CN112424333A - 用于在生物反应器中进行细胞培养的系统 - Google Patents

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凯文·亚历山德里
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Abstract

本发明涉及用于在生物反应器中进行细胞培养的系统，所述系统包含含有多个细胞微区室的封闭仓室，其中所述微区室各自包含外部水凝胶层，所述外部水凝胶层提供了包容一组自组织细胞和细胞外基质或细胞外基质替代物的空腔。本发明还涉及这类生物反应器用于生产细胞和/或类器官和/或分子和/或复杂分子组装体的用途。

Description

用于在生物反应器中进行细胞培养的系统
本发明涉及用于在生物反应器中进行细胞培养的系统。根据本发明所述的系统可用于生产感兴趣的细胞、细胞组装体(类器官、组织)和/或生产感兴趣的分子或复杂分子组装体(细胞外基质的组分、细胞器、抗体、疫苗、外来体、类病毒)或源自于细胞或由在这类系统中生长的细胞产生的其他感兴趣的材料。
生物反应器细胞培养系统对尤其是制药工业的重要性日益增长。事实上，真核细胞被越来越多地用作治疗工具，特别是在细胞和组织疗法中，并被用作从蛋白质组分(胰岛素、抗体等)到源自于细胞的蛋白质、脂类和糖类的复合体或细胞器、细胞外囊泡和外来体、直到病毒衍生物(特别是用于生产疫苗)的感兴趣的分子的生物生产工具。生物反应器细胞培养系统能够对这些细胞进行大规模培养，从而满足了在工业规模上对感兴趣的细胞和/或分子的需求。
目前，存在三种主要类别的生物反应器细胞培养方法：
-允许分批培养的方法，其中将细胞接种在固定体积的培养基中。在足以允许充分生长的培养时间后，收获所述分子和/或细胞。这些方法的主要问题在于培养基中存在的营养物随时间耗尽，并且有毒代谢物积累；
-允许补料分批培养的方法，其中根据需要添加培养基以饲养所述细胞并在同时维持可接受的细胞密度。这些系统的主要问题在于代谢废物未被除去并积累在所述生物反应器中，最终影响产量；
-允许灌注培养的方法，其中连续更换培养基以饲养所述细胞并除去废物。此类系统允许较高的产量，但培养基的快速和连续更换需要保留细胞而不损伤它们(由流动产生的机械应力)。
在现有技术中，这些大规模生物生产方法很难适用或不适用于脆弱细胞或脆弱细胞组装体。事实上，在悬液中、在聚集体中或在微载体上，细胞和细胞组装体直接暴露于培养基中的机械应力(冲击、剪切应力、压力等)。当体积变大时，用于搅拌培养基或使培养基流通的机械力可以破坏细胞或细胞组装体，特别是通过由液体流动施加的剪切应力或伴随着搅拌培养基的移动元件的冲击力。
发明内容
通过研究在生物反应器中进行细胞培养的这些问题，本发明人发现，为了在生物反应器内培养大量细胞，可以产生由外部水凝胶层限定的微区室内的培养空间。由此使感兴趣的细胞生境被水凝胶壳包围，所述水凝胶壳有利地允许营养物渗入并允许蛋白质和代谢物漏出，但保留尺寸超过150kDa的元件(细胞外基质、外来体、病毒粒子、细胞)。此外，由于所述水凝胶壳保护细胞免受可能存在于反应器内的应力影响，因此通过所述生物反应器的流动可以强烈到所述水凝胶壳可以支持的程度。此外，不同于现有的培养系统，所述细胞微区室的水凝胶壳保护细胞免受与碰撞相关的机械应力影响，并在液体悬浮培养期间防止存在的多细胞元件(聚集体、微载体)的融合，所述融合通过改变细胞所经历的局部条件(在培养基中的扩散距离、机械应力)而造成可重复性问题。所述微区室悬浮在所述生物反应器中，这允许培养基均匀地接近并扩散到所述微区室中，并允许良好的对流。此外，由于细胞生境受到所述水凝胶壳保护，因此有可能在最适生产条件下培养最脆弱的细胞类型，同时具有低细胞死亡率和良好控制的表型。与凝胶中包围的简单球状体不同，所述胶囊中的空腔为细胞增殖和/或在细胞外基质上自组装留下了空间。有利的是，每个微区室包含唯一的细胞生境。换句话说，给定的水凝胶壳包围单个细胞生境。由于所述微区室的外层由水凝胶制成，因此在生产结束时它可以被容易地溶解以回收所述细胞。由于这些微区室是3D的，因此它们有利地允许细胞在所述微区室中扩增高达100 000倍。
因此，本发明的目的在于一种生物反应器细胞培养系统，所述系统包含含有多个细胞微区室的封闭仓室，其中所述微区室各自包含外部水凝胶层，所述外部水凝胶层提供了包容一组自组织细胞和细胞外基质或细胞外基质替代物的空腔。
根据本发明，外部水凝胶层包围一组细胞。所述水凝胶层形成空心胶囊，提供了包容所述一组细胞的空腔。
在有利情况下，所述水凝胶胶囊包容唯一的一组细胞。
根据本发明，所述多个细胞微区室被悬浮在所述生物反应器仓室中。更具体来说，所述微区室漂浮在所述生物反应器仓室中包含的培养基中。
本发明的另一个目的在于这种包含封闭仓室的生物反应器细胞培养系统的用途，其用于生产和/或扩增感兴趣的细胞。在有利情况下，所述扩增为每次传代之间2至100,000倍。这种扩增倍数对应于在扩增结束时收获的活细胞数目除以接种的活细胞数目。
