JP2015033637A - 三次元組織構造体 - Google Patents
三次元組織構造体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015033637A JP2015033637A JP2014221669A JP2014221669A JP2015033637A JP 2015033637 A JP2015033637 A JP 2015033637A JP 2014221669 A JP2014221669 A JP 2014221669A JP 2014221669 A JP2014221669 A JP 2014221669A JP 2015033637 A JP2015033637 A JP 2015033637A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tissue
- cells
- cell
- present
- heart
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/20—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of the heart, e.g. heart valves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
- C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/30—Synthetic polymers
- C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
- C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
組織またはシートを提供すること。また、細胞治療に代わる新たな治療法を提供すること
。
【解決手段】特に、心筋以外の部分に由来する細胞を材料として移植手術に耐え得る人工
組織を作製することを目的とする。上記課題は、一部、本発明において特定の培養条件に
よって細胞を培養することによって予想外に組織化が進展し、かつ、培養皿から剥離し易
いという性質をもつ人工組織を見出したことによって達成された。本発明において、スキ
ャフォルドを用いず、成体の心臓を構成する心筋組織以外の部分に由来する筋芽細胞から
なる、心臓疾患に適用するためのシート状三次元構造体が提供される。
【選択図】なし
Description
由来する細胞を含む、心臓に適用可能な三次元構造体に関する.さらに、本発明は、その
ような三次元構造体を製造する方法に関する。
Levy D., Circulati0n. 1993;88: 107-115]。虚血性心疾患は、すべての心血管系の死
の50%の原因であり、欝血性心不全の主要な原因である。欝血性心不全と診断された患者
に関して、慢性心疾患の結果、1年死亡率は、20%である[American Heart Ass0ciati0n
., Dallas, Tex: American Heart Ass0ciati0n; 2001]。現在臨床医が利用可能な治療
の多くは、急性心筋梗塞に罹患した患者の予後を有意に改善し得る.血管形成術および血
栓崩壊剤は、この急性心筋梗塞の原因を除去し得るが、閉塞発症から再灌流までの時間が
、不可逆的心筋損傷の程度を決定する[Ryan TJ, Antman EM, Br00ks NH, Califf RM,
Hillis LD, Hiratzka LF, Rapap0rt E, Riegel B, Russell R0, Smith EE III, Weaver
WD, Gibb0ns RJ, Alpert JS, Eagle KA, Gardner TJ, Gars0n A Jr, Greg0rat0s G,
Ryan TJ, Smith SC Jr., J Am C0ll Cardi0l. 1999;34: 890-911]。臨床的に使用さ
れるどの薬剤も処置も、機能性収縮組織で心筋療痕を置換することにおいて、効力を示し
ていない。正常な心筋細胞を再生するための新規な治療についての需要が存在する。
外科的方法として提唱されているが、心機能に対する効果は、不明のままである[C0rin
WJ, Ge0rge DT, Sink JD et al., J Th0rac Cardi0vasc Surg 1992;104: 1662-71; K
ratz JM, J0hns0n WS, Mukherjee R et al., J Th0rac Cardi0vasc Surg 1994;107:
868-78; Carpentier A, Chachques JC., Lancet. 1985;8840: 1267;およびHagege AA, D
esn0s M, Chachques JCら、Preliminary rep0rt: f0ll0w-up after dynamic cardi0
my0plasty. Lancet. 1990;335: 1122-4]。近年、生分解性足場を使用する生体操作した
心臓移植片移植が、別の新規なストラテジーとして提唱されたが、これは、心筋層にほと
んど付着しないのが原因で、心機能の改善において最小限の利点しか示していない[Le0
r J, Etzi0n SA, Dar A et al., Circulati0n 2000;102[suppl III]III-56-III-61;
およびLi RK, Jia ZQ, Weisel RD et al., Circulati0n 1999;100[suppl II]:II-63-I
I-69]。生体操作した心臓組織が、障害心筋層の再生についてレシピエント心臓と組織学
的電気的統合を示し得ることが、要点であり得る。
に細胞シートを三次元重層する、新規な技術を使用する機能性心臓組織の作製を可能にす
る見込みがある[0kan0 T, Yamada N, Sakai H, Sakurai Y., J Bi0med Mater Res. 1
993;27: 1243-1251]。この新規な技術において、細胞間接合およびコンフルエントに培
養された細胞単層内の接着タンパク質の両方が、完全に保存される。そして採取法により
底部を採取された細胞シートを保存した内因性ECM[Kushida A, Yamat0 M, K0nn0 C,
Kikuchi A, Sakurai Y, 0kan0 T., J Bi0med Mater Res 45: 355-362, 1999]が、レ
シピエント心臓との統合のための接着因子として、重要な役割を果す。さらに、この心筋
細胞シートは、電気伝達する拍動性3-D心臓構築物である[Shimizu T, Yamat0 M, Akuts
u T et al., Circ Res. 2002 Feb 22; 90(3): e40]。しかし、インビボ移植後に、心筋
細胞シートがその機能を果すか否かは未知である。
能な機能的組織を提供する可能性がある。
臓器(例えば、心臓、血管など)の移植に外来性組織を使用する際の主な障害は免疫拒
絶反応である。同種異系移植片(または同種移植片、all0graft)と異種移植片(xen0g
raft)で起こる変化が最初に記述されたのは90年以上前のことである(Carrel A., 1907,
J Exp Med 9:226-8; Carrel A., 1912., J Exp Med 9:389-92; Calne RY., 1970, Trans
plant Pr0c 2:550およびAuchincl0ss 1988, Transplantati0n 46: 1)。動脈移植片の
拒絶反応は、病理学的には移植片の拡張(破裂に至る)または閉塞のいずれかを招く。前
者の場合、細胞外マトリクスの分解により生じ、一方、後者は血管内細胞の増殖により起
こる(Uretsky BF, Mulari S, Reddy S, et al., 1987, Circulati0n 76:827-34)。こ
のような移植片の使用は、材料として非生体物質を使用することが多いことから、このよ
うな副作用という弊害がある。
におけるヒト筋芽細胞移植は、1.移植細胞の障害損失、2.レシピエント心の注入時の
組織障害、3.レシピエント心への組織供給効率、4.不整脈の発生、5.梗塞部位全体
への治療の困難などの欠点を有する。従って、細胞移植はそれほど成功しているとはいい
がたい。
と、通常自己の心筋を用いる必要があることからその応用には限界があるという問題が指
摘される。
工組織、三次元構造体またはシートを提供することが渇望されている。
人工組織またはシートを提供することを課題とする。本発明はまた、細胞治療に代わる新
たな治療法を提供することを課題とする。特に、心筋以外の部分に由来する細胞を材料と
して移植手術に耐え得る人工組織を作製することを目的とする。
って達成された。上記課題は、一部、本発明において特定の培養条件によって細胞を培養
することによって予想外に組織化が進展し、かつ、培養皿から剥離し易いという性質をも
つ人工組織を見出したことによって達成された。
筋と同様に機能することが予想外に発見されたことによって達成された。
従って、本発明は以下を提供する。
(1)成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む、心臓に適用可能な三次元構造体。
(2)上記細胞は幹細胞または分化細胞である、項目1に記載の三次元構造体。
(3)上記細胞は間葉系細胞である、項目1に記載の三次元構造体。
(4)上記細胞が筋芽細胞に由来する、項目1に記載の三次元構造体。
(5)上記筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、項目4に記載の三次元構造体。
(6)上記細胞が線維芽細胞である、項目1に記載の三次元構造体。
(7)上記細胞が滑膜細胞である、項目1に記載の三次元構造体。
(8)上記細胞が幹細胞に由来する、項目1に記載の三次元構造体。
(9)上記細胞は、上記三次元構造体が適用される被験体に由来する、項目1に記載の三
次元構造体。
(10)上記細胞は、上記三次元構造体が適用される被験体に由来しない、項目1に記載
の三次元構造体。
(11)上記三次元構造体は、ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖
IId(IIx)、CD56、My0D、Myf5、my0geninおよびMRF4か
らなる群より選択される少なくとも1つの非成体心臓マーカーを発現する、項目1に記載
の三次元構造体。
(12)上記構造体における非成体心臓マーカーは、骨格筋芽細胞における非心臓マーカ
ーが発現するレベルの少なくとも50%のレベルで存在する、請求項11に記載の三次元
構造体。
(13)上記三次元構造体は、ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖
IId(IIx)、CD56、My0D、Myf5およびmy0geninをすべて発現
する、項目1に記載の三次元構造体。
(14)上記ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖IId(IIx)
、CD56、My0D、Myf5およびmy0geninはいずれも、骨格筋芽細胞が発
現するレベルの少なくとも約50%以上のレベルで存在する、項目13に記載の三次元構
造体。
(15)上記ミオシン重鎖IIa、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖IId(IIx)
、CD56、My0D、Myf5およびmy0geninはいずれも、骨格筋芽細胞が発
現するレベルの少なくとも約100%以上のレベルで存在する、項目13に記載の三次元
構造体。
(16)上記心筋以外の細胞は、心臓に由来しない細胞である、項目1に記載の三次元構
造体。
(17)上記心臓への適用可能性は心筋への適用可能性を含む、項目1に記載の三次元構
造体。
(18)単層の細胞シートを含む、項目1に記載の三次元構造体。
(19)複数の層の細胞シートを含む、項目1に記載の三次元構造体。
(20)上記複数の層の細胞シートは、生物学的に結合している、項目19に記載の三次
元構造体。
(21)上記生物学的結合は、細胞外マトリクスによる結合、電気的結合およびスキャフ
ォルドなしでの結合からなる群より選択される、項目20に記載の三次元構造体。
(22)項目1〜21に記載の三次元構造体を含む医薬。
(23)上記心臓は、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症
、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴
う、項目22に記載の医薬。
(24)成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む、心臓に適用可能な三次元構造体を
製造する方法であって、
a)水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答
性高分子がグラフティングされた細胞培養支持体上で、成体の心筋以外の部分に由来する
細胞を培養する工程;
b)培養液温度を、上記上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とする工程
;および
c)上記培養した細胞を、三次元構造体として剥離する工程;を包含する、方法。
(25)上記剥離時またはその前に、タンパク質分解酵素による処理がなされない、項目
24に記載の方法。
(26)上記温度応答性高分子が、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、項
目24に記載の方法。
おける周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作
用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
達成不可能な大きさを達成し、しかも強度も優れていることから、従来人工物での移植処
置が考えられなかった部位の処置が可能になった。本発明によって、心筋のみならずそれ
以外の部分に由来する細胞を材料として人工組織または三次元構造体を提供することが可
能となった。従って、自己の心筋以外の部分を材料として移植治療を行うことが可能とな
った。
限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞(
例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など)は、特に言及しない限り、そ
の複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用され
る用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解
されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての
専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解され
るのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書(定義を含めて)が優先する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
(再生医療)
本明細書において使用される「再生」(regeneration)とは,個体の組織
の一部が失われた際に残った組織が増殖して復元される現象をいう。動物種間または同一
個体における組織種に応じて、再生のその程度および様式は変動する。ヒト組織の多くは
その再生能が限られており、大きく失われると完全再生は望めない。大きな傷害では、失
われた組織とは異なる増殖力の強い組織が増殖し、不完全に組織が再生され機能が回復で
きない状態で終わる不完全再生が起こり得る。この場合には、生体内吸収性材料からなる
構造物を用いて、組織欠損部への増殖力の強い組織の侵入を阻止することで本来の組織が
増殖できる空間を確保し、さらに細胞増殖因子を補充することで本来の組織の再生能力を
高める再生医療が行われている。この例として、軟骨、骨および末梢神経の再生医療があ
る。神経細胞および心筋は再生能力がないかまたは著しく低いとこれまでは考えられてき
た。近年、これらの組織へ分化し得る能力および自己増殖能を併せ持った組織幹細胞(体
性幹細胞)の存在が報告され、組織幹細胞を用いる再生医療への期待が高まっている。胚
性幹細胞(ES細胞)はすべての組織に分化する能力をもった細胞であり、それを用いた
腎臓、肝臓などの複雑な臓器の再生が試みられているが実現には至っていない。
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味
と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包ま
れ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発
明の方法においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使用される「細胞」
の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は
、核の数を数えることにより計数を行う。当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシ
リンーエオシン(HE)染色を行うことにより細胞外マトリクス(例えば、エラスチンま
たはコラーゲン)および細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この組織切片を光
学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積(例えば、200μm×200μm)あたりの核の数を
細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存
在する細胞であっても、人工的に改変された細胞(例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞)
であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは
、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長
した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
「pluripotency」)を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受け
たときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹(ES)細胞
または組織幹細胞(組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう)であり
得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細
胞(たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など)
もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性
幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応
用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用され
つつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であ
り、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞
は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核/細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。
組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維
持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは胚性幹細胞であり得る
が、状況に応じて組織幹細胞も使用され得る。
神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが
挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵(共通)幹細胞、肝幹細胞などが挙げら
れる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経
系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
DNAを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定され
ているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するも
のであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は
、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚
葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、
体細胞はどのような間葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、間葉系由来の細胞が使用
され得る。
胚葉および内胚葉に由来する分化細胞または幹細胞が使用され得る。このような細胞とし
ては、例えば、間葉系の細胞が挙げられる。ある実施形態では、このような細胞として、
筋芽細胞(例えば、骨格筋芽細胞など)、線維芽細胞、滑膜細胞などが使用され得る。こ
のような細胞としては、分化細胞をそのまま利用したり、幹細胞をそのまま利用すること
もできるが、幹細胞から所望される方向に分化させた細胞を使用することができる。
はMSCと略されることがある。ここで、間葉とは、多細胞動物の発生各期に認められる
上皮組織間の間隙をうめる星状または不規則な突起をもつ遊離細胞の集団と、それに伴う
細胞間質によって形成される組織をいう。間葉系幹細胞は、増殖能と、骨細胞、軟骨細胞
、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞、脂肪細胞への分化能を有する。間葉系幹細胞は、
患者から採取した骨髄細胞等を培養または増殖、軟骨細胞あるいは骨芽細胞に分化させる
ために使用され、または歯槽骨、関節症等の骨、軟骨、関節などの再建材料として使用さ
れており、その需要は大きい。また、間葉系幹細胞は、血液細胞、リンパ系細胞へも分化
し得ることから、その需要がますます高まっている。従って、本発明の間葉系幹細胞また
は分化した間葉系幹細胞を含む人工組織または三次元構造体は、これらの用途において構
造体が必要である場合に特に有用である。
くとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離され
た細胞、組織などとは、天然の環境において付随する他の物質(たとえば、他の細胞、タ
ンパク質、核酸など)を実質的に含まない細胞をいう。組織についていう場合、単離され
た組織とは、その組織以外の物質(例えば、人工組織の場合は、その人工組織を作製する
に際して使用された物質、足場、シート、コーティングなど)が実質的に含まれていない
状態の組織をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、た
とえば、組換えDNA技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に
含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含ま
なし\核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来
する生物において天然に該核酸に隣接している(flanking)配列(即ち、該核酸
の5’末端および3’末端に位置する配列)を含まない。
場合、物理的な外傷がないことをいい、その人工組織などを作製した後、作製に使用され
た環境から分離する際に与えられる物理的衝撃などによる外傷などが実質的にないことを
いう。
ば、多分化能)を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状
態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
期胚以外の身体部分に由来する細胞がこれに該当するが、胚性幹細胞に改変(例えば、遺
伝的改変、融合など)を加えて得られる細胞もまた、非胚性細胞の範囲内にある。
ば、筋細胞、神経細胞など)をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとん
どない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血
液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色
素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
態をもつ細胞集団をいう。多細胞生物では、通常それを構成する細胞が分化し、機能が専
能化し、分業化がおこる。従って細胞の単なる集合体であり得ず、ある機能と構造を備え
た有機的細胞集団,社会的細胞集団としての組織が構成されることになる。組織としては
、外皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などが挙げられるがそれらに限定されない。本
発明の組織は、生物のどの臓器または器官由来の組織でもよい。本発明の好ましい実施形
態では、本発明が対象とする組織としては、血管、血管様組織、心臓弁、心膜、硬膜、角
膜、関節および骨の組織が挙げられるがそれらに限定されない。
いて、代表的には、人工組織は、細胞培養によって調製される。生物の中に存在する形態
の組織をそのまま取り出してきたものは本明細書では人工組織とはいわない。人工組織は
、生体に由来する物質および生体に由来しない物質を含み得る。本発明の人工組織は、通
常細胞および/または生体物質で構成されるが、それ以外の物質を含んでいてもよい。よ
り好ましくは、本発明の人工組織は、実質的に細胞および/または生体物質のみで構成さ
れる。このような生体物質は、好ましくはその組織を構成する細胞に由来する物質(例え
ば、細胞外マトリクスなど)であることが好ましい。
て移植することができ、移植後も少なくとも一定期間移植された部位において組織として
の役割を果たすことができる人工組織をいう。移植可能な人工組織は通常、十分な強度、
十分な大きさ、十分な無孔性、十分な厚み、十分な生体適合性、十分な生体定着性などを
有する。
が、当業者は適宜、その強度を設定することができる。しかし、移植される場合は少なく
とも一定の強度を有することが好ましく、そのような強度は、通常、引っ張り強さについ
て移植を目的とする部分の天然の強度の少なくとも約50%であり、好ましくは少なくと
も約60%であり、より好ましくは約70%、さらに好ましくは約80%であり、もっと
も好ましくは少なくとも約100%である。そのような強度は、後述の応力、歪み特性を
