CN1962856A - 一种实现干细胞定向增殖分化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞组织工程领域，具体地说是一种实现干细胞定向增殖分化的方法，以海藻酸钠，聚赖氨酸为材料，制备APA微囊化小鼠胚胎干细胞；将微囊化小鼠胚胎干细胞定向植入生物体内不同解剖学部位，即可实现干细胞的定向增殖分化。本发明建立了一种操作简单，并可广泛应用于干细胞体内定位移植、回收及体内定向诱导分化研究的新技术。其通过体外制备APA微囊化小鼠ES细胞后再行腹腔内移植、回收，并进一步检测回收细胞的分化状态来实现的；该方法既结合了APA微胶囊免疫隔离的生物学特性及易于定向植入、回收的优势，同时又能够详实考察体内微环境(或组织环境)对干细胞增殖及分化的影响。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞组织工程领域，具体地说是一项利用体内组织微环境实现干细胞定向增殖分化的新技术。
背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)是一类源于囊胚时期内细胞团的特定细胞群，兼具有自我更新及全向分化的潜能。1981年，小鼠ES细胞的成功分离建系揭开了干细胞研究的序幕[文献1.Evans MJ，Kaufman MH.Establishment inculture of pluripotential cells from mouse embryos.Nature，1981；292(5819)：154-156.]。继之，ES细胞定向诱导分化成为国内外共同关注的热点。目前有关ES细胞诱导分化的研究日趋深入：横向扩展至向神经元、心肌细胞、内皮细胞、造血细胞、肝前体细胞以及胰岛素分泌细胞等多种细胞的诱导分化，纵向已深入至基因调控、信号转导等方面的机制探讨[文献2.Kahan BW，Jacobson LM，Hullett DA，Ochoada JM，Oberley TD，Lang KM，Odorico JS.Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonicstem cells：An in vitro model to study islet differentiation.Diabetes，2003；52(8)：2016-2024.]。尽管如此，若要将ES细胞真正应用于临床细胞治疗，尚存在诸多问题。其中，如何标准化ES细胞定向诱导分化操作规则；如何提高定向分化率以及如何实现ES源目的细胞的分离纯化等---这些问题一直是制约干细胞相关研究的重要“瓶颈”之一。
归纳近年来发表的有关ES细胞定向诱导分化报道，其中所采用的实验手段很有限。包括：(1)添加化学性诱导剂，促进ES细胞向某一胚层细胞的定向分化。例如：一定浓度的二甲基亚砜可以促进小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞；(2)添加生物细胞因子。例如：培养基内添加细胞转化生长因子TGF-β能促进ES细胞向成骨细胞(或骨细胞)方向分化；(3)生物细胞因子和化学性诱导剂阶段性结合应用。例如：诱导ES细胞分化为胰岛素分泌细胞时，需要将细胞因子bFGF及fibronectin与尼克酰胺、亚硒酸钠、葡萄糖等试剂进行阶段性添加。但是，较低的定向诱导分化率和昂贵的细胞因子费用—这两个方面成为上述方法的主要缺陷。因此国内外学者仍在努力探索实现ES细胞定向诱导分化其它理想途径。2004年3月，《cell》曾发表文章：强调在干细胞的增殖与分化的动态调节过程中，所有外源性和内源性的影响因素共同构建了干细胞所处的微环境[文献3.Fuchs E，Tumbar T，Guasch G.Socializing with the neighbors：stem cells and their niche.Cell，2004，116：769-778]。微环境因素间复杂的相互作用在决定干细胞的命运方面起着重要作用[文献4.Spradling A，Drummond-Barbosa D，Kai T.Stem cells find their niche.Nature，2001，414：98-104；文献5.Levenberg S，Huang NF，Lavik E，Rogers AB，Itskovitz-Eldor J，Langer R.Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds.Proc Natl AcadSci USA，2002，100(22)：12741-12746]。新近研究发现，骨髓基质干细胞(MSC)输注入胎羊体内后，能够在体内多种组织内归巢并向所在组织的终末细胞类型分化，表明组织环境影响了干细胞的分化状态。但有关体内微环境与干细胞分化的报道多集中于成体干细胞，而相关ES细胞的研究尚未见报道，分析可能主要是由于成体干细胞的体内植入毋需受到免疫排斥的制约。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单的实现干细胞定向增殖分化的方法，该技术的建立是通过体外制备APA微囊化小鼠ES细胞后再行腹腔内移植、回收，并进一步检测回收细胞的分化状态来实现的；其既结合APA微胶囊的免疫隔离及易于定向植入、回收的优势，同时又能够考察体内微环境(或组织环境)对干细胞增殖及分化的影响的实验方法。而通过该实验方法所建立的APA微囊化干细胞模型可广泛应用于干细胞体内定位移植、回收及体内定向诱导分化的相关研究。
为实现上述目的，本发明以海藻酸钠，聚赖氨酸为材料，静电液滴法制备微囊化小鼠胚胎干细胞。然后，定向植入体内不同解剖学部位(腹腔，肾被膜下，蛛网膜下腔，骨髓腔，肝脏等)，定期回收体内微囊化ES细胞，考察体内微环境(或组织环境)对干细胞增殖及分化的影响。
一种实现干细胞定向增殖分化的方法，以海藻酸钠，聚赖氨酸为材料，制备APA微囊化小鼠胚胎干细胞；将微囊化小鼠胚胎干细胞定向植入生物体内不同解剖学部位，即可实现干细胞的定向增殖分化。
所述制备APA微囊化ES细胞的方法为静电液滴发生法，具体步骤如下，
①通过微胶囊制备仪，将均匀混合有ES细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下滴入钙溶液中，得到海藻酸钙凝胶珠；
②将海藻酸钙凝胶珠与聚赖氨酸溶液反应成膜，形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微囊膜，反应成-膜时间为8-15分钟，膜厚在5-50μm范围内；再与海藻酸钠溶液反应；最后用柠檬酸钠液化，于是便得到海藻酸钠/聚赖氨酸半透膜包封的内部为液态环境的APA微胶囊；
所述海藻酸钠的w/v浓度为1.5％-1.8％；钙溶液中钙离子浓度为0.05-0.3mol/L；聚赖氨酸重量浓度为0.05-0.1％，海藻酸钙胶珠与聚赖氨酸溶液的体积比为1∶10；柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L；在生理条件下制备APA微囊化小鼠胚胎干细胞，ES细胞存活率＞96％，调整ES细胞初始密度为100-150细胞/个微胶囊，微胶囊粒径可在400-600μm精确可控。
微胶囊粒径是通过控制微胶囊制备仪的操作条件(电压、频率、泵速以及针头孔径的大小)来调整的，其操作条件为：电压50-75V、频率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、针头孔径4#-7#，控制微囊直径大小在400-600μm之间，保证APA微胶囊的传质性能、机械强度，同时利于体内移植及回收操作；干细胞类型为多来源胚胎干细胞或各种成体干细胞；生物体为多种品系的成年鼠、猪或兔等实验动物；生物体内不同解剖学部位为腹腔，肾脏(肾被膜下)，蛛网膜下腔，骨髓(骨髓腔)，肝脏等；植入方式包括腹腔注射、手术包埋或血管介入等。
本发明具有如下优点：
1.操作方法简单。本发明利用APA(海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠)微胶囊内部的海藻酸钠凝胶是动物细胞的良好生长基质，具有良好生物相容性，不但能够维持干细胞的生物活性，而且可促进ES细胞在微囊内显著增殖；利用APA微胶囊所提供的特殊微环境，应用APA微囊化培养(包括液化型与非液化型)实现干细胞体内定向组织植入、扩增、并利于其定向分化；发挥APA微胶囊的免疫隔离及易于定向植入、回收的优势，能够考察体内微环境对ES细胞增殖分化的影响，建立一种应用于干细胞体内定位移植研究的新模型。
