KR20210011975A - 생물반응기에서 세포 배양을 위한 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다수의 세포 미소구획을 함유하는 밀폐된 챔버를 포함하는 생물반응기에서 세포 배양을 위한 시스템에 관한 것으로서, 미소구획은 각각이 자가-조직화된 세포의 세트 및 세포외 매트릭스 또는 세포외 매트릭스 대체물을 함유하는 공동을 제공하는 외부 히드로겔 층을 포함한다. 본 발명은 또한 세포 및/또는 오가노이드, 및/또는 분자 및/또는 복합 분자 집합체를 생산하기 위한 이러한 생물반응기의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생물반응기에서 세포 배양을 위한 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 따른 시스템은 관심 세포, 세포 집합체 (오가노이드, 조직)의 생산 및/또는 관심 분자 또는 복합 분자 집합체 (세포외 메트릭스의 성분, 세포 소기관, 항체, 백신, 엑소솜, 비로이드)의 생산, 또는 이러한 시스템에서 성장된 세포로부터 생산되거나 또는 세포로부터 기원하는 관심의 다른 물질의 생산에 사용될 수 있다.
생물반응기 세포 배양 시스템은 특히, 약학 산업을 위해 관심이 증가되고 있다. 실제로, 진핵생물 세포는, 치료 도구로서, 특히 세포 및 조직 요법에서, 그리고 단백질 분획 (인슐린, 항체 등)으로부터, 세포 또는 세포 소기관, 세포외 소포체 및 엑소솜으로부터 유래된 단백질, 지질 및 당의 복합체를 통해서, 바이러스 유도체 (특히 백신 생산용)에 대해서, 관심 분자의 생물생산을 위한 도구로서 점점 더 많이 사용되고 있다. 생물반응기 세포 배양 시스템은 이들 세포의 대량 배양을 가능하게 하여서 산업적 규모의 관심 분자 및/또는 세포에 대한 요구를 충족시킨다.
현재, 3가지 주요한 부류의 생물반응기 세포 배양 방법이 존재한다:
- 회분 배양이 가능한 방법으로서, 여기서 세포는 배양 배지에 고정 부피로 접종된다. 충분한 성장을 가능하게 하는 적절한 배양 시간 이후에, 분자 및/또는 세포를 수확한다. 이들 방법의 주요 문제는 배지에 존재하는 영양분이 시간 경과에 따라 고갈되고, 독성 대사산물이 축적된다는 것이다;
- 유가 배양 (fed-batch culture) 이 가능한 방법으로서, 여기서 배양 배지는 허용가능한 세포 밀도를 유지하면서 세포에 필요에 따라 공급되도록 첨가된다. 이들 시스템의 주요 문제는 대사 폐기물이 제거되지 않고 생물반응기에 축적되어, 궁극적으로 수율에 영향을 미친다는 것이다;
- 관류 배양이 가능한 방법으로서, 여기서 배양 배지는 세포에 공급하고 폐기물을 제거하도록 연속적으로 변화된다. 이러한 시스템은 더 높은 수율을 가능하게 하지만, 배양 배지의 신속하고 연속적인 변화는 그들을 손상시키지 않고 (흐름을 통해 발생된 기계적 응력) 세포를 유지시키는 것을 필요로 한다.
종래 기술에서, 이들 대량 생물생산 방법은 취성 세포 또는 취성 세포 집합체에 대한 적용가능성이 거의 없거나 또는 전혀없다. 실제로, 현탁물로, 응집체로, 또는 미립담체 상에서, 세포 및 세포 집합체는 배양 배지 중에서 기계적 응력 (충격, 전단력, 압력 등)에 직접적으로 노출된다. 부피가 커지게 되면, 배지를 교반 또는 순환시키는데 사용되는 기계력, 특히 배지를 교반시키는 가동 소자로 인한 충돌 또는 액체 흐름으로 적용되는 전단 응력이 세포 또는 세포 집합체를 파괴시킬 수 있다.
생물반응기에서 세포 배양의 이들 문제에 대해 노력하여, 본 발명자들은 생물반응기 내에서 많은 수의 세포를 배양하기 위해서 외부 히드로겔층에 의해 한정되는 미소구획 (microcompartment) 내에 배양 공간을 생성시키는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 따라서 관심 세포 적소 (niche)는 유리하게 영양분을 침투할 수 있게 하고 단백질 및 대사산물은 탈출할 수 있게 하지만 크기가 150 kDa을 초과하는 구성요소 (세포외 매트릭스, 엑소솜, 바이러스 입자, 세포)는 보유하는 히드로겔 쉘에 의해 둘러 싸여진다. 게다가, 세포가 히드로겔 쉘에 의해서 반응기 내에 존재할 수 있는 응력으로부터 보호되므로, 생물반응기를 통한 흐름은 히드로겔 쉘이 지지할 수 있는 만큼 강력할 수 있다. 더 나아가서, 세포 미소구획의 히드로겔 쉘은, 현행 배양 시스템과 달리, 충돌과 관련된 기계적 응력으로부터 세포를 보호하고 세포가 겪게되는 국소 조건 (배지 중 확산 거리, 기계적 응력)이 변화되어 재현성 문제를 초래하는, 액체 현탁 배양 동안 존재하는 다세포 구성요소 (응집체, 미립담체)의 융합을 방지한다. 미소구획은 생물반응기에서 현탁되어서, 배양 배지로의 균질한 접근 및 미소구획으로의 확산을 비롯하여, 양호한 대류를 가능하게 한다. 또한, 세포 적소가 히드로겔 쉘에 의해 보호되므로, 낮은 세포 사멸 및 충분히-통제된 표현형으로 최적 수율 조건 하에서 가장 취약한 세포 유형을 배양하는 것이 가능하다. 겔에 감싸진 단순한 스페로이드와 달리, 캡슐 내 공동은 세포가 세포외 매트릭스 상에서 복제하고/하거나 자가-조직화할 공간을 남겨둔다. 유리하게, 각각의 미소구획은 고유한 세포 적소를 포함한다. 달리 말해서, 제공된 히드로겔 쉘은 단일 세포 적소를 둘러싼다. 미소구획의 외부층이 히드로겔로 만들어지므로, 생산 종료 시에 세포를 회수하기 위해 쉽게 용해시킬 수 있다. 이들 미소구획은 3D이므로, 유리하게 그들은 최대 100 000배까지 미소구획에서 세포 증폭을 가능하게 한다.
따라서 본 발명은 이의 목적으로서 다수의 세포 미소구획을 함유하는 밀폐된 챔버를 포함하는 생물반응기 세포 배양 시스템을 가지며, 미소구획은 각각이 자가-조직화된 세포의 세트 및 세포외 매트릭스 또는 세포외 매트릭스 대체물을 함유하는 공동을 제공하는 외부 히드로겔층을 포함한다.
