JP5269629B2 - 培養容器および細胞培養方法 - Google Patents

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Description

本発明は、培養容器および細胞培養方法に関するものである。
従来、シャーレ等の培養容器の底面に細胞を播種して培養する場合に、所定の培養期間が経過すると細胞が底面いっぱいに広がってコンフルエントな状態となるため、タンパク質分解酵素等によって培養容器の底面から細胞を一旦剥離させ、他の複数の培養容器に分割して播種する、いわゆる継代処理を行う必要がある。
特開平９−２３８７６号公報
しかしながら、培養容器の底面に付着している細胞を剥離させるのには手間がかかり、タンパク質分解酵素を使用すると細胞にダメージが与えられる不都合がある。また、剥離させた細胞を分離して他の複数の培養容器に播種し直す作業も手間がかかるという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞にダメージを与えることなく、手間を省いて簡易に所望の細胞数まで細胞を増殖させることができる培養容器および細胞培養方法を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、容器本体と、該容器本体の底面に配置され細胞を３次元的に付着させて培養可能な３次元培養基材と、該３次元培養基材の上面を被覆し、細胞を２次元的に付着させて培養可能であり、かつ、培養温度より低い温度で液状化する温度応答性の平坦な膜状の２次元培養基材とを備える培養容器を提供する。
本発明によれば、少数の細胞を２次元培養基材に２次元的に分散させて播種し、培養することで、細胞が凝集し易く細胞の活性を向上することができる。したがって、少数の細胞を所定の細胞数まで効率的に増殖させることができる。また、この２次元培養基材は３次元培養基材を被覆しているので、培養温度より低い温度に設定して２次元培養基材を液状化するだけで、２次元培養基材に付着していた細胞を３次元的な培養面を有する３次元培養基材に付着させることができる。
すなわち、この培養容器によれば、２次元培養基材において所定の細胞数まで増殖した細胞をタンパク質分解酵素等を用いて培養面から剥離したり、剥離した細胞を分離したりすることなく、より広い培養面に播種し直してさらに培養することができる。これにより、細胞にダメージを与えることなく、手間を省いて簡易に所望の細胞数まで細胞を増殖させることができる。
上記発明においては、前記３次元培養基材が、ハニカム構造または多孔質構造を有していることとしてもよい。
このように構成することで、３次元培養基材の内部にまで細胞を付着させることができ、より広い範囲で細胞を培養することができる。
また、上記発明においては、前記３次元培養基材が、プリーツ構造を有することとしてもよい。
このように構成することで、容器本体内の限られた範囲で３次元培養基材の表面積を大きくすることができ、より広い範囲で細胞を培養することができる。
本発明は、３次元培養基材の上面を被覆し培養温度より低い温度で液状化する２次元培養基材に細胞を２次元的に播種する細胞播種工程と、前記培養温度に設定して前記２次元培養基材上の前記細胞を培養する第１の培養工程と、前記培養温度より低い温度に冷却して前記２次元培養基材を液状化させ、該２次元培養基材に付着していた前記細胞を前記３次元培養基材に３次元的に付着させる継代工程と、前記所定の培養温度に設定して前記３次元培養基材に付着した前記細胞を培養する第２の培養工程とを備える細胞培養方法を提供する。
本発明によれば、細胞播種工程および第１の培養工程において、２次元培養基材に少数の細胞を２次元的に播種して培養することで、少数の細胞を所定の細胞数まで効率的に増殖させることができる。また、この２次元培養基材は３次元培養基材を被覆しているので、継代工程において培養温度より低い温度に設定して２次元培養基材を液状化するだけで、２次元培養基材に付着していた細胞を３次元培養基材に３次元的に付着させることができる。
すなわち、この細胞培養方法によれば、２次元培養基材において所定の細胞数まで増殖した細胞をタンパク質分解酵素等を用いて培養面から剥離したり、剥離した細胞を分離したりすることなく、継代工程および第２の培養工程において、より広い培養面に細胞を播種し直してさらに培養することができる。これにより、細胞にダメージを与えることなく、手間を省いて簡易に所望の細胞数まで細胞を増殖させることができる。
本発明によれば、細胞にダメージを与えることなく、手間を省いて簡易に所望の細胞数まで細胞を増殖させることができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る培養容器の概略図である。 図１の培養容器のハニカム構造を有する３次元細胞担体を上方から見た概略図である。 図１の培養容器の温度感受性シートに細胞を播種した様子を示した概略図である。 図３の細胞を培養して増殖させた様子を示した概略図である。 図４の温度感受性シートを液状化した状態方から見た概略図である。 図５の細胞が３次元細胞担体に付着した様子を上方から見た概略図である。 図１の培養容器の３次元細胞担体をプリーツ構造にした変形例を示した概略図である。
