CN113278579A - 细胞三维培养体系、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞三维培养体系、其制备方法及其应用。该培养体系包括培养支架，其分布有至少一个第一室和至少一个第二室，第一室与第二室之间具有至少一个通孔；容纳于第一室和第二室内的营养物，营养物可自由穿梭通孔；支持细胞，可容纳于第一室内；共培养细胞，可容纳于第二室内；维持物，用于维持共培养细胞的三维结构及其生长所需微环境。该细胞三维培养体系形成共培养体系，维持共培养细胞在体内所需的微环境及促进共培养细胞的迁移和发育，改善共培养细胞培养所需微环境，保证其发育及成熟，以便产生其所应在体内具有的生理功能。

Description

细胞三维培养体系、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及细胞三维培养技术领域，尤其涉及细胞三维培养体系、其制备方法及其应用。

背景技术

所谓细胞三维培养，是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物，并且最大程度地模拟体内生长环境，使得被培养的细胞保持在体内迁移、生长、发育以及其所应具有其他生物学功能。

普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行，但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。

常用的三维细胞培养体系为水凝胶支架培养体系。该体系以多种包被表面(Amino、Collagen(Type I or IV)、Elastin、ProNectin(RGD)、Laminin(YIGSR))的胶原水凝胶为细胞外基质支架在生物材料支架研究方面，与传统的纳米纤维支架和多孔支架相比，水凝胶支架交联网络中含有大量水分，可以很好地供给细胞养分，同时还可以交联生物活性因子调节细胞的生长和分化，因此水凝胶支架可以更好地模拟细胞生长所需的类组织样物理和空间结构，并且可塑性高、制作工艺相对简单、临床应用方便。

然而，为提高水凝胶三维细胞培养体系的广泛性，使得其更广泛地应用于生物医学领域，并且为其具备更加的生物相容性、温敏性、应力刚化性能等，需要研究人员不断做出努力。

发明内容

本发明人经过深入地研究和创造性的劳动，得到了一种细胞三维培养体系，并且发现，其三维培养体系结构致密，应力刚性佳，对于一些细胞的培育具有不可替换的优势。基于此，本申请能够至少一定程度解决上述技术问题之一。

第一方面，本发明公开了一种细胞三维培养体系，包括：

培养支架，其分布有至少一个第一室和至少一个第二室，所述第一室与所述第二室之间具有至少一个通孔；

容纳于所述第一室和所述第二室内的营养物，所述营养物可自由穿梭所述通孔；

支持细胞，可容纳于所述第一室内；

共培养细胞，可容纳于所述第二室内；

维持物，用于维持所述共培养细胞的三维结构及其生长所需微环境。

由此，通过在培养支架中形成第一室和第二室作为基础，并在二者之间形成通孔，便于设置在第一室内的支持细胞和设置在第二室内的共培养细胞能够产生一种共培养体系，一则将这两种细胞共培养能够共生互补，维持共培养细胞在体内所需的微环境，二者支持细胞还能够促进共培养细胞的迁移和发育；而维持物能够加强这种作用。

在本发明实施例中，所述培养支架包括室壁以及固定于室壁上的第一膜和第二膜；所述室壁围合形成一两端开口的培养空间；所述第一膜对所述培养空间的一端开口进行封闭，所述第二膜分隔在所述培养空间的中间部位；所述第一膜、所述第二膜以及围合的部分所述室壁形之间形成所述第一室，所述第一膜与另外部分所述室壁围合形成所述第二室；其中，所述第一膜开设有与所述支持细胞相称尺寸的第一通孔，所述第二膜开设有所述共培养细胞相称尺寸的第二通孔。

在本发明实施例中，所述第一通孔的孔径为4μm～40μm，第二通孔的孔径为40um～200μm。

在本发明实施例中，所述第一膜上的第一通孔的孔隙率不低于80％，所述第二膜上的第二通孔的孔隙率不低于75％。

在本发明实施例中，所述支持细胞包括骨髓间充质干细胞、内膜干细胞、内皮干细胞、自体脂肪干细胞中的至少一种；所述共培养细胞包括人卵泡、小鼠卵泡、羊卵泡和猪卵泡中至少一种。