本发明的另一个目的在于这种生物反应器细胞培养系统的用途，其用于生产感兴趣的分子和/或复杂分子组装体例如细胞外基质的组分、细胞器、抗体、疫苗、外来体、类病毒等，所述分子和/或组装体由所述微区室的细胞分泌到所述微区室外进入培养基中或相反地积累在所述微区室内，用于后续的收获。
本发明的另一个目的在于一种生产感兴趣的类器官或细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
-在包含封闭仓室的生物反应器中引入多个细胞微区室，所述微区室各自包含外部水凝胶层，所述外部水凝胶层包封细胞和细胞外基质或细胞外基质替代物；
-将所述微区室在允许所述微区室内的细胞增殖和/或细胞自组装成类器官的条件下进行培养；
-回收所述细胞微区室；
-以及任选地，将所述水凝胶层水解以回收所述感兴趣的类器官或细胞。
本发明的另一个目的在于一种从专能、多能或全能细胞生产分化细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
-在生物反应器中引入多个细胞微区室，所述微区室各自包含外部水凝胶层，所述外部水凝胶层包封专能、多能或全能细胞和细胞外基质或细胞外基质替代物；
-将所述微区室在允许所述微区室内的细胞增殖和/或分化成一种或多种感兴趣的细胞类型的条件下进行培养；
-回收所述细胞微区室；
-以及任选地，将所述水凝胶层水解以回收所述感兴趣的细胞类型。
详细描述
本发明人发现，在包含封闭仓室的反应器内，通过将细胞保持在交联水凝胶的外部胶囊中来培养所述细胞是可能并且是特别有利的。更确切来说，本发明人开发了细胞微区室，其各自包含包封有一组自组织细胞和细胞外基质或细胞外基质替代物的外部水凝胶层。根据本发明，所述细胞微区室悬浮在所述生物反应器中。
根据本发明，自组织细胞意味着相对于彼此独特定位以产生细胞相互作用和通讯并形成感兴趣的三维微观结构的一组细胞。因此，每个微区室包含包容一组自组织细胞的外部水凝胶层或水凝胶胶囊。细胞可以在所述水凝胶胶囊内增殖、组织化和/或分化。
在一个实施方式中，所述水凝胶胶囊含有唯一的一组自组织细胞。唯一意味着所述胶囊仅含有一组细胞，其可以是或多或少内聚的。具体来说，唯一的一组细胞意味着其中所述组中的每个细胞与所述组中的至少一个其他细胞物理接触的三维细胞结构。
根据本发明，可以包封所有种类的真核细胞，更特别是哺乳动物细胞。具体来说，所述细胞选自分化细胞、祖细胞、干细胞、专能细胞、多能细胞、全能细胞、遗传修饰细胞及其混合物等。在一个实施方式中，被包封的细胞是多能干细胞，特别是选自胚胎干细胞和/或诱导多能细胞(IPS)。在一个实施方式中，被包封的细胞是胚胎干细胞，特别是多能胚胎干细胞。在一个实施方式中，被包封的细胞是胚胎干细胞，不包括需要破坏人类胚胎的人类胚胎干细胞。在另一个实施方式中，被包封的细胞是人类胚胎干细胞，其源自于在医疗辅助生育的情形中不再是父母亲计划的对象的多余的人类胚胎，并符合在获取所述胚胎干细胞的时间和国家中生效的生物伦理法律的规定。在另一个实施方式中，被包封的细胞是诱导多能细胞(IPS)，特别是人类诱导多能细胞(hIPS)。在另一个实施方式中，被包封的细胞是胚胎干细胞和诱导多能细胞。在一个实施方式中，被包封的细胞包含胚胎干细胞和诱导多能细胞的混合物。
在本发明的情形中，“外部水凝胶层”或“水凝胶壳”是指由被液体、优选为水溶胀的聚合物链的基质形成的三维结构。这种外部水凝胶层通过对水凝胶溶液进行交联来获得。在有利情况下，所述水凝胶溶液的聚合物是当经受刺激例如温度、pH、离子等时可交联的聚合物。在有利情况下，所使用的水凝胶溶液在对细胞无毒的意义上是生物相容的。在有利情况下，所述水凝胶层允许溶解的气体(特别是氧气和/或二氧化碳)、营养物和代谢废物扩散，以允许细胞的存活、增殖、分化、成熟和/或感兴趣的分子或分子组装体的生产和/或感兴趣的细胞行为的重演。所述水凝胶溶液的聚合物可以是天然或合成起源的。例如，所述水凝胶溶液含有基于磺酸的聚合物例如聚苯乙烯磺酸钠、基于丙烯酸的聚合物例如聚丙烯酸钠、聚二丙烯酸乙二醇酯、明胶甲基丙烯酸酯化合物、多糖特别是细菌起源的多糖例如结冷胶或植物起源的多糖例如果胶或藻酸盐中的一种或多种聚合物。在一个实施方式中，所述水凝胶溶液至少含有藻酸盐。优选地，所述水凝胶溶液只含有藻酸盐。在本发明的情形中，“藻酸盐”意味着由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)、它们的盐和衍生物形成的直链多糖。在有利情况下，所述藻酸盐是由超过80％G和少于20％M构成并具有100至400kDa的平均分子质量的藻酸钠(例如
Figure BDA0002792460040000061
SLG100)，并且以密度计的总浓度在0.5％至5％(重量/体积)之间。