測定したり、クリープ特性イデンテーション試験を行うことによって測定され得る。
るが、当業者は適宜、その大きさを設定することができる。しかし、移植される場合は少
なくとも一定の大きさを有することが好ましく、そのような大きさは、通常、面積につい
て少なくとも1cm2であり、好ましくは少なくとも2cm2であり、より好ましくは少
なくとも3cm2である。さらに好ましくは少なくとも4cm2であり、少なくとも5c
m2であり、少なくとも6cm2であり、少なくとも7cm2であり、少なくとも8cm
2であり、少なくとも9cm2であり、少なくとも10cm2であり、少なくとも15c
m2であり、あるいは少なくとも20cm2であり得る。
るが、当業者は適宜、その無孔性を設定することができる。本明細書において「無孔性」
とは、孔がない状態をいう。ここで、孔とは、その人工組織において体液またはその同等
物(例えば、水溶液など)を漏らす程度の実質的な大きさを有する穴をいう。従って、無
孔性を調べるためには、その人工組織を水平に配置し、その上に体液またはその同等物を
配置し、その体液またはその同等物が漏れないかどうかを確認し、このときに漏れない場
合は無孔性であると判定することができる。
が、当業者は適宜、その厚みを設定することができる。しかし、移植される場合は少なく
とも一定の厚みを有することが好ましく、そのような厚みは、通常、少なくとも約50μ
mであり、好ましくは少なくとも約100μmであり、より好ましくは約150μmであ
り、さらに好ましくは少なくとも約200μm、少なくとも約300μm、少なくとも約
400μm、少なくとも約500μm、少なくとも約600μm、少なくとも約700μ
m、少なくとも約800μm、少なくとも約900μm、少なくとも約1mmであり得る
。心臓へ移植する場合は、この最低限の厚みさえ有していればよいが、他の用途が意図さ
れる場合、厚みはより厚い方がよい場合があり得、そのような場合、例えば、少なくとも
2mm、より好ましくは少なくとも3mm、さらに好ましくは5mmであることが意図さ
れる。
動するが、当業者は適宜、その生体適合性の程度を設定することができる。通常、所望さ
れる生体適合性としては、例えば、炎症などを起こさず、免疫反応を起こさずに、周囲組
織と生物学的結合を行うことなどが挙げられるが、それらに限定されない。場合によって
、例えば、角膜などでは、免疫反応を起こしにくいことから、他の臓器において免疫反応
を起こす可能性がある場合でも、本発明の目的では生体適合性を有するとすることができ
る。生体適合性のパラメータとしては、例えば、細胞外マトリクスの存否、免疫反応の存
否、炎症の程度などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような生体適合性は、移
植後における移植部位での適合性を見ること(例えば、移植された人工組織が破壊されて
いないことを確認する)によって判定することができる(ヒト移植臓器拒絶反応の病理組
織診断基準鑑別診断と生検標本の取り扱い(図譜)腎臓移植、肝臓移植および心臓移植日
本移植学会日本病理学会編、金原出版株式会社(1998)を参照)。この文献によれば
、Grade 0、1A、1B、2、3A、3B、4に分けられ、Grade 0(no acute rejection)は、生検
標本に急性拒絶反応、心筋細胞障害などを示す所見がない状態である。GradeIA(focal,
mild acute rejection)は、局所的、血管周囲または間質に大型リンパ球が浸潤している
が、心筋細胞傷害は無い状態である。この所見は、1つまたは複数の生検標本で認められ
る。Grade 1B(diffuse, mild acute rejection)は、血管周囲、間質またはその両方に
大型リンパ球がよりびまん性に浸潤しているが、心筋細胞傷害は無い状態である。Grade
2(focal, moderate acute rejection)は、明瞭に周囲と境界された炎症細胞浸潤巣がた
だ一箇所で見出されるような状態である。炎症細胞は、大型の活性化されたリンパ球から
なり、好酸球をまじえることもある。心筋構築の改変を伴った心筋細胞傷害が病変内に認
められる。Grade 3A(multifocal, moderate acute rejection)は、大型の活性化したリ
ンパ球からなる炎症細胞浸潤巣が多発性に形成され、好酸球をまじえることもある状態で
ある。これらの多発性の炎症性の炎症細胞浸潤巣の2箇所以上が心筋細胞傷害を伴ってい
る。ときに、心内膜への粗な炎症細胞浸潤を伴っている。この浸潤巣は生検標本のひとつ
または複数の標本で認められる。Grade 3B(multifocal, borderline severe acute reje
ction)は、3Aで見られた炎症細胞浸潤巣がより融合性またはびまん性となり、より多く
の生検標本で認められる状態である。大型リンパ球および好酸球、ときに好中球を交える
炎症細胞浸潤とともに、心筋細胞傷害がある。出血はない。Grade 4(severe acute reje
ction)は、活性化したリンパ球、好酸球、好中球を含む多彩な炎症細胞浸潤がびまん性
に認められる。心筋細胞傷害と心筋細胞壊死とは常に存在する。浮腫、出血、血管炎も通
常認められる。「Quilty」効果とは異なる心内膜への炎症細胞浸潤が通常認められる。か
なりの期間、免疫抑制剤で強力に治療されている場合には、細胞浸潤よりも浮腫と出血と
が顕著となり得る。
動するが、当業者は適宜、その生体定着性の程度を設定することができる。生体適合性の
パラメータとしては、例えば、移植された人工組織と移植された部位との生物学的結合性
などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような生体定着性は、移植後における移
植部位での生物学的結合の存在によって判定することができる。本明細書において好まし
い生体定着性とは、移植された人工組織が移植された部位と同じ機能を発揮するように配
置されていることが挙げられる。
状組織には、心膜、硬膜、角膜などの器官の組織または袋状組織の一定面積部分の組織な
どが挙げられる。
ある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ,かつその部分が形態的に独立性をもっ
ている構造体をいう。一般に多細胞生物(例えば、動物、植物)では器官は特定の空間的
配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または
器官としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、膀帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓
、脳、関節、骨、軟骨、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。この
ような臓器または器官はまた、表皮系、膵実質系、膵管系、肝系、血液系、心筋系、骨格
筋系、骨芽系、骨格筋芽系、神経系、血管内皮系、色素系、平滑筋系、脂肪系、骨系、軟
骨系などの器官または臓器が挙げられるがそれらに限定されない。
部は管状の組織によって外部と接続され得る臓器をいい、例えば、心臓、肝臓、腎臓、胃
、脾臓などが挙げられる。
好ましくは虚血性の器官(心筋梗塞を起こした心臓、虚血を起こした心臓など)が挙げら
れる。1つの好ましい実施形態では、本発明が対象とする器官は、血管、血管様組織、心
臓、心臓弁、心膜、硬膜、角膜および骨である。別の好ましい実施形態では、本発明が対
象とする器官は、心臓、心臓弁、心膜および血管である。
を、巻く」とは、その人工組織などを、その部分を覆うように(すなわち、損傷などがか
くれるように)配置することをいい、その部分を「覆うように配置」すると交換可能に用
いられる。ある部分を覆うように配置したかどうかは、その部分と配置された人工組織ま
たは三次元構造体などとの間の空間的配置を確認することによって判定することができる
。好ましい実施形態では、巻く工程によって、ある部位にはその人工組織などが一回転す
るように巻き付けられることができる。
分と人工組織との組み合わせによって変動するが、当業者であれば、その組み合わせに応
じて適宜容易に決定することができる。このような時間としては、例えば、術後1週間、
2週間、1ヵ月、2ヵ月、3ヵ月、6ヵ月、1年などが挙げられるがそれらに限定されな
い。本発明では、人工組織は、好ましくは実質的に細胞およびそれに由来する物質のみを
含むことから、特に術後に摘出する物質が必要であるというわけではないので、この十分
な時間の下限は特に重要ではない。従って、この場合、長ければ長いほど好ましいといえ
るが、実質的には極端に長い場合は、実質的に補強が完了したといえる。
をいい、例えば、超急性拒絶反応(移植後数分以内)(β−Galなどの抗体による免疫
反応)、急性拒絶反応(移植後約7〜21日の細胞性免疫による反応)、慢性拒絶反応(
3ヵ月以降の細胞性免疫による拒絶反応)などが挙げられる。
、組織切片の検鏡によって、移植組織中への細胞(免疫系)浸潤について、その種、数な
どの病理組織学的検討を行うことにより判定することができる。
本明細書において生体内で「石灰化する」かどうかは、カルシウム濃度を測定すること
によって判定することができ、移植組織を取り出し、酸処理などにより組織切片を溶解さ
せ、その溶液を原子吸光度などの微量元素定量装置により測定し、定量することができる
。
をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべ
き位置をいう。
生体の一部分が「生体外に」(例えば、試験管内に)摘出または遊離されている状態をい
う。インビボと対照をなす用語である。
抽出し、インビトロで治療遺伝子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動
作をエキソビボという。
細胞を構成する物質の他、細胞が分泌する物質。代謝した物質などをが含まれるがそれら
に限定されない。代表的な細胞に由来する物質としては、細胞外マトリクス、ホルモン、
サイトカインなどが挙げられるがそれらに限定されない。細胞に由来する物質は、通常、
その細胞およびその細胞の宿主に対して有害な影響をもたらさないことから、そのような
物質は人工組織、三次元構造体などに含まれていても通常悪影響を有しない。
皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞(somatic cell)の間に存在する物質を
いう。細胞外マトリクスは、通常細胞が産生し、従って生体物質の一つである。細胞外マ
トリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関
与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や
内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満た
す基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成
成分はグリコサミノグリカン(酸性ムコ多糖)であり、その大部分は非コラーゲン性タン
パクと結合してプロテオグリカン(酸性ムコ多糖−タンパク複合体)の高分子を形成する
。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル(microfib
ril)、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊
に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に
大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が
起こる骨基質が産生される。本発明の1つの実施形態では、本発明の人工組織、三次元構
造体などは、細胞外マトリクス(たとえば、エラスチン、コラーゲン(例えば、1型、I
V型など)、ラミニンなど)は、移植が企図される器官の部位における細胞外マトリクス
の組成に類似することが有利であり得る。本発明において、細胞外マトリクスは、細胞接
着分子を包含する。本明細書において「細胞接着分子」(Cell adhesion
molecule)または「接着分子」とは、互換可能に使用され、2つ以上の細胞の互
いの接近(細胞接着)または基質と細胞との間の接着を媒介する分子をいう。一般には、
細胞と細胞の接着(細胞間接着)に関する分子(cell−cell adhesion
molecule)と,細胞と細胞外マトリックスとの接着(細胞−基質接着)に関与
する分子(cell−substrate adhesion molecule)に分
けられる。本発明の人工組織、三次元構造体は、通常、このような細胞接着分子を含む。
従って、本明細書において細胞接着分子は、細胞一基質接着の際の基質側のタンパク質を
包含するが、本明細書では、細胞側のタンパク質(例えば、インテグリンなど)も包含さ
れ、タンパク質以外の分子であっても、細胞接着を媒介する限り、本明細書における細胞
接着分子または細胞接着分子の概念に入る。
の分子(NCAM、L1、ICAM、ファシクリンII、IIIなど)、セレクチンなど
が知られており、それぞれ独特な分子反応により細胞膜を結合させることも知られている
。従って、1つの実施形態では、本発明の人工組織、三次元構造体などは、このようなカ
ドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する分子などの組成もまた、移植が意
図される部位と同程度の組成であることが好ましい。
ことから、当業者は、目的に応じて、適宜本発明の人工組織、三次元構造体に含まれるべ
き分子を選択することができる。細胞接着に関する技術は、上述のもののほかの知見も周
知であり、例えば、細胞外マトリックス −臨床への応用− メディカルレビュー社に記
載されている。
ラーゲン法)、免疫学的定量(酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討)、PCR法
、ハイブリダイゼイション法などのようなアッセイにおいて陽性となることを決定するこ
とにより判定することができる。このような細胞接着分子としては、コラーゲン、インテ
グリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、免疫グロブリ
ンスーパーファミリー(例えば、CD2、CD4、CD8、ICM1、ICAM2、VC
AM1)、セレクチン、カドヘリンなどが挙げられるがそれに限定されない。このような
細胞接着分子の多くは、細胞への接着と同時に細胞間相互作用による細胞活性化の補助シ
グナルを細胞内に伝達する。従って、本発明の組織片において用いられる接着因子として
は、そのような細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達するものが好ましい。細胞活性
化により、組織片としてある組織または臓器における損傷部位に適用された後に、そこに
集合した細胞および/または組織もしくは臓器にある細胞の増殖を促すことができるから
である。そのような補助シグナルを細胞内に伝達することができるかどうかは、生化学的
定量(SDS−PAG法、標識コラーゲン法)、免疫学的定量(酵素抗体法、蛍光抗体法
、免疫組織学的検討)、PCR法、ハイブリダイゼイション法というアッセイにおいて陽
性となることを決定することにより判定することができる。
てカドヘリンがあり、カドヘリンは、本発明の好ましい実施形態において使用することが
できる。一方,非固着性の血液・免疫系の細胞では,細胞接着分子としては、例えば、免
疫グロブリンスーパーファミリー分子(CD2、LFA−3、ICAM−1、CD2、C
D4、CD8、ICM1、ICAM2、VCAM1など);インテグリンファミリー分子
(LFA−1、Mac−1、gplIblIIa、p150、95、VLA1、VLA2
、VLA3、VLA4、VLA5、VLA6など);セレクチンファミリー分子(L−セ
レクチン,E−セレクチン,P−セレクチンなど)などが挙げられるがそれらに限定され
ない。従って、そのような分子は、血液・免疫系の組織または臓器を処置するための特に
有用であり得る。
となる。その場合,恒常的に発現するセレクチン分子などによる一次接着、それに続いて
活性化されるインテグリン分子などの二次接着によって細胞間の接着は段階的に強くなる
と考えられている。従って、本発明において用いられる細胞接着分子としては、そのよう
な一次接着を媒介する因子、二次接着を媒介する因子、またはその両方が一緒に使用され
得る。
、処理後の組織または器官がどの程度損なわれ傷ついているかの指標であり、その組織ま
たは器官の本来の機能を発揮することができるかどうかの指標である。本明細書において
組織損傷率を測定する方法は、当該分野において公知であり、例えば、エラスチン断裂部
位を計数することによって判定することができる。本明細書において用いられる方法では
、一視野を100μm×100μmごとのユニットに区切り、ユニットを単位としてエラ
スチン断裂部位がある場合にカウントして算出した。一視野あたり24ユニットが存在し
た。HE染色により組織切片における細胞外マトリクスの検鏡により計数し、未処理組織
を0%となるように規定し、損傷率=x/24で算出する。この場合未処理をx=0とし
て規定する。
その組織または器官の物理的強度である。組織強度は一般に、引っ張り強さ(例えば、破
断強度、剛性率、ヤング率など)を測定することによって判定することができる。そのよ
うな一般的な引っ張り試験は周知である。一般的な引っ張り試験によって得られたデータ
の解析により、破断強度、剛性率、ヤング率などの種々のデータを得ることができ、その
ような値もまた、本明細書において組織強度の指標として用いることができる。本明細書
では、通常、臨床適用することができる程度の組織強度を有することが必要とされる。
性を測定することによって測定することができる。手短に述べると、試料に荷重を加え、
例えば、1chは歪み、2chは荷重の各々のAD変換器(例えば、ELK−5000)
に入力して、応力および歪みの特性を測定することによって引っ張り強さを決定すること
ができる(図40)。引っ張り強さはまた、クリープ特性を試験することによっても達成
することができる。クリープ特性インデンテーション試験とは、一定の荷重を加えた状態
で時間とともにどのように伸びていくかを調べる試験である。微小な素材、薄い素材など
のインデンテーション試験は、先端の半径0.1〜1μm程度の、例えば、三角錐の圧子
を用いて実験を行う。まず、試験片に対して圧子を押し込み、負荷を与える。そして、試
験片に数十nmから数μm程度押し込んだところで、圧子を戻し除荷する。このような試
験方法によって得られる荷重除荷曲線を図41に示す。この曲線から得られた負荷荷重と
押し込み深さの挙動とによって硬さ、ヤング率などを求めることができる。
は、通常移植を目的とする部分の天然の強度の少なくとも約50%であり、好ましくは少
なくとも約60%であり、より好ましくは約70%、さらに好ましくは約80%であり、
もっとも好ましくは少なくとも約100%である。
用が意図される部分(例えば、心臓など))が有する組織強度の少なくとも約75%以上
、好ましくは約80%以上、より好ましくは約85%以上、さらに好ましくは約90%以
上であり得、天然の組織が有する組織強度以上の値を有していてもよい。ここで、天然の
組織が有する組織強度とは、その天然での状態で所望の目的の組織が有する組織強度をい
う。十分に強い組織強度は、膜状以外の組織(例えば、管状組織)を適用する場合にも有
することが好ましい特性である。管状組織の場合、組織強度は、β値で表すことができる
。β値の算出方法は、本明細書の別の場所において詳述し、実施例においても例示した。
ある実施形態において、本発明の人工組織は、約15以上のβ値の組織強度を有し、好ま
しくは、約18以上のβ値の組織強度を有し、より好ましくは約20以上のβ値の組織強
度を有し、さらに好ましくは約22以上のβ値の組織強度を有する。別の実施形態におい
て、本発明の人工組織は、処理前の組織が有していたβ値の少なくとも約75%以上、好
ましくは約80%以上、より好ましくは約85%以上、さらに好ましくは約90%以上で
あり得、未処理状態での(もともと有していた)β値以上の値を有していてもよい。ここ
で、組織が未処理状態での特性(例えば、β値)とは、その組織の処理(例えば、本発明
の1,2−エポキシド高分子での処理)の前(例えば、天然での状態)で有していた特性
をいう。従って、例えば、もともとの組織が25のβ値を有していた場合は、好ましくは
、本発明の人工組織は、17.5以上、好ましくは20以上、より好ましくは21.25
以上、さらに好ましくは22.5以上のβ値を有し得る。
とができる。β値は、P−D(圧力直径)関係を作製した後、
Ln(P/Ps)=β(D/Ds−1) (1)
で算出することができる。PsおよびDsは、100mmHgでの標準値を示す。Pおよ
びD各々のP(圧力)における直径(D)の値を示す。
外室を満たす。この状態から、内室へ圧力を外武装置より加えていくと同時に、その加圧
時の外径をモニタリングする。その測定によって得られる圧力と、外径との関係を上記(
1)の式に導入して、β値を算出する(Sonoda H, Takamizawa K., et al. J. Biomed. M
atr. Res. 2001:266-276)。
substance)とは、細胞または組織に作用する物質をいう。生理活性物質には、
サイトカインおよび増殖因子が含まれる。生理活性物質は、天然に存在するものであって
も、合成されたものでもよい。好ましくは、生理活性物質は、細胞が産生するものまたは
それと同様の作用を有するものである。本明細書では、生理活性物質はタンパク質形態ま
たは核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカ
インは通常はタンパク質形態を意味する。本発明において、生理活性物質は、本発明の人
工組織の移植の際に、定着を促進するためなどに使用され得る。
義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性
物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の
制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調
節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形
態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイ
トカインは通常はタンパク質形態を意味する。
互換的に用いられ、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子
または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添
加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分
化状態の制御因子としても機能することが判明している。
子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては
、代表的には、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞
増殖因子(FGF)、肝実質細胞増殖因子(HGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)の
ような増殖活性を有するものが挙げられる。
(redundancy)があることから、他の名称および機能で知られるサイトカイン
または増殖因子であっても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発
明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本明細書における好ま
しい活性を有してさえいれば、本発明の治療法または医薬の好ましい実施形態において使
用することができる。
(例えば、HGF)を、移植部位(例えば心筋移植部位)に本発明の人工組織または三次
元構造体と同時に投与することによって、人工組織または三次元構造体の定着および移植
部位の機能向上が見られることが明らかにされ、そのような併用療法を提供する。
達過程であって、特徴のある組織または器官を形成する過程をいう。「分化」は、主に発
生学(embryology)、発生生物学(developmental biolo
gy)などにおいて使用されている。1個の細胞からなる受精卵が分裂を行い成体になる
まで、生物は種々の組織および器官を形成する。分裂前または分裂が十分でない場合のよ
うな生物の発生初期は、一つ一つの細胞や細胞群が何ら形態的または機能的特徴を示さず
区別することが困難である。このような状態を「未分化」であるという。「分化」は、器
官のレベルでも生じ、器官を構成する細胞がいろいろの違った特徴的な細胞または細胞群
へと発達する。これも器官形成における器官内での分化という。従って、本発明の人工組
織、三次元構造体は、分化した状態の細胞を含む組織を用いてもよい。
いられ、身体の特定部位に挿入されるべき同種または異種の組織または細胞群あるいは人
工物であって、身体への挿入後その一部となるものをいう。従って、本発明の人工組織、
三次元構造体は、移植片として用いることができる。移植片としては、例えば、臓器また
は臓器の一部、血管、血管様組織、心臓、心臓弁、心膜などが挙げられるがそれらに限定
されない。従って、移植片には、ある部分の欠損部に差し込んで欠損を補うために用いら
れるものすべてが包含される。移植片としては、そのドナー(donor)の種類によっ
て、自己(自家)移植片(autograft)、同種移植片(同種異系移植片)(al
lograft)、異種移植片が挙げられるがそれらに限定されない。
、臓器など)とは、ある個体についていうとき、その個体に由来する移植片(組織、細胞
、臓器など)をいう。本明細書において自己移植片(組織、細胞、臓器など)というとき
は、広義には遺伝的に同じ他個体(例えば一卵」性双生児)からの移植片(組織、細胞、
臓器など)をも含み得る。本明細書では、このような自己との表現は、被験体に由来する
と交換可能に使用される。従って、本明細書では、ある被験体に由来しないとの表現は、
自己ではない(すなわち、非自己)と同一の意味を有する。
であっても遺伝的には異なる他個体から移植される移植片(組織、細胞、臓器など)をい
う。遺伝的に異なることから、同種異系移植片(組織、細胞、臓器など)は、移植された
個体(レシピエント)において免疫反応を惹起し得る。そのような移植片(組織、細胞、
臓器など)の例としては、親由来の移植片(組織、細胞、臓器など)などが挙げられるが
それらに限定されない。
移植片(組織、細胞、臓器など)をいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場
合、ブタからの移植片(組織、細胞、臓器など)は異種移植片(組織、細胞、臓器など)
という。
または移植体(組織、細胞、臓器など)を受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。
これに対し、移植片(組織、細胞、臓器など)または移植体(組織、細胞、臓器など)を
提供する個体は、「ドナー」(供与者)という。
ることができる。なぜなら、本発明の方法により形成された人工組織(例えば、膜状組織
、器官など)は、治療目的に損傷のない程度の組織損傷率を保持しつつ(すなわち、低く
保ちながら)、目的の機能を発揮することができるからである。従って、従来そのままの