在本发明实施例中，所述维持物包含DNA水凝胶，所述DNA水凝胶具有由单链DNA分子形成的DNA立体结构；所述DNA立体结构具有由第一单链分子聚合形成的Y型支架以及连接在所述Y型支架之间的由第二单链分子形成的连接肢组成的重复单元进行微观连接形成的结构；其中，所述第一单链分子包括如SEQ ID NO.1～3所示的单链DNA分子；所述第二单链分子包括如SEQ ID NO.4～5所示的单链DNA分子。通过这种DNA水凝胶形成的立体结构，为整个三维体系至少提供支持作用。在实际的应用中，由于细胞种类和所具有的生物学功能不同，此种实施例仅示例性地指出其中一种具体的DNA分子，以实现这种微观的DNA立体结构，但并不限于此。

在本发明实施例中，所述维持物还包括填充于所述DNA立体结构中的填充物，以进一步加强维持物的维持作用。

第二方面，本发明公开了第一方面涉及的细胞三维培养体系的制备方法，包括：获取所述培养支架；于所述第一室内种植所述支持细胞；形成所述维持物并将其包被所述共培养细胞，以形成包被物；将所述包被物种植于所述第一室内；其中，所述维持物包含DNA水凝胶和填充物。

由此，构建这种细胞三维培养体系的方法具有简便化，易于获得的特性。

在本发明实施例中，形成所述维持物及将其包被所述共培养细胞的步骤具体包括：获得三个如SEQ ID NO.1～3所示的单链DNA分子，并配置成第一悬浮液；获得两个如SEQID NO.4～5所示的单链DNA分子，并配置第二成悬浮液；将所述第一悬浮液经95℃、5min处理后自然冷却至室温；将所述共培养细胞悬浮于经热处理的所述第一悬浮液后与所述第二悬浮液混合，即可得到支持有所述共培养细胞的DNA水凝胶的胶体；将所述DNA水凝胶的胶体分散于所述填充物中以形成所述包被物。

第三方面，本发明公开了一种体外获得细胞的方法，所述方法用于维持所述细胞的增殖、形态和功能，该方法包括利用第一方面涉及的细胞三维培养体系进行培养以及从所述细胞三维培养体系中回收细胞的步骤。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明中涉及的细胞三维培养体系形成共培养体系，维持共培养细胞在体内所需的微环境及促进共培养细胞的迁移和发育，能够满足所述支持细胞对所述共培养细胞的支持作用，或者改善所述共培养细胞培养所需微环境，保证其发育及成熟，以便产生其所应在体内具有的生理功能。

附图说明

图1为本发明实施例提供的细胞三维培养体系的结构示意图。

图2为本发明实施例提供可选的培养支架的立体结构示意图。

图3为本发明实施例提供的共培养细胞包被物的结构示意图。

图4为本发明实施例提供的DNA水凝胶重复单元的微观结构示意图。

图5为本发明实施例提供的不同培养体系培养窦前卵泡的结果对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，本发明实施例提供一种细胞三维培养体系1，包括：培养支架10，其分布有至少一个第一室101和至少一个第二室102，第一室101与第二室102之间具有至少一个通孔103；容纳于第一室101和第二室102内的营养物104，营养物104可自由穿梭通孔103；可容纳于第一室101内的支持细胞11；可容纳于第二室102内的共培养细胞12；维持物13，用于维持共培养细胞12的三维结构及其生长所需微环境。

在本发明实施例中，以培养支架形成第一室和第二室作为基础，并在二者之间形成通孔，便于设置在第一室内的支持细胞和设置在第二室内的共培养细胞能够产生一种共培养体系，一则将这两种细胞共培养能够共生互补，维持共培养细胞在体内所需的微环境，二者支持细胞还能够促进共培养细胞的迁移和发育；而维持物能够加强这种作用。

培养支架

其中，培养支架10可以采用现有的常规的细胞迁移实验用的培养小室，也可以采用一种改进的培养小室，具体如图1所示，该培养小室包括室壁105以及固定于室壁105上的第一膜106和第二膜107。

具体地，室壁105围合形成一两端开口的培养空间1000；第一膜106对该培养空间1000的一端开口进行封闭；第二膜107分隔在该培养空间1000的中间部位，以此在第一膜106、第二膜107以及围合的部分室壁105之间形成第一室101，培养空间1000除此之外即为第二室102。

