KR101480206B1 - 3차원 세포 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아가로스 젤 상에 접착성 있는 미세 구멍이 형성된 3차원 세포 배양 구조물, 이의 제조방법 및 상기 3차원 세포 배양 구조물에 세포를 부착한 후, 구조물을 거꾸로 뒤집어 배양하는 3차원 세포 배양방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 기존 구조물과 같이 가교 역할을 하는 인위적인 구조물을 만들어줄 필요가 없으며, 세포 사이의 구조물이 없으므로 새로운 배지 공급과 기체 순환 과정이 원활하여 3차원으로 세포를 배양하는데 좋은 환경을 제공할 수 있다.

Description

3차원 세포 배양방법{Three dimensional cell culturing method}

본 발명은 3차원 세포 배양 구조물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 3차원 세포 배양방법에 관한 것이다.

세포는 배양접시에서 배양할 경우 일반적으로 한 층으로 배양하는 것이 보통이다. 입체적 형태의 세포층을 관찰하기 위해서는 여려 겁의 세포층을 이루도록 3차원 세포 배양 구조물이 필요하다.

일반적으로 3차원 세포 배양 구조물이란 세포가 부착하고 증식할수 있는 공간을 제공하는 다공질의 3차원 구조물로서 생체 내에서와 유사한 세포 증식 환경을 제공하기 위한 구조물이다. 생체 내에서 세포는 주변 세포들에 둘러싸여 3차원적으로 증식하기 때문에 실험실 내에서 세포를 배양할 때에 생체 내에서와 유사한 환경을 제공하기 위해서는 세포가 3차원적으로 부착할 있는 다수의 세공을 가지는 다공질의 3차원 구조물을 이용할 수 있다.

그런데, 종래의 3차원 세포 배양 구조물들은 그 소재 및 제조 방법 상의 한계로 인해, 예를 들면 펩티드(peptide)의 자기조립(self-assembly)에 의해 3차원 구조물을 얻는 등의 이유로 인해 세공(pore)의 크기 및 그 배열 형태를 표준화하거나 의도대로 제어할 수 없었다. 이러한 점은 세포 배양 조건을 표준화하거나 특정 목적의 세포 배양 구조물을 제공하는 것을 제약하는 요소가 되어왔다.

또한, 기존 방식들은 세포를 여려 겹의 세포층으로 키우기 위해 세공(pore)을 촘촘히 만들어 세포들끼리 적당한 간격을 유지하여 층을 이루도록 하는 방식을 이용하여 입체적인 형태의 세포층을 이루도록 하는 것이 보통이다.

세포 사이에 원활한 순환을 위해 세포 사이의 적당한 공극 유지를 위하여, 젤라틴, 실리콘 합성물(PDMS), 폴리카프로락톤, 페이퍼, electrochemically switchable surfaces를 이용한 것 등 다양한 구조물이 사용되고 있다[AlgiMatrix 3D Cell Culture System; 3D Insert-PCL Cell Culture Plates; 비특허문헌 1 내지 4]. 이 각각의 구조물들은 원하는 형태로 다루기 어렵고 특성이 다른 다양한 세포의 조건에 맞추어 구조물을 변형시켜 세포를 입체배양하기는 쉽지 않다.

또한, 특허 문헌 1에는 3차원 동물 간 세포의 배양의 매트릭스 성분으로 콜라겐을 사용하고 있으나, 콜라겐은 접착력은 있어 세포가 자라기에는 좋지만, 내구성이 떨어져 연구자가 다루기 쉽지 않고 그 점을 보안하기 위한 다른 특수한 도구가 필요하다는 불편함이 있다.

특히, 본 발명에서 사용하고 있는 아가로스의 경우에는 연구자가 핸들링 하기에 용이하나, 점착성이 없고 식물성 재료로 세포벽이 없어 동물 세포를 배양하기에는 적합하지 않았었다.

하지만 본 발명자들은 아가로스에 당을 결합시켜 접착력을 부여하여 동물 세포 배양용으로 적합한 매트릭스 성분으로 변형시킴으로써 아가로스 장점을 살리면서 단점을 보완함으로써 3차원 세포 배양을 가능하게 하였다.