根据本发明，所述细胞微区室是封闭的。正是所述外部水凝胶层为所述细胞微区室提供了尺寸和形状。所述微区室可以具有与细胞的包封相容的任何形状。
优选地，所述细胞外基质层形成凝胶。所述细胞外基质层包含细胞例如多能细胞的培养所需的蛋白质和细胞外化合物的混合物。优选地，所述细胞外基质包含结构蛋白例如层粘连蛋白521、511或421、巢蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白，以及生长因子例如TGF-β和/或EGF。在一个实施方式中，所述细胞外基质层由
Figure BDA0002792460040000062
和/或
Figure BDA0002792460040000065
构成或含有
Figure BDA0002792460040000063
和/或
Figure BDA0002792460040000064
根据本发明，所述微区室可以含有细胞外基质替代物来代替所述细胞外基质。细胞外基质替代物意味着能够通过与膜蛋白和/或细胞外信号转导途径相互作用而促进细胞附着和/或存活的化合物。例如，这种替代物包含生物聚合物及其片段，包括蛋白质(层粘连蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白)、未硫酸化糖胺聚糖(透明质酸)或硫酸化糖胺聚糖(硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素)，以及含有源自于生物聚合物或重现它们的性质的单元(RGD单元)的合成聚合物和模拟与基材的附着的小分子(Rho-A激酶抑制剂例如Y-27632或thiazovivin)。
用于生产在水凝胶胶囊内含有细胞外基质和细胞的细胞微区室的任何方法均可用于执行根据本发明所述的制备方法。具体来说，可以通过改编在Alessandri等，2016(“生产用于人类神经元干细胞(hNSC)的培养和分化的功能化水凝胶微胶囊的3D打印的微流体装置”(A 3D printed microfluidic device for production of functionalizedhydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal StemCells(hNSC))，Lab on a Chip,2016,vol.16,no.9,pp.1593-1604)中描述的方法和微流体装置来制备微区室。
在有利情况下，所述细胞微区室的维度受控。在一个实施方式中，根据本发明所述的细胞微区室具有球形形状。优选地，这种微区室的直径在10μm至1mm之间，更优选地在50μm至500μm之间，甚至更优选地小于500μm，优选地小于400μm。在另一个实施方式中，根据本发明所述的细胞微区室具有细长形状。具体来说，所述微区室可以具有卵形或管状形状。在有利情况下，这种卵形或管状微区室的最小维度在10μm至1mm之间，更优选地在50μm至500μm之间，甚至更优选地小于500μm，优选地小于400μm。“最小维度”意味着位于所述水凝胶层的外表面上的点与所述微区室的中心之间的最小距离的两倍。
在特定实施方式中，所述外部水凝胶层的厚度占所述微区室半径的5至40％。所述细胞外基质层的厚度占所述微区室半径的5至80％，并且在有利情况下悬挂在所述水凝胶壳的内表面上。这个基质层可以填充所述细胞与水凝胶壳之间的空间。在本发明的情形中，层的“厚度”是所述层从所述微区室的中心轴向延伸的维度。
在本发明的一个实施方式中，所述生物反应器包含微区室，在所述微区室中所述细胞自组织成胞囊。
在本发明的情形中，胞囊被定义为围绕中央腔组织的至少一层多能或全能细胞。因此，根据本发明，这种微区室依次包含围绕中央腔的所述多能细胞的层、细胞外基质或细胞外基质替代物的层和外部水凝胶层。所述腔在胞囊形成时由在所述细胞外基质层上的层中增殖和发育的细胞产生。在有利情况下，所述腔含有液体，更特别是培养基。
根据本发明，在有利情况下，胞囊含有一层或多层人类或非人类哺乳动物的多能干细胞。多能干细胞或多能细胞意味着具有形成起源完整生物体中存在的所有组织的能力但不能形成完整生物体本身的细胞。具体来说，胞囊可以含有胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干(IPS)细胞或在成年哺乳动物皮肤和骨髓中发现的多谱系分化持续应激(MUSE)细胞。
在有利情况下，所述外部水凝胶层的厚度占所述微区室半径的5至40％，所述细胞外基质层的厚度占所述微区室半径的5至80％，并且所述多能细胞层的厚度占所述微区室半径的约10％。所述多能细胞层至少在一个点处与所述细胞外基质层接触，在所述基质层与胞囊之间可以存在被培养基填充的空间。因此，所述腔占所述微区室半径的5至30％。在特定实例中，所述细胞微区室具有半径等于100μm的球形形状。所述水凝胶层具有5μm至40μm的厚度。所述细胞外基质层具有5μm至约80μm的厚度。所述多能细胞层具有10至30μm的厚度，所述腔粗略地具有5至30μm的半径。