进一步优选的，第一膜106具有与支持细胞相称尺寸的通孔，第二膜107具有与共培养细胞相称尺寸的通孔。具体的，其中第一个“相称”是指不能促使第一室内支持细胞从第一膜的通孔中迁移出，但是能够促使所需的营养物通过；第二个“相称”是指不能促使支持细胞整体从第一室迁移至第二室内，和/或者不能促使共培养细胞整体从第二室迁移至第一室内；但是能够促使营养物质能够通过第二膜进入第二室内。

由此，对于第一膜106的通孔孔径为4μm～40μm，第二膜107的通孔孔径为40um～200μm。例如，第一膜的通孔孔径为4～10μm、10～20μm和20～40μm的，第二膜的通孔孔径为40～80μm、80～150μm和150～200μm，作为该培养小室的整体配置，可将上述第一膜的通孔孔径和第二膜的通孔孔径的实施例进行组合。

另外，对于这些通孔分布的均匀性，可以采用常规的方法进行量化测量，如：直接观察法，即通过显微镜，随机拍摄支架的图片，使用图片分析软件对图中孔径进行测量，再计算出孔径的大小及其分布范围。也可以使用气体吸附法，进行更加量化的测量。

在实际的应用中，由于细胞种类和大小不同，并不预先优选支架孔径的分布集中在某一较窄的特定范围内，但是，如果了解了某一种细胞所趋好的通孔大小，将针对该种细胞制备具有较为均一的孔径分布的膜。

例如，本发明实施例提供的支持细胞包括骨髓间充质干细胞、内膜干细胞、内皮干细胞、自体脂肪干细胞中的至少一种；共培养细胞包括人卵泡、小鼠卵泡、羊卵泡和猪卵泡中至少一种。

另外，需要对于第一膜106和第二膜107上的通孔的分布密度进行说明，如通过通孔的孔隙率进行说明，孔隙率为通孔截面面积占整个通孔的截面面积的百分比。其中，第一膜106的通孔孔隙率不低于80％，第二膜107的通孔孔间隙率不低于75％。

由于具体的培养过程一般是基于培养皿或者孔板108进行的，具体的该培养小室能够“正向”放置于培养皿或孔板中，所谓“正向”放置是指该培养小室的培养空间的未封闭的开口竖直朝上搁置在培养皿或孔板的小孔中。具体的，在该培养小室内可注入用于培养共培养细胞的培养基，在该培养小室与培育皿或孔板件之间注入的支持细胞培养用的培养基，或者在第一膜和第二膜之间注入支持细胞培养用的培养基。

更进一步优选的，如图2所示，为便于支持细胞生长所用培养基能够更加顺利进入第一室内，第一膜与第二膜之间的室壁可以为格栅式或者不进行设置，均通过第一膜进行封闭，如此，能够获得更大的培养基通过面积。

维持物

由于本发明实施例提供的支持细胞和/或共培养细胞并未直接在培养小室内生长，而是需要其赖以形成三维结构的维持物进行维持的，下方将对维持物13进行说明。

维持物13包含DNA水凝胶，DNA水凝胶具有由单链DNA分子形成的DNA立体结构。如图3、4，DNA立体结构具有由第一单链分子聚合形成的Y型支架130以及连接在所述Y型支架之间的由第二单链分子形成的连接肢131组成的重复单元进行微观连接形成的结构。

具体的，第一单链分子包括如SEQ ID NO.1～3所示的单链DNA分子；第一单链分子包括如SEQ ID NO.4～5所示的单链DNA分子聚合而成。

更进一步的，维持物还包括填充物，填充于所述DNA立体结构中。此处的填充物可以是海藻酸钠形成的胶体，或者胶原蛋白形成的胶体。其用于填充DNA立体结构的间隙，对于控制通过DNA立体结构间隙的分子大小进行控制，一定程度上也形成了凝结结合水的可能。

海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换，生成凝胶。利用这种性质，将海藻酸盐溶液滴入含有钙离子的水溶液中可产生海藻酸钙胶球，使用喷嘴，可制造出凝胶纤维；将含有钙离子的水溶液加入海藻酸盐溶液，可生成凝胶冻。