본 발명에 따라서, 외부 히드로겔 층은 세포의 세트를 둘러싼다. 히드로겔 층은 세포의 세트를 함유하는 공동을 제공하는, 중공 캡슐을 형성한다.
유리하게, 히드로겔 캡슐은 고유한 세포의 세트를 함유한다.
본 발명에 따라서, 다수의 세포 미소구획이 생물반응기 챔버에 현탁된다. 보다 특히, 미소구획은 생물반응기 챔버에 함유된 배양 배지에 부유된다.
본 발명은 또한 이의 목적으로서 관심 세포의 생산 및/또는 증폭을 위한, 밀폐된 챔버를 포함하는, 이러한 생물반응기 세포 배양 시스템의 용도를 갖는다. 증폭은 유리하게 각 계대 사이에 2 내지 100,000배이다. 이러한 증폭 배율은 접종된 생존 세포 수로 나눈, 증폭 종료시 수확된 생존 세포의 수에 해당된다.
본 발명은 또한 이의 목적으로서 관심 분자 및/또는 복합 분자 집합체, 예컨대 세포외 매트릭스의 성분, 세포 소기관, 항체, 백신, 엑소솜, 비로이드 등의 생산을 위한 이러한 생물반응기 세포 배양 시스템의 용도를 가지며, 상기 분자 및/또는 집합체는 미소구획의 세포에 의해서 상기 미소구획 밖으로 배양 배지에 배출되거나, 또는 반대로 후속 수확을 위해 미소구획 내부에 축적된다.
본 발명은 또한 이의 목적으로서 하기에 따른 단계를 포함하는 관심 세포 또는 오가노이드의 제조를 위한 방법을 갖는다:
- 다수의 세포 미소구획을 밀폐된 챔버를 포함하는, 생물반응기에 도입시키는 단계로서, 상기 미소구획은 각각이 세포 및 세포외 매트릭스 또는 세포외 매트릭스 대체물을 캡슐화하는 외부 히드로겔 층을 포함하는 것인 단계;
- 미소구획 내 세포의 증식, 및/또는 오가노이드로 세포의 자가-조직화를 가능하게 하는 조건 하에서 미소구획을 배양시키는 단계;
- 세포 미소구획을 회수하는 단계;
- 및 임의로, 히드로겔 층을 가수분해시켜서 오가노이드 또는 관심 세포를 회수하는 단계.
본 발명은 또한 이의 목적으로서 하기에 따른 단계를 포함하는 다능성, 만능성 또는 전능성 세포로부터 분화된 세포를 제조하기 위한 방법을 갖는다
- 다수의 세포 미소구획을 생물반응기에 도입시키는 단계로서, 상기 미소구획은 각각이 다능성, 만능성 또는 전능성 세포 및 세포외 매트릭스 또는 세포외 매트릭스 대체물을 캡슐화하는 외부 히드로겔 층을 포함하는 것인 단계;
- 미소구획 내 세포의 증식, 및/또는 하나 이상의 관심 세포 유형(들)으로의 분화를 가능하게 하는 조건 하에서 미소구획을 배양시키는 단계;
- 세포 미소구획을 회수하는 단계;
- 및 임의로, 히드로겔 층을 가수분해시켜서 관심 세포 유형(들)을 회수하는 단계.
본 발명자들은 가교된 히드로겔의 외부 캡슐 내부에 세포를 유지시킴으로써, 밀폐된 챔버를 포함하는 반응기 내에서 세포를 배양하는 것이 가능하고 특히 유리하다는 것을 발견하였다. 보다 상세하게, 본 발명자들은 각각이 자가-조직화된 세포의 세트 및 세포외 매트릭스 또는 세포외 매트릭스 대체물을 캡슐화하는 외부 히드로겔 층을 포함하는 세포 미소구획을 개발하였다. 본 발명에 따라서, 세포 미소구획은 생물반응기에 현탁된다.
본 발명에 따라서, 자가-조직화된 세포는 세포 상호작용 및 커뮤니케이션을 생성시키고 관심 3차원 미세구조를 형성하도록 서로에 대해서 고유하게 위치된 세포의 세트를 의미한다. 따라서 각각의 미소구획은 자가-조직화된 세포의 세트를 함유하는, 외부 히드로겔 층, 또는 히드로겔 캡슐을 포함한다. 세포는 히드로겔 캡슐 내에서 증식, 조직화 및/또는 분화될 수 있다.
일 구현예에서, 히드로겔 캡슐은 자가-조직화된 세포의 고유한 세트를 함유한다. '고유한' 은 캡슐이 더 또는 덜 응집할 수 있는, 오직 하나의 세포군을 함유한다는 것을 의미한다. 특히, 세포의 고유한 세트는 상기 세트의 각 세포가 상기 세트의 적어도 하나의 다른 세포와 물리적으로 접촉하고 있는 3차원 세포 구조를 의미한다.
본 발명에 따라서, 모든 종류의 진핵생물 세포, 및 보다 특히 포유동물 세포를 캡슐화하는 것이 가능하다. 특히, 세포는 분화된 세포, 전구체, 줄기 세포, 다능성 세포, 만능성 세포, 전능성 세포, 유전자 변형 세포, 및 이의 혼합물 등으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 캡슐화된 세포는 특히 배아 줄기 세포 및/또는 유도 만능성 세포 (IPS)로부터 선택된, 만능성 줄기 세포이다. 일 구현예에서, 캡슐화된 세포는 배아 줄기 세포, 특히 만능성 배아 줄기 세포이다. 일 구현예에서, 캡슐화된 세포는 인간 배아의 파괴를 요구하는 인간 배아 줄기 세포를 제외한, 배아 줄기 세포이다. 다른 구현예에서, 캡슐화된 세포는 상기 배아 줄기 세포가 수득된 나라에서 그 당시에 시행 중인 생명윤리법에 따라서, 더 이상 부모 프로젝트의 대상이 아닌 의료적으로 도움을 얻는 출산의 상황에서 착상된 과잉 인간 배아로부터 유래된 인간 배아 줄기 세포이다. 다른 구현예에서, 캡슐화된 세포는 유도 만능성 세포 (IPS), 및 특히 인간 유도 만능성 세포 (hIPS)이다. 다른 구현예에서, 캡슐화된 세포는 배아 줄기 세포 및 유도 만능성 세포이다. 일 구현예에서, 캡슐화된 세포는 배아 줄기 세포 및 유도 만능성 세포의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, "외부 히드로겔 층" 또는 "히드로겔 쉘"은 액체, 및 바람직하게는 물에 의해 팽창된 중합체 사슬의 혼합물로 형성된 3차원 구조를 의미한다. 이러한 외부 히드로겔 층은 히드로겔 용액을 가교시켜 수득된다. 유리하게, 히드로겔 용액의 중합체(들)는 온도, pH, 이온 등과 같은 자극이 가해질 때 가교가능한 중합체이다. 유리하게, 사용된 히드로겔 용액은 이것이 세포에 유독하지 않다는 의미에서, 생체적합성이다. 히드로겔 층은 유리하게 세포의 생존, 증식, 분화, 성숙화, 및/또는 관심 분자 또는 분자 집합체의 생산 및/또는 관심 세포 거동의 재현이 가능하도록 용존 가스 (및 특히 산소 및/또는 이산화탄소), 영양분, 및 대사 폐기물의 확산을 가능하게 한다. 히드로겔 용액의 중합체는 천연 또는 합성 기원일 수 있다. 예를 들어, 히드로겔 용액은 술포네이트-기반 중합체, 예컨대 소듐 폴리스티렌 술포네이트, 아크릴레이트-기반 중합체, 예컨대 소듐 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 젤라틴 메타크릴레이트 화합물, 다당류, 및 특히 박테리아 기원의 다당류, 예컨대 젤란 검, 또는 식물 기원의 다당류, 예컨대 펙틴 또는 알기네이트 중 하나 이상의 중합체를 함유한다. 일 구현예에서, 히드로겔 용액은 적어도 알기네이트를 함유한다. 바람직하게, 히드로겔 용액은 오직 알기네이트만을 함유한다. 본 발명의 문맥에서, "알기네이트"는 β-D-만누로네이트 (M) 및 α-L-굴루로네이트 (G)로부터 형성된 선형 다당류, 이의 염 및 유도체를 의미한다. 유리하게, 알기네이트는 80% 초과의 G 및 20% 미만의 M으로 구성되고, 100 내지 400 kDa의 평균 분자량 (예를 들어: PRONOVA® SLG100)을 갖는 소듐 알기네이트로서, 총 농도는 0.5 밀도% 내지 5 밀도% (중량/부피)에 포함된다.