根据本发明的示例性实施方式，可以按照下述步骤在例如150mL的生物反应器中培养这种其中细胞形成胞囊的微区室：
(a)将600,000至2百万个哺乳动物多能干细胞在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中温育；
(b)将这些源自于步骤(a)的多能干细胞与细胞外基质混合；
(c)将来自于步骤(b)的混合物包封在水凝胶层中；
(d)将在步骤(c)中获得的胶囊在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中培养；
(e)清洗从步骤(d)得到的胶囊，以便除去所述RHO/ROCK途径抑制剂；
(f)通过每天将培养基体积用不含所述RHO/ROCK途径抑制剂的多能细胞培养基例如MTESR1(Stemcell Technologies)稀释两倍，以补料分批型生产模式将从步骤(e)得到的胶囊培养3至20天，优选地5至10天，并任选地回收所获得的细胞微区室。
本领域技术人员知道如何根据需要改变细胞数目和生物反应器的体积。
在含有一种或多种RHO/ROCK(“Rho相关蛋白激酶”)途径抑制剂例如thiazovivin(C15H13N5OS)和/或Y-27632(C14H21N3O)的培养基中的温育步骤(a)和培养步骤(d)促进了多能干细胞的存活和在细胞外基质周围形成外部水凝胶层时所述细胞与所述细胞外基质的粘附。然而，希望这些步骤在时间上受限，以便所述RHO/ROCK途径抑制剂不阻止胞囊的形成。
因此，优选地，步骤(a)的温育进行几分钟至几小时之间、优选地2分钟至2小时之间、更优选地10分钟至1小时之间的时间段。
同样，优选地，所述培养步骤(d)进行2至48小时之间的时间段，优选地6至24小时之间的时间段，更优选地12至18小时之间的时间段。
为了确保除去任何痕量的RHO/ROCK途径抑制剂，步骤(e)是必需的。步骤(e)通过例如在不含RHO/ROCK途径抑制剂的连续培养基中清洗、优选地清洗几次来进行。
在有利情况下，步骤(f)进行足够的时间以获得其中细胞外基质和多能细胞的层具有等于所述外部水凝胶层厚度的50％至100％的累加厚度的细胞微区室。可以使用适合于培养多能干细胞的任何培养基。
在一个实施方式中，根据本发明所述的方法包括中间步骤(a′)，即，在步骤(b)之前优选地利用不含酶的试剂解离从步骤(a)得到的多能干细胞。在有利情况下，所述试剂在包封步骤之前被抑制或洗掉，特别是通过在用于多能细胞的特定培养基中连续清洗。例如，所使用的试剂是
Figure BDA0002792460040000101
当然，也可以使用胰蛋白酶或含有酶的试剂，但与使用不含酶的试剂相比在这个步骤后多能细胞的存活率则可能更低。
可选地，这种微区室可以按照下述步骤获得：
(A)将哺乳动物分化细胞与细胞外基质和细胞重编程试剂混合；
(B)将来自于步骤(A)的混合物包封在水凝胶层中；
(C)将从步骤(B)得到的胶囊培养至少3天，并任选地回收所获得的细胞微区室。
例如，所使用的分化细胞是成纤维细胞、外周血单核细胞、上皮细胞，更通常是源自于人类组织的液体或固体活检样品的细胞。
专业技术人员知道如何通过利用特定因子重新激活与胚胎期相关的基因的表达而将分化细胞重编程成为干细胞。例如，可以提到的是在Takahashi等，2006(“通过确定的因子从小鼠胚胎和成人成纤维细胞培养物诱导多能干细胞”(Induction of pluripotentstem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by definedfactors)，Cell,2006Vol 126，第663-676页)和题为“重编程多能细胞的产生”(Productionof reprogrammed pluripotent cells)的国际申请WO2010/105311中描述的方法。
在有利情况下，将所述重编程试剂与所述分化细胞共同包封，以便浓缩所述产品并促进与所述一组细胞的接触。
重编程试剂可以迫使所述细胞经历连续的表型改变直至多能阶段。在有利情况下，重编程步骤(A)使用促进这些表型变化的特定培养基进行。例如，将所述细胞在第一培养基中培养，所述第一培养基在最低必需Eagle培养基(DMEM)中含有10％人或牛血清并增补有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体抑制剂(例如产品SB-431542(C22H16N4O3))、一种或多种RHO/ROCK(“Rho相关蛋白激酶”)途径的抑制剂例如thiazovivin和/或Y-27632、成纤维细胞生长因子例如FGF-2、抗坏血酸和抗生素例如曲古抑菌素A(C17H22N2O3)。然后将所述培养基更换为促进多能细胞增殖的培养基例如
Figure BDA0002792460040000111