2.制备过程条件温和，对小鼠ES细胞活性没有影响。同时，APA微胶囊免疫隔离的生物学特性及易于定向植入、回收的优势，使ES细胞能够在异种或异体内植入并增殖。此外，APA微囊化ES细胞的体内定位植入还充分利用了组织环境中所特有的营养组分和生物因子，为考察体内微环境(或组织环境)与干细胞增殖及定向诱导分化之间的相互作用提供了一个理想的研究手段。在APA微囊化ES细胞的制备过程中，毋需去除饲养层细胞，在体内培养过程中并不影响干细胞走向分化。
3.本发明所提供的实验方法为基础发育生物学以及下游的临床细胞治疗研究提供了非常有价值的技术手段。本发明以小鼠胚胎干细胞ES-D3为细胞模型，以海藻酸钠和聚赖氨酸为材料制备APA(alginate-poly-lysine-alginate，APA)微囊化ES细胞，并将其进行体内定位移植研究。由此既结合了APA微胶囊的免疫隔离及易于定向植入、回收的优势，同时又能够考察体内微环境对ES细胞增殖分化的影响，以建立一种应用于干细胞体内定位移植研究的新模型。由于具备上述优点，使得该实验方法在基础发育生物学以及下游的临床细胞治疗中都将发挥重要作用。
附图说明
图1为比较APA微囊内小鼠胚胎干细胞在体外、体内培养条件下的增殖情况图；A为体外培养的微囊化ES细胞(7天，100×，OLYMPUS)；B为体内回收的微囊化ES细胞(7天，100×，OLYMPUS)，APA微囊化ES细胞经过腹腔内植入并培养2-7天后，每个微囊内细胞可增殖至初始接种数量的数十至数百倍。比较微囊化ES细胞的体外培养，腹腔内能大大增加ES细胞的增殖速度。
图2为H&E染色显示体内培养7天后APA微囊化小鼠胚胎干细胞的生长形态图(H&E染色，200×，OLYMPUS)；收集上述微囊化ES细胞的样品，制备为石蜡切片，经H&E染色进行初步形态学观察，APA微囊内ES细胞增殖良好，但细胞分布较为分散，不同于体外培养条件下所形成的细胞团结构。
图3免疫组织化学技术检测体内回收样品内AP蛋白的表达情况图；对照体外培养的微囊化ES细胞(22天，A)，腹腔内培养7天，免疫组织化学检测体内回收的ES细胞中仅有少量细胞AP表达阳性(B，箭头示，200×，OLYMPUS)，对比同期体外培养的微囊化ES细胞，样品经体内植入一周后，所表达的AP蛋白水平迅速降低，仅有少量细胞表达阳性。
图4免疫荧光检测检测体内回收样品内SSEA-1蛋白的表达情况图；对照体外培养的微囊化ES细胞(14天，A)，微囊化ES细胞体内培养7天，免疫荧光检测显示仅有少量SSEA-1的表达。(绿色为SSEA-1蛋白，红色为PI复染细胞核)，对比同期体外培养的微囊化ES细胞，样品经体内植入一周后，所表达的SSEA-1蛋白水平迅速降低，仅有少量细胞表达阳性。
图5RT-PCR检测体内回收的微囊化ES细胞表达Oct-4mRNA，同时对比体外培养的微囊化ES细胞和平面培养的未分化ES细胞。β-actin为内参基因；对比同期体外培养的微囊化ES细胞，微囊化ES细胞经体内培养一周后，仅低水平表达甚至检测不到相关基因的表达---Oct-4。表明：APA微囊化小鼠ES细胞经腹腔植入后，体内组织微环境能够促进干细胞走向增殖分化。
具体实施方式
APA微胶囊的制备：ES-D3细胞以生长培养基在体外进行维持培养。经0.25％胰蛋白酶消化并收集后，调整细胞密度4×106cells/ml。利用静电液滴发生法，在生理条件下制备出APA微囊化小鼠ES细胞，具体制备条件为：5#国产注射器针头，电压70V，频率120Hz，泵速8.9ml/h，pH6.0-7.4，20-37℃，1个大气压，无震荡及剪切。操作过程为：将ES细胞与1.5％(W/V)海藻酸钠溶液混合后，将该细胞悬液经注射器泵滴入100mmol/L Cacl2溶液中钙化20min，得到海藻酸钙凝胶珠。将海藻酸钠凝胶珠与0.05％(W/V)的聚赖氨酸(PLL)反应成膜12min，形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微囊膜，再与0.15％(W/V)海藻酸钠溶液反应3min，最后用55mmol/L柠檬酸钠液化5min，于是便得到海藻酸钠/聚赖氨酸半透膜包封的内部为液态环境的APA微胶囊。
1.经0.25％胰蛋白酶消化并收集平面培养的ES-D3细胞，调整细胞密度1.0×106-5.0×106cells/ml。利用静电液滴发生法，在生理条件下制备出APA微囊化小鼠ES细胞，制备过程中海藻酸钠的配制浓度为1.5％-1.8％(w/v)，聚赖氨酸浓度为0.05％。
2.采用局部注射方式移植APA微囊化小鼠ES细胞至昆明种小白鼠腹腔，定期回收APA微囊化ES细胞。