본 발명에 따라서, 세포 미소구획은 밀폐된다. 세포 미소구획에 이의 크기 및 형상을 제공하는 것은 외부 히드로겔 층이다. 미소구획은 세포의 캡슐화와 상용성인 임의 형상을 가질 수 있다.
바람직하게, 세포외 매트릭스 층은 겔을 형성한다. 세포외 매트릭스 층은 세포 배양, 예를 들어 만능성 세포에 필요한 단백질 및 세포외 화합물의 혼합물을 포함한다. 바람직하게, 세포외 매트릭스는 구조 단백질, 예컨대 라미닌 521, 511 또는 421, 엔탁틴, 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐을 비롯하여, 성장 인자, 예컨대 TGF-베타 및/또는 EGF를 포함한다. 일 구현예에서, 세포외 매트릭스 층은 Matrigel® 및/또는 Geltrex®로 이루어지거나 또는 이를 함유한다.
본 발명에 따라서, 미소구획은 세포외 매트릭스 대신에, 세포외 매트릭스 대체물을 함유할 수 있다. 세포외 매트릭스 대체물은 막 단백질 및/또는 세포외 신호 전달 경로와의 상호작용에 의해 세포 부착 및/또는 생존을 촉진할 수 있는 화합물을 의미한다. 예를 들어, 이러한 대체물은 단백질 (라미닌, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 및 콜라겐), 비술페이트화 글리코사미노글리칸 (히알루론산) 또는 술페이트화 글리코사미노글리칸 (콘드로이틴 술페이트, 더마탄 술페이트, 케라탄 술페이트, 헤파란 술페이트)를 포함하는 생물학적 중합체 및 이의 단편, 및 생물학적 중합체로부터 유래되거나 또는 그들 성질을 재현한 유닛 (RGD 유닛)을 함유하는 합성 중합체 및 기질과의 부착을 모방하는 소형 분자 (Rho-A 키나제 억제제 예컨대 Y-27632 또는 티아조비빈)를 포함한다.
히드로겔 캡슐 내에 세포 및 세포외 매트릭스를 함유하는 세포 미소구획의 제조를 위한 임의 방법은 본 발명에 따른 제조 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 특히, [Alessandri et al. 2016 ("A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC)", Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, pp. 1593-1604)]에 기술된 미세유체 장치 및 방법을 적용하여 미소구획을 제조하는 것이 가능하다.
유리하게, 세포 미소구획의 치수는 제어된다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 미소구획은 구형 형상을 갖는다. 바람직하게, 이러한 미소구획의 직경은 10 ㎛ 내지 1 mm, 보다 바람직하게 50 ㎛ 내지 500 ㎛, 보다 더 바람직하게 500 ㎛ 미만, 바람직하게 400 ㎛ 미만에 포함된다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 미소구획은 장방형 형상을 갖는다. 특히, 미소구획은 타원형 또는 관형 형상을 가질 수 있다. 유리하게, 이러한 타원형 또는 관형 미소구획의 최소 치수는 10 ㎛ 내지 1 mm, 보다 바람직하게 50 ㎛ 내지 500 ㎛, 보다 더 바람직하게 500 ㎛ 미만, 바람직하게 400 ㎛ 미만에 포함된다. "최소 치수"는 미소구획의 중심 및 히드로겔 층의 외부 표면 상에 위치된 점 사이의 최소 거리의 2배를 의미한다.
특정 구현예에서, 외부 히드로겔 층의 두께는 미소구획의 반경의 5% 내지 40%에 상당한다. 세포외 매트릭스 층의 두께는 미소구획의 반경의 5% 내지 80%에 상당하고, 유리하게 히드로겔 쉘의 내부면 상에 현수된다. 이러한 매트릭스 층은 세포와 히드로겔 쉘 사이 공간을 충전시킬 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 층의 "두께"는 미소구획의 중심으로부터 방사상으로 확장된 상기 층의 치수이다.
본 발명의 일 구현예에서, 생물반응기는 세포가 낭포 (cyst)로 자가-조직화되는 미소구획을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 낭포는 중심 내강 주변에서 조직화된 만능성 또는 전능성 세포의 적어도 하나의 층으로서 정의된다. 본 발명에 따라서, 이러한 미소구획은 연속적으로, 중심 내강 주변에, 상기 만능성 세포의 층, 세포외 매트릭스의 층, 또는 세포외 매트릭스 대체물의 층, 및 외부 히드로겔 층을 포함한다. 내강은 낭포 형성 순간에, 세포외 매트릭스 층 상에 층으로 증식 및 발생되는 세포에 의해 생성된다. 유리하게, 내강은 액체, 및 보다 특히 배양 배지를 함유한다.
본 발명에 따라서, 낭포는 유리하게 포유동물, 인간 또는 비인간의 만능성 줄기 세포의 하나 이상의 층을 함유한다. 만능성 줄기 세포, 또는 만능성 세포는 그와 같은 전체 유기체를 형성할 수는 없는, 기원의 전체 유기체에 존재하는 모든 조직을 형성하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 특히, 낭포는 배아 줄기 세포 (ESC), 유도 만능성 줄기 (IPS) 세포, 또는 성체 포유동물 피부 및 골수에 존재하는 다계통-분화 스트레스 지속성 (multilineage-differentiating stress stress enduring) (MUSE) 세포를 함유할 수 있다.