海藻酸钠与钙离子形成的凝胶具有热不可逆性，凝胶性能不受温度影响，可进行加热灭菌和微波炉等处理。海藻酸钠凝胶化的速度及凝胶形成的机械性能与钙盐的种类、钙离子络合剂和溶液的酸碱度有关，可通过调节以上三个要素，控制凝胶化的速度。

细胞三维培养体系的制备方法

本发明实施例将提供细胞三维培养体系的制备方法，具体包括以下步骤：

S1、获取培养支架；

S2、于第一室内种植支持细胞；

S3、形成维持物并将其包被共培养细胞，以形成包被物；

S4、将包被物种植于所述第二室内；

其中，维持物包含DNA水凝胶和填充物。

具体的，培养支架、第一室和第二室的结构均如上述实施例所述，支持细胞、共培养细胞以及维持物亦如上述实施例所述，维持物亦包含DNA水凝胶和填充物。

本发明实施例进一步提供一种体外获得细胞的方法，该方法用于维持所述细胞的增殖、形态和功能，该方法包括利用上述的细胞三维培养体系进行培养以及从细胞三维培养体系中回收细胞的步骤。

S1中，获取培养支架即包括制备上述培养支架的步骤。具体包括，首先形成室壁的形状，如可通过PVC等有机高分子材料注射成型或热熔成型，以或者通过玻璃或石英材质高温热熔成型。而第一膜和第二膜均可为聚酯纤维、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或其他有机高分子材料之一制成，例如第一膜可选自美国进口Kenker聚碳酸酯膜，其本身具体不同孔径，可选用10～12μm孔径；而第二膜可选用尼龙过滤膜Biosharp过滤膜，孔径大小为40μm、70μm和100μm。置于第一膜和第二膜的固定，可以采用热压，或者通过其他固定件进行固定；或者通过粘接(如通过无机胶水粘结)于室壁上。

S3中，形成所述包被物的步骤具体包括：

S31、获得三个如SEQ ID NO.1～3所示的单链DNA分子，并配置成第一悬浮液；

S32、获得两个如SEQ ID NO.4～5所示的单链DNA分子，并配置第二成悬浮液；

S33、将所述第一悬浮液经95℃5min处理后自然冷却至室温；

S34、将所述共培养细胞悬浮于经热处理的所述第一悬浮液，在将其与所述第二悬浮液混合，即可得到支持有所述共培养细胞的DNA水凝胶的胶体；

S35、将所述DNA水凝胶的胶体分散于所述填充物中以形成所述包被物。

其中，在S31获得的第一悬浮液和S32获得的第二悬浮液经过95℃处理，能够促使其中第一单链分子和第二单链分子分别快速通过自组装，达到预期所需的立体结构，如第一单链分子配对形成Y型支架，第二单链分子配对形成连接肢，再经过混合，能够形成最终所需的DNA水凝胶的立体结构。

下方将结合具体的培养实施例进行说明，以支持细胞为骨髓间充质干细胞，共培养细胞为窦前小鼠卵泡为例。

一、培养体系及培养过程

1、骨髓间充质干细胞(BMSCs)的提取和培养

(1)所需实验耗材及器械提前高压灭菌，BMSCs培养液于水浴锅中37℃预热，超净工作台灭菌半小时等。

(2)提取：取8周左右C57BL/6J雌鼠(斯贝福(北京)生物技术有限公司)一只，处死后用酒精浸泡消毒，于超净工作台之上获取其胫骨与股骨，去除干骺端后用BMSCs培养液反复冲洗骨髓腔；收集冲洗下来的培养液并用滤网过滤，1000r/5min离心后弃去上清液，用BMSCs培养液重悬，吹打混匀，按4×105个/ml接种于细胞培养瓶中，于CO₂培养箱中培养。24h后首次更换培养液，之后每隔2-3天视情况更换培养液。

(3)培养：待BMSCs约融合90％时，用PBS漂洗细胞1-2次，加入胰酶，使其充分覆盖细胞表面，消化约3min，可观察到大部分细胞变圆，轻敲瓶底使细胞脱壁。当大部分细胞脱落悬浮于培养液时，加入3ml的BMSCs培养液终止消化，1000r/5min离心后小心弃去上清液，用1mlBMSCs培养液重悬，按1:2传代，接种于细胞培养瓶中，再添加4ml培养液，放入CO₂培养箱中培养。24h后首次更换培养液，之后每隔2-3天视情况更换培养液。

