, como alternativa, se puede

5 emplear medio sin suero sin suplemento de dicho suero.

En el método de la presente invención, el periodo de tiempo requerido para cultivo puede determinarse en función de la aplicación del tejido protésico o estructura tridimensional. Con el fin de desprender y recuperar el tejido protésico o estructura tridimensional cultivado del material de soporte, la temperatura del material de soporte que tiene células fijadas se incrementa a o por encima de la temperatura de solución crítica límite superior de un polímero que cubre el material base de soporte o se disminuye a o por debajo de la temperatura de solución crítica límite inferior. En este caso, el tejido protésico o la estructura tridimensional que se cultiva se desprenden directamente u, opcionalmente, con una membrana macromolecular unida. Obsérvese que el tejido protésico o estructura tridimensional se puede desprender en el medio de cultivo donde las células se han cultivado o, como 15 alternativa, en otras soluciones isotónicas. Dichas soluciones se pueden seleccionar en función de la finalidad. Los ejemplos de la membrana macromolecular, que opcionalmente está fijada a la lámina celular o estructura tridimensional, incluyen, entre otros, difluoruro de polivinilideno (PVDF) hidrofilizado, polipropileno, polietileno, celulosa y derivados de los mismos, quitina, quitosano, colágeno, papel (por ejemplo, papel de Japón etc.), uretano, materiales macromoleculares de tipo red o de tipo punto de espiga (por ejemplo, licra, etc.) y similares. Cuando se usa un material macromolecular de tipo red o de tipo punto de espiga, el tejido protésico o estructura tridimensional tiene un grado más alto de libertad, de forma que se puede incrementar la función de contracción/relajación del mismo. Un método para producir el tejido protésico o estructura tridimensional que comprende células de la presente invención no está particularmente limitado. Por ejemplo, el tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención se puede producir usando la lámina celular cultivada descrita anteriormente fijada a una membrana

25 macromolecular.

Con el fin de desprender y recuperar el tejido protésico o estructura tridimensional con un rendimiento alto del soporte del cultivo celular, se da golpecitos o se agita el soporte del cultivo celular o el medio se agita con una pipeta. Estos procedimientos se pueden realizar de forma individual o en combinación. Además, el tejido protésico o estructura tridimensional puede aclararse opcionalmente con solución isotónica o similar antes del desprendimiento y la recuperación. Estirando el tejido protésico o estructura tridimensional en una dirección específica después de desprenderse del material base, la lámina celular o estructura tridimensional se proporciona con alineación. El estirado se puede realizar usando un dispositivo de tracción (por ejemplo, Tensilon, etc.), o simplemente unas pinzas

o similares. Un método de estiramiento no está particularmente limitado. Proporcionando alineación, es posible

35 conferir direccionalidad al movimiento de la propia lámina celular o estructura tridimensional. Por tanto, por ejemplo, es posible permitir que el tejido protésico o estructura tridimensional se mueva de acuerdo con el movimiento de un órgano específico. El tejido protésico o estructura tridimensional se puede aplicar eficientemente a los órganos.

El tejido protésico o la estructura tridimensional que se obtiene de este modo no se puede obtener mediante técnicas convencionales. El tejido protésico o la estructura tridimensional retienen la membrana basal que se rompe en las técnicas convencionales. Por tanto, el tejido protésico o estructura tridimensional se puede aceptar de forma satisfactoria por el tejido circundante y puede pulsar in situ cuando se entierra en cualquier parte de un organismo (por ejemplo, corazón, hueso, músculo, brazo, hombro, pie y otros órganos). Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que la razón es la siguiente. El tejido protésico o la estructura tridimensional enterrada dentro 45 de un organismo es aceptada por un tejido biológico y se contrae o relaja. En este caso, el tejido protésico o la estructura tridimensional está en el estado de oxígeno bajo. Para compensar el estado, las células endoteliales de los vasos sanguíneos entran de forma agresiva en el tejido protésico o estructura tridimensional desde el tejido biológico circundante. Como resultado se forman vasos sanguíneos de modo que se pueda suministrar suficiente oxígeno y nutrientes a través de la sangre. Por tanto, el tejido protésico o estructura tridimensional enterrada dentro de un organismo puede formar un tejido funcional dentro del organismo. Cabe esperar firmemente que dicho tejido protésico o estructura tridimensional se use en aplicaciones clínicas, tal como implantación y similar. Específicamente, el tejido protésico o estructura tridimensional de la presente invención se puede usar como instrumento terapéutico para cardiopatías (por ejemplo, infarto de miocardio etc.). En este caso, por ejemplo, el tejido protésico o estructura tridimensional se implanta en un sitio de un corazón que tiene una débil fuerza de

55 contracción. Como alternativa, el tejido protésico o estructura tridimensional se puede aplicar alrededor de un vaso sanguíneo para mejorar la circulación. Por ejemplo, el tejido protésico o estructura tridimensional es útil como instrumento terapéutico para la enfermedad de Raynaud grave, un hombro rígido grave, la disfunción de la aorta y similares. Obsérvese que se puede usar repetidamente un soporte de cultivo celular para su uso en la presente invención.

(Preparación de tejido protésico usando agente estimulante tridimensional)

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para producir un tejido protésico. El método para producir un tejido protésico comprende las etapas de: A) proporcionar una célula; B) introducir la célula en un 65 recipiente que contiene un medio de cultivo celular que incluye un agente estimulante tridimensional, donde el recipiente tiene una base con un área suficiente para acomodar un tamaño deseado del tejido protésico; y C) cultivar

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