組織または臓器自体を移植物として使用するしかなかった状況にあった。このような状況
において、細胞から三次元的に結合した組織を形成することができたことによって、その
ような三次元的な人工組織を用いることが可能になったことは、従来技術では達成するこ
とができなかった本発明の格別の効果の一つといえる。
もいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
本発明の人工組織、三次元構造体、組織グラフトで必要に応じて使用される細胞は、同
系由来(自己(自家)由来)でも、同種異系由来(他個体(他家)由来)でも、異種由来
でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由来の細胞が好ましいが、拒絶反応が問
題でない場合同種異系由来であってもよい。また、拒絶反応を起こすものも必要に応じて
拒絶反応を解消する処置を行うことにより利用することができる。拒絶反応を回避する手
順は当該分野において公知であり、例えば、新外科学体系、第12巻、臓器移植(心臓移
植・肺移植技術的,倫理的整備から実施に向けて)(改訂第3版)、中山書店に記載され
ている。そのような方法としては、例えば、免疫抑制剤、ステロイド剤の使用などの方法
が挙げられる。拒絶反応を予防する免疫抑制剤は、現在、「シクロスポリン」(サンディ
ミュン/ネオーラル)、「タクロリムス」(プログラフ)、「アザチオプリン」(イムラ
ン)、「ステロイドホルモン」(プレドニン、メチルプレドニン)、「T細胞抗体」(0
KT3、ATGなど)があり、予防的免疫抑制療法として世界の多くの施設で行われてい
る方法は、「シクロスポリン、アザチオプリン、ステロイドホルモン」の3剤併用である
。免疫抑制剤は、本発明の医薬と同時期に投与されることが望ましいが、必ずしも必要で
はない。従って、免疫抑制効果が達成される限り免疫抑制剤は本発明の再生・治療方法の
前または後にも投与され得る。
もよい。好ましくは、脊椎動物由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物(例え
ば、霊長類、趨歯類など)由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類由来の細
胞が用いられる。最も好ましい実施形態において、ヒト由来の細胞が用いられる。通常は
、宿主と同じ種の細胞を用いることが好ましい。
、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋
症および拡張型心筋症)を起こした心臓への移植、心膜パッチ、心筋梗塞、下肢、上肢な
どへの血管移植などが挙げられるがそられに限定されない。
とする組織は、どのような種類の生物由来であり得る。本発明が対象とする生物としては
、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする生物は、哺
乳動物(例えば、霊長類、趨歯類など)である。より好ましくは、本発明が対象とする生
物は、霊長類である。最も好ましくは、本発明はヒトを対象とする。
使用について、当該分野において周知の技術を応用して移植などをすることができる。例
えば、ステントレス異種生体弁が当該分野においてよく知られている。異種生体弁では、
ステントの存在で有効な弁ロ面積が小さくなり、また弁葉の石灰化や変性が問題であった
。最近、ブタ大動脈基部の形態を生かし、ステントを用いないステントレス異種生体弁が
大動脈弁位の人工弁として注目されている(Gross C.et al.,Ann T
horac Surg 68:919,1999)。ステントがないことで、小さいサイ
ズの弁を使用せざるを得ない場合でも弁を介した圧較差が少なく、術後の左心室肥大に対
しても有効であると考えられている.また大動脈の基部の弾性が維持され、弁尖にかかる
ストレスが少なくステント付き生体弁に比較して耐久性の向上も期待できる.さらに、感
染による心内膜炎、人工弁感染時にも使用が可能である.現在欧米でのステントレス異種
生体弁の中期術後成績は十分に満足できる報告がなされており、長期成績にも期待できる
(Gross C.et al.,Ann Thorac Surg 68:919,1
999)。
さをいい、代表的には、孔がない部分の長手方向の長さが少なくとも1cm、好ましくは
少なくとも1.5cm、さらに好ましくは少なくとも2cmであることを意味する。この
場合、短手方向の長さもまた、少なくとも1cm、好ましくは少なくとも1.5cm、さ
らに好ましくは少なくとも2cmであることが好ましいが必ずしもそうである必要はない
。面積で表す場合、孔がない部分の内接円の面積が通常少なくとも1cm2であり、好ま
しくは少なくとも2cm2であり、より好ましくは少なくとも3cm2であり、さらに好
ましくは少なくとも4cm2であり、なおさらに好ましくは少なくとも5cm2であり、
最も好ましくは少なくとも6cm2である。
力)などに対して、抵抗性を有することをいう。可擁性を有する人工組織は、移植される
部位が、自律的にまたは他からの影響で運動したり変形したりする場合に好ましい。従っ
て、そのような可擁性を有する人工組織は、移植された後も、可擁性を有することが好ま
しい。
えば、拍動)に対して抵抗性を有する性質をいう。伸縮性を有する人工組織は、移植され
る部位が伸縮性の刺激を伴う場合好ましい。そのような伸縮性の刺激を伴う部位としては
、例えば、心臓、筋肉、関節、軟骨、腱などが挙げられるがそれらに限定されない。1つ
の実施形態では、心臓の拍動運動に耐え得る程度の伸縮性が要求され得る。
中の心筋を除く、任意の部分、組織、細胞、器官を指す。そのような部分、組織、細胞、
器官としては、骨格筋芽細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、幹細胞が挙げられるが、それらに
限定されない。これらの細胞は、成体心臓の心筋に由来する細胞に特徴的なマーカーを有
さない。このようなマーカー(本明細書において「成体心筋マーカー」という)は、成体
心筋に特異的なマーカーであれば、核酸分子(mRNAの発現)、タンパク質、細胞外マ
トリクス、特定の表現型、細胞の形状などどのようなパラメータでも使用することができ
る。従って、本明細書において具体的に記載されていない成体心筋マーカーであっても、
成体心心筋由来であることを示すことができるマーカーであれば、どのようなマーカーを
利用して、本発明の人工組織を判定してもよい。このような成体の心筋以外の部分の代表
例としては、成体の心筋以外の部分が挙げられ、そのような部分としては、例えば、心筋
以外の心臓の部分、間葉系幹細胞またはそれに由来する細胞を含む部分、組織、器官、筋
芽細胞(例えば、骨格筋芽細胞)、線維芽細胞、滑膜細胞などが挙げられるがそれらに限
定されない。従って、このような心筋以外の部分に特徴的な特異的マーカーを発現するも
のを同定することによっても成体の心筋以外の部分であることを確認することができる。
を除く、任意の組織、細胞、器官を指す。そのような組織、細胞、器官としては、骨格筋
芽細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、幹細胞が挙げられるが、それらに限定されない。これら
の細胞は、成体心臓に由来する細胞に特徴的なマーカーを有さない。ここで、成体心臓に
特異的なマーカーであれば、核酸分子(mRNAの発現)、タンパク質、細胞外マトリク
ス、特定の表現型、細胞の形状などどのようなパラメータでも使用することができる。従
って、本明細書において具体的に記載されていない心臓心筋マーカーであっても、成体心
臓由来であることを示すことができるマーカーであれば、どのようなマーカーを利用して
、本発明の人工組織を判定してもよい。このような成体の心臓以外の部分の代表例として
は、成体の心臓以外の部分が挙げられ、そのような部分としては、例えば、間葉系幹細胞
またはそれに由来する細胞を含む部分、組織、器官、筋芽細胞(例えば、骨格筋芽細胞)
、線維芽細胞、滑膜細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、このような
心臓以外の部分に特徴的な特異的マーカーを発現するものを同定することによっても成体
の心筋以外の部分であることを確認することができる。
はまた、骨格筋芽細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、幹細胞などを含む成体の心筋に由来する
細胞または成体心臓に由来する細胞に特徴的なマーカー(本明細書においてそれぞれ「非
成体心筋マーカー」または「非成体心臓マーカー」という)を一定レベル、例えば、特異
的に発現するものの少なくとも約100%未満、好ましくは約80%未満、より好ましく
は約50%未満、さらに好ましくは、約25%未満、場合によっては約1%未満発現する
ことによって同定することができる。このようなマーカーとしては、ミオシン重鎖IIa
、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖IId(IIx)、CD56、My0D、Myf5
、my0geninなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において具体
的に記載されていない非成体心臓マーカーであっても、成体心臓以外の由来であることを
示すことができるマーカーであれば、どのようなマーカーを利用して、本発明の人工組織
を判定してもよい。
)、ミオシン重鎖IIb(ヒト:アクセッション番号NM_017533;配列番号3および4)、ミオ
シン重鎖IId(IIx)(ヒト:アクセッション番号NM_005963;配列番号5および6)とは、
であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである(Havenith MG, Visser R, Schrijvers-van
Schendel JM, Bosman FT. Muscle fiber typing inroutinely processed skeletal muscl
e with monoclonal antibodies. Histochemistry. 1990;93(5): 497-9)。このマーカー
は、主にタンパク質の存在を見ることによって確認することができる。ミオシン重鎖IIa
、ミオシン重鎖IIbおよびミオシン重鎖IId(IIx)に対する抗体としては、たとえば、Sig
maから入手可能なMY-32などがあり、この抗体は、骨格筋特異的で心筋は染めない(Webst
er C, Pavlath GK, Parks DR, Walsh FS, Blau HM, Exp Cell Res. 1988 Jan; 174(1):25
2-65;およびHavenith MG, Visser R, Schrijvers-van Schendel JM, B0sman FT, 1990;9
3(5):497-9)。
芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にmRNAの存在を見ることによ
って確認することができる。
筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にmRNAの存在を見ることに
よって確認することができる。
あり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にmRNAの存在を見る
ことによって確認することができる。
とは、であり、筋芽細胞に特異的なマーカーである。このマーカーは、主にmRNAの存
在を見ることによって確認することができる。
うなマーカーとしては、例えば、胚性幹細胞については0ct−3/4、SSEA−1、
Rex−1、0tx2などが挙げられ;内皮細胞についてはVE一カドヘリン、Flk−
1、Tie−1、PECAM1、vWF、c−kit、CD34、Thy1、Sca−1
などが挙げられ;骨格筋について上述のもののほか骨格筋αアクチンなどが挙げられ;神
経細胞についてNestin、Gluレセプター、NMDAレセプター、GFAP、ニュ
ーレグリンー1などが挙げられ;造血細胞系についてc−kit、CD34、Thy1、
Sca−1、GATA−1、GATA−2、F0Gなどが挙げられる。
々存在していた細胞塊、組織、器官などから分離、単離、または抽出されたこと、あるい
はその細胞が、幹細胞から誘導されたことを意味する。
うな能力を意味する。このような心臓に適用可能な組織は、拍動する場合の伸縮に耐え得
る強度を有することになる。ここでは、心臓への適用可能性は、心筋への適用可能性を含
む。心臓に適用可能かどうかは、移植後に移植されたレシピエントが生存しているかどう
かを確認することによって判定することができる。
配向を保持している細胞を含む、三次元方向に広がる物体を指す。この用語は、任意の形
(例えば、シート状など)の物体を包含する。そのようなシート状構造体は、一層でも複
数層でもあり得る。
ような細胞シートは、少なくとも二次元の方向に生物学的結合を有する。生物学的結合を
有するシートは、製造された後、単独で扱われる場合でも、細胞相互の結合が実質的に破
壊されないことが特徴である。そのような生物学的結合には、細胞外マトリクスを介した
細胞間の結合が含まれる。
の間に生物学的になんらかの相互作用があることをいう。そのような相互作用としては、
例えば、生体分子(例えば、細胞外マトリクス)を介した相互作用、情報伝達を介した相
互作用、電気的相互作用(電気信号の同期などの電気的結合)が挙げられるがそれらに限
定されない。相互作用を確認する場合は、その相互作用の特性によって適切なアッセイ方
法を用いる。例えば、生体分子を介した物理的相互作用を確認する場合は、人工組織、三
次元構造体などの強度(例えば、引っ張り試験)を確認する。情報伝達を介した場合は、
シグナル伝達がなされるかどうかを、遺伝子発現などを介して確認する。あるいは、電気
的な相互作用の場合は、人工組織、三次元構造体などにおける電位の状況を測定し、一定
の波をもって電位が伝播しているかどうかを見ることによって確認することができる。従
って、好ましくは、物理的結合は、スキャフォルドなしで結合しているかどうかを見るこ
とによって判定することができる。本発明において、通常生物学的結合は、少なくとも二
次元方向にあれば十分であるが、好ましい実施形態では、三次元すべての方向に生物学的
結合を有することが有利であり、そのような場合、三次元構造体を形成し得る。好ましく
は、三次元すべての方向にほぼ均等に生物学的結合を有することが有利であることがある
が、別の実施形態では、二次元方向にほぼ均等に生物学的結合を有するが、第三の方向に
はすこし弱い生物学的結合を有する人工組織、三次元構造体なども使用され得る。
物薬、医薬部外品、水産薬および化粧品等として、公知の調製法により提供され得る。
従って、本発明が対象とする動物は、臓器または器官を有するものであれば、どの生物
(例えば、動物(たとえば、脊椎動物、無脊椎動物))でもよい。好ましくは、脊椎動物
(たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、
鳥類、哺乳動物など)であり、より好ましくは、哺乳動物(例えば、単孔類、有袋類、貧
歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海
牛類、クジラ目、霊長類、趨歯類、ウサギ目など)であり得る。例示的な被験体としては
、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに
限定されない。さらに好ましくは、霊長類(たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト
)が用いられる。最も好ましくはヒトが対象とされ得る。移植治療において限界があるか
らである。
どをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当
該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩
衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的アジュバントが挙げられるが
それらに限定されない。本発明の処置方法において使用される医薬(人工組織、併用され
る医薬化合物など)の量は、使用目的、対象疾患(種類、重篤度など)、患者の年齢、体
重、性別、既往歴、組織の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定すること
ができる。本発明の処置方法を被験体(または患者)に対して施す頻度もまた、使用目的
、対象疾患(種類、重篤度など)、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過な
どを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数
ヶ月に1回(例えば、1週間に1回−1ヶ月に1回)の投与が挙げられる。1週間−1ヶ
月に1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
む医薬を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて被検体に提供することを意味する。
本発明の人工組織は、以下のような治療部位(例えば、障害心臓など)への導入方法,導
入形態および導入量が使用され得る。すなわち、本発明の人工組織および三次元構造体の
投与方法としては、例えば心筋梗塞、狭心症等で虚血性の障害を受けた心筋組織の障害部
位への直接貼付、貼付後に縫合、挿入等の方法があげられる。組み合わせは、例えば、混
合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して;または逐次的にかのいずれか
で投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提
示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に(例えば、人工組織などが直
接手術によって提供され、他の薬剤は静脈注射によって与えられる場合)投与される手順
もまた含む。「組み合わせ」投与は、第1に与えられ、続いて第2に与えられる化合物また
は薬剤のうちの1つを別々に投与することをさらに含む。
。
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法
などを医師、患者など投与を行う人、診断する人(患者本人であり得る)に対して記載し
たものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言
が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁(例えば、日本であ
れば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局(FDA)など)が規定した様式に従って作
製され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書
(package insert)であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定さ
れず、例えば、電子媒体(例えば、インターネットで提供されるホームページ(ウェブサ
イト)、電子メール)のような形態でも提供され得る。
応答して、その刺激のある前とその刺激を受けた後との形状および/または」性質が変化
するものをいう。そのような刺激としては、光照射、電場印加、温度変化、pH変化、化
学物質の添加などが挙げられるがそれに限定されない。刺激応答性高分子としては、例え
ば、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド
−アクリル酸)共重合体、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレー
ト)共重合体、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム)共重合
体、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−ビニルフェロセン)共重合体、γ線照射し
たポリ(ビニルメチルエーテル)(PVME)、ポリ(オキシエチレン)、核酸などの生
体物質を高分子に組み込んだ樹脂、および上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製
したゲルなどが挙げられるがそれらに限定されない。
は」性質を変化させる性質を有する高分子をいう。温度応答性高分子としては、例えば、
ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−ア
クリル酸)共重合体、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート)
共重合体、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム)共重合体、
ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−ビニルフェロセン)共重合体、γ線照射したポ
リ(ビニルメチルエーテル)および上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製したゲ
ルなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、例えば、ポリ(N−イソプロ
ピルアクリルアミド)、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−メチルメタクリレート
)共重合体、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸ナトリウム)共重合体
および上記高分子に対して架橋剤によって架橋し作製したゲルなどが挙げられるがそれら
に限定されない。本明細書において使用される温度応答性高分子としては、例えば、水に
対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が0〜80℃であるものが挙げられるが
それらに限定されない。ここで、臨界溶解温度とは、形状および/または性質を変化させ
る閾値の温度をいう。本明細書では、好ましくは、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミ
ド)が使用され得る。
るが、温度が上がると脱水和して収縮する感熱性の高分子ゲルとなることが知られている
。ゼリーのように均質透明なPVMEゲルを温めると白濁し透明性が変化する。多孔質構
造のゲルを調製したり、繊維または粒子などの小さな形に成形すると高速で伸縮するよう
になる。このような多孔質構造をもつ繊維状PVMEゲルの場合、伸縮速度は1秒末満と
いう速さであるといわれる(http://www.aist.go.jp/NIMC/overview/v27-j.html、特開2
001−213992号および特開2001−131249号参照)。N−イソプロピル
アクリルアミドゲル(すなわち、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド))もまた、温
度応答性ゲルとして知られる。ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)に対して、疎水
性のモノマーを共重合させると、形状および/または」性質が変化する温度を低下させる
ことができ、親水性のモノマーを共重合させると形状および/または」性質が変化する温
度を上げることができる。これを利用して、所望の刺激に応答した充填剤を調製すること
ができる。このような手法は、他の温度応答性高分子に対しても適用することができる。
れ、タンパク質の分解を触媒する酵素をいい、プロテアーゼとも呼ばれる。
本明細書において「規則的配列」フィルムとは、ある一定の規則によって配列される構
造を有するフィルムをいう。このようなフィルムには、ハニカム構造、ライン構造、ドッ
ト構造などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の人工組織は、好ましくは、こ
のような規則的配列を用いて生産される。このようなフィルムは、生分解性材料(例えば
、ポリ−L−乳酸(PLLA)など)を用いて構成することができる。伸展性のフィルム
を作製するためには、ポリ(5−カプロラクトン)(PCL)などを使用することができ
る。
ることが多く、細胞との相互作用において細胞は最良表面の化学的な性質のみならず微細
な形状によっても影響を受けることが知られている。細胞の機能制御を目指すとき、細胞
と接触する材料表面の化学的性質および細胞の微細な構造の双方の設計が重要となる。ハ
ニカム構造を有する多孔性フィルムではハニカムパターンが細胞接着面を提供し、多孔質
構造が細胞の支持基盤へのアクセス、栄養の供給ルートとなることが示されている。従っ
て、1つの実施形態において、本発明では、このようなハニカム構造を利用することが好
ましい。
人工臓器または人工組織が提供される。人工臓器または人工組織等にしたときには体内に
吸収される可能性があることから、この基材は長期的には生体内へ吸収されることが望ま
しい。これまでのハニカム構造を与える材料で細胞培養に要する時間は安定に構造を維持
し、それ以上では分解するような生分解性材料から作られたものは、例えば、特開200
1−157574号、特開2002−335949号などに記載されている。特開200
1−157574号には、生分解性ポリマーが50〜99w/w%および両親媒性ポリマ
ーが50〜1w/w%からなるポリマーの疎水性有機溶媒溶液を、相対湿度50〜95%
の大気下で基板上にキャストし、この有機溶媒を徐々に蒸散させると同時に上記キャスト
液表面で結露させ、上記結露により生じた微小水滴を蒸発させることで得られるハニカム
構造体、並びに上記ハニカム構造体からなるフィルムが開示されている。また、特開20
02−335949号には、この方法で作製したハニカム構造を有するフィルムを用いて
、生体組織に類似した秩序だった細胞の三次元集合体の形成することができることが記載
されている。
または生分解性ポリマーと両親媒性ポリマーとを含むポリマー混合物の疎水性有機溶媒溶
液を基板上にキャストし、上記有機溶媒を蒸散させると同時にこのキャスト液表面で結露
させ、上記結露により生じた微小水滴を蒸発させることにより得られる。
いは、生分解性を有するポリマーと両親媒性を有するポリマーから成る複数のポリマーの
混合物を使用してもよい。
酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレンアジペート、ポリブチレンアジペートなどの生分
解性脂肪族ポリエステル、並びにポリブチレンカーボネート、ポリエチレンカーボネート
等の脂肪族ポリカーボネート等が、有機溶媒への溶解性の観点から好ましい。中でも、ポ
リ乳酸、ポリカプロラクトンが入手の容易さ、価格等の観点から望ましい。
ことを考慮すると毒性のないことが好ましく、ポリエチレングリコール/ポリプロピレン
グリコールブロック共重合体、アクリルアミドポリマーを主鎖骨格とし、疎水性側鎖とし
てドデシル基と親水性側鎖としてラクトース基或いはカルボキシル基を併せ持つ両親媒性
ポリマー、或いはヘパリンやデキストラン硫酸、核酸(DNA、RNAなど)などのアニ
オン性高分子と長鎖アルキルアンモニウム塩とのイオンコンプレックス、ゼラチン、コラ
ーゲン、アルブミン等の水溶性タンパク質を親水性基とした両親媒性ポリマー等を利用す
ることが望ましい。生分解性かつ両親媒性を有する単独のポリマーとしては、例えば、ポ