유리하게, 외부 히드로겔 층의 두께는 미소구획의 반경의 5% 내지 40%에 상당하고, 세포외 매트릭스 층의 두께는 미소구획의 반경의 5% 내지 80%에 상당하고 만능성 세포층의 두께는 미소구획의 반경의 약 10%에 상당한다. 만능성 세포층은 세포외 매트릭스 층과 적어도 한 지점에서 접촉하고, 배양 배지로 충전된 공간은 매트릭스 층과 낭포 사이에 존재할 수 있다. 그러면 내강은 미소구획의 반경의 5% 내지 30%에 상당한다. 특정한 예에서, 세포 미소구획은 100 ㎛과 동등한 반경을 갖는 구형 형상을 갖는다. 히드로겔 층은 5 ㎛ 내지 40 ㎛의 두께를 갖는다. 세포외 매트릭스 층은 5 ㎛ 내지 약 80 ㎛의 두께를 갖는다. 만능성 세포층은 10 내지 30 ㎛의 두께를 갖고, 내강은 대략 5 내지 30 ㎛의 반경을 갖는다.
본 발명의 예시적인 구현예에 따라서, 하기 단계들에 따라서, 세포가 낭포를 형성하는, 이러한 미소구획을 예를 들어 150 mL의 생물반응기에서 배양하는 것이 가능하다:
(a) 600,000 내지 2백만개의 포유동물 만능성 줄기 세포를 RHO/ROCK 경로의 억제제를 함유하는 배양 배지에서 인큐베이션시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 유래된 이들 만능성 줄기 세포를 세포외 매트릭스와 혼합시키는 단계;
(c) 히드로겔 층으로 단계 (b)의 혼합물을 캡슐화시키는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 캡슐을 RHO/ROCK 경로의 억제제를 함유하는 배양 배지에서 배양시키는 단계;
(e) 단계 (d) 유래의 캡슐을 세정하여, RHO/ROCK 경로의 억제제를 제거하는 단계;
(f) RHO/ROCK 경로의 억제제가 없는 만능성 세포 배양 배지 예컨대 MTESR1 (Stemcell Technologies)으로 매일 2배까지 배지의 부피를 희석하여서, 3일 내지 20일, 바람직하게 5일 내지 10일 동안 단계 (e) 유래의 캡슐을 유가 유형 제조 방식으로 배양시키는 단계, 및 임의로 수득된 세포 미소구획을 회수하는 단계.
당업자는 필요에 따라서 생물반응기의 부피 및 세포의 수를 어떻게 적합화시키는지 알게 될 것이다.
RHO/ROCK ("Rho-associated protein kinase") 경로의 하나 이상의 억제제, 예컨대 티아조비빈 (C15H13N5OS) 및/또는 Y-27632 (C14H21N3O)를 함유하는 배지 중에서 단계 (a)의 인큐베이션 및 단계 (d)의 배양은 상기 세포외 매트릭스 주변에 외부 히드로겔 층의 형성 순간에 세포외 매트릭스에 세포의 부착 및 만능성 줄기 세포의 생존을 촉진시킨다. 그러나, 이들 단계는 시간 제한적이어서, RHO/ROCK 경로의 억제제가 낭포의 형성을 막지 않는 것이 바람직하다.
따라서, 바람직하게, 단계 (a)의 인큐베이션은 수 분 내지 수 시간, 바람직하게 2분 내지 2시간, 보다 바람직하게 10분 내지 1시간을 포함하는 시간 기간 동안 수행된다.
유사하게, 바람직하게는, 배양 단계 (d)는 2시간 내지 48시간을 포함하는 시간 기간 동안, 바람직하게 6시간 내지 24시간의 시간 기간 동안, 보다 바람직하게12시간 내지 18시간의 시간 기간 동안 수행된다.
단계 (e)는 RHO/ROCK 경로의 임의의 미량의 억제제의 제거를 보장하기 위해 필요하다. 단계 (e)는 예를 들어 RHO/ROCK 경로의 억제제가 없는 연속적인 배양 배지에서, 세정, 바람직하게는 수 회의 세정을 통해 수행된다.
유리하게, 단계 (f)는 세포의 매트릭스의 층 및 만능성 줄기 세포가 외부 히드로겔 층의 두께의 50% 내지 100%와 동등한 누적 두께를 갖는 세포 미소구획을 수득하기에 충분한 시간 동안 수행된다. 만능성 줄기 세포의 배양에 적합한 임의의 배양 배지가 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게 효소-무함유 시약을 통해서, 단계 (b) 이전에 단계 (a) 유래의 만능성 줄기 세포를 해리시키는 것으로 이루어지는 중간 단계 (a')를 포함한다. 유리하게, 상기 시약은 특히 만능성 세포에 특이적인 배지에서 연속 세정을 통해서, 캡슐화 단계 이전에 억제 또는 세정된다. 예를 들어, 사용되는 시약은 ReLeSR®이다. 물론, 트립신 또는 효소 함유 시약을 사용하는 것도 가능하지만, 이 단계 이후에 만능성 세포의 생존율이 효소-무함유 시약의 사용과 비교하여 더 낮을 수 있다.
대안적으로, 이러한 미소구획은 하기 단계에 따라 수득될 수 있다:
(A) 포유동물 분화된 세포를 세포외 매트릭스 및 세포 및 세포 리프로그래밍 (reprogramming) 제와 혼합시키는 단계;
(B) 히드로겔 층에 단계 (A)의 혼합물을 캡슐화시키는 단계;
(C) 단계 (B)로부터 유래된 캡슐을 적어도 3일 동안 배양시키고, 임의로 수득된 세포 미소구획을 회수하는 단계.
예를 들어, 사용된 분화된 세포는 섬유아세포, 말초 혈액 단핵 세포, 상피 세포 및 보다 일반적으로 인간 조직의 액상 또는 고형 생검으로부터 유래된 세포이다.
당업자는 특이적 인자들을 통해서 배아 단계와 연관된 유전자의 발현을 재활성화시킴으로써 분화된 세포를 줄기 세포로 리프로그래밍하는 방법을 알고 있다. 예로서, [Takahashi et al., 2006 ("Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors" Cell, 2006 Vol 126, pages 663-676)] 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO2010/105311 (발명의 명칭: "Production of reprogrammed pluripotent cells")에 기술된 방법을 언급할 수 있다.
리프로그래밍제는 유리하게는 생성물을 농축시키고 세포 세트와의 접촉을 촉진하기 위해서, 분화된 세포와 동시-캡슐화된다.