(4)鉴定方法：流式细胞术鉴定干细胞特异表面免疫分子、干细胞体外分化潜能诱导实验包括成骨诱导和成脂诱导。

2、1％海藻酸钠水溶液的配制

称取1g海藻酸钠粉末，用100ml PBS溶解后，用过滤器过滤后4℃保存，1月内用完。

3、50mM CaCl₂、140mM NaCl水溶液的配制

称取0.3675g CaCl₂·H₂O、0.4091gNaCl粉末，用50ml超纯水溶解后，用过滤器过滤后4℃保存，1月内用完。

4、DNA水凝胶成分序列

第一单链DNA：如SEQ ID NO.1～3所示；第二单链DNA：如SEQ ID NO.4～5所示；均按照上述序列进行人工合成，来源于上海生工。

5、窦前卵泡培养液配制

(1)窦前卵泡成长培养液(IVG，in vitro growth)：α-MEM+1％双抗+100mIU/ml r-FSH+1％ITS(100×)，用过滤器(0.22μm)过滤后4℃保存，1周内用完。其中，r-FSH表示重组卵泡刺激素，ITS表示胰岛素-转铁蛋白-硒形成的复合物，该培养液来自美国Gibco公司。

(2)窦前卵泡成熟培养液(IVM，in vitro maturation)：α-MEM+10％胎牛血清+2.5IU/ml hCG+10ng/ml EGF，现配现用。其中，hCG表示人绒毛膜促性腺激素，EGF表示表皮细胞生长因子，该培养液来自美国Gibco公司。

6、“BMSCs/藻酸盐/DNA水凝胶”体外3D培养人窦前卵泡体系

1)将状态良好的P3-P9代BMSCs细胞种植于如图1或图2中所示的培养小室的第一室101中，并进行薄膜计数板计数，种植密度为每孔约8万个细胞；

2)24小时后，在EP管内加入三条经过设计的第一单链DNA，再用PBS缓冲液配成终浓度为500μM，配置成第一悬浮液；

3)在另一EP管内加入另两条第二单链DNA，用PBS缓冲液配成终浓度为750μM，配置成第二悬浮液；

4)将第一悬浮液和第二悬浮液分别放入95℃水浴锅内处理5min，之后缓慢冷却2h至室温；

5)用口吸器将窦前卵泡悬于上述经热处理的第一悬浮液中，再将其与第二悬浮液等体积混合，即可得到支持有窦前卵泡的DNA水凝胶的胶体；

6)再于显微镜下用10μl移液器取5μl DNA水凝胶体系包裹的卵泡缓慢逐滴(每个液滴包裹一个窦前卵泡)到滴入悬于1％海藻酸钠溶液中；

7)同样的方法，在显微镜下用10μl移液器取DNA水凝胶体系包裹的卵泡与1％海藻酸钠溶液的混合液约10μl缓慢逐滴滴入(每个液滴一个窦前卵泡)到50mM CaCl₂、140mMNaCl溶液内，37℃、5％CO₂ 5min，吸尽CaCl₂溶液，用PBS漂洗3遍；即可得到包被窦前卵泡的包被物；

8)BMSCs提前种植于培养小室的第一室内；并及时更换1ml的IVG培养液。同样于显微镜下将上述包被物用无菌镊将球形胶体加入到种植有BMSCs的培养小室的第一室内，于CO₂培养箱中常规培养，隔天显微镜下观察；

9)培养结束时释放卵子方式：将培养基吸弃，用PBS洗两遍后，加入盐酸盐裂解酶作用5min，收集混合液，用PBS洗3遍，移弃上清液。

7、培养体系容量实验

采用上述“BMSCs/藻酸盐/DNA水凝胶”体外3D培养人窦前卵泡体系中大致相同的步骤作为实验组，实验组设置两组，培养的卵泡数量分别为5个和50个。

对照组：仅在于第7)步骤中使用的盐溶液不同，将其中使用的盐溶液替换为50mMCaSO₄、140mM KCl溶液，同样形成培养体系，培养的卵泡数量分别为5个和50个。