국내 공개 제2011-0091805호

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/3D-Cell-Culture/3D_Cell_Culture-Misc/AlgiMatrix.html http://www.techtransfer.harvard.edu/technologies/tech.php?case=3231 http://www.ibidi.com/applications/ap_angiogenesis.html Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 839-845, The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue

이에, 본 발명자들은 기존 3차원 세포 배양법의 문제점을 해결하고자 연구 노력한 결과, 아가로스(agarose)에 점착성 있는 미세 구멍을 형성시키고 여기에 세포를 부착시켜 거꾸로 뒤집어 세포를 배양하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 아가로스 젤 상에 점착성 있는 미세 구멍이 형성된 3차원 세포 배양 구조물 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 3차원 세포 배양 구조물의 미세 구멍에 배양하고자 하는 세포를 부착시키고 구조물을 거꾸로 뒤집어 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양방법 및 3차원 세포 배양 키트를 제공하는데 다른 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은

아가로스 젤 상에 점착성 있는 미세 구멍이 형성된 3차원 세포 배양 구조물을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은

아가로스 젤 상에 점착성 있는 미세구멍이 형성시키는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양 구조물의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은

상기 3차원 세포 배양 구조물의 미세 구멍에 배양하고자 하는 세포를 부착시키고 구조물을 거꾸로 뒤집어 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양방법을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은

자동배지공급배양접시, 에어필터, 멸균된 당 분말 및 모세관을 포함하는 3차원 세포 배양 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 세포 배양방법은 아가로스 젤 상에 굴곡(미세기공)을 만들어 표면적을 넓혀 스펀지와 같은 형태가 되도록 하여 더 많은 세포의 부착과 배지(media) 확보가 가능하므로 세포 배양이 더 원활하게 유도할 수 있다. 또한, 3차원 세포 배양 구조물을 거꾸로 뒤집어 세포를 배양하여 중력방향으로 세포가 자라게 되어 세포들이 중첩에 의해 눌려 성장이 억제되는 것을 방지할 수 있다.

게다가, 원활한 배지 공급을 위해 세포들 사이를 일정 간격으로 거리를 두기 위한 가교 역할을 하는 인공구조물을 별도로 만들어 주지 않아도 되고, 점성에 의해 세포가 부착될 수 있는 환경을 제공하므로 세포가 적응하기에 좋은 환경을 제공할 수 있다. 또한, 적은 양의 배지로도 세포를 배양할 수 있고, 재료를 용이하게 구할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 3차원 세포 배양구조물의 배양방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 원래 세포를 걸러 내는 체(strainers)로 사용되는 제품(Biologix Research Company사)이나, 본 발명에서는 3차원 세포 배양용 배지 제조 시 멸균한 글루코오스 분말을 아가로스 용액 상에 골고루 뿌려 접착성 미세구멍이 고루 분포하도록 하기 위해 사용된 것이다.
도 3은 본 발명의 3차원 세포 배양법으로 배양된 세포를 관찰하기 위하여, 아가로스 젤로 분리하지 않고 아가로스 젤을 잘라 확인하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 기존 입체 세포 배양법의 경우에는 가교구조가 필요한 문제가 있거나(a, b), 세포 배양 시 중력에 의해 처음 배양된(밑부분) 세포가 중첩에 의해 눌려 배양액 공금 및 기체 순환이 어려운 문제가 있으나(c), 본 발명의 세포 배양법(d)은 세포가 점성이 있는 아가로스 젤에 스스로 부착하여 거꾸로 뒤집어 배양하므로 중력 방향으로 세포가 자라기 때문에 세포들이 눌리지 않고 적당한 간격을 유지하며 자랄 수 있는 장점이 있다.
도 5는 본 발명의 3차원 세포 배양 장치를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 3차원 세포 배양법으로 배양한 지 3일째 된 자궁경부암세포(SiHa)의 사진이다.
도 7은 본 발명의 3차원 세포 배양법으로 배양한 지 4일째 된 자궁경부암세포(SiHa)의 사진이다[a,b,c: 빨간색 표시 부분을 확대한 사진].
도 8은 본 발명의 3차원 세포 배양법으로 배양한 지 4일째 된 위암세포(AGS)의 사진이다[화살표: 아가로스 젤에 입체로 배양된 세포가 박힌 방향을 표시한 것임].
도 9는 본 발명의 3차원 세포 배양법으로 배양한 지 5일째 된 위암세포(AGS)로, 배지를 넣어주지 않아도 아가로스 젤이 머금고 있는 수분에 의해 세포가 마르지 않음을 보여주는 사진이다[a: 빨간색 표시 부분을 확대한 사진].