리프로그래밍제는 만능 단계까지 일련의 표현형 변화를 세포에 부여하는 것을 가능하게 만든다. 유리하게, 리프로그래밍 단계 (A)는 이들 표현형 변화를 촉진하는 특이적 배양 배지를 사용해 수행된다. 예를 들어, 세포는 세린/트레오닌 단백질 키나제 수용체 억제제 (예컨대 제품 SB-431542 (C22H16N4O3)), RHO/ROCK ("Rho-associated protein kinase") 경로의 하나 이상의 억제제, 예컨대 티아조비빈 및/또는 Y-27632, 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 FGF-2, 아스코르브산 및 항생제, 예컨대 트리코스타틴 A (C17H22N2O3)가 보충된 최소 필수 이글 (Eagle) 배지 (DMEM) 중에 10% 인간 또는 소 혈청을 포함하는 제1 배지에서 배양된다. 다음으로 배양 배지는 만능성 세포의 증식을 촉진하는 배지, 예컨대 배지 mTeSR®1로 교체된다.
이러한 낭포는 특히 관심 분자의 생산, 또는 관심 오가노이드의 생산을 위해, 하나 이상의 관심 세포 유형을 함유하는 미소구획을 수득하기 위해서, 관심 분화 경로로 강요될 수 있다.
일 구현예에서, 생물반응기는 오가노이드로 자가-조직화된 세포를 포함하는 미소구획을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 오가노이드는 장기의 적어도 일부분의 미세구조를 재생시키기 위해 3차원으로 조직화된 다세포 구조로서 정의된다. 본 발명에 따라서, 그러므로 이러한 미소구획은 세포외 매트릭스에 의해 둘러싸인, 3차원 다세포 구조를 포함하고, 그 전체는 외부 히드로겔 층에 캡슐화된다.
본 발명에 따라서, 오가노이드는 히드로겔 캡슐 내에서 이후에 분화되는 만능성 또는 전구체 세포를 캡슐화하거나, 또는 분화 또는 성숙 세포를 직접 캡슐화하여 수득될 수 있다.
일 구현예에서, 생물반응기에 도입되는 세포 미소구획은 만능성 세포를 함유한다. 다음으로 적어도 하나의 관심 세포 유형으로 세포 분화 단계가 생물반응기 내부에서 수행되고, 임의로 미소구획에서 상기 분화된 세포의 증식 단계가 수행된다.
일 구현예에서, 생물반응기에 도입되는 세포 미소구획은 이미 분화된 세포 또는 전구체를 함유한다. 다음으로 미소구획에서 상기 분화된 세포의 증식 및/또는 성숙화의 단계가 생물반응기 내부에서 수행된다.
유리하게, 생물반응기에 도입되는 미소구획은 미소구획의 내부 부피의 10% 점유율 미만, 바람직하게 1% 미만, 보다 더 바람직하게 0.1% 미만의 초기 세포 밀도를 갖는다.
유리하게, 생물반응기에서 배양 단계의 종료시에 회수된 미소구획은 미소구획의 내부 부피의 10% 점유율 초과의 세포 밀도를 갖는다.
본 발명에 따라서, 히드로겔 캡슐에 함유된 세포는 생물반응기에 함유되어 히드로겔 층을 통해 통과하는 배지의 흐름을 겪게 된다.
유리하게, 미소구획 내부의 확산 부피에 대한 미소구획 외부의 대류 부피의 비율은 1 내지 10,000, 바람직하게 1 내지 1000, 보다 바람직하게 1 내지 100에 포함된다.
본 발명에 따라서, 대류 부피는 미소구획 사이에, 반응기 챔버 내부의 배양배지의 부피를 의미한다. 미소구획이 생물반응기에 현탁되어서, 대류 부피는 미소구획 사이에서 순환하는 배지를 의미한다. 반대로, 확산 부피는 미소구획 내부, 즉 자가-조직화된 세포에 의해서/그 사이/그 주변에 생성된 공간(들)/공극(들)에서, 확산되는 배양 배지의 부피를 의미한다.
따라서, 낭포를 함유하는 미소구획의 경우에, 확산 부피는 주로 중심 내강 및, 낭포의 성장 시작 시에, 캡슐벽과 낭포 사이의 공간으로 구성된다. 오가노이드를 함유하는 미소구획의 경우에, 확산 부피는 주로 3차원 다세포 구조 내에 생성된 공간으로 이루어진다.
본 발명에 따른 미소구획은 유리하게는 세포가 없는, 하나 이상의 내강 또는 하나 이상의 공간의 히드로겔 캡슐 내의 존재 및 정확히 미소구획 내부에서 세포의 증식 또는 자가-조직화를 허용하는 것을 특징으로 한다. 당업자는 이러한 맥락에서 최적 공간의 특정 포화도에 상응하는 그들의 증폭 또는 분화 과정를 위해 가장 적절한 순간에 세포를 수확하는 방법을 알게 될 것이다.
일 구현예에서, 미소구획은 생물반응기 챔버의 부피의 0.01% 내지 74%를 점유한다.
세포 미소구획의 사용은 밀폐된 챔버가 장착된, 임의 유형의 생물반응기, 및 특히 회분, 유가 또는 연속 공급 (관류) 방식으로 생물반응기에서 세포를 배양하는 것을 가능하게 만든다. 이들 미소구획의 사용은 연속 공급 배양의 경우에 특히 유리하다. 실제로, 세포가 히드로겔 쉘에 의해 보호되면, 그들을 약화시킬 위험없이 연속 흐름을 가하는 것을 가능하게 한다.
일 구현예에서, 생물반응기는 기밀 밀봉될 수 있는 챔버를 포함한다. 이것은 생물반응기 내부 대기를 제어하는 것을 가능하게 만드는데, 예를 들어 불활성 대기 하에서 미소구획을 배양하는 것을 가능하게 만든다.
본 발명에 따른 세포 배양 시스템은 1 mL 내지 10,000 L, 바람직하게 5 mL 내지 10,000 L, 10 mL 내지 10,000 L, 100 mL 내지 10,000 L, 200 mL 내지 10,000 L, 500 mL 내지 10,000 L에 포함되는 부피를 갖는 챔버를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 챔버는 적어도 1 mL의 부피를 갖는다. 일 구현예에서, 챔버는 적어도 10 mL의 부피를 갖는다. 일 구현예에서, 챔버는 적어도 100 mL의 부피를 갖는다. 일 구현예에서, 챔버는 적어도 500 mL의 부피를 갖는다. 일 구현예에서, 챔버는 적어도 1 L의 부피를 갖는다. 일 구현예에서, 챔버는 적어도 10 L의 부피를 갖는다. 일 구현예에서, 챔버는 100 L 이상의 부피를 갖는다. 유리하게, 밀폐된 챔버를 포함하고 세포, 오가노이드, 분자 및/또는 복합 분자 집합체의 산업적 규모의 생산을 할 수 있는 임의의 생물반응기가 사용될 수 있다.