将实验组和对照组均于CO₂培养箱中常规培养，隔天显微镜下观察。

二、结果

1、窦前卵泡在BMSCs/藻酸盐/DNA水凝胶体系中的生长发育情况

图5中，“2D-BMSCs”作为对比例进行培养，表示窦前卵泡与BMSC如下方式进行培养：

取提前一天种好BMSCs的24孔板，每孔放入一个Transwell小室，每孔中及Transwell小室中均匀加入400μl的IVG培养基。挑选直径约120-140μm的窦前卵泡，每孔一个，于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，隔日更换半量培养液。取卵当日记为D0，培养第8天当日将IVG培养基更换为IVM培养液，18-20h后将培养的细胞转移至80IU/ml透明质酸酶中脱颗粒，获得卵母细胞，观察成熟率及做后续实验。

图5中，“BMSCs/胶原蛋白”、“BMSCs/藻酸盐”、“BMSCs/藻酸盐”、“BMSCs/藻酸盐/DNA水凝胶”及“BMSCs/胶原蛋白/DNA水凝胶”均为按照如图1所示的培养体系进行培养，BMSCs均于培养小室的第一室中培养；只不过每一组别的用于包裹卵泡的维持物不同而已。

结果如图5中第1行所示，窦前卵泡在2D-BMSCs(与干细胞共培养，具体说明是如何制备的，没有使用DNA水凝胶的)培养体系中贴壁生长，培养第4天可看到颗粒细胞逐渐分散、贴壁，培养第8天可看到大量的颗粒细胞分散贴壁生长。

如图5中第2行所示，窦前卵泡在BMSCs/胶原蛋白体系中呈球状，颗粒细胞层数较少，培养第8天酶解释放后，可见卵母细胞皱缩不够饱满；窦前卵泡在BMSCs/藻酸盐体系中，呈球状，颗粒细胞层数少，第8天酶解释放后卵母细胞形态尚可；

如图5中第3～6行所示，窦前卵泡在BMSCs/胶原蛋白/DNA水凝胶体系中，呈球状，颗粒细胞层数较单独胶原蛋白体系增加，培养第8天酶解释放后卵母细胞无皱缩现象；窦前卵泡在BMSCs/藻酸盐/DNA水凝胶体系中，呈球状，培养第4天、第8天和其他三组对照(BMSCs/胶原蛋白组、BMSCs/藻酸盐组、BMSCs/胶原蛋白/DNA水凝胶组、BMSCs/藻酸盐/DNA水凝胶组)相比，均可见颗粒细胞层数较多，发育良好，培养第8天用盐酸盐裂解酶释放细胞后，细胞无损。由此表明，BMSCs/藻酸盐/DNA水凝胶体系对于培养该窦前卵泡具有最佳效果。

表1

*P<0.05vs单独培养组；**P<0.01vs单独培养组；其中，成熟率＝MII数量/GV数量×100％

表1统计了不同体系培养窦前卵泡的成熟情况，结果表明，BMSCs/藻酸盐/DNA水凝胶3D培养体系培养窦前卵泡的成熟率显著高于其他组别，可有效地促进人GV期卵泡体外成熟。

2、培养体系容量实验

由表2可知，对照组有一定窦前卵泡发生脱落和死亡，可见对照组的培育体系对于卵泡的生长产生了不利影响。由此说明，对照组中使用的填充物中，盐溶液对于海藻酸钠凝胶形成产生了不利于其三维培养的因素。

表2

综上，本发明实施例采用DNA水凝胶以补充传统3D培养体系中水凝胶材料的不足，DNA在材料开发中获得重要作用，通过设计物理作用(如氢键或者范德华力)或化学作用(如DNA连接酶)使得DNA链形成复杂的超分子聚集体，物理方法形成凝胶不需要引入其他的酶等外界物质，更少影响体系的稳定性，这种凝胶更容易实现对温度等刺激的响应。DNA水凝胶具有较好的生物相容性并且能够通过设计使其对多种外界刺激响应，可以增大其应用范围，而且DNA水凝胶是由DNA组成的3D结构，可以按照需求设计其形状、尺寸和形式已适用于各种不同的条件。

目前DNA水凝胶主要应用于生物传感，可以用于核酸响应分子；药物输送和治疗，通过控制DNA水凝胶的形成和分解来达到对药物输送和释放的目的；在3D细胞培养中，水凝胶提供的悬浮状态更加接近体内的生长环境，有利于细胞的生长。相较于藻酸盐，DNA水凝胶具有良好的生物可降解性，良好的延展性和通透性，无需酶融，能维持卵泡成熟的全过程，更接近卵巢环境。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学