본 발명은 아가로스 젤 상에 점착성 있는 미세구멍이 형성된 3차원 세포 배양 구조물에 관한 것이다.

상기 접착성 있는 미세구멍은 당 분말에 의해 형성되며, 세포가 부착할 수 있는 환경을 제공한다. 특히, 물리적인 처리에 의한 당 분말의 크기, 양에 따라 미세 구멍의 크리는 조절할 수 있다.

아가로스 젤 내에 미세구멍을 형성하여 아가로스 젤의 표면적을 넓혀 스펀지와 같은 형태가 되도록 함으로써 더 많은 세포의 부착과 배지(media) 확보가 가능하다. 이로서, 세포 배양을 더욱 원활히 유도할 수 있다. 또한, 아가로스는 끓는 물에서 잘 녹고 수분친화력이 좋다. 따라서, 배양 온도에서는 내구성이 뛰어나고 증류수에 넣고 끓이면 수분 확보가 용이하여 세포를 배양하는 동안 적은 양의 배양 용액으로도 세포가 건조되지 않을 뿐만 아니라, 아가로스 젤 자체에 함유된 수분으로 인하여 세포 대사로 생긴 암모니아, 이산화탄소 등에 의해 증가되는 pH를 완화시키는 작용을 할 수 있다.

상기 당은 아가로스 젤 상에 점착성 있는 미세 구멍을 형성시키기 위해 사용되므로, 점착성을 가지며 젤 상에 미세구멍을 형성시킬 수 있는 것이면 모두 사용 가능하나, 이당류 또는 글루코오스가 바람직하며, 특히 세포 대사에 필요한 영양분 제공이 가능하고 별도 효소가 필요하지 않으며 세포 대사 후 불필요한 찌꺼기가 생성되지 않는 점에서 글루코오스를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명은 아가로스 젤 상에 접착성 있는 미세구멍을 형성하는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양 구조물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 1) 아가로스(agarose) 용액이 식기 전에 멸균된 당 분말을 뿌린 후, 아가로스 용액을 식혀 아가로스 젤을 제조하는 단계; 및 2) 상기 아가로스 젤에서 당을 제거하여 접착성 있는 미세구멍을 형성하는 단계로 구분할 수 있다.

상기 3차원 세포 배양 구조물의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 아가로스 젤을 제조하기 위하여, 아가로스를 증류수에 넣고 끊인 후, 배양 접시에 아가로스 용액을 도포한다. 상기 아가로스는 0.5 내지 5%(w/v) 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 아가로스 용액의 농도가 0.5%(w/v) 보다 낮을 경우 내구성이 현저히 떨어지고 5%(w/v) 보다 높을 경우 세포가 아가로스젤 환경에 적응하기에 적합하지 않다.

상기 아가로스 용액 상에 멸균된 당 분말을 골고루 뿌린 후, 당 분말이 살짝 녹은 상태로 아가로스 용액을 굳혀 접착성이 있는 아가로스 젤을 제조한다. 특히, 당을 알코올로 소독하여 멸균시키는 과정은 원활한 세포 배양을 위해서 필수적인 과정이다.

상기 굳은 아가로스 젤에 박혀 남은 당을 증류수로 완전히 녹여 제거하여 접착성 있는 미세구멍이 형성된 3차원 세포 배양 구조물을 제조한다.

본 발명은 상기와 같은 방법으로 제조된 3차원 세포 배양 구조물을 포함한다.