经生理盐水洗涤后，采用腹腔注射的方式将微囊化ES细胞移植入昆明种小鼠腹腔12只。空白对照组为腹腔注射空微囊，以明确微囊化ES细胞移植是否对动物生理状态产生影响。
3.考察回收样品内ES细胞的增殖活性，并对照同期体外培养的微囊化ES细胞。
定期(每隔2天)断颈处死动物，通过腹腔冲洗回收微囊，相差显微镜下观察，拍照。激光共聚焦显微镜下定性检测细胞存活情况，并与微囊化ES细胞的体外培养结果相比较。
4.通过免疫组化和分子生物学技术检测回收样品，考察体内植入后细胞未分化表型的改变，并对照同期体外培养的微囊化ES细胞，明确体内微环境对ES细胞命运的调控。
收集上述微囊化ES细胞的样品，PBS溶液清洗2遍，4％甲醛室温下固定。经脱水，石蜡包埋，制备石蜡切片。经H&E染色进行初步形态学观察，明确ES细胞在APA微囊内增殖情况。
5.将上述制备的石蜡切片进行脱蜡处理，利用免疫组织化学和免疫荧光技术检测分别与抗小鼠单克隆抗体SSEA-1及AP孵育，检测其未分化标志蛋白的表达情况。结果表明：体外培养22天后，微囊内ES细胞仍能不同程度的表达SSEA-1，AP。
6.回收微囊化ES细胞样品，机械法破碎微囊并分离细胞，Trizol裂解也提取细胞样品总RNA，利用RT-PCR方法检测样品内未分化基因Oct-4的表达情况。
Claims (7)
1.一种实现干细胞定向增殖分化的方法，其特征在于：以海藻酸钠，聚赖氨酸为材料，制备APA微囊化小鼠胚胎干细胞；将微囊化小鼠胚胎干细胞定向植入生物体内不同解剖学部位，即可实现干细胞的定向增殖分化。
2.按照权利要求1所述实现干细胞定向增殖分化的方法，其特征在于：
所述制备APA微囊化ES细胞的方法为静电液滴发生法，具体步骤如下，
①通过微胶囊制备仪，将均匀混合有ES细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下滴入钙溶液中，得到海藻酸钙凝胶珠；
②将海藻酸钙凝胶珠与聚赖氨酸溶液反应成膜，形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微囊膜，反应成-膜时间为8-15分钟，膜厚在5-50μm范围内；再与海藻酸钠溶液反应；最后用柠檬酸钠液化，于是便得到海藻酸钠/聚赖氨酸半透膜包封的内部为液态环境的APA微胶囊；
所述海藻酸钠的w/v浓度为1.5％-1.8％；钙溶液中钙离子浓度为0.05-0.3mol/L；聚赖氨酸重量浓度为0.05-0.1％，海藻酸钙胶珠与聚赖氨酸溶液的体积比为1∶10；柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L；ES细胞存活率＞96％，ES细胞含量100-150cells/microcapsule，微胶囊粒径可在400-600μm精确可控。
3.按照权利要求1所述实现干细胞定向增殖分化的方法，其特征在于：微胶囊粒径是通过控制微胶囊制备仪的操作条件来调整的，其操作条件为：电压50-75V、频率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、针头孔径4#-7#。
4.按照权利要求1所述实现干细胞定向增殖分化的方法，其特征在于：所述干细胞为多来源胚胎干细胞或各种成体干细胞。
5.按照权利要求1所述实现干细胞定向增殖分化的方法，其特征在于：所述生物体为鼠、猪或兔。
6.按照权利要求1所述实现干细胞定向增殖分化的方法，其特征在于：所述生物体内不同解剖学部位为腹腔、肾脏、蛛网膜下腔、骨髓或肝脏。
7.按照权利要求1所述实现干细胞定向增殖分化的方法，其特征在于：所述植入方式包括腹腔注射、手术包埋或血管介入。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN102747029A (zh) * | 2012-07-30 | 2012-10-24 | 何伟 | 一种视网膜祖细胞培养方法及其培养基 |
| CN115927201A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-04-07 | 无锡市南京大学锡山应用生物技术研究所 | 治疗脊髓损伤的可移植细胞株的制备方法及其应用 |
-
2005
- 2005-11-11 CN CNA2005100476907A patent/CN1962856A/zh active Pending
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