1培养基。
然后可以迫使这些胞囊进入感兴趣的分化途径，以便获得含有一种或多种感兴趣的细胞类型的微区室，特别是用于生产感兴趣的分子或生产感兴趣的类器官。
在一个实施方式中，所述生物反应器包含含有自组织成类器官的细胞的微区室。
在本发明的情形中，类器官被定义为在三个维度上组织化以便重现至少一部分器官的微观结构的多细胞结构。因此，根据本发明，这种微区室包含被细胞外基质包围的三维多细胞结构，它们整体被包封在所述外部水凝胶层中。
根据本发明，所述类器官可以通过将多能细胞或祖细胞包封在所述水凝胶胶囊中，随后所述多能细胞或祖细胞分化来获得，或者通过直接包封分化或成熟细胞来获得。
在一个实施方式中，引入到生物反应器中的细胞微区室含有多能细胞。然后在所述生物反应器内进行将细胞分化成至少一种感兴趣的细胞类型的步骤和任选的在所述微区室中增殖所述分化细胞的步骤。
在一个实施方式中，引入到生物反应器中的细胞微区室含有已经分化的细胞或祖细胞。然后在所述生物反应器内进行使所述微区室中的所述分化细胞增殖和/或成熟的步骤。
在有利情况下，引入到生物反应器中的微区室具有占所述微区室内部体积的不到10％、优选地不到1％、甚至更优选地不到0.1％的初始细胞密度。
在有利情况下，在所述生物反应器中在培养步骤结束时回收的微区室具有占所述微区室内部体积的超过10％的细胞密度。
根据本发明，所述水凝胶胶囊中包含的细胞经历包含在所述生物反应器中并通过所述水凝胶层的培养基的流动。
在有利情况下，所述微区室外部的对流体积与所述微区室内部的扩散体积的比率在1至10,000之间，优选地1至1000之间，更优选地1至100之间。
根据本发明，所述对流体积是指在所述反应器仓室内在所述微区室之间的培养基体积。所述微区室被悬浮在所述生物反应器中，因此所述对流体积代表了在所述微区室之间流通的培养基。相反，所述扩散体积是指在所述微区室内、即在自组织后的细胞周围/之间产生或由所述细胞产生的空间/空隙中扩散的培养基体积。
因此，在含有胞囊的微区室的情况下，所述扩散体积主要由所述中央腔和在所述胞囊生长开始时所述胶囊壁与所述胞囊之间的空间构成。在含有类器官的微区室的情况下，所述扩散体积主要由在所述三维多细胞结构内产生的空间构成。
在有利情况下，根据本发明所述的微区室的特征在于在所述水凝胶胶囊内存在不含细胞并恰好允许所述微区室内的细胞增殖和/或自组织的一个或多个腔或一个或多个空间。专业技术人员知道如何在最恰当的时候收获所述细胞用于扩增或分化过程才能对应于这种背景下一定的最佳空间饱和水平。
在一个实施方式中，所述微区室占所述生物反应器仓室体积的0.01％至74％之间。
细胞微区室的使用使得在装备有封闭仓室的任何类型的生物反应器中，特别是在采用分批、补料分批或连续补料(灌注)模式的生物反应器中培养细胞成为可能。在连续补料培养中，这些微区室的使用是特别有利的。事实上，由于所述细胞受到所述水凝胶壳保护，因此可以使它们经历连续流动而没有削弱它们的风险。
在一个实施方式中，所述生物反应器包含可以被气密密封的仓室。这使得控制所述生物反应器内的气氛和例如在惰性气氛下培养所述微区室成为可能。
根据本发明所述的细胞培养系统可以包含体积在1mL至10,000L之间，优选地在5mL至10,000L之间、10mL至10,000L之间、100mL至10,000L之间、200mL至10,000L之间、500mL至10,000L之间的仓室。在一个实施方式中，所述仓室具有至少1mL的体积。在一个实施方式中，所述仓室具有至少10mL的体积。在一个实施方式中，所述仓室具有至少100mL的体积。在一个实施方式中，所述仓室具有至少500mL的体积。在一个实施方式中，所述仓室具有至少1L的体积。在一个实施方式中，所述仓室具有至少10L的体积。在一个实施方式中，所述仓室具有100L或更大的体积。在有利情况下，可以使用包含封闭仓室并且能够在工业规模上生产细胞、类器官、分子和/或复杂分子组装体的任何生物反应器。
通常，封闭仓室的使用允许精细控制培养环境而没有被外部环境扰乱的风险。此外，容易获得无菌产物。它也允许获得更好的体积得率。
在一个实施方式中，所述微区室在收获时包含10体积％至98体积％的细胞，即取决于所关注的仓室的直径和所生产的细胞的大小在100至1,000,000个之间的细胞，这可以通过生产的细胞总数(正如由专业技术人员使用Malassez细胞或自动化细胞计数器所测量的)与获得的胶囊数目(正如由专业技术人员通过在光学显微镜下手动计数或通过自动化图像分析表征胶囊体积所测量的)之间的比率来计算。当然，可以使用在开始时包含更少细胞数、特别是1至1,000个细胞之间的微区室来开始细胞培养，即取决于所关注的仓室的直径和所生产的细胞的大小所述细胞在所述微区室内占0.01体积％和10体积％。更通常地，根据本发明所述的微区室包含0.01体积％至98体积％之间的细胞。
然后使所述细胞在所述微区室内增殖并自组织成特别是类器官。