リ乳酸一ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリ5一カプロラクトンーポリエチ
レングリコールブロック共重合体、ポリリンゴ酸一ポリリンゴ酸アルキルエステルブロッ
ク共重合体などが挙げられる。
えば、虚血性障害が挙げられるが、これに限定されない)を受けた心臓および心筋層を指
す。そのような虚血性障害としては、心筋梗塞、狭心症等が挙げられるが、これらに限定
されない。
団が三次元方向に生物学的結合することを促進させる因子をいう。そのような因子として
は、代表的には、細胞マトリクスの分泌を促進するような因子が挙げられる。そのような
三次元化促進因子としては、例えば、アスコルビン酸またはその誘導体(例えば、アスコ
ルビン酸2リン酸、アスコルビン酸1リン酸、L一アスコルビン酸ナトリウムなど)など
が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、このような三次元化促進因子は、適
用が意図される部分の細胞外マトリクスの組成成分および/またはその量に類似するよう
に細胞外マトリクスの分泌を促す成分(単数または複数)であることが好ましい。そのよ
うな三次元化促進因子が複数の成分を含む場合は、そのような複数成分は、適用が意図さ
れる部分の細胞外マトリクスの組成成分および/またはその量に類似するように組成され
得る。
の類似体(例えば、アスコルビン酸2リン酸、アスコルビン酸1リン酸など)、およびそ
の塩(例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩など)が含まれる。
供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範
囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書
中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである
。
適用可能な三次元構造体を提供する。心臓に適用可能な三次元構造体は、従来成体の心筋
由来の細胞で小型で性能の悪いものが提供されていた。本発明は、特定の培養条件下(例
えば、三次元化促進因子の存在など)で成体(胚でない)の心筋以外の部分に由来する細
胞を含む細胞を培養することにより、世界で初めて心臓に適用可能な三次元構造体を提供
することができたという効果を有する。このような三次元構造体は、細胞を含み、好まし
くは実質的に細胞および細胞に由来する成分(例えば、細胞外マトリクスなど)から構成
される。このように、本発明の三次元構造体は、好ましい実施形態において生体物質から
構成されることから、従来の足場(scaffold)を用いた構造体に比べて、足場に
起因する欠点(例えば、生体適合性の問題、免疫原性の問題など)が解消されるという点
で有利である。
ても分化細胞であっても両方を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、本発明の三次
元構造体が含む細胞は、間葉系細胞である。理論に束縛されないが、間葉系細胞が好まし
いのは、間葉系細胞自体が心臓と適合性が優れているからであり、心臓へ分化する能力を
有し得るからである。
本発明において使用される間葉系細胞としては、例えば、骨髄、脂肪細胞、滑膜細胞、
などが挙げられるがそれらに限定されない。
とが好ましい。筋芽細胞を用いた三次元構造体が心臓において適用可能であることは、従
来予測不可能であったことであり、驚くべき効果であるといえる。筋芽細胞が好ましい理
由としては、例えば、供給源が豊富であることが挙げられるがそれに限定されない。
。骨格筋芽細胞は、豊富に存在することから容易に入手可能な供給源として好ましい。ま
た、骨格筋芽細胞は、本発明において初めて実証されるように、心臓に対する移植可能性
が示されたことから、実際の医療に使用可能である。
移植手術を行わなくても、欠陥心臓を修復することができる。
別の実施形態において、本発明において使用される細胞は、線維芽細胞であってもよい
。線維芽細胞もまた、三次元構造体において三次元方向に生物学的結合を有することが確
認されたからである。ただし、線維芽細胞を用いた三次元構造体は、心臓用途に使用する
ことができる。あるいは、このような滑膜細胞から構成される三次元構造体は、心臓用途
以外にも補強に使用することができる。
滑膜細胞もまた、三次元構造体において、顕著に三次元方向の生物学的結合を有する。従
って、このような滑膜細胞から構成される三次元構造体もまた、心臓用途に使用すること
ができる。あるいは、このような滑膜細胞から構成される三次元構造体は、心臓用途以外
にも補強に使用することができる。
に由来する細胞から構成される三次元構造体は、所望の方向に分化させた細胞を利用する
ことができるからである。従って、心臓に用いる場合は、心臓の分化細胞への分化の方向
に分化させた幹細胞を用いることが好ましくあり得る。そのような分化の手法としては、
LIFを用いて分化させることなどが挙げられるがそれらに限定されない。
れる被験体に由来する細胞であることが有利である。このような場合、本明細書において
使用される細胞は自己細胞ともいわれるが、自己細胞を用いることによって、免疫拒絶反
応を防ぐかまたは低減することができる。
される被験体に由来しない細胞であってもよい。この場合、好ましくは、免疫拒絶反応を
防ぐ手段が講じられることが好ましい。
鎖IIa、ミオシン重鎖IIb、ミオシン重鎖IId(IIx)、CD56、My0D、
Myf5およびmyogeninからなる群より選択される少なくとも1つの非成体心臓
マーカーを発現する。このような非成体心臓マーカーを有することによって、非成体心臓
由来の細胞を用いた三次元構造体であることが確認され得る。本発明の三次元構造体は、
成体の心臓を使用することを回避することによって、心臓治療の可能性を格段に増加させ
たという効果をもたらす。
ルの量で発現されており、通常例えば、非成体心臓の臓器または組織が天然で有するレベ
ルの少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約
70%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、より
好ましくは少なくとも約100%以上のレベルで存在し得る。このようなレベルを確認す
る方法としては、例えば、PCR、ノーザンブロッティングなどのmRNA発現量を確認
するブロッティング、あるいはウェスタンブロッティングなどの発現タンパク質の量を確
認するブロッティングなどが挙げられる。PCRを利用する場合、上述の非成体心臓マー
カーのうち、特異的なプライマーを当該分野において周知の方法によって(例えば、市販
のPCRプライマー設計装置を利用する)設計し、対象となる組織または細胞からmRN
Aを含む試料を抽出しcDNAを当該分野において周知の手法によって調製し、これを用
いて特異的発現の検出を可能にするPCRサイクルを行い、その後増幅された産物を例え
ば電気泳動およびその後の染色によって確認することによって発現レベルを測定すること
ができる。ノーザンブロッティングの場合は、上述の非成体心臓マーカーの核酸配列全部
または一部(特に、特異的検出を可能にするもの)をプローブとして調製し、対象となる
組織または細胞からmRNAを含む試料を抽出し電気泳動によって分離した後、上述のプ
ローブを用いて発現を検出することができる。マーカーがタンパク質発現を伴う場合は、
それに対する特異的抗体を調製し、その抗体を用いてウェスタンブロッティングなどの抗
原抗体反応を用いることによって発現を検出することができる。
ーカーを実質的に含まない。このような成体心臓マーカーを実質的に有しないことによっ
て、非成体心臓由来の細胞を用いた三次元構造体であることが確認され得る。本発明の三
次元構造体は、成体の心臓を使用することを回避することによって、心臓治療の可能性を
格段に増加させたという効果をもたらす。
満で発現されており、通常例えば、成体心臓の臓器または組織が天然で有するレベルの少
なくとも約100%未満、好ましくは少なくとも約80%未満、より好ましくは少なくと
も約50%未満、より好ましくは少なくとも約20%未満、より好ましくは少なくとも約
10%未満、より好ましくは少なくとも約5%未満のレベルで存在する。
臓マーカーを実質的に含まない。成体心臓マーカーすべて確認することによって、成体心
臓以外であることを確認することがより確実にできるからである。ただし、これらすべて
を常に確認する必要があるというわけではない。
ことが好ましい。心筋以外の細胞であれば、本発明において利用可能であるが、心臓由来
の細胞は、その供給源が限定されていること、および自己由来の心臓由来の細胞は実質的
に入手不可能であることから、心臓以外に由来する細胞を用いることが好ましい。
てもよい。好ましくは、本発明の三次元構造体は、心筋へ適用され得る。
1つの実施形態において、本発明の三次元構造体は、少なくとも単層の細胞シートを含
み、ある実施形態では、本発明の三次元構造体は、単層の細胞シートによって構成される
。細胞シートが含まれることによって、本発明の三次元構造体は、無傷であることが保証
され、あるいは、無孔性が保証されるからである。従って、細胞シートを少なくとも単層
で持つ本発明の三次元構造体は、損傷部位を覆う用途において有用である。
好ましくは、この複数の層の細胞シートは、互いに生物学的に結合していることが有利で
ある。生物学的に結合とは、この場合、細胞外マトリクスを介した物理的結合、あるいは
、拍動などの電気的結合であることが好ましいが、それらの結合は、所望とされる部位に
応じて変動する。心臓への移植が意図される場合、このような生物学的結合は、通常電気
的結合を含む。あるいは、このような生物学的結合は、スキャフォルドなしでの結合とい
う側面で記載することができる。
元構造体は、医師などが医療現場で調製してもよく、または、医師が細胞を調製した後、
その細胞を第三者が培養して三次元構造体として調製し、手術に用いてもよい。この場合
、細胞の培養は、医師でなくても、細胞培養の当業者であれば実施することができる。従
って、当業者であれば、本明細書における開示を読めば、細胞の種類および目的とする移
植部位に応じて、培養条件を決定することができる。
用可能な三次元構造体を製造する方法を提供する。この方法は、a)温度応答性高分子を
含む支持体上で成体の心筋以外の部分に由来する細胞を培養する工程;b)培養温度をそ
の温度応答性高分子の臨界溶解温度範囲の外側にする工程(この場合、上限がある場合、
上限以上であり、下限がある場合下限以下);およびc)培養した細胞を三次元構造体と
して剥離する工程を含む。ここで、心筋以外の部分に由来する細胞は、心臓以外の部分に
由来する細胞であり、例えば、間葉系の細胞(例えば、筋芽細胞、骨格筋芽細胞、滑膜細
胞、線維芽細胞)などであり得る。好ましくは、臨界溶解温度の外側とは、水に対する上
限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が0〜80℃である。温度応答性高分子を含む支
持体は、好ましくは、そのような温度応答性高分子がグラフティングされている。
ンパク質分解酵素による処理がなされないことが好ましい。従来の細胞シートなどの調製
方法では、タンパク質分解酵素による処理を行うことによって剥離を容易にしていたが、
これにより細胞シートが損傷を受け、三次元構造体とはなっていなかったという問題があ
った。本発明は、上記のような方法を用いることによって、タンパク質分解酵素による処
理を省くことができ、その結果、損傷のない三次元構造体が提供されたという効果をもた
らす。
)である。ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)は、20℃強という下限臨界溶解温
度を有することから、この場合、通常の培養温度(例えば、37℃前後)から培養液を2
0℃前後にすることによって、容易に三次元構造体を調製することができるという効果が
もたらされる。これによって、移植手術に適用可能な、成体心筋以外に由来する細胞から
構成される三次元構造体が提供された。これにより、従来心臓移植しか助かる道の無かっ
た数多くの疾患(例えば、拡張型心筋症など)にとって、実質的に臓器移植以外の手法が
提供されるという従来の方法では不可能であった治療法を提供する。
促進因子を含むことが好ましい。このような三次元組織化促進因子は、アスコルビン酸ま
たはその誘導体であり得る。
パーゼ、トリプシン等で代表されるタンパク質分解酵素による損傷を受けていないもので
ある。そのため、基材から剥離された人工組織および三次元構造体は、細胞、細胞間のタ
ンパク質(例えば、細胞外マトリクス)が保持された強度ある細胞塊として回収すること
ができ、心筋細胞特有の収縮弛緩機能、細胞間の電気的結合、および配向性等の機能を何
ら損なうことなく保有している。また、三次元構造体においては、例えば、結合組織から
なる膜形成、血管内皮細胞による管腔形成等の生体組織様の幾つかの特徴ある細胞の配列
も認められる。トリプシン等の通常のタンパク質分解酵素を使用した場合、細胞、細胞間
のデスモソーム構造、および細胞、基材間の基底膜様タンパク質等は殆ど保持されておら
ず、従って細胞は個々に分かれた状態となって剥離される。その中でタンパク質分解酵素
であるディスパーゼに関しては、細胞、基材間の基底膜様タンパク質を殆ど破壊してしま
うものの、デスモソーム構造については10℃〜60℃に保持した状態で剥離させること
ができることで知られているが、得られる三次元構造体および人工組織は強度の弱いもの
である。それに対し、本発明の三次元構造体および人工組織は、デスモソーム構造、基底
膜様タンパク質が共に80%以上残存された状態のものであり、その結果上述したような
種々の効果を得ることができるようになる。細胞培養支持体において基材の被覆に用いら
れる温度応答性ポリマーは、水溶液中で上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度0℃〜
80℃、より好ましくは20℃〜50℃を有する。上限臨界溶解温度または下限臨界溶解
温度が80℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。また、上限臨界
溶解温度または下限臨界溶解温度が0℃より低いと一般に細胞増殖速度が極度に低下する
か、または細胞が死滅してしまうため、やはり好ましくない。
。このような重合体としては、上述のほかに、例えば、特開平2−211865号公報に
記載されいる重合体が挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合また
は共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、(メタ)アクリルア
ミド化合物、N−(若しくはN,N−ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、
またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コ重合体の場合は、これらのうちの任意の2種
以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、重合
体同士のグラフトまたは共重合、あるいはホモポリマー、コポリマーの混合物を用いても
よい。また、重合体本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。被覆を施
される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポ
リメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例
えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
211865号公報に記載されている方法に従ってよい。すなわち、被覆は、基材と上記
モノマーまたは重合体を、電子線照射(EB)、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、
コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混線等の物理的吸着等により
行うことができる。
、細胞培養皿)で行われる。培地温度は、基材表面に被覆された前記重合体が上限臨界溶
解温度を有する場合はその温度以下、また前記重合体が下限臨界溶解温度を有する場合は
その温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、
あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでも
ない。温度以外の培養条件は、当該分野において周知の技術を用いることができ、特に制
限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎仔血清(FCS
)等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無
血清培地でもよい。
合わせて培養時間を設定すれぱよい。培養した人工組織または三次元構造体を支持体材料
から剥離回収するには、培養された人工組織もしくは三次元構造体をそのまま、または必
要に応じ高分子膜に密着させ、細胞の付着した支持体材料の温度を支持体基材の被覆重合
体の上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって、培養され
た細胞シートまたは三次元構造体を単独で、若しくは高分子膜に密着させた場合はそのま
ま高分子膜とともに剥離することができる。なお、人工組織または三次元構造体を剥離す
ることは細胞を培養していた培養液において行うことも、その他の等張液において行うこ
とも可能であり、目的に合わせて選択することができる。また、必要に応じ細胞シートま
たは三次元構造体を密着させる際に使用する高分子膜としては、例えば、親水化処理が施
されたポリビニリデンジフルオライド(PVDF)、ポリプロピレン、ポリエチレン、セ
ルロースおよびその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、和紙等の紙類、ウレタン、
スパンデックス等のネット状・ストッキネット状高分子材料を挙げることができる。ここ
で、ネット状、ストッキネット状高分子材料であれば人工組織および三次元構造体は自由
度が増し、収縮弛緩機能を更に増大させることができる。本発明における細胞の人工組織
および三次元構造体の製法は特に限定されるものではないが、例えば、上記した高分子膜
に密着した培養細胞シートを利用することで製造することができる。
たたいたり、ゆらしたりする方法、さらにはピペットを用いて培地を撹拝する方法等を単
独で、あるいは併用して用いてもよい。加えて、必要に応じて人工組織および三次元構造
体は、等張液等で洗浄して剥離回収してもよい。基材から剥離された人工組織、または三
次元構造体は、特定方向に引き伸ばすことで、さらに配向された細胞シートまたは三次元
構造体となる。その引き伸ばす方法は、何ら制約されるものではないが、テンシロンなど
の引っ張り装置を用いる方法、あるいは、単純にピンセットで引っ張る方法等が挙げられ
る。配向させることで、細胞シートおよび三次元構造体自身の動きに方向性を持たせるこ
とができ、このことは、例えば、特定の臓器の動きに合わせて、人工組織あるいは三次元
構造体を重ね合わせることを可能とするため、人工組織あるいは三次元構造体を臓器に適
用する場合に効率が良い。
ったものである。得られた人工組織あるいは三次元構造体は従来技術では断絶された基底
膜を保持している為、心臓、骨、筋肉、腕、肩、足、その他のいかなる臓器等、生体内の
どこに埋入しても、周囲の組織に良く生着し、それぞれの場合で脈を打ち続ける。理論に
束縛されないが、これは、生体内に埋入された人工組織あるいは三次元構造体が、生体組
織に生着すると同時に、収縮弛緩することで低酸素状態となり、それを補うために生体組
織側より積極的に血管内皮細胞が進入し、血管が形成され、血液を介して酸素のみならず
栄養分も十分に補給された結果と考えられる。以上より、生体内に埋入された人工組織お
よび三次元構造体により、生体内で機能性組織が形成されることとなる。それらは移植用
等の臨床応用が強く期待される。具体的には、本発明の人工組織、三次元構造体あるいは
組織を心臓の収縮力の弱まった部位に移植することで、心筋梗塞等の心疾患等に対する治
療用用具として、あるいはそれらを血管の周囲に当てることで血行を改善させることがで
き、例えば、重度のレイノウ、重度な肩こり、さらには大動脈の機能不全等の治療用具と
して有用なものとなる。なお、本発明の方法において使用される細胞培養支持体は繰り返
し使用が可能である。
別の局面において、本発明は、人工組織を生産するための方法を提供する。この人工組
織生産法は、A)細胞を提供する工程;B)該細胞を、三次元化促進因子を含む細胞培養
液を収容する、所望の人工組織のサイズを収容するに十分な底面積を有する容器に配置す
る工程;およびC)該容器中の該細胞を、該所望の大きさのサイズを有する人工組織を形
成するに十分な時間培養する工程、を包含する。
該分野において周知であり、例えば、組織を摘出してその組織から細胞を分離する方法、
あるいは、血液細胞などを含む体液から細胞を分離する方法、あるいは、細胞株を人工培
養によって調製する方法などが挙げられるがそれらに限定されない。
ような三次元化促進因子としては、例えば、アスコルビン酸またはその誘導体などが挙げ
られ、例えば、アスコルビン酸1リン酸、アスコルビン酸2リン酸、L−アスコルビン酸
などが挙げられるがそれらに限定されない。
地であってもよいが、例えば、DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、
MCDB104、199、MCDB153、L15、SkBM、Basal培地などを適
宜グルコース、FBS(ウシ胎仔血清)、抗生物質(ペニシリン、ストレプトマイシンな
ど)を加えてたものが使用され得る。
底面積を有する限り、当該分野において通常使用されるような容器を用いることができ、
例えば、シャーレ、フラスコ、型容器など、好ましくは底面積が広い(例えば、少なくと
も1cm2)容器が使用され得る。その容器の材質もまた、どのような材料を利用しても
よく、ガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリカーボネートなど)、シリコ
ーンなどが用いられ得るがそれらに限定されない。
スコルビン酸2リン酸を含む。従来アスコルビン酸を細胞培養に用いることは知られてい
たが、アスコルビン酸2リン酸を意図的に加えて組織形成を行ったという報告はなされて
いない。本発明では、アスコルビン酸2リン酸を一定量加えることによって、生産される
細胞外マトリクスが多すぎず、その組成も移植可能にする程度となり、従って、細胞と細
胞外マトリクスとの比率が移植可能な程度の強度などを保持させることを達成したという
予想外の効果が奏される。
なくとも0.01mMで存在し、好ましくは少なくとも0.05mMで存在し、さらに好
ましくは少なくとも0.1mMで存在する。より好ましくは少なくとも0.2mMの濃度
で存在することが好ましい。さらに好ましくは、0.5mMの濃度、さらにより好ましく
は1.0mMの濃度で存在することが好ましい。
ン酸と共存して用いられる。この場合、使用されるアスコルビン酸1リン酸とアスコルビ
ン酸2リン酸とは、特定の比率で用いることが好ましくあり得る。そのような好ましい比
率としては、例えば、1:10〜10:1の範囲内が挙げられる。あるいは、好ましい比
率としては、アスコルビン酸1リン酸のモル量がアスコルビン酸2リン酸よりも少ないと
いう関係を挙げることができる。
酸2リン酸を含む。アスコルビン酸2リン酸を明示的に加えて組織形成を行ったという報
告はなされていない。本発明では、アスコルビン酸2リン酸を一定量加えることによって
、生産される細胞外マトリクスが多すぎず、その組成も移植可能にする程度となり、従っ
て、細胞と細胞外マトリクスとの比率が移植可能な程度の強度などを保持させることを達
成したという予想外の効果が奏される。
りも少ない場合、本発明において使用されるアスコルビン酸2リン酸は、通常少なくとも
0.01mMで存在し、好ましくは少なくとも0.05mMで存在し、さらに好ましくは
少なくとも0.1mMで存在する。より好ましくは少なくとも0.2mMの濃度で、さら
に好ましくは少なくとも0.5mMの濃度で存在することが好ましい。さらにより好まし
くは1.0mMの濃度で存在することが好ましい。
ビン酸1リン酸またはその塩、アスコルビン酸2リン酸またはその塩およびL−アスコル
ビン酸またはその塩を含む。
されることが好ましい。あるいは、別の好ましい実施形態では、この容器は、ハニカム構
造をした足場が敷かれていることが好ましいがそれに限定されない。ハニカム構造の利用
については、例えば、田中賢ら、「新しいバイオメディカルインターフェイス」化学工業
2002年12月号901−906、化学工業社に記載されており、これを参照すること
ができる。
ロピルアクリルアミド)を含む。
好ましい実施形態では、本発明の人工組織生産法では、培養した工程に続き、D)人工
組織を剥離させ自己収縮させる工程、をさらに含む。剥離は、物理的な刺激(例えば、容
器の角に棒などで物理的刺激を与えるなど)を行うことによって促進することができる。
温度応答性高分子を用いる場合、その臨界溶解温度よりも高いまたは低い温度に環境を操
作することによって、剥離を促進することができる。自己収縮は、このような剥離の後自
然に起こる。自己収縮により、特に第三次元方向(シート上の組織に関する場合、二次元
方向と鉛直な方向)の生物学的結合が促進される。このようにして製造されることから、
本発明の人工組織は、三次元構造体という形態をとるといえる。
動するが、好ましくは少なくとも3日間を意味するが、それ以上であってもよく、それ以
下であってもよい。3日間培養することによって、少なくとも心臓の補強に使用すること
ができる程度の移植片を調製することができるからである。
能的人工組織は、移植可能な人工組織である。これまでも細胞培養によって人工組織を作
製することが試みられているが、いずれも、大きさ、強度、はがすときの物理的損傷など
によって移植に適した人工組織とはなっていなかった。本発明は、上述のような三次元化
促進因子の存在下で細胞を培養することによって、大きさ、強度などの点で問題が無く、
剥離させるときに特に困難を伴わない組織培養方法が提供された。このような組織培養法
が提供されたことによって、初めて移植可能な人工組織が提供されたことになる。従来、
臓器移植のみに頼っていた疾患(例えば、難治」性心疾患(心筋炎、肥大型心筋症、拡張
相肥大型心筋症、拡張型心筋症など))にとっては、それ以外の汎用性のある治療法が提
供されることになり、その有用性は計り知れない。
な心疾患としては、心不全、心筋梗塞、心筋症などが挙げられる。本発明の併用療法は、
組織傷害の再生を目的とする限り、心臓以外の臓器の傷害を再生するためにも適用され得
る。特定の実施形態において、本発明の方法が対象とする疾患は、難治性心不全である。
、全身の臓器へ必要な量および質の血液を循環し得なくなった状態をいう。心不全は、心
筋梗塞、心筋症などの心臓疾患の末期の症状である。重症心不全とは、その程度が重症で
あるものをいい、末期心不全ともいう。
い、慢性心不全または末期的心不全とほぼ同義に用いられる。このような難治性心不全は
、通常のジギタリス薬、利尿薬、ACE阻害薬などを用いるトリプルセラピー、β遮断薬
を加えた薬物治療ではコントロールできない。これらの治療には、IABP(intra
−aortic balloon pumping)またはPCPS(percutan
eous cardiopulmonary support)などによる機械的循環補