또한, 상기 3차원 세포 배양 구조물을 이용한 3차원 세포 배양방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 3차원 세포 배양방법은 상기 3차원 세포 배양 구조물의 미세구멍에 배양하고자 하는 세포를 부착시키고 구조물을 거꾸로 뒤집어 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

또한, 배지(media)를 공급하는 단계를 추가로 포함한다.

3차원 세포 배양 구조물을 거꾸로 뒤집어 세포를 배양함으로써 중력 방향으로 세포가 자라게 되어 세포들이 중첩에 의해 눌려 사멸되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 원활한 배지 공급을 위해 세포들 사이를 일정 간격으로 거리를 두기 위한 가교 역할을 하는 인공 구조물이 별도로 필요하지 않다.

이렇게 배양된 세포는 통상적인 고정액으로 고정하여 슬라이드로 제작하여 관찰할 수 있다.

세포를 입체로 배양한 후 도 3의 착색 아가로스 젤(검정색으로 표시된 젤)을 도포하여 내구성이 좋고 얇게 재조된 입체배양용 아가로스 젤과 배양 접시로부터 분리가 용이한 두께가 되도록 제작하여, 배양된 세포가 부숴지지 않게 분리할 수 있게 한다.

또한, 도 3과 같이 착색 아가로스 젤은 아가로스 젤을 도포하여 입체배양용 젤과 구분한다. 배양용 접시와 분리되며 증류수를 끓여 만든 아가로스 젤은 재료의 성질이 끈적이지 않고 약간의 수분과는 밀착된다. 그러므로 도 3에서 입체 배양한 세포만을 착색 아가로스 젤층으로부터 박리하지 않고 밀착하여 아가로스 젤을 잘라 관찰이 용이하다.

본 발명에서 사용하고 있는 아가로스의 경우에는 연구자가 다루기 쉽고 내구성이 뛰어나 세포 입체 배양에 적합하나 접착력이 떨어지는 점을 당을 이용하여 보안하여 세포를 입체배양에 적합하도록 제작한 것이 특징이다. 세포배양 접시의 미세구멍이 배양을 머금도록 하여 배양접시를 뒤집어도 배지가 흐르지 않도록 제작되어 세포가 중력방향으로 아가로스 젤에 매달려 증식하게 된다.

그러므로 본 발명에서는 세포를 배양접시를 거꾸로 뒤집어 배양하여 세포들 간에 중첩되어 눌리지 않게 함으로써 공극을 따로 만들어 주지 않아도 배양액과 기체의 순환이 잘 되는 간편함이 있다.

상기와 같은 본 발명의 세포 배양법을 적용하기 위하여, 본 발명은 또한 3차원 세포 배양 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 3차원 세포 배양 키트는 자동배지공급배양접시, 에어필터, 모세관 및 배지 공급기 외에 멸균된 당 분말을 포함할 수 있으며, 추가로 아가로스를 포함할 수 있다.

상세하게는 첨부도면 도 5에 나타낸 바와 같이, 아가로스 젤 제작용 자동배지공급배양접시로, 세포배양을 하는 접착성 입체 배양 아가로스 젤 접시 부분과 배양액 넣는 용기를 접착성 입체 배양 아가로스 젤 접시 뒷부분에 부착하여 모세관을 통하여 배양을 공급하는 방식[도 5의 b]이다.

즉, 거꾸로 뒤집어서 세포를 배양하는 동안 배지가 마르지 않고 새로운 배양액이 계속 공급될 수 있도록 하기 위한 장치로 일체형과 분리형으로 제작할 수 있다. 자동배지공급을 위해 배양접시 내부의 기압과 바깥의 기압은 도 5의 a와 같이 에어필터(Air Filter)를 배양액 용기에 꽂아 조절되도록 한다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 3D 세포 배양

클린벤치에서 100% 에탄올이 담긴 5-플라스크에 D-글루코오스 분말을 넣어 골고루 헹궈 불순물을 제거하였다. 새로운 100% 에탄올을 이용하여 3회 충분히 헹군 후 에탄올을 따라 버리고, 뚜껑이 닫힌 상태에서 56℃ 드라이 오븐에 넣고 24시간 이상 완전히 건조시켜 멸균된 D-글루코오스를 미리 준비해두었다.