<120> 细胞三维培养体系、其制备方法及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctacacatgg aaggaggcsg ttatgagggg gtccatccta accat 45

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ctacacatgg aaggaggcsg ttatgaggcs ttcgacggtc atgtac 46

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ctacacatgg aaggaggcsg ttatgaggcs ctctgatcta gtagtta 47

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cctcataacg csctccttcc atgtgtagtc tattcgcsat gagaattc 48

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cctcataacg csctccttcc atgtgtagcs ttacggtgaa tggaatt 47

Claims (10)

1.一种细胞三维培养体系，包括：

培养支架，其分布有至少一个第一室和至少一个第二室，所述第一室与所述第二室之间具有至少一个通孔；

容纳于所述第一室和所述第二室内的营养物，所述营养物可自由穿梭所述通孔；

支持细胞，可容纳于所述第一室内；

共培养细胞，可容纳于所述第二室内；

维持物，用于维持所述共培养细胞的三维结构及其生长所需微环境。

2.根据权利要求1所述的细胞三维培养体系，其特征在于，所述培养支架包括室壁以及固定于室壁上的第一膜和第二膜；

所述室壁围合形成一两端开口的培养空间；所述第一膜对所述培养空间的一端开口进行封闭，所述第二膜分隔在所述培养空间的中间部位；

所述第一膜、所述第二膜以及围合的部分所述室壁形之间形成所述第一室，所述第一膜与另外部分所述室壁围合形成所述第二室；

其中，所述第一膜开设有与所述支持细胞相称尺寸的第一通孔，所述第二膜开设有所述共培养细胞相称尺寸的第二通孔。

3.根据权利要求2所述的细胞三维培养体系，其特征在于，所述第一通孔的孔径为4μm～40μm，第二通孔的孔径为40um～200μm。

4.根据权利要求2所述的细胞三维培养体系，其特征在于，所述第一膜上的第一通孔的孔隙率不低于80％，所述第二膜上的第二通孔的孔隙率不低于75％。

5.根据权利要求1所述的细胞三维培养体系，其特征在于，所述支持细胞包括骨髓间充质干细胞、内膜干细胞、内皮干细胞、自体脂肪干细胞中的至少一种；

所述共培养细胞包括人卵泡、小鼠卵泡、羊卵泡和猪卵泡中至少一种。

6.根据权利要求1-5任一项所述的细胞三维培养体系，其特征在于，所述维持物包含DNA水凝胶，所述DNA立体结构具有由第一单链分子聚合形成的Y型支架以及连接在所述Y型支架之间的由第二单链分子形成的连接肢组成的重复单元进行微观连接形成的结构；其中，所述第一单链分子包括如SEQ ID NO.1～3所示的单链DNA分子；所述第二单链分子包括如SEQ ID NO.4～5所示的单链DNA分子。

7.根据权利要求6所述的细胞三维培养体系，其特征在于，所述维持物还包括填充于所述DNA立体结构中的填充物。

8.权利要求1-7任一项所述的细胞三维培养体系的制备方法，其特征在于，包括：

获取所述培养支架；

于所述第一室内种植所述支持细胞；

形成所述维持物并将其包被所述共培养细胞，以形成包被物；

将所述包被物种植于所述第二室内；

其中，所述维持物包含DNA水凝胶和填充物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，形成所述包被物的步骤具体包括：

获得三个如SEQ ID NO.1～3所示的单链DNA分子，并配置成第一悬浮液；

获得两个如SEQ ID NO.4～5所示的单链DNA分子，并配置第二成悬浮液；

将所述第一悬浮液、所述第二悬浮液分别经95℃、5min处理后自然冷却至室温；

将所述共培养细胞悬浮于经热处理的所述第一悬浮液后与所述第二悬浮液混合，即可得到支持有所述共培养细胞的DNA水凝胶的胶体；

将所述DNA水凝胶的胶体分散于所述填充物中以形成所述包被物。

10.一种体外获得细胞的方法，所述方法用于维持所述细胞的增殖、形态和功能，其特特征在于；所述方法包括利用权利要求1-7任一项所述的细胞三维培养体系进行培养以及从所述细胞三维培养体系中回收细胞的步骤。

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