助、あるいは心臓移植を必要とすることから、簡便でかつ根本的な治療の開発が求められ
ていた。特に、心臓移植は、ドナー不足が深刻であり、心臓移植適応除外症例(たとえば
、高齢者、透析症例など)の場合は難治性心不全は大きな問題となっており、心臓移植代
替治療が切望されている。
に虚血性壊死が生じる疾患である。心筋梗塞の重傷度判定には、種々の分類がある。その
ような分類としては、例えば、時間的経過による分類、形態学的分類(心筋層内範囲、部
位、壊死の大きさなど)、心筋の壊死形態、梗塞後の心室再構築、血行動態的分類(治療
、予後などに関連する)、臨床的重症度による分類などが挙げられる。ここで重症度が高
いものを特に重症心筋梗塞という。
圧、代謝異常症、虚血などの基礎疾患に続発する二次性心筋症、および見かけ上の基礎疾
患なしに発症する突発性心筋症に分類される。病理的変化としては、心筋肥大、線維化、
変性などが認められる。
症」とも言われる。本明細書において「DCM」(dilated cardiomyo
pathy)と略することがある。拡張型心筋症では、収縮不全が伴い、慢性心不全をき
たす。病因としては、たとえば、ウイルス感染、遺伝子変異など多様なものが挙げられる
。一般的には、他に明らかな一義的原因のある虚血性心筋症、代謝異常などに伴う心筋疾
患などの特定心筋疾患(従来、二次性心筋疾患と称されていた疾患)は含まれないとされ
るが、本発明の目的では、その治療効果が示される限り、本発明の範囲内に入る。大部分
の患者は全体に収縮力低下を示すが孤立性に部分的壁運動異常が起こることもあるといわ
れる。通常はうっ血を伴う心不全徴候を示すが,低心拍出量状態を現す倦怠感を示すこと
もある。拡張型心筋症は、原因不明で、特発性の心筋疾患である。主な病態は心筋収縮力
の低下であり、その結果左室内腔の拡大をきたす。左室拍出血液量の減少、左室拡張期圧
の上昇などを起こす。発症は急性または潜行性であり、末期では難治性心不全を呈するこ
とが多い。病理組織学的には,びまん性にあるいは局所的に心筋組織の変性、線維化、萎
縮が認められる。残存心筋細胞が肥大している例も多い。心不全のほか重篤な不整脈、血
栓塞栓症をきたし,予後はきわめて不良である。診断上とくに有用なものは心エコー図で
あり、びまん性壁運動の低下、心室壁の非薄化、心室内腔の拡大を証明する。これに冠動
脈造影術にて冠動脈病変の否定、心筋生検(心筋バイオプシー)を行うことによりより確
実に診断することができる。従って、本発明では、心臓超音波検査、心臓カテーテル検査
、核医学検査(心筋シンチ検査)、心筋生検など当該分野において周知の検査手法を行う
ことによって拡張型心筋症の改善を確認することができる。
法、塩分・水分摂取制限、運動制限などの生活指導が行われているが、いずれも疾患その
もののに対する治療ではない。不整脈に対してはアミオダロンなどの抗不整脈投与が行わ
れているが、これも対症療法としかなり得ない。血栓、塞栓にはワルファリンなどの抗凝
固薬が使用されるが、これも対症療法に過ぎない。外科的療法として、ぺースメーカー、
埋め込み型除細動器、補助循環装置(バイパス)、心臓移植などが行われているが、心臓
移植以外は根治的とはいえず、ドナー不足が深刻な現在、心臓移植にも限界が存在する。
本発明の治療技術は、このような拡張型心筋症などにも有効であり、画期的な治療効果を
もたらす。
M)は、心筋の異常な肥厚および左心室肥大による拡張期コンプライアンスの低下を主な
症状とする心筋症をいう。心収縮機能は通常保たれている。5年および10年の生存率は
、それぞれ約90%、約80%であり、良好であるが、突然死の原因とされており、臨床
上の問題となっていることから、その根治的治療が求められている。本発明の治療技術は
、このような肥大型心筋症などにも有効であり、画期的な治療効果をもたらす。
室壁の非薄化、収縮力の低下が生じ、心室内腔の拡張をきたして拡張型心筋症のような症
状を呈したものをいう。きわめて予後不良といわれているが、無症状のものも多数存在し
ており、臨床上の問題となっている。従って、この拡張相肥大型心筋症もまた、根治的治
療が求められている。本発明の治療技術は、このような拡張相肥大型心筋症などにも有効
であり、画期的な治療効果をもたらす。
の治療2002−2003、篠山重威、矢崎義雄編、南江堂、2002などに記載されて
いる。つい最近に刊行された循環器疾患最新の治療2002−2003、篠山重威、矢崎
義雄編、南江堂、2002に記載されているように、難治性心不全については、根治的治
療法がなく、本発明はこのような心疾患、特に難治性心不全に対して初めて治療法を提供
したという効果を奏する。
は、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状
態が起こらないようにするか、そのような状態を低減した状態で生じさせるかまたはその
状態が起こることを遅延させるように処置することをいう。
た場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好まし
くは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。本明細書では「根治的治療」とは
、病的過程の根源または原因の根絶を伴う治療をいう。従って、根治的治療がなされる場
合は、原則として、その疾患の再発はなくなる。
治療後の状態を診断または処置することをいう。
好ましい実施形態では、本発明の人工組織は、三次元方向に生物学的に結合されている
。ここで、生物学的結合は、本明細書において他の場所において説明されており、例えば
、細胞外マトリクスによる物理的結合、電気的結合などが挙げられるがそれらに限定され
ない。本発明では特に、組織の強度という点から細胞外マトリクスによる物理的結合が重
要である。
う点で異なるということができる。
好ましくは、本発明の人工組織は、実質的に細胞または該細胞に由来する物質から構成
される。実質的に細胞および細胞に由来する物質(例えば、細胞外マトリクス)のみから
構成されることによって、生体適合性および生体定着性を上げることができる。ここで、
細胞に由来する物質は、代表的に細胞外マトリクスを含む。特に、人工組織では、細胞と
細胞外マトリクスが適切な割合で含まれていることが好ましい。そのような適切な割合と
は、例えば、細胞と細胞外マトリクスとの比が1:9〜9:1、好ましくは、3:7〜7
3、より好ましくは3:7〜5:5程度である。好ましい比率は、目的とする処置によっ
て変動するが、そのような変動は、当業者には自明であり、目的とする臓器における細胞
および細胞外マトリクスの比率を調査することによって、推定することができる。
は、この場合、培養に用いた足場、支持体、培養液などから分離されていることを意味す
る。足場などの物質が実質的に存在しないことによって、本発明の人工組織は、移植後の
免疫拒絶反応、炎症反応などの有害反応を抑えることができる。
工組織は、本発明において初めて提供された、三次元化促進因子を用いた人工組織生産法
によって実質的に初めて提供可能となった。なぜなら、従来は、人工組織を培養環境から
剥離する際、どうしても組織そのものに物理的刺激を与えざるを得ず、その際必然的に傷
が付かざるを得ない状態になっていたからである。従って、従来方法で調製された細胞シ
ートは、複数重ねて利用するということが試みられていた。しかし、複数重ねて使用して
も実際の移植に容易に利用できる状態にならない。従って、このような問題点を本発明の
人工組織はこの無傷性によって達成する。
象の部位を覆うに十分な面積を有することをいう。そのような面積は、例えば、少なくと
も1cm2以上であり、より好ましくは、少なくとも2cm2以上であり、少なくとも3
cm2以上であり、少なくとも4cm2以上であり、さらに好ましくは少なくとも5cm
2以上であり、あるいは少なくとも6cm2以上であることがさらに好ましい。
象の部位を覆うに十分な強度を有する程度の厚みをいう。そのような面積は、例えば、少
なくとも約50μm以上であり、より好ましくは、少なくとも約100μm以上であり、
少なくとも約200μm以上であり、少なくとも約300μm以上であり、さらに好まし
くは少なくとも約400μm以上であり、あるいは少なくとも約500μmまたは約1m
mであることがさらに好ましい。
るからである、特に、覆う必要がある袋状組織の欠損部位を補強するために好ましい。
別の実施形態において、本発明の人工組織は、可擁性である。可擁性であることによっ
て、特に、運動性の臓器の補強に適切となる。そのような臓器としては、例えば、心臓、
血管、筋肉などが挙げられるがそれらに限定されない。
別の実施形態において、本発明の人工組織は、伸縮性を有する。伸縮性を有することに
よって、伸び縮みする臓器、例えば、心臓、筋肉などにおける適用が可能となる。このよ
うな伸縮性は、従来の方法で調製された細胞シートなどでは達成されなかった性質である
。好ましくは、本発明の人工組織は、心臓の拍動運動に耐え得る強度を有する。そのよう
な拍動運動に耐え得る強度とは、例えば、少なくとも天然の心筋が有する強度の少なくと
も約50%以上、好ましくは少なくとも約75%以上、より好ましくは少なくとも約10
0%以上であることが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましい実施形態において、本発明の人工組織は、三次元方向すべてに生物学的結合が
ある。従来の方法で調製された人工組織は、二次元方向には生物学的結合がある程度見ら
れるものがあったが、三次元方向にあった組織は調製されていない。従って、本発明の人
工組織は、このように三次元方向すべての生物学的結合を有することによって、どのよう
な用途においても実質的に移植可能という性質がもたらされる。
相互結合、電気的結合、細胞間情報伝達の存在が挙げられるがそれらに限定されない。細
胞外マトリクスの相互作用は細胞間の接着を顕微鏡で適宜染色して観察することができる
。電気的結合は、電位を測定することによって観察することができる。
を有する。臨床適用することができる組織強度は、適用が意図される部位に応じて変動す
る。そのような強度は、当業者が本明細書の開示を参照して、当該分野における周知技術
を参酌することによって決定することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明
において要求される強度は、臨床適用が意図される部分の組織強度の少なくとも80%以
上である。
って、心臓以外の部分への適用が企図される。
別の局面において、本発明は、細胞から人工組織を生産するための細胞培養組成物を提
整理番号=FI05040CIVPCT/P2004/00I024提出日=平成18年1月17日34供する。この細胞
培養組成物は、細胞を維持または増殖させるための成分(例えば、市販される培地など)
;および三次元化促進因子を含む。このような三次元化促進因子に関する説明は、上述の
人工組織生産法において詳述した。従って、この三次元化促進因子は、アスコルビン酸ま
たはその誘導体(例えば、アスコルビン酸1リン酸またはその塩、アスコルビン酸2リン
酸またはその塩、L一アスコルビン酸またはその塩など)を含む。ここで、本発明の培養
組成物において含まれるアスコルビン酸2リン酸またはその塩は、少なくとも0.1mM
で存在するか、あるいは濃縮培養組成物の場合は、調製時に少なくとも0.1mMとなる
ように含まれている。あるいは、この最低限度の濃度は、0.01mM、0.05mMで
あり得、または0.2mM、もしくは0.3mMであり得る。さらに好ましくは最低限度
の濃度は、0.5mMであり得、あるいは1.0mMであり得る。
ビン酸1リン酸またはその塩およびアスコルビン酸2リン酸またはその塩を含む。
本発明において使用されるアスコルビン酸2リン酸は、アスコルビン酸1リン酸と共存
して用いられる。この場合、使用されるアスコルビン酸1リン酸とアスコルビン酸2リン
酸とは、特定の比率で用いることが好ましくあり得る。そのような好ましい比率としては
、例えば、1:10〜10:1の範囲内が挙げられる。あるいは、好ましい比率としては
、アスコルビン酸1リン酸のモル量がアスコルビン酸2リン酸よりも少ないという関係を
挙げることができる。
酸2リン酸を含む。アスコルビン酸2リン酸を明示的に加えて組織形成を行ったという報
告はなされていない。本発明では、アスコルビン酸2リン酸を一定量加えることによって
、生産される細胞外マトリクスが多すぎず、その組成も移植可能にする程度となり、従っ
て、細胞と細胞外マトリクスとの比率が移植可能な程度の強度などを保持させることを達
成したという予想外の効果が奏される。
なくとも0.01mMで存在し、好ましくは少なくとも0.05mMで存在し、さらに好
ましくは少なくとも0.1mMで存在する。より好ましくは少なくとも0.2mMの濃度
で、さらに好ましくは少なくとも0.5mMの濃度で存在することが好ましい。さらに好
ましくは最低限度の濃度は、1.0mMであり得る。
ビン酸1リン酸またはその塩、アスコルビン酸2リン酸またはその塩およびL一アスコル
ビン酸またはその塩を含む。
るための人工組織を提供する。このような補強を行うことができる人工組織は、本発明の
人工組織生産法によって初めて達成された技術である。
または無孔性という性質が人工組織にとって重要であり、そのような性質を有する人工組
織であって、一定の大きさを持つような組織は従来提供されていない。従って、上述のよ
うな本発明の人工組織が提供されたことによって初めて袋状臓器の実質的な治療が可能に
なったといえる。従って、袋状臓器については、特定の疾患(例えば、難治精神疾患(例
えば、拡張型心筋症など)など)の場合、初めて臓器移植以外の治療が可能になったとい
える。
限定されない。
本発明の特定の実施形態において、上記補強は、上記部分を覆うように本発明の人工組
織を配置することによって達成され得る。従来の方法で提供される人工組織は、このよう
な覆うことによる処置(すなわち、「巻く」用法)が不可能であったことから、本発明の
人工組織は、従来技術で達成不可能であった用途を提供することになる。
対して抵抗性を有する。
好ましい実施形態において、本発明の人工組織は、生物学的結合を有することが有利で
ある。
的結合、細胞間の情報伝達のうち少なくとも1つを含む。
別の好ましい実施形態において、本発明の補強用人工組織は、三次元化促進因子の存在
下で細胞を培養することによって形成される。
ト)に由来する細胞(自己細胞)を含む。より好ましくは、本発明の補強用人工組織は、
処置該当される動物(例えば、ヒト)に由来する細胞(自己細胞)のみを細胞として含む
。
方法を提供する。この方法は、A)人工組織を、該部分を覆うように配置する工程;およ
びB)該人工組織と該部分とが生物学的に結合するに十分な時間保持する工程、を包含す
る。ここで、ある部分を覆うように配置することは、当該分野において周知技術を用いて
行うことができる。ここで、十分な時間は、その部分と人工組織との組み合わせによって
変動するが、当業者であれば、その組み合わせに応じて適宜容易に決定することができる
。このような時間としては、例えば、術後1週間、2週間、1ヵ月、2ヵ月、3ヵ月、6
ヵ月、1年などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、人工組織は、好まし
くは実質的に細胞およびそれに由来する物質のみを含むことから、特に術後に摘出する物
質が必要であるというわけではないので、この十分な時間の下限は特に重要ではない。従
って、この場合、長ければ長いほど好ましいといえるが、実質的には極端に長い場合は、
実質的に補強が完了したといえ、特に限定する必要はない。
、肝臓、腎臓など)を含むことが好ましい。そのような袋状組織の補強には、巻くこと(
損傷部分を覆うこと)が必要である。巻く用途で抵抗可能な人工組織は、本発明によって
初めて提供された。従って、本発明の補強方法は、従来達成されなかった画期的な方法を
提供することになる。
有する。このような伸縮の例としては、心臓の拍動運動、筋肉の収縮などが挙げられるが
それらに限定されない。
合(例えば、細胞外マトリクスの相互結合、電気的結合、細胞間の情報伝達など)を含む
。この生物学的結合は、三次元方向すべてにおいて有されていることが好ましい。
胞を培養して本発明の人工組織を形成する工程をさらに包含する。このような三次元化促
進因子の存在下での培養を包含する方法の移植・再生技術は、従来提供されていなかった
方法であり、このような方法によって、従来治療が不可能とされていた疾患(例えば、難
治性心疾患(例えば、拡張型心筋症など))を治療することができるようになった。
用される細胞は、移植が意図される動物に由来する細胞(すなわち、自己細胞)である。
自己細胞の使用により、免疫拒絶反応などの有害な副作用を回避することができる。
患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症、拡張型心筋症など
の疾患または障害を伴う。
が困難といわれるものがある(例えば、難治性心疾患など)。しかし、本発明の上述のよ
うな効果によって、従来では不可能とされていた処置が可能となり、根本的な治療にも応
用することができることが明らかとなった。したがって、本発明は、従来の医薬で達成不
可能であった有用性を有するといえる。
を併用することによる再生療法を提供する。
本発明で使用されるサイトカインはすでに市販されているが(例えば、東洋紡(株)H
GF−101等)、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で
調製されたものを用いることができる.HGFを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養
し、培養上清等から分離、精製して該HGFを得ることもできる.或いは、遺伝子工学的
手法によりHGFをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に
挿入して挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組み換えHGF
を得ることができる(例えば、Nature、342、440(1989)、特開平5−
111383号公報、Biochem-Biophys. Res. Commun., 163;967(1989)等を参照)。上
記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主
細胞、例えば大腸菌、酵母または動物細胞一などを用いることができる。このようにして
得られたHGFは、天然型HGFと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の1若
しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/または付加されていてもよい。患者への導入方
法としては、例えば、本発明においてHGFの導入方法として、安全かつ効率の良い遺伝子
導入法であるセンダイ・ウィルス(HVJ)リポソーム法(Molecular Medicine、30、1440-
1448(1993)、実験医学、12、1822−1826(1994))、電気的遺伝子導入法、ショットガ
ン方式遺伝子導入法等があげられる。好ましくは、HVJリポソーム法が使用される。
供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の
範囲によってのみ限定される。
物愛護精神に則って実験を行った。
(実施例1:心筋細胞シートでの人工組織および三次元構造体の作製および利用一組織
操作した収縮性心筋細胞シートは、障害心筋層を再生する一)(生体操作した収縮性心筋
細胞シートは、梗塞心筋層と統合してこれを再生する)本実施例において、本発明者らは
、(1)心筋細胞シート(人工組織)は、移植後に生存し、かつ障害心筋層との組織学的
電気的結合を示すか否か;(2)移植した心筋細胞シート(人工組織)は、心機能の改善
を誘導し得るか否かという特定の課題について検証し、それぞれ、電気的結合を示すこと
および心機能改善をもたらすことを実証した。
足場を有さない組織操作した収縮性心筋細胞シートが、障害心筋層との組織学的電気的統
合を示し、梗塞心筋層の再生をもたらしたことを実証した。
(心筋梗塞モデル)
30匹のLewis系統の雄性ラット(300g、8週齢;Seac Yoshitomi Ltd, Fuku
oka, Japan)を、本研究のために使用した。人道的な動物の世話は、National Socity fo
r Medical researchにより規定された「Principles of Laboratory Animal Care」および
Institute of Laboratory Animal Resourceにより準備されNational Institute of Healt
hにより刊行された「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」(NIH Publi
cation No.86-23、1985年改訂)に従った。急性心筋梗塞を、他所[Weisman HF, Bush DE
, Mannisi JA, Weisfeldt ML, HealyB. Cellular mechanism of myocardial infarct exp
ansion. Circulation. 1988;78: 186-201]で記載されたようにして誘導した.簡単に述べ
ると、ラットを、ペントバルビタールナトリウムで麻酔し、そして気管内チューブを通し
て、陽圧呼吸を適用した。第4左肋間隙にて胸郭を開胸し、8−0ポリプロピレン結紮糸
によって、LADの起点から3mm遠位にて、LADを完全に結紮した。
設計したPIPAAmグラフティング細胞培養皿の調製のための特定の手順は、他所[Ok
ano T, Yamada N, Sakai H, Sakurai Y., J Biomed Mater Res. 1993;27:1243-1251]に
記載されている。簡単に述べると、2一プロパノール溶液中のIPAAmモノマー(Kohj
in, Tokyo, Japanにより親切にも提供された)を、組織培養ポリスチレン(TCPS)皿
(Falcon 3002, Becton Dickinson)上に広げた。その後、これらの皿を、Area Beam Ele
ctron Processing System(Nisshin High Voltage)を使用する照射(0.25MGy電
子ビーム線量)に供し、IPAAmの重合およびこの皿表面へのIPAAmの共有結合を
生じさせた。これらのPIPAAmグラフティング皿を、冷たい蒸留水でリンスして、グ
ラフティングしていないIPAAmを除去し、この皿を窒素ガス中で乾燥させた。第2工
程において、このPIPAAmグラフティング表面を、矩形のカバーガラス(24×24
mm、Matsunami, Tokyo, Japan)でマスクした。2−プロパノール中のアクリルアミド
(AAm)モノマー溶液を、このマスクした皿表面上に広げた。その後、この皿表面に、
電子ビームを照射し、そして洗浄した。結果として、各皿の中心の矩形領域は、PIPA
Amグラフティングされており(温度応答性であり)、周囲の境界は、ポリ−AAmグラ
フティングされていた(非細胞接着性であった)。矩形の構成をしたPIPAAmグラフ
ティング皿を、培養中で使用する前に、エチレンオキシドによりガス滅菌した。
れた手順[Shimizu T, Yamato M, Akutsu T et al., Circ Res. 2002 Feb22;90(3):e40]
に従って調製した。簡単に述べると、1日齢〜2日齢の新生児ラットを、深く麻酔して屠
殺し、その心臓を迅速に取り出し、コラゲナーゼ(クラスII、Worthington
Biochemical)を含むハンクス溶液中で37℃にて消化した。単離した細胞
を、6%FBS、40%Medium199(Gibco BRL)、0.2%ペニシリ
ンーストレプトマイシン溶液、2.7mmol/Lグルコース、および54%平衡塩類溶
液(116mmol/LNaCl、1.0mmol/LNaH2P04、0.8mmol
/LMgS04、1.18mmol/LKCl、0.87mmol/LCaCl2、およ
び26.2mmol/KNaHC03を含む)を含む培養培地中に、懸濁した。この細胞
懸濁物を、細胞密度8×106/皿でプレーティングし、5%C02を含む加湿雰囲気下
で37℃にてインキュベートした。
初代線維芽細胞を、以前に刊行された手順[Z. Yablonka-Reuveni, M. Nameroff. Skel
et al muscle cell populations. Separation and partial characterization of fibro
blast-like cells from embryonic tissue using density centrifugation.Histochemist
ry.1987;87:27-38]に従って調製した。簡単に述べると、8週齢のLewisラットの脚の筋肉
由来の細胞懸濁物を、Percoll TM(Amersham Biosciences Sweden)密度遠心分離により
、線維芽細胞と筋細胞とに分離した。単離した線維芽細胞を、コントロール線維芽細胞シ
ートのために使用した。
単離した新生児ラットの心筋細胞を、矩形に設計したPIPAAmグラフティングポリ
スチレン細胞培養皿上で培養し、そして温度を20℃まで低下させることによって矩形の
細胞シートとして剥離させた。そして2つの心筋細胞シートを重層して、より厚い心臓移
植片を作製した。二重層心臓シートの断面観察は、密接した結合と均質な心臓様組織を示
した。四重層心筋細胞シートの同期した運動が、肉眼で検出された(データは示さず)。
線維芽細胞シートの場合、単離した線維芽細胞を、同じ皿上で2日間培養し、そして同じ
方法によって、矩形の細胞シートとして剥離した。
週間後に実施した。全身麻酔下に、この調査中のラットを、第4左肋間隙を介して曝した
。その梗塞領域を、表面療痕および壁運動の異常を基にして可視的に同定した。心筋細胞
シートまたは線維芽細胞シートを、梗塞心筋層中に移植した。コントロール群には、処置
しなかった。
心臓を採取し、切片化し、そして組織学的検査および免疫組織学的検査のために処理した
。
移植した心筋細胞シートの同定のために、EGFP新生児ラット心筋細胞を、同じプロ
トコルにより単離し、そして心筋細胞シートを作製した。本発明者らは、EGFP新生児
ラット心筋細胞シートを、ヌードラットの梗塞心筋層に移植した。本発明者らは、その梗
塞心筋層において、EGFP陽性心筋細胞を検出し得た(図6左下および右下)。
ラットに、ペントバルビタールナトリウムで麻酔した。麻酔にエタノールを補充して、
軽度の麻酔を維持した。ラットを、仰臥位で軽く固定し、前胸部を剃毛した。心臓超音波
検査を、市販の心エコーS0N0S5500(PHILIPS Medical Systems, USA)を用いて実施し
た。12MHzの環状アレイ変換器を、左半胸郭に適用した音響カップラーゲル層上に配置し
た。胸部への過度の圧力を避けつつその変換きが胸部との十分な接触を維持するように、
注意を払った。上述のラットを、浅い左側面位で画像化した。まず、心臓を、最大左心室
(LV)直径のレベルで、短軸断面にて2次元モードで画像化した。収縮左心室(LV)面積
および拡張左心室(LV)面積を、同じ時間で決定した。左心室(LV)容量を、左心室(LV
)短軸面積により評価した[Gorcsan J 3rd, Morita S, Mandarino WA, Deneault LG,
Kawai A, Kormos RL, Griffith BP, Pinsky MR. Two-dimensional Echocardiographic A
utomated Border Detection Accurately Reflects Changesin Leftventricular Volume.