在一个实施方式中，微区室的细胞全部是相同细胞类型的。根据本发明，如果相同微区室的至少50％、优选地70％、更优选地90％、甚至更优选地98％或更多的细胞具有相同表型，根据本领域技术人员的知识可以表征这种细胞类型，则所述微区室的细胞被认为全部是相同细胞类型的。在另一个实施方式中，微区室的细胞是至少两种不同细胞类型的。在有利情况下，区室的20至100％之间的细胞具有相同表型。
根据本发明，可以在同一生物反应器内培养全部包含相同细胞类型或相反地具有不同细胞类型的微区室。例如，所述生物反应器可以含有两种类型的微区室，其各自含有特定的细胞类型。
根据本发明所述的培养系统对于感兴趣的细胞的生产和/或扩增来说特别有利。事实上，所述细胞与所述细胞外基质一起在所述水凝胶胶囊内的组织化允许它们在每次传代之间增殖2至100,000倍。
传代意味着对细胞进行操作以增加空间或培养表面，以便继续扩增或启动分化或自组织成类器官。在例如微载体的情况下，这种操作可能使得必须用新的微载体重新装载所述生物反应器。对于贴壁多能干细胞的标准二维培养来说，这种操作由从旧培养基脱离细胞以便重新接种具有更大表面积的新培养基构成；对于专业技术人员来说，这种操作可能导致损失50％的细胞。对于根据本发明的在微区室中的培养来说，这对应于解离所述微区室、解离所述自组装的细胞组或将它们分散成小得足以再次包封在新的微区室中的细胞组。
具体来说，本发明的另一个目的在于这种生物反应器细胞培养系统用于多能细胞的大规模生产的用途。
本发明的另一个目的在于这种生物反应器细胞培养系统用于从多能细胞生产单能或专能祖细胞的用途。
本发明的另一个目的在于这种生物反应器细胞培养系统用于从多能细胞和/或单能或专能祖细胞和/或这些祖细胞的组合体生产终末分化细胞(即对应于一种或多种特定功能)的用途。
具体来说，本发明的另一个目的在于一种用于生产感兴趣的类器官或细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
-将多个细胞微区室引入到包含封闭仓室的生物反应器中，所述微区室各自包含包封细胞和细胞外基质或细胞外基质替代物的外部水凝胶层；
-将所述微区室在允许所述微区室内的细胞增殖和/或细胞自组装成类器官的条件下进行培养；
-回收所述细胞微区室；
-以及任选地，将所述水凝胶层水解以回收所述感兴趣的类器官或细胞。
专业技术人员能够使培养条件适应于所述微区室的细胞类型，以便促进它们的增殖和/或自组织化。
在一个实施方式中，引入的细胞微区室含有多能细胞，所述方法包括在所述生物反应器内将细胞分化成至少一种感兴趣的细胞类型的步骤和在所述微区室中增殖所述分化的细胞的步骤。例如，用于研究人类内胚层组织中的分化的原始内胚层类器官的生产可以按照下述流程进行：
-从上述获得微区室的步骤f)起，在培养2-3天时：
-在150mL封闭生物反应器中，在由STEMCELL Technologies销售的STEMdiffTM胰腺祖细胞试剂盒的STEMdiffTM胰腺第1阶段培养基中培养3至6天。
-将所获得的原始内胚层用于发育研究。
在另一个实施方式中，引入的细胞微区室含有已经分化的细胞或祖细胞，所述方法包括在所述生物反应器内将所述分化的细胞在所述微区室中增殖的步骤。
在所述增殖和/或成熟步骤中，在有利情况下，所述细胞将根据所述细胞类型特定的组织化方式自组织成特定类器官。
在涉及扩增的实施方式中，引入到生物反应器中的微区室具有占所述微区室内部体积的不到10％、优选地1％、甚至更优选地0.1％的细胞密度。然后使所述细胞在所述培养步骤期间在所述微区室内增殖。
在涉及分化和/或成熟而不涉及扩增的实施方式中，引入到生物反应器中的微区室具有占所述微区室内部体积的超过1％的细胞密度。然后使所述细胞在所述培养步骤期间在所述微区室内分化和/或成熟和/或自组织。例如，在用于帕金森氏病的细胞疗法的情形中，用于神经元移植的神经类器官的第一种类型的生产按照下述流程进行：
-将5百万个例如由Cellular Dynamics International销售的多巴胺能祖细胞(
Figure BDA0002792460040000171
DopaNeurons)融化。
-按照在Alessandri等，2016中描述的流程包封预分化的神经祖细胞。
-在150mL封闭生物反应器中，在由Cellular Dynamics提供的培养基中进行培养。
-在所述生物反应器中使多巴胺能神经类器官成熟并结构化2周。
-通过利用在1mL
Figure BDA0002792460040000172
(Stemcell Technologies)中的两次30秒清洗而解离水凝胶胶囊，然后重悬浮在70kDa葡聚糖在神经元培养基中的11质量％溶液中，在我们自制的玻璃套管中分配，来制备移植物。
-移植到帕金森氏病的动物模型中。