일반적으로, 밀폐된 챔버의 사용은 외부 환경에 의한 방해의 위험없이, 배양 환경의 미세한 제어를 가능하게 한다. 더 나아가서, 멸균 산물을 수득하는 것을 쉽게 한다. 또한 더 나은 재적 수확량을 가능하게 한다.
일 구현예에서, 미소구획은 수확 시 10 부피% 내지 98 부피%의 세포, 즉 생산된 세포의 총 개수 (말라세즈 (Malassez) 세포 또는 자동 세포 계측기로 당업자가 측정) 와 수득된 캡슐의 개수 (광학 현미경 하에서 수동 계측으로 또는 자동 영상 분석을 통해 캡슐의 부피를 특징규명하여 당업자가 측정)사이의 비율로 계산할 수 있는, 생산된 세포의 크기 및 고려되는 구획의 직경에 따라서, 100 내지 1,000,000의 세포를 포함한다. 물론, 시작 시에 더 적은 개수의 세포, 특히 1 내지 1,000 세포, 즉 생산되는 세포의 크기 및 고려되는 구획의 직경에 따라서 미소구획 내에 세포가 점유하는 0.01 부피% 내지 10 부피%를 포함하는 미소구획으로 세포 배양을 시작하는 것이 가능하다. 보다 일반적으로, 본 발명에 따른 미소구획은 0.01 부피% 내지 98 부피%의 세포를 포함한다.
다음으로 세포는 미소구획 내부에서 증식되고, 특히 오가노이드로 자가-조직화될 수 있다.
일 구현예에서, 미소구획의 세포는 모두 동일한 세포 유형이다. 본 발명에 따라서, 동일한 미소구획의 세포는 이러한 세포 유형을 특징규명하는 것을 가능하게 만드는 당업자의 지식에 따라서, 상기 미소구획의 세포 중 적어도 50%, 바람직하게 70%, 보다 바람직하게 90%, 보다 더 바람직하게 98% 이상이 동일한 표현형을 가지면 모두 동일한 세포 유형으로 간주된다. 다른 구현예에서, 미소구획의 세포는 적어도 2종의 상이한 세포 유형이다. 유리하게, 구획의 세포 중 20% 내지 100%가 동일한 표현형을 갖는다.
본 발명에 따라서, 동일한 생물반응기 내에서 모두 동일한 세포 유형을 포함하거나, 또는 반대로 상이한 세포 유형을 갖는 미소구획을 배양하는 것이 가능하다. 예를 들어, 생물반응기는 각각의 특정한 세포 유형을 함유하는, 2가지 유형의 미소구획을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 배양 시스템은 관심 세포의 생산 및/또는 증폭에 특히 유리하다. 실제로, 세포외 매트릭스와 함께, 히드로겔 캡슐 내 세포의 조직화는 각 계대 간에 2배 내지 100,000배 까지 그들 증식을 가능하게 한다.
계대는 증폭을 계속하기 위해서 또는 분화를 개시하기 위해서 또는 오가노이드로 자가-조직화하기 위해서 공간 또는 배양 표면을 첨가하기 위한 세포의 조작을 의미한다. 이러한 작업은 미립담체의 예에서, 새로운 미립담체를 생물반응기에 재적재하는 것이 필수적일 수 있다. 부착성, 만능성 줄기 세포의 표준 2-차원 배양을 위해서, 이러한 작업은 표면적이 더 큰 새로운 배양 배지를 재접종하기 위해서 구 배양 배지로부터 세포를 탈착시키는 단계로 이루어지고; 당업자는, 이러한 작업으로 세포의 50%의 손실을 야기시킬 수 있다. 본 발명에 따른 미소구획에서 배양을 위해서, 이것은 새로운 미소구획에 다시 캡슐화시키기에 충분히 작게 미소구획의 해리, 자가-조직화된 세포 세트의 해리 또는 세포 세트로 그들의 분산에 상응한다.
본 발명은 특히 이의 목적으로서 만능성 세포의 대량 생산을 위한 이러한 생물반응기 세포 배양 시스템의 용도를 갖는다.
본 발명은 또한 이의 목적으로서 만능성 세포로부터 단분화능 또는 다능성 전구체의 생산을 위한 이러한 생물반응기 세포 배양 시스템의 용도를 갖는다.
본 발명은 또한 이의 목적으로서 만능성 세포 및/또는 단분화능 또는 다능성 전구체 및/또는 이들 전구체의 조합으로부터 말단 분화된 세포 (즉, 하나 이상의 특이적 기능에 상응)의 생산을 위한 이러한 생물반응기 세포 배양 시스템의 용도를 갖는다.
본 발명은 특히 이의 목적으로서 하기에 따른 단계를 포함하는 관심 세포 또는 오가노이드의 제조를 위한 방법을 갖는다:
- 다수의 세포 미소구획을 밀폐된 챔버를 포함하는 생물반응기에 도입시키는 단계로서, 상기 미소구획은 각각이 세포 및 세포외 매트릭스 또는 세포외 매트릭스 대체물을 캡슐화하는 외부 히드로겔 층을 포함하는 것인 단계;
- 미소구획 내에서 세포의 증식, 및/또는 오가노이드로 세포의 자가-조직화를 가능하게 하는 조건 하에서 미소구획을 배양시키는 단계;
- 세포 미소구획을 회수하는 단계;
- 및 임의로, 히드로겔 층을 가수분해하여 관심 세포 또는 오가노이드를 회수하는 단계.
당업자는 그들의 증식 및/또는 자가-조직화를 촉진시키기 위해서, 미소구획의 세포 유형에 배양 조건을 적합화시킬 수 있다.
일 구현예에서, 도입되는 세포 미소구획은 만능성 세포를 함유하고, 상기 방법은 생물반응기 내부에서, 적어도 하나의 관심 세포 유형으로 세포 분화 단계 및 미소구획에서 상기 분화된 세포의 증식 단계를 포함한다. 예를 들어, 인간 내배엽 조직에서 분화의 연구를 위한 원시 내배엽 오가노이드의 생성은 하기 프로토콜에 따라 수행될 수 있다:
- 단계 f)로부터 배양 2-3일에, 상기 기술된, 미소구획의 수득:
- 3일 내지 6일 동안 STEMCELL Technologies가 판매하는 STEMdiff™ Pancreatic Progenitor 키트의 STEMdiff™ Pancreatic stage 1 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 발생 연구를 위해 수득된 원시 내배엽의 사용.
다른 구현예에서, 도입되는 세포 미소구획은 이미 분화된 세포 또는 전구체를 함유하고, 상기 단계는 생물 반응기 내부에서, 미소구획에서 상기 분화된 세포의 증식 단계를 포함한다.
증식 및/또는 성숙화 단계 동안, 세포는 유리하게 상기 세포 유형에 특이적인 조직화에 따라서, 특이적 오가노이드로 자가-조직화될 것이다.