J Am Soc Echocardiogr. 1993;6:482-9]。得られた画像は、左心室(LV)前壁および
左心室(LV)後壁に対して垂直にMモードカーソルを位置付けるために使用した。すべ
ての測定は、モニターを使用してオンラインで行った。拡張測定は、見かけの最大左心室
(LV)拡張寸法の時期に行った。左心室(LV)収縮末期寸法を、左心室(LV)後壁
の最も前方に収縮した軌跡の時期に測定した。左心室(LV)拡張寸法(LVDd)およ
び左心室(LV)収縮寸法(LVDs)を測定した。寸法データおよび面積データは、選
択した2拍動または3拍動の測定値の平均として表す。左心室(LV)駆出率(EF)を
、LVEF(%)=[(LVDd3−LVDs3)/LVDd3]×100として計算し
た。LV%内径短縮率(FS)を、LV%FS=[(LVDd−LVDs)/LVDd]
×100として計算した。
カラーキネシスは、この技術の拡大部分である。カラーキネシスは、リアルタイムで心
臓内運動を自動的に探知しそして提示する手段として、連続的音波フレーム間の組織の後
方散乱値を比較する。カラーキネシスを、市販の超音波システム(SoNoS5500, PHILIPS M
edical Systems, USA)に組み込んだ[Auchincloss 1988, Transplantation 46:1: Rober
t ML, Philippe V, Lynn W, James B, Claudia K, Joanne S, Rick K, David P, Victor
MA, et al. Echocardiographic quantification of regional left ventricular wall mo
tion with color kinesis. Circulation. 1996;93:1877-1885]。
した。側面位にて呼気終期の間に、胸骨傍短軸を得た。画像の質を最適にした後、心臓境
界検出のための超音波定量システムを起動させた。利得制御(全利得および側方利得、時
間利得補償)を調整して、予め規定した目的の領域内の血液一心臓内境界面の探知を最適
にした。その後、カラーキネシスを、心収縮期全体を通して心臓内軌跡のオンラインカラ
ーコード化のために起動した。心周期全体を通してカラーキネシスデータを含む画像系列
を得、そのデータを、オフライン分析のために光学ディスクにデジタル形式で格納した。
左心室心筋層検体を、心筋細胞シート移植後2週間目および8週間目に得た。各検体を
、10%中性ホルムアルデヒド中に配置し、そしてパラフィン中に包埋した。各検体から
、2〜3個の連続切片を切断し、そして光学顕微鏡検査のためにヘマトキシリンおよびエ
オシンで染色した。
た。凍結切片を、PBS中の2%パラホルムアルデヒド溶液を用いて、室温にて5分間固
定し、3%過酸化水素を含むメタノール中に15分間浸漬させ、その後、PBSで洗浄し
た。そのサンプルを、ウシ血清アルブミン溶液(DAKOLASBKit, DAKOCORPORATION, Denmar
k)を用いて10分間カバーして、非特異的反応をブロックした。この検体を、HRPと結合し
たEPOS結合体化抗第VIII関連抗原抗体(DAKOEPOSAnti-Human Von Wilebrand Factor/HRP
、DAKO Denmark)とともに一晩インキュベートした。このサンプルをPBSで洗浄した後
、これらを、ジアミノベンジジン溶液(PBS中0.3mg/mlのジアミノベンジジン
)中に浸漬して、陽性染色を得た。
した。凍結切片を、3%過酸化水素を含むメタノール中に5分間浸漬し、その後、PBS
で洗浄した。この検体を、コネキシン43に対するマウスモノクローナル抗体(CHEMICON
International, Inc., USA)とともに20分間インキュベートした。このサンプルをP
BSで洗浄した後、このサンプルを、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン(DAKO, Denmar
k)中に10分間浸漬し、その後、PBSで洗浄した。このサンプルを、ペルオキシダー
ゼ結合体化ストレプトアビジン(DAKO, Denmark)中に10分間浸漬した。サンプルをP
BSで洗浄した後、このサンプルを、ジアミノベンジジン溶液(PBS中0.3mg/m
lのジアミノベンジジン)中に浸漬して、陽性染色を得た。
l CO. Ltd., Tokyo)を、心筋細胞を移植した療痕の上、線維芽細胞シートを移植した療
痕の上、または処置していない療痕の上に、配置した。他の2つの電極を、左肋骨下領域
および右大腿領域に配置した。宿主心筋層の刺激のために、2つの微小電極を、心房上に
配置した。宿主心電図の検出のために、3つの電極を、胸部右上領域、左肋骨下領域およ
び右大腿領域に取り付けた。両方の電位図を、生体電気増幅器(UA-102、Unique Medical
CO., Ltd., Tokyo)により増幅し、そしてデータ収集システム(UAS-108S, Unique Medi
cal CO., Ltd., Tokyo)により記録した。心房を、刺激器(NIHONKODEN, Japan)によっ
て、速度300bpmで刺激した。その後、電位を、目的の領域中で捕捉した。
上、心筋細胞シートを移植した療痕上、または線維芽細胞シートを移植した療痕上に、配
置した。ぺーシングした宿主心電図の検出のために、1つの電極を、正常な心筋層に取り
付け、そして他の2つの電極を、左肋骨下領域および右大腿領域に配置した。その後、本
発明者らは、同じ刺激器によって、速度300bpmにて、処置していない療痕、心筋細
胞シートを移植した療痕、または線維芽細胞シートを移植した療痕を刺激した。
データを、平均±標準偏差(SD)として表す。個々の群の間の差異の有意性を評価す
るために、ノンパラメトリック・マン−ホイットニー二標本検定を用いて、統計学的評価
を実施した。統計学的有意性は、0.05未満のp値と決定した。
(心臓移植片の特徴)
剥離した心筋細胞シートは、細胞骨格再構成に起因して、面積が5.76cm2から1
11±0.05cm2へと縮んだ(n=3)。一方、その厚さは、20.1±0.9μm
から52.4±6.0μmへと増加した(n=3)。この心臓シートは、巨視的観察によ
ると、自然に収縮した。
本発明者らは、低温度下で単層心筋細胞シートを得ることができた(図6の左上)。心
筋細胞シートは、移植後に結紮糸を用いずに、梗塞心筋層上にじかに付着させた(図6右
上)。移植の2週間後、移植した心筋細胞シートのヘマトキシリンーエオシン(HE)染
色の組織学的検査により、炎症細胞が蓄積することなく、梗塞心筋層上に整列して十分に
付着したことが示された。黄色の矢印は、コラーゲンシートを示し、これは、心筋細胞シ
ートを梗塞心筋層に送達するために必要である(図7)。移植した心筋細胞シートを移植
後8週目に目視すると、移植した心筋細胞シートとレシピエント心臓との間が密接に付着
していることが明らかになった。移植の8週間後の移植した心筋細胞シートのHE染色に
より、心筋細胞シートと宿主心筋層とが療痕の中心に整列して統合したことが示された(
図7右下)。免疫組織化学染色により、移植した心筋細胞シート中、および移植した心筋
細胞シートとレシピエント心臓との間の接触領域周辺にある、不規則な方向のコネキシン
43が示された(図7中下)。第VIII因子免疫組織化学染色により、移植した心筋細
胞シート中またはこのシートの周辺にある、多くの第VIII因子陽性細胞が示された(
図7左下)。
Bモード分析により、C群と比較してT群において、左心室の拡張が十分に抑制された
こと、および全体的壁運動が十分に保存されたことが、示された(図8)。ベースライン
での駆出率(EF)、内径短縮率(FS)、左心室収縮末期面積(LVESA)は、3つ
の群の間で有意には異ならなかった。
T群におけるEFおよびFSの有意な改善を示した。LVESAは、他の群においてより
もT群において有意に小さかった。これらの機能的改善は、移植の8週間後に保存された
(図9)。
電気生理学的実験は、C群において脚ブロックのようなQRS波の2つのピークを示し
たにも関わらず、T群において、処置した療痕領域のQRS波の1つのピーク成分を示し
た(図11)。F群もまた、T群ほどではないが効果が観察された。さらに、電気生理学
的実験は、F群およびC群において低振幅を示したにも関わらず、T群において、QRS
群の振幅(ボルト)の改善を示した(C群対T群:2.79±0.9V対0.83±0.
64V、P<0.05)(図11)。
電気スパイクが、移植した領域で検出された(図10左下)。さらに、レシピエント心臓
のぺーシングについての閾値は、F群およびC群よりもT群において低かった(C群対F
群対T群:4.9±0.9V対3.0±0.7V対1.7±0.5V、P<0.05)(
図10右)。
チレン細胞培養表面上にグラフティングした。新生児ラットの心筋細胞を、これらの皿上
で培養し、そしてトリプシンを用いずに20℃未満で矩形の細胞シートとして剥離した。
2つのシートを重層して、より厚い心臓移植片を作製した。これらの心筋細胞シートは、
自然に収縮した。2つのシートの断面観察は、密接な結合と均質な心臓様組織を示した。
移植(T群、n=10)、2)線維芽細胞シート移植(F群、n=10)を行った。コン
トロール群は、処置をしなかった(C群、n=10)。エンドカルジオグラフィによって
、移植の2週間後、4週間後、および8週間後に、T群において心機能が有意に改善され
たことが示された。カラーキネシスにより、移植前の値と比較して、局所的収縮壁運動が
非常に回復されたことが示された。心筋細胞シートは、梗塞心筋層上に整列して付着し、
その心筋層において均質の組織であるように見えた。免疫組織化学染色により、移植した
心筋細胞シートにおいて、新脈管形成および不規則な方向を向いたコネキシン43が示さ
れた。電気生理学的実験によって、C群において脚ブロックのようなQRS群の2つのピ
ーク成分が示されたにも関わらず、T群において、R波の改善および処置した療痕領域に
おけるQRS群の1つのピークが示された。F群においても、若干の改善が見られた。さ
らに、レシピエント心臓のぺーシングの閾値は、F群およびT群においては、C群よりも
低かった(C群対F群対T群:4.9±0.9V対3.0±0.7V対1.7±0.5V
、P<0.05)。
針注入により導入される細胞性心筋症の近年の発達により、損傷した心機能を回復する
ための新規なアプローチが提供された[Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P, Jones
TR, Reedy MC, Hutcheson KA, Glower DD, Kraus WE. Regeneration of functional myo
cardium: Improved performance after skeletal myoblast transplantation.
Nature Med. 1998; 4: 929-933]。心筋細胞シート移植法の付加された潜在的利点は、
組織形成プロセス(移植片の形状、サイズ、および一貫性)の良好な制御、容易な移植技
術、ならびに最小の細胞損失で多数の細胞を移植することであり、一方、注射法は、トリ
プシン処理によって一定量の細胞または細胞表面タンパク質(例えば、コネキシン43)
の損失をもたらす。心筋細胞シート移植法は、心筋梗塞に加えて、全体的な心筋機能不全
(例えば、拡張型心筋症)の修復のために有用であり得る。臨床的適用を達成するために
、移植した全心筋組織量は、障害心筋層の修復のために極めて重要であり、そして新脈管
形成の増強により、心臓シートをより厚くすること、およびより多くの細胞を障害心筋層
に送達することが、可能になり得る。
して移植後の心臓の機能評価および組織学的評価を分析した。心筋細胞シートは、新脈管
形成を伴って梗塞心筋層に付着した。この心筋細胞シートは、コネキシン43を発現する
均質な筋細胞組織のように見え、そしてインビボで同期的に収縮する。心筋細胞シート中
の心筋細胞は、移植した心筋細胞シート中で整列すること、およびほとんど炎症細胞が蓄
積しないことを示した。この心筋細胞シート移植は、心臓の収縮性能および拡張性能の優
れた改善をもたらす見込みがあった。電気生理学的実験により、心筋細胞シートが、療痕
における導電率を改善すること、そして処置した療痕領域におけるQRS群の1つのピー
ク成分を再構成することが、明らかになった。これらのデータは、収縮性心筋細胞シート
が、新脈管形成およびコネキシン43の発現が付随する、障害心筋層との組織学的電気的
統合を示し、心機能の有意な改善を誘導するという、本発明者らの仮説を証明した。本発
明者らが知る限りでは、これは、障害心筋層において、組織操作した心臓シートを使用し
て心筋再生治療が成功した最初の報告である。
ある。
動的統合に関して、移植した心筋細胞シートの心筋細胞は、梗塞心筋層において整列を
示し、そして局所的および全体的な収縮機能の有意な改善を促進した。損なわれたリモデ
リングは、梗塞心臓における心臓の構造的変形および心機能の劣化の原因である[Tyagi
SC. Extracellular matrix dynamics in heart failure: A prospect for gene therapy.
J. Cell. Biochem. 1998; 68: 403-410]。Kelleyらは、梗塞心筋層上にメッシュ
を配置された左心室(LV)の拡張の制限が、ヒツジ心筋梗塞モデルにおいて左心室(L
V)の構成および休止機能を保存することを示した[Kelley ST, Malekan R, Gorman JH
ら、Restraining infarct expansion preserves left ventricular geometry and functi
on after acute anteroapical infarction. Circulation. 1999; 99: 135-142]。機能不
全組織における左心室(LV)構成の保存および局所的収縮機能の改善の両方が、損傷し
た心臓における収縮性能を修復するために必須であり得るが、それゆえ、左心室(LV)
拡張の減弱のみでは、不十分な処置である。非収縮シートが収縮シートと比較して収縮性
能を改善しなかった本発明者らのデータは、この所見を支持する。さらに、本発明者らの
データは、梗塞心筋層において有意な新脈管形成を示した。心臓機能の改善に関する機構
の1つは、移植した心筋細胞シートにより誘導される新脈管形成であり得る。総括すると
、心筋細胞シート移植により誘導される収縮機能の有意な改善は、左心室(LV)構成の
保存、局所的収縮機能の改善、および新脈管形成の誘導を担う。
発現する心筋細胞シート)が、療痕における導電性を促進して、梗塞心筋層において、Q
RS群の振幅の改善、および脚ブロックのようなQRS群の2つのピーク成分の修復をも
たらしたことを、示した。脚ブロックパターンは、心筋層における線維症または壊死に関
連する可能性がある[Agarwal A. K., Venugopalan P. Right bundle branch block: var
ying electrocardiogram patterns. Aetiological correlation, mechanisms and electr
ophysiology. International Journal of Cardiology. 1999;71: 33-39]。組織学的変化
は、心電図記録におけるQRS群の振幅を反映した[Sakamoto A, ono K, Abe M, Jasmin
G, Eki T, Murakami Y, Masaki T, Toyo-oka T, Hanaoka F. Both hypertrophic and di
lated cardiomyopathies are caused by mutation of the same gene, delta-sarcoglyca
n, in hamster: an animal model of disrupted dystrophin-associated glycoprotein c
omplex. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; Dec 9; 94(25): 13873-8]。USにおいて示さ
れた同期的壁運動の事実、脚ブロックのようなQRS群の2つのピーク成分の修復、およ
び療痕における閾値の減少は、移植した心筋細胞シートと宿主心筋層との間の電気的接続
を示し得る。この理由のために、本発明者らがトリプシンではなく温度応答性皿を使用し
て培養皿から細胞シートを剥離した場合、その細胞シートは、コネキシン43とその表面
との良好な状態を維持した。
良好な付着を示した。すでに、本発明者らは、血液細胞増殖因子による細胞/細胞相互作
用および細胞/ECM相互作用の増強による組織学的統合が、梗塞心筋層の心筋再生に必
須であることを示した[Miyagawa S, Sawa Y, Taketani S, Kawaguchi N, Nakamura T, M
atsuura N, Matsuda H. Myocardial regeneration therapy for heart failure. Hepatoc
yte growthfactor enhances the effect of cellular cardiomyoplasty. Circulation. 2
002; 105: 2556-2561]。Kushidaらは、細胞シート中の接着因子は、温度応答性皿からの
剥離後に十分に保存されたことを報告した[Kushida A, Yamato M, Konno C, Kikuchi A,
Sakurai Y, Okano T., J Biomed Mater Res 45: 355-362, 1999]。従って、これらのシ
ートは、その表面に接着分子を良好に保存して、いくつかの器官との良好な付着および統
合を示す[Shimizu T, Yamato M, Kikuchi Aら、Two-dimensional manipulation of card
iac myocyte sheetsutilizing temperature-responsive culture dishes augments the p
ulsatile amplitude. Tissue Eng 2001; 7(2): 141-51; 24: von Recum HA, Kim SW, Kik
uchi A, Okuhara M, Sakurai Y, Okano T. Retinal pigmented epithelium culture on t
hermally responsive polymer porous substrates. J Biomater Sci Polym Ed 9: 1998;
1241-1254]。さらに、細胞群落を保存しての細胞の送達が、注射法を介する細胞送達と
は対照的に、細胞の生存および生存度にとって重要であり得る。これらの結果は、足場を
有さない心筋細胞シートが、宿主心筋層とのシンチウムを生じることを示す。
、細胞移植の臨床適用のために最も広範に使用されている。筋芽細胞は、心筋細胞よりも
虚血を許容する可能性を有する。それゆえ、筋芽細胞は、現在のところ、臨床適用におけ
る細胞シート移植のために適切な細胞供給源のうちの1つである。
に、そして組織学的に、統合することを示した。
心筋細胞シート移植は、障害心筋層における機能的性能および心臓構造を修復するため
の、新規かつ有望なストラテジーであり得る。
って、少なくとも応急措置として線維芽細胞シートを利用することができることが実証さ
れた。
新生児ラットの心筋細胞を使用する人工組織は、障害心筋層と統合し、虚血心筋層モデ
ルにおいて心機能を改善した。本発明者らは心筋細胞を使用したが、細胞シート技術を使
用して組織化した人工組織は、組織移植の新規な概念として、再生医療の分野において有
用である。この方法を、図1に模式化して示す。
(自己由来筋芽細胞シートは、障害心筋層を再生する:臨床適用への道−ラットを用い
た実証例)
組織工学における最近の進歩は、心筋以外の種々の細胞および細胞外基質から構成され
る、移植可能な機能的組織を提供する可能性がある。本発明者らは、自己由来筋芽細胞シ
ートを設計した。これらのシートが、臨床適用の点で有益であり得ると、本発明者らは考
え、本実施例では、筋芽細胞を材料として用いて人工組織または三次元構造体を構築し、
その医療応用における効果を実証した。
左前下行枝(LAD)を2週間結紮することによって、28匹のラットにおいて、損傷
心臓を作製した。高分子(N−イソプロピルアクリルアミド)製の温度応答性ドメインで
、培養皿上をコーティングした。脚筋肉から単離した骨格筋芽細胞(SM)を培養し(図
12を参照)、20℃にて単一の単層細胞シート(組織)として皿から脱着した(図13
)。9匹のラットにおいて2つの筋芽細胞シート移植(筋芽細胞シート(S)群=107
細胞)を行った;9匹のラットにおいて筋芽細胞注入(1群=107細胞)を行った;1
0匹のラットにおいて非細胞治療(C群=培地のみの注入)を行った(図14および16
を参照)。
ラットを麻酔し、手術後14日目および28日目に、心機能をモニターした。12MH
zで操作する環状アレイ変換器を備えた超音波機器(Sonos 5500)を使用して
、エンドカルジオグラフィを実施した(図18)。B画像化モードおよびM画像化モード
における胸骨傍短軸画像および胸骨傍長軸画像を実施した。前壁圧に加えて、全体的パラ
メーター(例えば、左心室拡張末期直径、左心室収縮末期直径、内径短縮率および駆出率
)を測定した(図14を参照)。
2週間後および4週間後、過量のペントバルビタールによってラットを屠殺し、その心
臓を摘出し、10%ホルマリンで固定し、そしてパラフィン中に包埋した。低温槽を使用
することによって、心臓の長手軸方向に沿って心底から心尖まで、一連の5mm厚切片を
調製し、その後、標準的組織学のために処理した(図15および17に示されるように、
筋肉の可視化のためのヘマトキシリンおよびエオシン染色およびコラーゲン含量を評価す
るためのマッソン−トリクローム染色を行った)。
(心機能に対する筋芽細胞移植の効果)
実験により、手術の24時間以内に、心筋梗塞は20%未満の急性死亡率を生じた。一
方、この細胞移植手順は、さらなる動物の死亡を引き起こさなかった。
。4週目および8週目において、組織(MS群)およびMI群は、左心室直径の有意な減
少を生じ、左心室拡張末期面積(LVEDA)および左心室収縮末期面積(LVESA)
の両方が、この処置後に改善した。さらに筋芽細胞シート群における駆出率(EF)値お
よび内径短縮率(FS)値もまた、MI群と比較した高かった(図19を参照)。
および明らかに低い駆出率(EF)値および内径短縮率(FS)値を示した。
(組織学的知見)
MI群の損傷心臓が、拡張して不均一に厚くなった壁を有したこと(図20を参照)、
および移植細胞のパッチをほとんど含まなかったことが、組織学によって明らかになった
(図21)。対照的に、シート移植物を含む梗塞心臓は、拡張せず、均一に厚くなった壁
を有し、十分に細胞化し、そして療痕を有さなかった。移植物の生存を、移植後2週間目
、4週間目、および8週間目に同定した。
合、15分および1日の時点で、MS群においてはMI群と比較して少なかった(全心臓
細胞数の3.7±0.5%対1.7±0.5%)。
影することによって確認した(図22〜29)。
図22A〜図22Fは、電気生理学的試験の結果を動画表示し、その中で代表的なコマ
を静止画として表したものである。図22A〜Cは、コントロールであり、図22D〜図
22Fは、本発明の筋芽細胞シートによる結果である。
止画として表したものである。本発明の筋芽細胞シートは、実際に拍動していることがわ
かる。
、その中で代表的なコマを静止画として表したものである。
図25A〜図25Cもまた、超音波エコー図の結果を動画表示し、その中で代表的なコ
マを静止画として表したものである。左側は梗塞心のコントロールであり、右側は本発明
の筋芽細胞シートでの結果を示す。示されるように、本発明によって、梗塞がほぼ治癒し
、ほぼ正常に拍動している様子がわかる。
ように、梗塞心は本発明によってほぼ治癒している様子がわかる。
図27A〜27Cもまた、本発明の処置による梗塞心の超音波エコー図の結果を動画表
示し、その中で代表的なコマを静止画として表したものである。このように、梗塞が本発
明の処置により治癒していることがわかる。
量を行った。この実施例では、SRYおよびIL2の遺伝子コピー数についてTaqMa
nアッセイを行った。
て、雌性宿主中の染色体における遺伝子量を比較し、生着性を確認した。以下のプライマ
ーを使用した。
Universal Mix(製造業者が提供) 12.5μl
プライマー(100μM)フォワード 0.05μl
プライマー(100μM)リバース 0.05μl
プローブ(50μM) 0.1μl
dH20 10.3μl
テンプレート(DNA) 2.0μl
プライマーおよびプローブ配列は以下のとおりである。
SRY(フォワードプライマー)GCC TCA GGA CAT ATT AAT CTC TGG AG(配列番号15)
(リバースプライマー) GCT GAT CTC TGA ATT CTG CAT GC(配列番号16)
(プローブ) AGG CGC AAG TTG GCT CAA CAG AAT CC(配列番号17)
IL2(フォワードプライマー)GCC TTG TGT GTT ATA AGT AGG AGG C(配列番号18)
(リバースプライマー) AGT GCC AAT TCG ATG ATG AGC(配列番号19)
(プローブ) TCT CCT CAG AAA TTC CAC CAC AGT TGC TG(配列番号20).