以下、本発明の一実施形態に係る培養容器１００および細胞培養方法について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る培養容器１００は、図１に示すように、細胞５０（図３参照）を収容する容器本体１と、容器本体１を密閉する蓋５とを備えている。培養する細胞５０としては、例えば、皮膚細胞、軟骨細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞等、接着性を有する生体組織由来の様々な細胞が挙げられる。
容器本体１は、例えば、透明なプラスチック製の容器であり、容器本体１の底面に配置された３次元構造の３次元構造担体（３次元培養基材）３と、３次元構造担体３の上面を被覆した平面状の温度感受性シート（２次元培養基材）２とを備えている。
３次元構造担体３は、容器本体１の底面全域に敷き詰められている。この３次元構造担体３は、例えば、図２に示すようにハニカム構造を有し、平面状の温度感受性シート２より大きな表面積を有している。これにより、３次元構造担体３は、内部の表面に３次元的に細胞５０を付着させて培養することができるようになっている。３次元構造担体３としては、例えば、コラーゲンなどスポンジ状の生体材料、リン酸カルシウム、ガラス、ポリ乳酸、ポリエチレン等の合成材料を用いることができる。
温度感受性シート２は、平坦な膜状部材であり、３次元構造担体３側とは反対側の表面に２次元的に細胞５０を付着させて培養することができるようになっている。また、温度感受性シート２は、培養温度（例えば、３７℃）より低い温度で液状化する温度応答性を有している。温度感受性シート２としては、例えば、メビオールジェル(登録商標）や温度感受性ゼラチンゲル（例えば、ＢＳＴ−Ｇｅｌ（登録商標））等を用いることができる。
次に、このように構成された本実施形態に係る培養容器１００の作用について説明する。
培養容器１００を用いて細胞５０を培養するには、図３に示すように、少数の細胞５０を容器本体１の温度感受性シート２の表面全面に略均等に間隔をあけて播種する（細胞播種工程）。温度感受性シート２上に細胞５０が播種されたら、容器本体１に蓋５をして所定の培養温度で保存する。この状態で、所定の細胞数まで細胞５０を培養する（第１の培養工程）。
細胞５０を温度感受性シート２の表面に２次元的に分散して播種することで、図４に示すように、細胞５０は広範囲にわたって温度感受性シート２上に増殖し、少数の細胞５０を所定の細胞数まで効率的に増殖させることができる。
細胞５０が所定の細胞数まで増殖したら、培養温度より低い温度に設定して、図５に示すように温度感受性シート２を液状化させる。温度感受性シート２は３次元構造担体３の上面に被覆されているので、温度感受性シート２が液状化することで、図６に示すように、温度感受性シート２に付着していた細胞５０が、３次元的な培養面を有する３次元構造担体３に付着する（継代工程）。
したがって、温度感受性シート２において所定の細胞数まで増殖した細胞５０をタンパク質分解酵素等を用いて培養面から剥離したり、剥離した細胞５０を分離したりすることなく、より広い培養面を有する３次元構造担体３に播種し直すことができる。この状態で、再度所定の培養温度に設定して細胞５０を培養する（第２の培養工程）。
以上説明したように、本実施形態に係る培養容器１００および細胞培養方法によれば、温度感受性シート２において少数の細胞５０を効率的に培養した後、温度を低くして度温度感受性シート２を液状化するだけで、より広い培養面を有する３次元構造担体３に細胞５０を播種し直すことができる。したがって、細胞５０にダメージを与えることなく、手間を省いて簡易に所望の細胞数まで細胞５０を増殖させることができる。
なお、本実施形態においては、３次元構造担体３がハニカム構造を有することとしたが、細胞５０を３次元的に付着させて培養することができればよく、例えば、３次元構造担体３が多孔質構造を有することとしてもよい。また、３次元構造担体３は、図７に示すように、プリーツ構造を有することとしてもよい。このようにすることで、容器本体１内の限られた範囲で３次元構造担体３の表面積をより大きくすることができる。
１ 容器本体
２ 温度感受性シート（２次元培養基材）
３ ３次元構造担体（３次元培養基材）
５０ 細胞
１００ 培養容器

Claims (4)

  1. 容器本体と、
    該容器本体の底面に配置され細胞を３次元的に付着させて培養可能な３次元培養基材と、
    該３次元培養基材の上面を被覆し、細胞を２次元的に付着させて培養可能であり、かつ、培養温度より低い温度で液状化する温度応答性の平坦な膜状の２次元培養基材と
    を備える培養容器。
  2. 前記３次元培養基材が、ハニカム構造または多孔質構造を有している請求項１に記載の培養容器。
  3. 前記３次元培養基材が、プリーツ構造を有する請求項１に記載の培養容器。
  4. ３次元培養基材の上面を被覆し培養温度より低い温度で液状化する２次元培養基材に細胞を２次元的に播種する細胞播種工程と、
    前記培養温度に設定して前記２次元培養基材上の前記細胞を培養する第１の培養工程と、
    前記培養温度より低い温度に冷却して前記２次元培養基材を液状化させ、該２次元培養基材に付着していた前記細胞を前記３次元培養基材に３次元的に付着させる継代工程と、
    前記所定の培養温度に設定して前記３次元培養基材に付着した前記細胞を培養する第２の培養工程と
    を備える細胞培養方法。
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