1.5%(w/v) 아가로스를 증류수에 넣고 아가로스가 완전히 녹을 때까지 끓인 후, 클린밴치에서 아가로스 용액을 48-well 배양 접시에 각각 200 μl씩 분주하였다. 아가로스 용액이 식기 전에 바로 멸균된 D-글루코오스를 표면이 덮이도록 골고루 뿌려 그대로 식혀 굳혔다.

완전히 굳은 후, 증류수를 1ml씩 넣고 1~2시간 방치하여 D-글루코오스가 완전히 녹은 것을 확인하였다.

새로운 증류수로 헹궈 완전히 D-글루코오스를 제거하고, 세포배양용 배지(RPMI1640 배지에 10% FBS와 10% Human Serum을 넣은 배지) 500 μl 넣고 한 번 헹궈 세포배양이 가능한 배지가 되도록 하였다. 자궁경부암 세포(SiHa Cell line) 및 위암 세포(AGS Cell line)를 세포배양용 배지에 넣고 각각 5.6 Ｘ 10⁶ 개씩 48개의 각 웰에 각각 200 ul씩 분주한 후 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하여 미리 만들어 놓은 점성이 있는 아가로스 젤에 세포들이 붙도록 하였다. 붙지 않은 세포와 상층액을 흐르지 않을 정로로 제거하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양용 접시를 뒤집어 거꾸로 세포를 배양하였다.

매일 새로운 세포배양용 배지를 200 μl씩 넣고 흐르지 않을 정도로 제거하여 세포배양에 따른 노폐물을 제거하고 새로운 배지를 공급하였으며 세포가 마르지 않도록 하였다. 상기와 같은 방법으로 배양용 접시를 뒤집어서 거꾸로 3~4일 동안 배양한 결과는 도 6~7과 같다. 또한, 아가로스 젤이 머금고 있는 증류수로 적은 양의 배지로도 세포가 마르는 것을 억제할 수 있었고 pH의 변화를 조절하는 효과가 있다[도 8 및 도 9].

상기와 같은 방법으로 배양용 접시를 뒤집어서 거꾸로 5일 동안 세포 배양을 하였으며, 세포가 글루코오스의 점성에 접착된 후 2~3일 후부터는 아가로스 젤에 환경에 적응하여 도 7과 같이 4일째부터는 아가로스 젤에 박혀 입체적으로 증식하는 형태로 배양되었다.

Claims (15)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 아가로스 젤 상에 점착성 있는 미세구멍을 형성시키는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양 구조물의 제조방법.
   
5. 아가로스(agarose) 용액이 식기 전에 멸균된 당 분말을 뿌린 후, 아가로스 용액을 식혀 아가로스 젤을 제조하는 단계; 및
   상기 아가로스 젤에서 당을 제거하여 점착성 있는 미세구멍을 형성하는 단계;
   를 포함하는 3차원 세포 배양 구조물의 제조방법.
   
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 아가로스는 증류수에 대하여 0.5 내지 5%(w/v) 농도인 3차원 세포 배양 구조물의 제조방법.
   
7. 제 5 항에 있어서,
   상기 멸균된 당은 당을 100% 알코올로 소독하여 건조한 3차원 세포 배양 구조물의 제조방법.
   
8. 제 5 항에 있어서,
   상기 당은 이당류 또는 글루코오스인 3차원 세포 배양 구조물의 제조방법.
   
9. 제 5 항에 있어서,
   상기 당은 증류수로 녹여 제거하는 3차원 세포 배양 구조물의 제조방법.
   
10. 삭제
11. 제 5 항의 방법으로 제조된 3차원 세포 배양 구조물의 미세구멍에 배양하고자 하는 세포를 부착시키고 구조물을 거꾸로 뒤집어 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 3차원 세포 배양방법.
    
12. 제 11 항에 있어서,
    배지(media)를 공급하는 단계를 추가로 포함하는 3차원 세포 배양방법.
    
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제

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