100ngの各ゲノムDNAを用いてPCRを行った。その反応混合液を、Micro
Amp optical 96ウェル反応プレートのウェル中に入れた。MicroAm
p optical Capsを用いてウェルにキャップをし、手短に気泡を抜き、これ
らのウェル中の底にある液体を集めた。各々の遺伝子についての測定は、3連で行った。
PCRは、ABI Prism 7700 Sequence Detection S
ystemを用いて行った。
Y 200ng=3x10 copy; IL 2200ng=6x10 copy)。サーマルサイクリングのパラメータとして
は以下のものを用いた。
ステージ1 ステージ2 ステージ3
50℃/2分 95℃/10分 95℃/15秒−−60℃/1分
これを40サイクル反復雄性細胞の指標、以下の式で求めた。
その結果、図28に示すように、シート(三次元組織体)移植は、針移植(細胞そのも
の)より良好な細胞生着性を示すことが明らかになった。
移植筋芽細胞シートが移植後にどのような細胞種に分化しているかどうかを検証した。
そこで、マッソントリクローム染色HE(ヘマトキシリンーエオシン)染色MHC速筋
(MHC fast)染色およびMHC遅筋(MHC slow)染色を行った。
<マッソントリクローム染色>
マッソントリクローム染色法は以下のとおりである:マッソントリクローム染色では、鉄
ヘマトキシリンで核が染められ、その後に拡散速度の大きい小色素分子(酸フクシン、ポ
ンソーキシリジン)が細胞の細網孔へ浸透し、次いで拡散速度の小さい大色素分子(アニ
リン青)が膠原線維の粗構造に入り込み青色に染め出す。
A)媒染剤
10%トリクロル酢酸水溶液 1容
10%重クロム酸カリウム水溶液 1容
B)ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液(使用時に1液と2液を等量混合)
1液
ヘマトキシリン 1g
100%エタノール 100ml
2液
塩化第二鉄 2.0g
塩酸(25%) 1ml
蒸留水 95ml
C)1%塩酸70%アルコール
D)I液
1%ビーブリッヒスカーレット 90ml
1%酸性フクシン 10ml
酢酸 1ml
E)II液
リンモリブデン酸 5g
リンタングステン酸 5g
蒸留水 200ml
F)III液
アニリン青 2.5g
酢酸 2ml
蒸留水 100ml
G)1%酢酸水
マッソントリクローム染色法の手順
1.脱パラ、水洗、蒸留水
2.媒染(10〜15分)
3.水洗(5分)
4.ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液(5分)
5.軽く水洗
6.1%塩酸70%アルコールで分別
7.色出し、水洗(10分)
8.蒸留水
9.I液(2〜5分)
10.軽く水洗
11.II液(30分以上)
12.軽く水洗
13.III液(5分)
14.軽く水洗
15.1%酢酸水(5分)
16.水洗(すばやく)
17.脱水、透徹、封入。
に染まり、核は黒紫色に染まり、細胞質は淡赤色に染まり、赤血球は檀黄色〜深紅色に染
まり、粘液は青色に染まり、細胞分泌穎粒は好塩基性が青に好酸性が赤に染まり、線維素
は赤に染まる。従って、青く染まった面積を線維化した部位として算出することができる
。
細胞における支持体の定着・消長を観察するために、HE染色を行った。その手順は以
下のとおりである。必要に応じて脱パラフィン(例えば、純エタノールにて)、水洗を行
い、オムニのヘマトキシリンでサンプルを10分浸した。その後流水水洗し、アンモニア
水で色出しを30秒間行った。その後、流水水洗を5分行い、塩酸エオジン10倍希釈液
で2分間染色し、脱水し、透徹し、封入する。
モノクローナル抗骨格筋ミオシン(FAST)
ミオシン重鎖:MY−32(骨格筋芽細胞)
ラットおよびヒトとの比反応性
1)凍結ストックから、5μm厚の切片を作製する。
ブロックは、パラフィン除去し再水和する必要がある)
3)内因性ペルオキシド活性は、メタノール中0.3%H202中で20分間室温でブ
ロックする(1ml 30%H202+99mlメタノール)
4)PBSで洗浄する(3×5分)。
ド)と4℃で湿式チャンバー内で一晩インキュベートする。
6)翌日PBSで洗浄する(3×5分)。
する(3滴を直接スライドにたらす)。
8)PBSで洗浄する(3×5分)。
10〜15分間浸す。
10)PBSで洗浄する(3×5分)。
12)茶っぽい色を顕微鏡で観察する。
13)水中に5分ほど浸す。
15)数回洗浄する。
16)イオン交換水で1回洗浄する。
18)90%エタノールで1分洗浄する。
19)100%エタノールで1分洗浄する。(3回)
20)キシレンで3回×1分間洗浄する。その後カバースリップをかける。
(MHC sl0w染色)
モノクローナル抗ミオシン:骨格筋遅筋
イヌ、ラットおよびヒトでの、比反応性
1)凍結ストックから、5μm厚の切片を作製する。
ブロックは、パラフィン除去し再水和する必要がある)
3)内因性ペルオキシド活性は、メタノール中0.3%H202中で20分間室温でブ
ロックする(1ml 30%H202+99mlメタノール)
4)PBSで洗浄する(3×5分)。
ド)と4℃で湿式チャンバー内で一晩インキュベートする。
6)翌日PBSで洗浄する(3×5分)。
する(3滴を直接スライドにたらす)。
8)PBSで洗浄する(3×5分)。
す。
10)PBSで洗浄する(3×5分)。
12)茶っぽい色を顕微鏡で観察する。
13)水中に5分ほど浸す。
15)数回洗浄する。
16)イオン交換水で1回洗浄する。
18)90%エタノールで1分洗浄する。
19)100%エタノールで1分洗浄する。(3回)
20)キシレンで3回×1分間洗浄する。その後カバースリップをかける。
その結果、図29に示すように、移植した筋芽細胞シートは、速筋繊維(fast f
iber)から遅筋線維(slow fiber)に分化していたことが明らかになった
。これらのマーカーは、本発明の三次元組織構造体を識別するために使用することができ
る。
骨格筋芽細胞移植は、心臓リモデリングを減弱させそして損傷心筋層を再生させること
によって、細胞移植と比較して、全体的心機能を改善した。このことは、心筋再生治療の
ための有望なストラテジーを示唆する。
機能が改善することを実証した。本実施例では、直接注入を使用して、自己由来骨格筋芽
細胞(SM)の移植を、臨床適用した。直接注入に起因する移植細胞および移植細胞外基
質(ECM)の損失は、骨格筋芽細胞の数および能力を制限する。
移植よりも組織移植の方が、損傷心臓を再生するために有利であることも実証された。
(実施例3:骨格筋芽細胞−組織操作した筋芽細胞シートの移植は、心筋症ハムスター
において、心臓リモデリングの減弱によって心機能を改善する−ハムスターでの例)次に
、骨格筋芽細胞を用いて作製した人工組織または三次元構造体が心筋症が改善するかどう
かを実証した。
は、拡張型心筋症(DCM)における全般的細胞送達について制限を有するようである。
この一連の証拠を考慮して、組織操作した筋芽細胞シートは、拡張型心筋症(DCM)に
おける心機能を改善するための優れた有望な方法であり得ると、本発明者らは考え本実施
例を実行した。
症(DCM)モデルハムスター)を、レシピエントとして使用した。BI0FIBハムス
ター(FIB)から単離した筋芽細胞を、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド製温度
応答性高分子をグラフティングした皿上で培養し、そして20℃にて、酵素処理を用いる
ことなく細胞シートを脱着した。
細胞(FIBから単離した筋芽細胞)注入群(T群、n=10)、(3)シャム手術群(
C群、n=10)を行った。S群において、筋芽細胞シートを、左心室(LV)壁上に移
植した。T群において、筋芽細胞を、右心室(RV)壁および左心室(LV)壁中に注入
した。
(梗塞心筋層の機能的回復)
Bモード分析により、C群と比較してT群において、左心室の拡張が十分に抑制された
こと、および全体的壁運動が十分に保存されたことが、示された(図18)。
超音波エコー図(UCG)によって示され、他方、T群およびC群の心臓は、左心室(L
V)拡張の進行を示した(図33A)。手術の6週間後、内径短縮率(FS)は、C群と
比較して、S群およびT群において有意に改善された。7週間後、S群における内径短縮
率(FS)は手術前のレベルで維持され、一方、他の群の内径短縮率(FS)は、徐々に
減少した。S群における僧帽弁E波の最大速度は、シート移植の1週間後にわずかに減少
したが、これは、手術の2週間後に、手術前のレベルに回復した。S群およびT群におけ
る平均E波は、手術の4週間後およびその後、C群においてよりも有意に高かった。移植
したシートがほぼ全心臓を覆うこと、および生存筋芽細胞により左心室(LV)壁厚が増
加したことが、S群における組織学的検査によって示された(図30A〜30D)。図3
0Bから明らかなように、移植後の筋芽細胞は、組織構造体にした場合に、密に細胞が生
着し心臓の機能を補助していることがわかる。図30Cおよび図30Dから明らかなよう
に、α−サルコグリカンおよびβ−サルコグリカンの発現は、正常を5、DCMハムスタ
ーを1とした場合、αの場合で2〜3とスコアリングされ、ベータの場合で3程度と、ほ
ぼ中程度に回復していたことが明らかになった。DCMハムスターは、サルコグリカンの
発現が減少することによって一部拡張型心筋症の症状を呈することが知られているが、本
発明の三次元組織構造体によって、そのような遺伝子発現も補充する効果があることが明
らかになった。
週を超えてDCMハムスターが生存していた。これは、注入(細胞のみ)またはコントロ
ールと比較して(これらはいずれも38週〜40週で死滅)と比較して、顕著な効果であ
り、全く予想外のことといえる。図33Cに示すように、筋芽細胞三次元組織構造体の移
植により拡張型心筋症の左室収縮能が顕著に改善した。これは、心臓において本願発明の
構造体が適用可能であることを示す。この顕著な改善は、人間に換算すると約25年の寿
命延長に該当し、本発明の三次元組織構造体の顕著な効果が心筋症において実証されたと
いえる。これは、正常ハムスターの寿命は2年、人間を80年とし、DCMハムスターの
平均寿命はであり40週、シート移植による最長寿命は70週であることを考慮し計算し
た結果、人間の寿命に換算すると25年であることに基づく。
筋芽細胞シート移植は、拡張型心筋症(DCM)心臓において、心臓拡張の進行を減少
させ、心機能を改善した。筋芽細胞シート移植は、拡張型心筋症(DCM)心臓における
心臓リモデリングの減弱により心機能を回復させるための有望な方法であり得る。
本実施例では、より臨床での知見をめざし大動物心筋梗塞モデルに骨格筋芽細胞シート
を移植し、その心機能改善を検討した。
30kgのブタを全身麻酔下、開胸を行い、LADを結紮することにより作製された心
筋梗塞モデルに3つの異なる治療1)骨格筋芽細胞シート群2)骨格筋芽細胞注入群3)
コントロール群を作製し、心機能、心筋組織の変化を検討した(図34)。骨格筋芽細胞
は自己の大腿筋から採取し、分解液としてコラゲナーゼ、トリプシンEDTA、硫酸ゲン
タマイシン、アンフォテリシンBを調製後、0.22μフィルターでろ過したものを使用
し、初代培養液としてSkBM Basal Medium、ウシ胎児血清、EGF、リ
ン酸デキサメタゾンナトリウム、硫酸ゲンタマイシン、アンフォテリシンBを調製後0.
22μフィルターでろ過したものを使用した。この細胞をポリ(N−イソプロピルアミド
製温度応答性高分子をグラフトした皿上で培養し、温度変化にて酵素処理することなく細
胞シートを脱着した。
細胞シートを移植した群では心機能の収縮性、拡張性が改善している(図35および3
6)。さらに心筋梗塞部分に移植細胞の生着を確認した。
げっ歯類以外の動物の実験においても、本発明の筋芽細胞シートを使用して治療するこ
とにより心機能改善効果を認められた。
別の細胞で実証するために、組織幹を含む細胞として、滑膜細胞をシート状にし、心筋
梗塞モデルに移植し、心機能改善効果があるか検討した。
8週齢ラットの膝関節を剥離し、関節内側面に滑膜組織を切離する。20%FBS、DM
EM high glucoseの培養液に貼り付け、細胞を培養する。得られた細胞を
ポリ(N−イソプロピルアミド製温度応答性高分子をグラフトした皿上で培養し、温度変
化にて酵素処理することなく細胞シートを脱着した。LADの結紮することにより作製さ
れた心筋梗塞モデルに3つの異なる治療1)細胞シート群2)細胞注入群3)コントロー
ル群を作製し、心機能、心筋組織の変化を検討した。
細胞シートを移植した群では心機能の収縮性、拡張性が改善している。さらに心筋梗塞
部分に移植細胞の生着を確認した。
滑膜組織から得られた細胞から分化した細胞においても、シート化することにより心機
能改善効果を認められる。
未分化細胞の例として、マウス胚性幹細胞から心筋細胞に分化する細胞があることが知
られている。本実施例ではこの心筋細胞をシート状にし、心筋梗塞モデルに移植し、心機
能改善効果があるか検討した。
遺伝子を導入し、分化させると心筋細胞以外に分化する細胞は淘汰される高濃度薬剤選択
性培養を行い、心筋細胞を選択した。この細胞をポリ(N−イソプロピルアミド製温度応
答性高分子をグラフトした皿上で培養し、温度変化にて酵素処理することなく細胞シート
を脱着した。LADの結紮することにより作製された心筋梗塞モデルに3つの異なる治療
1)細胞シート群2)細胞注入群3)コントロール群を作製し、心機能、心筋組織の変化
を検討した。
細胞シートを移植した群では心機能の収縮性、拡張性が改善している。さらに心筋梗塞
部分に移植細胞の生着を確認した。
胚性幹細胞から分化した細胞においても、シート化することにより心機能改善効果を認
められる。
次に、アスコルビン酸またはその誘導体による人工組織作製への影響を検討した。
筋芽細胞を十分量増殖させた後、5×106の細胞数を、10cmの温度応答性培養皿
にて培養した。培養には、SkBM Basal Medium(Clonetics(
Cambrex))という培地を使用した。次に、アスコルビン酸2リン酸(0.5mM
)、アスコルビン酸1リン酸マグネシウム塩(0.1mM)、L−アスコルビン酸Na(
0.1mM)を投与し、培養開始4日後に20度にて、脱着させた。コントロールとして
、アスコルビン酸類を添加しない培養系で培養した人工組織を作製した。
アスコルビン酸類を添加した場合は、無添加の培養系での人工組織よりも、脱着が格段
に容易となっており、しかも、無添加の培養系では、数mm程度の大きさまでしか培養さ
れず、それを超えると、割れ目などが入り、成長しなかった。しかも、はがすことが実質
的に困難であり、移植可能な人工組織を提供できなかった。これに対し、本発明のアスコ
ルビン酸類を添加した培地で培養した人工組織は、移植可能な程度の大きさに成長し、し
かも、脱着が容易であり、孔も発生せず、傷もほとんど付けることなく人工組織を単離す
ることができた。生物学的結合を見たところ、細胞外マトリクスによる相互作用がかなり
進んでいることが判明した(図37〜39)。
次に、アスコルビン酸2リン酸酸による人工組織作製への影響を検討した。
滑膜細胞および筋芽細胞を十分量増殖させた後、5×106の細胞数を、10cmの温
度応答性培養皿にて培養した。培養には、アスコルビン酸2リン酸(1mM)を含むSk
BM Basal Medium(筋芽細胞)またはアスコルビン酸2リン酸(1mM)
を含むDMEM(滑膜細胞)という培地を使用した。コントロールとして、アスコルビン
酸類を添加しない同じ培地を含む培養系および通常使用されるアスコルビン酸1リン酸(
1mM)を含む同じ培地を含む培養系で培養した人工組織を作製した。
た。
収縮した組織をHE染色などの組織学分析を行ったところ(図42、滑膜細胞)、細胞
は10層以上になり、マトリクスはコラーゲンのメッシュまたはスポンジ状となっており
、ピンセットで容易につまめる硬さとなっていた。
体を引っ張ったときの荷重一時間(応力歪み)曲線を得る。この曲線から比例限度、弾性
係数、降伏点、最大強さ、破談点、弾性エネルギーおよび靭性を得る。
ション試験は、粘弾性を測定することによって実施する。歪みが増加する現象を観察する
ことができる。棒のようなものでゲル状物質を一定圧で押し込み、変形をモニターする。
アスコルビン酸2リン酸を添加した場合は、無添加の培養系での人工組織および通常使
用されるアスコルビン酸1リン酸を含む系での人工組織よりも、脱着が格段に容易となっ
ており、しかも、無添加の培養系では、数mm程度の大きさまでしか培養されず、それを
超えると、割れ目などが入り、成長しなかった。通常使用されるアスコルビン酸1リン酸
を含む系で培養したものも、大きさ、強度などの点で添加した系に及ばなかった。無添加
コントロール系では、人工組織をはがすことが実質的に困難であり、移植可能な人工組織
を提供できなかった。
ンセットでつまめる程度の硬度であったのに対して、それ以外のものでは、硬度の点でア
スコルビン酸2リン酸を含む系には及ばなかった。アスコルビン酸2リン酸を添加した培
地で培養した人工組織は、移植可能な程度の大きさに成長し、しかも、脱着には特別な注
意も要することなく、孔も発生せず、傷もほとんど付けることなく人工組織を単離するこ
とができる。生物学的結合を見たところ、細胞外マトリクスによる相互作用がかなり進ん
でいることが判明した。
実施例7および8においてアスコルビン酸類の存在下で作製した人工組織を、拡張型心
筋症ハムスターに移植したところ、移植したハムスターすべてが完治し、通常のハムスタ
ーと同様の生存期間生存した。従って、本発明は、特定の三次元化促進因子の存在によっ
て、従来難治性といわれた疾患をも完治させることができることが判明した。
上記実施例で作製されたシートと遺伝子治療の併用療法を施行した。これは併用療法に
よりシート移植部の血管新生を促進し、移植シートの生着促進、シート内部の細胞壊死を
抑制する目的である。
センダイウイルス(HVJ)およびリポソーム複合体の調製は文献(Kaneda Y, Iwai K
, Uchida T. Increased expression of DNA co-introduced with nuclear protein in ad
ult rat liver. Science. 1989; 243: 375-378)の記載に従っておこなった。以下
に簡潔に示す。DNA溶液200μ1を加え、30秒間振盤し、37度恒温槽に30秒間
静置する。これを8回繰り返す。5秒間超音波処理をし、30秒間振盤する。0.3ml
のBSSを加え、37度恒温槽で振盤する。不活化したHVJを加え、氷上で10分間置
く。37度恒温槽にて1時間振盤する。超遠心チューブに60%と30%のショ糖溶液を
それぞれ1ml、6mlで重層し、HVJリポソーム液をのせ、BSSをチューブの付近
まで加える。62,800g、4度で1.5時間超遠心する。30%ショ糖溶液層のすぐ
上を回収し、4度に保存し、遺伝子導入に用いた。
FcDNAを含む)を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクタ
ーを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。心臓組織におけるヒトHGF濃度を、抗ヒト
HGFモノクローナル抗体(日本、東京、株式会社特殊免疫研究所(Institite
of Immunolo))を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA
)で測定した(Ueda H, Sawa Y, Matsumoto K et al. Gene Transfection of Hepatocyte
Growth Factor Attenuates reperfusion Injury in the Heart. Ann Thorac Surg. 1999
; 67: 1726-1731)。細胞をポリ(N−イソプロピルアミド製温度応答性高分子をグラフ
トした皿上で培養し、温度変化にて酵素処理することなく細胞シートを脱着した。LAD
の結紮することにより作製された心筋梗塞モデルに3つの異なる治療1)細胞シート群2
)遺伝子治療群3)併用療法群4)コントロール群を作製し、心機能、心筋組織の変化を
検討した。
細胞シートを移植した群、併用療法群では心機能の収縮性、拡張性が改善している。さ
らに併用療法をした群では心筋梗塞部分に血管新生を認め、移植細胞の生着が改善してい
ることが確認できる。
シート化した組織と遺伝子治療を併用することにより心機能改善効果とさらに血管新生
効果と細胞保護効果があり、より心機能の改善が認められる。
が、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解
される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的
に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用され
るべきであることが理解される。
臓疾患など)の根本的な治療方法、技術、医薬を提供するという有用性を有する。
Claims (10)
- スキャフォルドを用いず、成体の心臓を構成する心筋組織以外の部分に由来する筋芽細
胞からなる、心臓疾患に適用するためのシート状三次元構造体。 - 筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、請求項1に記載のシート状三次元構造体。
- 前記細胞は、前記シート状三次元構造体が適用される被験体に由来する、請求項1、2
のいずれか1項に記載のシート状三次元構造体。 - 複数の層の細胞シートを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のシート状三次元構
造体。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載のシート状三次元構造体を含む心臓疾患に適用する
ための医薬。 - 前記心臓は、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張
相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う、請
求項5に記載の医薬。 - スキャフォルドを用いず、成体の心臓を構成する心筋組織以外の部分に由来する筋芽細
胞からなる、心臓疾患に適用するためのシート状三次元構造体を製造する方法であって、
a)水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性
高分子がグラフティングされた細胞培養支持体上で、成体の心筋以外の部分に由来する細
胞を培養する工程;
b)培養液温度を、該上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とする工程;お
よび
c)該培養した細胞を、シート状三次元構造体として剥離する工程;
を包含する、方法。 - 前記剥離前に、培地にアスコルビン酸またはその誘導体を加えることを特徴とする、請
求項7に記載の方法。 - 前記剥離時またはその前に、タンパク質分解酵素による処理がなされない、請求項7、
8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記温度応答性高分子が、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、請求項7
〜9のいずれか1項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014221669A JP2015033637A (ja) | 2003-08-01 | 2014-10-30 | 三次元組織構造体 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003285476 | 2003-08-01 | ||
JP2003285476 | 2003-08-01 | ||
JP2014221669A JP2015033637A (ja) | 2003-08-01 | 2014-10-30 | 三次元組織構造体 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012087825A Division JP2012139541A (ja) | 2003-08-01 | 2012-04-06 | 三次元組織構造体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015033637A true JP2015033637A (ja) | 2015-02-19 |
Family
ID=34113882
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006519056A Expired - Fee Related JP4943844B2 (ja) | 2003-08-01 | 2004-02-02 | 三次元組織構造体 |
JP2009223536A Pending JP2010029680A (ja) | 2003-08-01 | 2009-09-28 | 三次元組織構造体 |
JP2012087825A Pending JP2012139541A (ja) | 2003-08-01 | 2012-04-06 | 三次元組織構造体 |
JP2014221669A Withdrawn JP2015033637A (ja) | 2003-08-01 | 2014-10-30 | 三次元組織構造体 |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006519056A Expired - Fee Related JP4943844B2 (ja) | 2003-08-01 | 2004-02-02 | 三次元組織構造体 |
JP2009223536A Pending JP2010029680A (ja) | 2003-08-01 | 2009-09-28 | 三次元組織構造体 |
JP2012087825A Pending JP2012139541A (ja) | 2003-08-01 | 2012-04-06 | 三次元組織構造体 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9587222B2 (ja) |
EP (3) | EP2266500B1 (ja) |
JP (4) | JP4943844B2 (ja) |
DK (2) | DK2266500T3 (ja) |
ES (2) | ES2540242T3 (ja) |
WO (1) | WO2005011524A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2017073794A1 (ja) * | 2015-10-30 | 2018-08-16 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞から3次元の心筋組織を製造する方法 |
Families Citing this family (93)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101203434B1 (ko) * | 2003-02-06 | 2012-11-21 | 가부시키가이샤 셀시드 | 전안부 관련 세포 시트, 3 차원 구조체, 및 그들의 제조법 |
EP1600498B1 (en) * | 2003-02-06 | 2012-08-15 | Cellseed Inc. | Substrates for high-density cell arrays and preparation processes and uses thereof |
KR101228251B1 (ko) * | 2003-02-20 | 2013-01-30 | 가부시키가이샤 셀시드 | 재생 각막 내피 세포 시트, 제조 방법 및 그 이용 방법 |
WO2005103233A1 (ja) * | 2004-04-25 | 2005-11-03 | Cellseed Inc. | 培養歯根膜細胞シート、製造方法及びその利用方法 |
EP1859817A4 (en) * | 2005-02-28 | 2012-11-07 | Cellseed Inc | CULTIVATED CELL SHEET, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND PROCESS FOR RESTORING TISSUE USING THE SAME |
DK1857126T3 (en) * | 2005-02-28 | 2019-02-04 | Cellseed Inc | CULTIVATED CELL LAYER, MANUFACTURING THEREOF AND USING THEREOF. |
WO2007001351A1 (en) * | 2005-06-17 | 2007-01-04 | Iken Tissue Therapeutics, Inc. | Methods for treating ischemic tissue |
US20100184660A1 (en) * | 2006-12-19 | 2010-07-22 | Sanofi-Aventis | Single exon genes encoding for novel bio-active peptides |
US8983570B2 (en) * | 2007-03-27 | 2015-03-17 | Cardiovascular Biotherapeutics, Inc. | Therapeutic angiogenesis for treatment of the spine |
US11224635B2 (en) | 2007-03-27 | 2022-01-18 | Venturis Thereuptics, Inc. | Therapeutic angiogenesis for treatment of the spine and other tissues |
WO2010141027A1 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Electromagnetic controlled biofabrication for manufactcuring of mimetic biocompatible materials |
JP5378743B2 (ja) * | 2008-09-30 | 2013-12-25 | テルモ株式会社 | 医療用細胞シートの製造方法 |
JP5269629B2 (ja) * | 2009-01-16 | 2013-08-21 | オリンパス株式会社 | 培養容器および細胞培養方法 |
CA2758208A1 (en) * | 2009-04-09 | 2010-10-14 | Jordan Lancaster | Cellular seeding and co-culture of a three dimensional fibroblast construct |
EP2500042A4 (en) * | 2009-11-13 | 2014-06-25 | Yoshiki Sawa | CELL LAYER FOR CARDIAC CREATION, MANUFACTURING METHOD AND METHOD OF USE THEREOF |
JP5667357B2 (ja) * | 2009-11-30 | 2015-02-12 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
JP5702060B2 (ja) * | 2009-12-01 | 2015-04-15 | テルモ株式会社 | 単離されたシート状細胞培養物の製造方法 |
JP5661048B2 (ja) * | 2009-12-03 | 2015-01-28 | 株式会社セルシード | 脂肪細胞シート、その三次元構造体、及びそれらの製造方法 |
US8883210B1 (en) | 2010-05-14 | 2014-11-11 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
US10130736B1 (en) | 2010-05-14 | 2018-11-20 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
US9352003B1 (en) | 2010-05-14 | 2016-05-31 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
WO2012015030A1 (ja) | 2010-07-29 | 2012-02-02 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物解離システム |