在组合了扩增和分化/成熟的实施方式中，在有利情况下，引入到生物反应器中的微区室具有占所述微区室内部体积的不到10％、优选地1％、甚至更优选地0.1％的细胞密度。然后使所述细胞在培养步骤中在所述微区室内增殖，然后在分化步骤中分化。然后使所述细胞在第二个培养步骤中在所述微区室内自组织，这可以通过改变营养培养基的性质或物理触发物(温度、照射)来触发。例如，在用于帕金森氏病的细胞疗法的情形中，用于神经元移植的神经类器官的第二种类型的生产按照下述流程进行：
-从上述获得微区室的步骤f)起，在培养2-3天时：
-在150mL封闭生物反应器中，在增补有N2和B27的神经基础培养基/DMEM-F12基础上含有BMP2(2μm dorsomorphin或0.5μm LDN 193189)和TGFβ(10μm+SB 431542)信号传导途径抑制剂、10μm24(S),25-环氧胆甾醇的神经诱导培养基中培养1至2天。
-在150mL封闭生物反应器中，在增补有N2和B27的神经基础培养基/DMEM-F12基础上含有BMP2(2μm dorsomorphin或0.5μm LDN 193189)和TGFβ(10μm+SB 431542)信号传导途径抑制剂、SHH途径的两种激活剂(200ng/mL SHH；1μm purmorphamine)和FGF8(100ng/mL)、WNT途径抑制剂(3μm Chir99021)、10μm 24(S),25-环氧胆甾醇的神经区域化培养基中培养6天。
-在150mL封闭生物反应器中，在增补有N2和B27的神经基础培养基/DMEM-F12基础上含有BMP2信号传导途径抑制剂(2μm dorsomorphin或0.5μm LDN 193189)、WNT途径抑制剂(3μm Chir99021)、10μm 24(S),25-环氧胆甾醇的第二神经区域化培养基中培养1天。
-在150mL封闭生物反应器中，在含有环AMP(500μM)+抗坏血酸(200μM)+GDNF(20ng/mL)+BDNF(20ng/mL)+FGF-20(5ng/mL)+TGFβ(1ng/mL)+曲古抑菌素(10nM)+化合物E(1μM)的生物反应器中，在用于多巴胺能神经类器官的成熟和结构化的培养基中培养2周。
-通过利用在1mL
Figure BDA0002792460040000181
(Stemcell Technologies)中的两次30秒清洗而解离水凝胶胶囊，然后重悬浮在70kDa葡聚糖在神经元培养基中的11质量％溶液中，在我们自制的玻璃套管中分配，来制备移植物。
-移植到帕金森氏病的动物模型中。
在组合了扩增和分化/成熟的另一个实施方式中，在有利情况下，引入到生物反应器中的微区室具有占所述微区室内部体积的不到10％、优选地1％、甚至更优选地0.1％的细胞密度。然后使所述细胞在所述微区室内增殖。然后通过解离所述胶囊来回收细胞，然后使所述细胞经历第二个包封步骤，然后是分化步骤，然后使所述细胞在第二个培养步骤中在所述微区室内自组织，这可以通过改变营养培养基的性质或物理触发物(温度、照射)来触发。例如，用于人类胰腺组织移植的人类胰腺类器官的生产按照下述流程来进行：
-从上述获得微区室的步骤f)起，在培养2-3天时：
-在150mL封闭生物反应器中，在由STEMCELL Technologies销售的STEMdiffTM胰腺祖细胞试剂盒的增补有增补物1A和增补物1B的STEMdiffTM胰腺第1阶段培养基中培养1天。
-在150mL封闭生物反应器中，在由STEMCELL Technologies销售的STEMdiffTM胰腺祖细胞试剂盒的增补有增补物1B的STEMdiffTM胰腺第1阶段培养基中培养1天。
-在150mL封闭生物反应器中，在由STEMCELL Technologies销售的STEMdiffTM胰腺祖细胞试剂盒的增补有增补物2A和增补物2B的STEMdiffTM胰腺第2-4阶段培养基中培养1天。
-在150mL封闭生物反应器中，在由STEMCELL Technologies销售的STEMdiffTM胰腺祖细胞试剂盒的增补有增补物2A和增补物2B的STEMdiffTM胰腺第2-4阶段培养基中培养2天。
-在150mL封闭生物反应器中，在由STEMCELL Technologies销售的STEMdiffTM胰腺祖细胞试剂盒的增补有增补物3的STEMdiffTM胰腺第2-4阶段培养基中培养3天。
-在150mL封闭生物反应器中，在由STEMCELL Technologies销售的STEMdiffTM胰腺祖细胞试剂盒的增补有增补物3的STEMdiffTM胰腺第2-4阶段培养基中培养5天。
-通过利用在1mL
Figure BDA0002792460040000191
(Stemcell Technologies)中的两次30秒清洗而解离水凝胶胶囊，然后重悬浮在70kDa葡聚糖在前述培养基中的11质量％溶液中，在我们自制的玻璃套管中分配，来制备移植物。
-移植到1型糖尿病的动物模型中。
在有利情况下，在所述培养步骤结束时在所述生物反应器中回收的微区室具有占所述微区室内部体积的超过10％、优选地超过50％的细胞密度，并且所述细胞密度在类器官的情况下可以占高达98％。