증폭과 관련된 일 구현예에서, 생물반응기에 도입된 미소구획은 미소구획의 내부 부피의 10% 점유율 미만, 바람직하게 1%, 보다 더 바람직하게 0.1%의 세포 밀도를 갖는다. 그러고 나서 세포는 배양 단계 동안, 미소구획 내부에서 증식될 것이다.
증폭없이 분화 및/또는 성숙화화 관련된 일 구현예에서, 생물반응기에 도입되는 미소구획은 미소구획의 내부 부피의 1% 점유율보다 더 높은 세포 밀도를 갖는다. 그러고 나면 세포는 배양 단계 동안, 미소구획 내부에서 분화 및/또는 성숙화 및/또는 자가-조직화될 것이다. 예를 들어, 파킨슨병에 대한 세포 요법의 경우에 신경원 이식을 위한 신경 오가노이드의 제1 유형의 생성은 하기 프로토콜에 따라서 수행되었다:
- Cellular Dynamics International (iCell® DopaNeurons)가 판매하는 것과 같은 5백만개의 도파민작용성 전구체를 해동.
- [Alessandri et al. 2016]에 기술된 프로토콜에 따라 분화전 신경 전구체의 캡슐화.
- Cellular Dynamics가 제공하는 배양 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 생물반응기 내에서 2주 동안 도파민작용성 신경 오가노이드를 성숙화 및 구조화.
- 1 mL의 ReLeSR® (Stemcell Technologies) 중에 2회 30-초 세정을 통한 히드로겔 캡슐의 해리 후 신경원 배양 배지 중 11 질량%의 70 kDa 덱스트란 용액에 재현탁하고, 우리가 제조한 유리 캐뉼라에 분배하여 이식편 제조.
- 파킨슨병의 동물 모델에 이식.
증폭 및 분화/성숙화를 조합한 일 구현예에서, 생물반응기에 도입되는 미소구획은 유리하게 미소구획의 내부 부피의 10% 점유율 미만, 바람직하게 1%, 보다 더 바람직하게 0.1%의 세포 밀도를 갖는다. 그러고 나서, 세포는 배양 단계 동안 그 후에 분화 단계 동안 미소구획 내부에서 증식될 것이다. 다음으로 세포는 물리적 기폭제 (온도, 조명) 또는 영양 배지의 성질의 변화를 통해 촉발될 수 있는 제2 배양 단계 동안, 미소구획 내부 에서 자가-조직화될 것이다. 예를 들어, 파킨슨 병에 대한 세포 요법의 경우에 신경원 이식을 위한 제2 유형의 신경 오가노이드 생산은 하기 프로토콜에 따라 수행되었다:
- 단계 f)로부터 배양의 2-3일에 상기 기술된 미소구획을 수득:
- 1일 내지 2일 동안 N2 및 B27이 보충된 신경기저/DMEM-F12 베이스 상에 BMP2 (2 μm 돌소모르핀 또는 0.5 μm LDN 193189) 및 TGF베타 (10 μm +SB 431542) 신호전달 경로의 억제제, 10 μm 24(S),25-에폭시콜레스테롤을 함유하는 신경 유도 배지 중에서 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 6일 동안 N2 및 B27이 보충된 신경기저/DMEM-F12 베이스 상에 BMP2 (2 μm 돌소모르핀 또는 0.5 μm LDN 193189) 및 TGF베타 (10 μm +SB 431542) 신호전달 경로의 억제제, SHH 경로의 2종 활성제 (200 ng/mL SHH; 1 μm 푸르모르파민) 및 FGF8 (100 ng/mL), WNT 경로의 억제제 (3 μm Chir99021), 10 μm 24(S),25-에폭시콜레스테롤을 함유하는 신경 지역화 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 1일 동안 N2 및 B27이 보충된 신경기저/DMEM-F12 베이스 상에 BMP2 신호전달 경로의 억제제 (2 μm 돌소모르핀 또는 0.5 μm LDN 193189), WNT 경로의 억제제 (3 μm Chir99021), 10 μM 24(S),25-에폭시콜레스테롤을 함유하는 제2의 신경 지역화 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 사이클릭 AMP (500 μM) + 아스코르브산 (200 μM) + GDNF (20 ng/mL) + BDNF (20 ng/mL) + FGF-20 (5 ng/mL) + TGF베타 (1 ng/mL) + 트리코스타틴 (10 nM) + 화합물 E (1 μM)를 함유하는 생물반응기에서 2주 동안 도파민작용성 신경 오가노이드의 성숙화 및 구조화를 위한 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 1 mL의 ReLeSR® (Stemcell Technologies) 중에 2회 30초 세정을 통해 히드로겔의 해리 후, 신경원 배양 배지 중 11 질량%의 70 kDa 덱스트란의 용액에 재현탁하고, 우리가 제조한 유리 캐뉼라에 분배하여 이식편 제조.
- 파킨슨병의 동물 모델에서 이식.
증폭 및 분화/성숙화를 조합하는 다른 구현예에서, 생물반응기에 도입되는 미소구획은 유리하게 미소구획의 내부 부피의 10% 점유율 미만, 바람직하게 1%, 보다 더 바람직하게 0.1%의 세포 밀도를 갖는다. 그러고 나서 세포는 미소구획 내부에서 증식될 것이다. 그 다음으로 세포는 캡슐의 용해에 의해 회수되고 나서, 제2 캡슐화 단계에 이어서 분화 단계가 수행되고 나면, 세포는 물리적 기폭제 (온도, 조명) 또는 영양 배지의 성질 변화에 의해 촉발될 수 있는 제2 배양 단계 동안, 미소구획 내부에서 자가-조직화될 것이다. 예를 들어, 인간 췌장 조직 이식을 위한 인간 췌장 오가노이드의 생산은 하기 프로토콜에 따라 수행되었다:
- 단계 f)로부터 배양의 2-3일에 상기 기술된 미소구획을 수득:
- 1일 동안 STEMCELL Technologies가 판매하는 STEMdiff™ Pancreatic Progenitor 키트의 보충물 1A 및 보충물 1B가 보충된 STEMdiff™ Pancreatic stage 1 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 1일 동안 STEMCELL Technologies가 판매하는 STEMdiff™ Pancreatic Progenitor 키트의 보충물 1B가 보충된 STEMdiff™ Pancreatic stage 1 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 1일 동안 STEMCELL Technologies가 판매하는 STEMdiff™ Pancreatic Progenitor 키트의 보충물 2A 및 보충물 2B가 보충된 STEMdiff™ Pancreatic stage 2-4 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 2일 동안 STEMCELL Technologies가 판매하는 STEMdiff™ Pancreatic Progenitor 키트의 보충물 2A 및 보충물 2B가 보충된 STEMdiff™ Pancreatic stage 2-4 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 3일 동안 STEMCELL Technologies가 판매하는 STEMdiff™ Pancreatic Progenitor 키트의 보충물 3이 보충된 STEMdiff™ Pancreatic stage 2-4 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 5일 동안 STEMCELL Technologies가 판매하는 STEMdiff™ Pancreatic Progenitor 키트의 보충물 3이 보충된 STEMdiff™ Pancreatic stage 2-4 배지 중에 150 mL의 밀폐된 생물반응기에서 배양.