EP2607898B1 (en) * | 2010-08-17 | 2016-01-20 | Terumo Kabushiki Kaisha | Method for evaluating graft |
JP5752905B2 (ja) * | 2010-08-19 | 2015-07-22 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の品質判定方法およびそのためのシステム、ならびにそれらに適したシート状細胞培養物 |
JP5757706B2 (ja) * | 2010-08-25 | 2015-07-29 | 国立大学法人 岡山大学 | 細胞シートの製造方法 |
US8895291B2 (en) | 2010-10-08 | 2014-11-25 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions |
JP5840855B2 (ja) | 2011-03-30 | 2016-01-06 | 学校法人東京女子医科大学 | 胚性幹細胞から心筋シートを製造する方法 |
US8834928B1 (en) | 2011-05-16 | 2014-09-16 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissugenic implants, and methods of fabricating and using same |
TWI452138B (zh) * | 2011-06-01 | 2014-09-11 | Univ Taipei Medical | 用於細胞培養及片狀細胞層脫著之支撐物及片狀細胞層脫著之方法 |
WO2012172887A1 (ja) * | 2011-06-13 | 2012-12-20 | 国立大学法人大阪大学 | 心疾患治療薬および心疾患治療用細胞シート |
JP6111013B2 (ja) * | 2011-10-30 | 2017-04-05 | 株式会社セルシード | 腱細胞シート及びその製造方法 |
JP5920741B2 (ja) | 2012-03-15 | 2016-05-18 | iHeart Japan株式会社 | 人工多能性幹細胞から心筋および血管系混合細胞群を製造する方法 |
WO2014014119A1 (en) * | 2012-07-17 | 2014-01-23 | Kyoto University | Novel cardiomyocyte marker |
US9125959B1 (en) * | 2012-10-17 | 2015-09-08 | University Of South Florida | Compositions and methods for reducing or preventing medical device-related infections |
JPWO2014133168A1 (ja) | 2013-02-28 | 2017-02-09 | 秀昭 坂井 | 新規グラフトポリマー、それを用いた細胞培養用温度応答性基材及びその製造方法、並びに当該ポリマーが固定化された液体クロマトグラフィー担体及びそれを用いた液体クロマトグラフィー法 |
JP6373255B2 (ja) | 2013-03-19 | 2018-08-15 | 学校法人東京女子医科大学 | 筋芽細胞を含む細胞シート積層体およびその製造方法 |
WO2014185517A1 (ja) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
ES2714127T3 (es) * | 2013-10-24 | 2019-05-27 | Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital And Inst Of Gerontology | Células madre musculares o mioblastos, procedimiento de cribado de sustancias que participan en la conversión metabólica usando las mismas, y composición farmacéutica que comprende la sustancia obtenida de dicho procedimiento del cribado |
CN105992816B (zh) | 2013-11-16 | 2018-04-17 | 泰尔茂比司特公司 | 生物反应器中的细胞扩增 |
WO2015129764A1 (ja) | 2014-02-26 | 2015-09-03 | テルモ株式会社 | 目的細胞の純度が高い細胞集団の製造方法 |
JP5802298B2 (ja) | 2014-03-25 | 2015-10-28 | テルモ株式会社 | 凍結保存細胞からの生細胞の回収方法およびシステム |
EP3613841B1 (en) | 2014-03-25 | 2022-04-20 | Terumo BCT, Inc. | Passive replacement of media |
JP6837333B2 (ja) * | 2014-03-27 | 2021-03-03 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物を製造するための細胞培養器具およびそれを用いたシート状細胞培養物の製造方法 |
WO2015146560A1 (ja) * | 2014-03-27 | 2015-10-01 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物を製造するための細胞培養器具およびそれを用いたシート状細胞培養物の製造方法 |
WO2015168528A1 (en) * | 2014-05-02 | 2015-11-05 | University Of Houston System | Two stage cellularization strategy for the fabrication of bioartificial hearts |
JP6495603B2 (ja) | 2014-09-03 | 2019-04-03 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物とフィブリンゲルとの積層体の製造方法 |
JP6599089B2 (ja) * | 2014-09-03 | 2019-10-30 | テルモ株式会社 | 補強部を有するシート状細胞培養物とフィブリンゲルとの積層体 |
JP6494957B2 (ja) * | 2014-09-03 | 2019-04-03 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物回収システムおよび方法 |
JP6830059B2 (ja) | 2014-09-26 | 2021-02-17 | テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド | スケジュール化された細胞フィーディング |
EP3219790B1 (en) | 2014-11-12 | 2021-08-04 | Terumo Kabushiki Kaisha | Myocardial cell sheet |
EP3023059A1 (en) * | 2014-11-18 | 2016-05-25 | Samsung Medison Co., Ltd. | Ultrasound imaging apparatus and method of controlling the same |
JP5727665B2 (ja) * | 2014-12-11 | 2015-06-03 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
JP6742915B2 (ja) | 2014-12-26 | 2020-08-19 | テルモ株式会社 | 液体移送方法 |
JP6130868B2 (ja) * | 2015-02-19 | 2017-05-17 | テルモ株式会社 | 単離されたシート状細胞培養物の製造方法 |
JP6621245B2 (ja) * | 2015-03-27 | 2019-12-18 | 大日本印刷株式会社 | 制御された微細構造を含む三次元構造を有する人工組織の作製方法 |
WO2016158897A1 (ja) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | テルモ株式会社 | 細胞のシート形成能の評価方法 |
JP5893786B2 (ja) * | 2015-04-02 | 2016-03-23 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
CA2986744A1 (en) * | 2015-05-21 | 2016-11-24 | University Of South Florida | Cell culture substrate for rapid release and re-plating |
CA3177726A1 (en) | 2015-05-21 | 2016-11-24 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Modified demineralized cortical bone fibers |
JP6159365B2 (ja) * | 2015-06-11 | 2017-07-05 | テルモ株式会社 | 医療用細胞シートの製造方法 |
WO2017004592A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-05 | Terumo Bct, Inc. | Cell growth with mechanical stimuli |
US11111375B2 (en) | 2015-10-05 | 2021-09-07 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for generating oligodendrocyte precursors |
JP6140322B2 (ja) * | 2016-02-24 | 2017-05-31 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
WO2017170097A1 (ja) | 2016-03-28 | 2017-10-05 | テルモ株式会社 | 液体中の脆弱物の形状を保持する方法およびデバイス |
WO2017205667A1 (en) | 2016-05-25 | 2017-11-30 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
US11104874B2 (en) | 2016-06-07 | 2021-08-31 | Terumo Bct, Inc. | Coating a bioreactor |
US11685883B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-06-27 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems for coating a cell growth surface |
CN109153963B (zh) | 2016-11-01 | 2022-06-24 | 泰尔茂株式会社 | 粘附状态的细胞培养物的改变方法 |
EP3530729A4 (en) | 2016-11-25 | 2020-04-15 | Terumo Kabushiki Kaisha | LIQUID FOR PRESERVING LIVING CELLS OR COMPOSITION CONTAINING LIVING CELLS |
WO2018097228A1 (ja) | 2016-11-25 | 2018-05-31 | テルモ株式会社 | 生細胞または生細胞を含む組成物の保存液 |
JP6843599B2 (ja) * | 2016-11-25 | 2021-03-17 | テルモ株式会社 | 生細胞または生細胞を含む組成物の保存液 |
EP3593816A4 (en) | 2017-03-06 | 2020-12-30 | Tokyo Women's Medical University | LYPD1 INHIBITORS AND METHOD FOR MANUFACTURING BIOLOGICAL TISSUE WITH IT |
CN117247899A (zh) | 2017-03-31 | 2023-12-19 | 泰尔茂比司特公司 | 细胞扩增 |
US11624046B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
JP6490738B2 (ja) * | 2017-04-28 | 2019-03-27 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
WO2018218049A1 (en) * | 2017-05-25 | 2018-11-29 | The Regents Of The University Of California | Methods of identifying equine immune-mediated myositis |
JP2020524002A (ja) | 2017-06-16 | 2020-08-13 | エイブリィ セラピューティクス インコーポレイテッド | 三次元組織組成物及び使用方法 |
WO2019177135A1 (ja) * | 2018-03-15 | 2019-09-19 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
TWI741263B (zh) | 2018-03-15 | 2021-10-01 | 日商泰爾茂股份有限公司 | 片狀細胞培養物的製造方法 |
EP3811983B1 (en) | 2018-06-12 | 2023-10-25 | Kyoto University | Composition for cell transplant, and method for cell transplant |
SG11202007242UA (en) * | 2018-07-27 | 2020-08-28 | Univ Nagasaki | Sheet-shaped cell culture for regeneration of digestive tract |
WO2020067442A1 (ja) | 2018-09-27 | 2020-04-02 | テルモ株式会社 | 細胞の凍結保存方法 |
JPWO2020067438A1 (ja) | 2018-09-27 | 2021-08-30 | 国立大学法人大阪大学 | 多能性幹細胞由来細胞のシート化方法 |
JP6657452B2 (ja) * | 2019-02-27 | 2020-03-04 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
JP7002497B2 (ja) * | 2019-06-20 | 2022-01-20 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
EP4026888A4 (en) | 2019-09-30 | 2022-11-30 | TERUMO Kabushiki Kaisha | CONTAINERS FOR LIVING CELL SEPARATION |
WO2021065989A1 (ja) | 2019-09-30 | 2021-04-08 | テルモ株式会社 | Cd56陽性細胞の比率を高めるための方法 |
WO2021076454A1 (en) * | 2019-10-16 | 2021-04-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Mechanically stable and high cell density honeycomb retinal scaffold design for transplantation therapy of photoreceptor cells and retinal pigment epithelium |
JPWO2021075525A1 (ja) * | 2019-10-17 | 2021-04-22 | ||
US20210189327A1 (en) * | 2019-12-24 | 2021-06-24 | Mcmaster University | 3d stimulated tissue constructs and methods of making thereof |
WO2021146994A1 (zh) * | 2020-01-22 | 2021-07-29 | 京东方科技集团股份有限公司 | 间充质干细胞膜片及其用途 |
JP6872051B2 (ja) * | 2020-02-05 | 2021-05-19 | テルモ株式会社 | シート状細胞培養物の製造方法 |
TW202306575A (zh) | 2021-06-23 | 2023-02-16 | 日商Adeka股份有限公司 | 去細胞化細胞結構體 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002008387A1 (fr) * | 2000-07-21 | 2002-01-31 | Cellseed Inc. | Feuille cellulaire du type muscle cardiaque, construction tridimensionnelle, tissu du type muscle cardiaque et procede de production associe |
US20030027332A1 (en) * | 2001-07-16 | 2003-02-06 | Edwards Lifesciences Corporation | Tissue engineered heart valve |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06104061B2 (ja) | 1989-02-10 | 1994-12-21 | 花王株式会社 | 細胞培養支持体材料 |
JP2777678B2 (ja) | 1990-06-11 | 1998-07-23 | 敏一 中村 | 組換ヒト肝実質細胞増殖因子及びその製造方法 |
JPH05192138A (ja) * | 1992-01-22 | 1993-08-03 | Kao Corp | 皮膚細胞培養法及び培養皮膚 |
US6432711B1 (en) * | 1993-11-03 | 2002-08-13 | Diacrin, Inc. | Embryonic stem cells capable of differentiating into desired cell lines |
US5618718A (en) | 1994-12-30 | 1997-04-08 | Universite Laval | Production of a contractile smooth muscle |
US6207451B1 (en) * | 1998-09-15 | 2001-03-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Mammalian muscle construct and method for producing same |
AU770889B2 (en) | 1999-07-23 | 2004-03-04 | Genvec, Inc. | Muscle cells and their use in cardiac repair |
JP4389008B2 (ja) | 1999-11-09 | 2009-12-24 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 有機ゲル複合化球形無機多孔質粒子およびその製造方法 |
JP4431233B2 (ja) | 1999-11-30 | 2010-03-10 | テルモ株式会社 | ハニカム構造体およびその調製方法、ならびにその構造体を用いたフィルムおよび細胞培養基材 |
JP2001213992A (ja) | 2000-01-31 | 2001-08-07 | Japan Chemical Innovation Institute | 感温性多孔質高分子ゲル粒子及びその製造方法 |
JP2002233567A (ja) | 2000-12-06 | 2002-08-20 | Mitsuo Ochi | 移植用組織等価物及びその製造方法 |
JP2002335949A (ja) | 2001-05-22 | 2002-11-26 | Inst Of Physical & Chemical Res | ハニカム構造体フィルムを用いた細胞の三次元組織培養法 |
JP3599701B2 (ja) * | 2001-11-15 | 2004-12-08 | 独立行政法人理化学研究所 | 立体構造物表面への細胞生着法 |
FR2833610B1 (fr) | 2001-12-14 | 2007-01-26 | Natural Implant | Construits cellulaires cultives in vitro, preparation et utilisations |
-
2004
- 2004-02-02 JP JP2006519056A patent/JP4943844B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-02 EP EP20100183373 patent/EP2266500B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-02 DK DK10183373T patent/DK2266500T3/da active
- 2004-02-02 EP EP10183361.4A patent/EP2266499B1/en not_active Revoked
- 2004-02-02 US US10/567,728 patent/US9587222B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-02-02 ES ES10183361.4T patent/ES2540242T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-02 DK DK10183361.4T patent/DK2266499T3/en active
- 2004-02-02 WO PCT/JP2004/001024 patent/WO2005011524A1/en active Application Filing
- 2004-02-02 EP EP04707319.2A patent/EP1659979B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-02-02 ES ES10183373.9T patent/ES2535087T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-09-28 JP JP2009223536A patent/JP2010029680A/ja active Pending
-
2012
- 2012-04-06 JP JP2012087825A patent/JP2012139541A/ja active Pending
-
2014
- 2014-10-27 US US14/524,212 patent/US20150110756A1/en not_active Abandoned
- 2014-10-30 JP JP2014221669A patent/JP2015033637A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002008387A1 (fr) * | 2000-07-21 | 2002-01-31 | Cellseed Inc. | Feuille cellulaire du type muscle cardiaque, construction tridimensionnelle, tissu du type muscle cardiaque et procede de production associe |
US20030027332A1 (en) * | 2001-07-16 | 2003-02-06 | Edwards Lifesciences Corporation | Tissue engineered heart valve |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6008065676; MEMON, I. et al.: 日本外科学会雑誌 Vol.104, 200304, p.422 * |
JPN6008065678; SHIMIZU, T. et al.: Journal of Artificial Organs Vol.5, 2002, pp.216-222 * |
JPN7012002430; AHMAD, I. et al.: 第6回日本組織工学会抄録集 , 200306, p.123 * |
JPN7012002433; 宮川繁 他: 第6回日本組織工学会抄録集 , 200306, p.50 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2017073794A1 (ja) * | 2015-10-30 | 2018-08-16 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞から3次元の心筋組織を製造する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4943844B2 (ja) | 2012-05-30 |
US9587222B2 (en) | 2017-03-07 |
EP1659979B1 (en) | 2015-04-01 |
US20150110756A1 (en) | 2015-04-23 |
EP2266500A2 (en) | 2010-12-29 |
DK2266500T3 (da) | 2015-04-27 |
DK2266499T3 (en) | 2015-06-29 |
EP2266499A2 (en) | 2010-12-29 |
EP2266500B1 (en) | 2015-04-01 |
ES2535087T3 (es) | 2015-05-05 |
ES2540242T3 (es) | 2015-07-09 |
EP2266500A3 (en) | 2011-09-14 |
JP2012139541A (ja) | 2012-07-26 |
EP1659979A1 (en) | 2006-05-31 |
JP2007528755A (ja) | 2007-10-18 |
EP2266499B1 (en) | 2015-06-10 |
JP2010029680A (ja) | 2010-02-12 |
US20070092492A1 (en) | 2007-04-26 |
EP2266499A3 (en) | 2011-09-14 |
WO2005011524A1 (en) | 2005-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4943844B2 (ja) | 三次元組織構造体 | |
JP6609595B2 (ja) | 肺臓の組織工学 | |
JP2024015176A (ja) | 臓器および組織を脱細胞化および再細胞化する方法 | |
ES2550267T3 (es) | Células derivadas de cordón umbilical post-parto para su uso en el tratamiento de enfermedad del corazón y el sistema circulatorio | |
Yeh et al. | Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model | |
Nunes et al. | Stem cell-based cardiac tissue engineering | |
Budharaju et al. | Recent advancements in cardiovascular bioprinting and bioprinted cardiac constructs | |
CN103221058B (zh) | 用于心脏修复的骨髓衍生cd271前体细胞 | |
US7396537B1 (en) | Cell delivery patch for myocardial tissue engineering | |
EP3275471A1 (en) | Three-dimensional structure for cardiac muscular tissue regeneration and manufacturing method therefor | |
Liu et al. | Electrospun nanofibrous sheets of collagen/elastin/polycaprolactone improve cardiac repair after myocardial infarction | |
WO2004037188A2 (en) | Cardiac muscle regeneration using mesenchymal stem cells | |
JP2012523238A (ja) | 三次元繊維芽細胞構築物の細胞播種および共培養 | |
CN108472319A (zh) | 用于治疗心脏病的移植材料 | |
Portillo Esquivel et al. | Application of cell, tissue, and biomaterial delivery in cardiac regenerative therapy | |
TWI263784B (en) | Encapsulated cell indicator system | |
WO2008101100A2 (en) | Composition for stimulating formation of vascular structures | |
JP2005278711A (ja) | ハニカムフィルムを用いた機能的人工組織の生産 | |
Lancaster | Development and testing of a tissue engineered cardiac construct for treatment of chronic heart failure | |
Hu et al. | Recellularization of Decellularized Whole Organ Scaffolds: Elements, Progresses, and Challenges | |
FÉRNANDEZ et al. | Postinfarction Functional Recovery Driven by a Three-Dimensional Engineered Fibrin Patch Composed of Human Umbilical Cord Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells | |
HL | 3rd EACTS Meeting on Cardiac and Pulmonary Regeneration Berlin-Brandenburgische Akademie, Berlin, Germany, 14–15 December 2012 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141128 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141128 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151201 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160201 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20160316 |