根据本发明所述的培养系统对于感兴趣的分子和/或复杂分子组装体的生产来说也特别有吸引力，所述分子和/或复杂分子组装体被所述微区室的细胞分泌到所述微区室外进入培养基中或者相反地积累在所述微区室内，用于后续的收获。这种生产方法具体来说可以通过将细胞元件集中在所述微区室内部而限制所述细胞元件的过滤步骤。凭借在所述生物反应器中通过所述胶囊将对流体积与扩散体积分开，这种方法允许更容易地将含有可溶性元件的培养基与不可溶或比所述胶囊的水凝胶的网目尺寸(对于藻酸盐来说通常为150至250kDa)更大的元件分离开。
根据本发明，在有利情况下，随后将所述微区室用于采取连续补料模式的反应器。正如上文解释的，保护性水凝胶壳的存在使得以没有损伤所述细胞的风险的流速灌注培养基成为可能。具体来说，可以以每天所述生物反应器中包含的细胞的0.01至100倍体积之间的流速用培养基灌注所述反应器的内部。

Claims (16)

1.一种生物反应器细胞培养系统，所述系统包含含有多个悬浮细胞微区室的封闭仓室，其中所述微区室各自包含外部水凝胶层，所述外部水凝胶层提供了包容一组自组织细胞和细胞外基质或细胞外基质替代物的空腔。
2.根据权利要求1所述的生物反应器细胞培养系统，其中所述微区室外部的对流体积与所述微区室内部的扩散体积的比率在1至10000之间。
3.根据前述权利要求中的任一项所述的生物反应器细胞培养系统，其中全部或一部分所述微区室包含自组织成胞囊的细胞。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的生物反应器细胞培养系统，其中全部或一部分所述微区室包含自组织成类器官的细胞。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的生物反应器细胞培养系统，其中所述生物反应器选自分批模式生物反应器、补料分批模式生物反应器和连续模式生物反应器，优选地选自连续(灌注)模式生物反应器。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的生物反应器细胞培养系统，其中所述仓室具有1mL至10,000L之间的体积。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的生物反应器细胞培养系统，其中所述微区室包含0.01体积％至98体积％之间的细胞。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中微区室的细胞全部是相同细胞类型的，或者相反，是至少两种不同细胞类型的。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述微区室全部包含相同细胞类型，或者相反，具有至少部分不同的细胞类型。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的生物反应器细胞培养系统的用途，其用于优选地以每次传代之间2至100,000的倍数生产和/或扩增感兴趣的细胞。
11.根据权利要求1至9中的任一项所述的生物反应器细胞培养系统，其用于生产感兴趣的分子或复杂分子组装体，所述分子或组装体由所述微区室的细胞分泌到所述微区室外进入培养基中或者相反积累在所述微区室内，用于后续的收获。
12.一种用于生产感兴趣的类器官或细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
-在生物反应器中引入多个细胞微区室，所述微区室各自包含外部水凝胶层，所述外部水凝胶层包封细胞和细胞外基质或细胞外基质替代物；
-将所述微区室在允许所述微区室内的细胞增殖和/或细胞自组装成类器官的条件下进行培养；
-回收所述细胞微区室；
-以及任选地，将所述水凝胶层水解以回收所述类器官或细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中引入的细胞微区室含有多能细胞，所述方法包括在所述生物反应器内将细胞分化成至少一种感兴趣的细胞类型的步骤，和任选的使所述分化的细胞在所述微区室内增殖的步骤。
14.根据权利要求12所述的方法，其中引入的细胞微区室含有已经分化的细胞或祖细胞，所述方法包括在所述生物反应器内使所述分化的细胞在所述微区室中增殖和/或成熟的步骤。
15.根据权利要求12至14中的任一项所述的方法，其中引入到生物反应器中的微区室具有占所述微区室内部体积的不到10％、优选地不到1％、甚至更优选地不到0.1％的初始细胞密度。
16.根据权利要求12至15中的任一项所述的方法，其中在所述生物反应器中在培养步骤结束时回收的微区室具有占所述微区室内部体积的超过10％的细胞密度。
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