- 1 mL의 ReLeSR® (Stemcell Technologies) 중에 2회 30초 세정 후, 이전 배지 중 11 질량%의 70 kDa 덱스트란의 용액에 재현탁시키고, 우리가 제조한 유리 캐뉼라에 분배시켜 이식편 제조.
- 1형 당뇨병의 동물에 이식.
유리하게, 생물반응기에서 배양 단계의 종료시에 회수된 미소구획은 미소구획의 내부 부피의 10% 점유율 초과, 바람직하게 50% 초과의 세포 밀도를 가지며, 오가노이드의 경우에 최대 90% 점유율까지 갈 수 있다.
본 발명에 따른 배양 시스템은 또한 특히 관심 분자 및/또는 복합 분자 집합체의 생산에 매력적이며, 상기 분자 또는 복합 분자 집합체는 미소구획의 세포에 의해 상기 미소구획의 밖으로 배양 배지에 배출되거나, 또는 반대로 후속 수확을 위해 미소구획 내부에 축적된다. 이러한 제조 방법은 특히 미소구획 내부에 그들을 농축시킴으로써 세포 구성요소의 여과 단계를 제한하는 것을 가능하게 만든다. 이러한 방법은 캡슐에 의한 대류 및 확산 부피의 생물반응기에서 분리를 통해서, 캡슐의 히드로겔의 메쉬 크기보다 크거나 (전형적으로 알기네이트의 경우 150 내지 250 kDa) 또는 불용성인 구성요소로부터 용해된 구성요소를 함유하는 배지의 보다 쉬운 분리를 가능하게 한다.
본 발명에 따라서, 미소구획은 연속 공급 방식으로 반응기에서 유리하게 사용된다. 상기에 설명된 바와 같이, 보호성 히드로겔 쉘의 존재는 세포 손상의 위험 없이 유속에서 배양 배지를 관류시키는 것을 가능하게 만든다. 특히, 1일 당 생물반응기에 함유되는 0.001 내지 100부피의 세포에 포함되는 유속에서 배양 배지로 반응기 내부를 관류시키는 것을 가능하게 한다.
Claims (16)
- 다수의 현탁된 세포 미소구획을 함유하는 밀폐된 챔버를 포함하는 생물반응기 세포 배양 시스템으로서, 미소구획은 각각이 자가-조직화된 세포의 세트 및 세포외 매트릭스 또는 세포외 매트릭스 대체물을 함유하는 공동을 제공하는 외부 히드로겔 층을 포함하는 것인 생물반응기 세포 배양 시스템.
- 제1항에 있어서, 미소구획 내부의 확산 부피에 대한 미소구획 외부의 대류 부피의 비율은 1 내지 10000에 포함되는 것인 생물반응기 세포 배양 시스템.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 미소구획의 전부 또는 일부는 낭포로 자가-조직화된 세포를 포함하는 것인 생물반응기 세포 배양 시스템.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미소구획의 전부 또는 일부는 오가노이드로 자가-조직화된 세포를 포함하는 것인 생물반응기 세포 배양 시스템.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기는 회분 방식 생물반응기, 유가 (fed-batch) 방식 생물반응기 및 연속 방식 생물반응기로부터, 바람직하게는 연속 (관류) 방식 생물반응기로부터 선택되는 것인 생물반응기 세포 배양 시스템.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 챔버는 1 mL 내지 10,000 L에 포함되는 부피를 갖는 것인 생물반응기 세포 배양 시스템.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 미소구획은 0.01 부피% 내지 98 부피%의 세포를 포함하는 것인 생물반응기 세포 배양 시스템.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 미소구획의 세포는 모두 동일한 세포 유형이거나, 또는 반대로 적어도 2종의 상이한 세포 유형인 생물반응기 세포 배양 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 미소구획은 모두가 동일한 세포 유형을 포함하거나, 또는 반대로 적어도 부분적으로 상이한 세포 유형을 갖는 것인 생물반응기 세포 배양 시스템.
- 바람직하게 각 계대 간에 2배 내지 100,000배까지, 관심 세포의 생산 및/또는 증폭을 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 생물반응기 세포 배양 시스템의 용도.
- 관심 분자 또는 복합 분자 집합체의 생산을 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 생물반응기 세포 배양 시스템의 용도로서, 상기 분자 또는 집합체는 미소구획의 세포에 의해서 상기 미소구획 밖으로 배양 배지에 배출되거나, 반대로 후속 수확을 위해 미소구획 내부에 축적되는 것인 용도.
- 하기에 따른 단계를 포함하는, 관심 세포 또는 오가노이드의 제조 방법:
- 다수의 세포 미소구획을 생물반응기에 도입시키는 단계로서, 상기 미소구획은 각각이 세포 및 세포외 매트릭스 또는 세포외 매트릭스 대체물을 캡슐화하는 외부 히드로겔 층을 포함하는 것인 단계;
- 미소구획 내 세포의 증식, 및/또는 오가노이드로 세포의 자가-조직화를 가능하게 하는 조건 하에서 미소구획을 배양시키는 단계;
- 세포 미소구획을 회수하는 단계;
- 및 임의로, 히드로겔 층을 가수분해하여 오가노이드 또는 세포를 회수하는 단계. - 제12항에 있어서, 도입되는 세포 미소구획은 만능성 세포를 함유하고, 상기 방법은 생물반응기 내부에서, 적어도 하나의 관심 세포 유형으로의 세포 분화 단계 및 임의로 미소구획에서 상기 분화된 세포의 증식 단계를 포함하는 것인 관심 세포 또는 오가노이드의 제조 방법.
- 제12항에 있어서, 도입되는 세포 미소구획은 이미 분화된 세포 또는 전구체를 함유하고, 상기 방법은 생물반응기 내부에서, 미소구획에서 상기 분화된 세포의 증식 및/또는 성숙화 단계를 포함하는 것인 관심 세포 또는 오가노이드의 제조 방법.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기에 도입되는 미소구획은 미소구획의 내부 부피의 10% 점유율 미만, 바람직하게 1% 미만, 보다 더 바람직하게 0.1% 미만의 초기 세포 밀도를 갖는 것인 관심 세포 또는 오가노이드의 제조 방법.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 생물반응기에서 배양 단계의 종료 시에 회수된 미소구획은 미소구획의 내부 부피의 10% 점유율 초과의 세포 밀도를 갖는 것인 관심 세포 또는 오가노이드의 제조 방법.
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