CN1898375A - 用于对具有三维形状、活性和机械抗力的细胞移植体进行培养和刺激的方法和生物反应器 - Google Patents

用于对具有三维形状、活性和机械抗力的细胞移植体进行培养和刺激的方法和生物反应器 Download PDF

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Abstract

一种生物反应器(1)包括：一个与反应器锁定装置(21)在耐压无菌条件下相连接的基架，形成至少一个反应室，其中设置有移植物(11)的沉积表面和微型促动器(14)。所述生物反应器(1)上还装配有至少两个用于除气体引入外的培养基进料和出料的软管联接器(19)。

Description

用于对具有三维形状、活性和机械抗力的细胞移植体进行培养和刺激 的方法和生物反应器
本发明涉及一种对具有三维形状、活性和机械抗力的细胞培养物进行培养的方法和装置，所述细胞培养物优选为可以同时、连续地在锁定的微型生物反应器中或者在依据产品生产质量管理规范(GMP)导则的受时间控制的方法中进行培养和刺激的软骨细胞构造物。这些按照这种方式培养的移植体可作为替代组织材料，用于进行例如连接和支承组织损坏处、直接关节损伤、风湿病以及关节变性疾病的治疗，并且可以提供常规(手术)治疗，例如膝关节病的微压裂法或穿孔术的替代方法。
运用上述称作自体细胞材料的内源体外复制的组织工程学，可以尝试培养可以在移植期植入受损组织中的功能替代细胞和组织结构。
为此目的，在实验室中对细胞培养物(例如关节软骨细胞)进行常规复制。这些细胞(例如软骨细胞)的实际复制发生于一个依照标准协议覆盖的细胞培养物的烧瓶或培养皿底部上面的单层培养物上，还包括与组织相关的成长因子、介体和诱导物的添加。
这些添加因子的作用是，例如，对软骨细胞具有合成一个足够数量的胞外基质成分的这种特殊能力的刺激，以达到在体外复制中质量比为1％的软骨细胞至99％的胞外基质成分的比例，即存在于功能关节软骨中的比例(Stockwell RA：The cell density of human articularand costal cartilage.J Anat.1967；101(4)：753-763；Hamerman D，Schubert M：Diarthrodial joints，an essay.Amer JMed.1962；33：555-590)。
由于不能通过简单的添加培养基达到要求，因此尝试通过提供多种方法和手段来影响或刺激这些软骨细胞，从而可以在实验室中培养出合适的具有高的分化度的替代自体(玻璃状)软骨。
所述的细胞培养物的复制以及替代组织结构的培养具有很多缺点。
在一个覆盖有培养基的简单培养皿的二维表面培养物上进行的软骨细胞培养物的被动培养，不能产生具有分化能力软骨细胞的有效刺激。
从Minuth，W.W.，Kloth S.，Aigner J.，Steiner P.：MINUSHEET-Perfusionskultur：Stimulierung eines gewebetypischen Milieus.Bioscope 1995；4：20-25中得知一个概念，即尝试在人造载体结构中来自患者的细胞材料中避免此缺点，此人造载体结构具有生物物理性能，即类似于那些软骨组织的性能以及允许在多层排列细胞间的网状接合性能，以及在合适的生物反应器中进行灌注培养的性能。很多实验表现了一个做为合成ECM中繁殖结果的繁殖细胞分化性能，合成ECM通过在最大分化生物相容性和生物可吸收性的基质中软骨细胞的三维形状培养得到，这些基质包括，例如，不同浓度的水凝胶、藻朊酸盐、琼脂糖(Benya和Shaffer：Dedifferentiated chondrocytes reexpress thedifferentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.Cell.1982；30：215-224.)。
因此而构造的空间维结构刺激了活体组织如膝盖和髋关节中软骨细胞的原始比例，例如因此表现出体内位置的有益的适应作用。
通过细胞的附着表面培养，培养基的充分供给比这些单独直接位于细胞上或下的培养物要相对简单，因此允许通过扩散进行未受损材料的交换。
相对于此，当使用通过静置培养法培养的包埋有细胞的三维形状基质时，形成浓缩斜面或梯度的结构，这种结构限制了在医用构造物中材料的传输，从而对细胞层的最佳培养要求起到不利的影响。
这种在立体载体基质中细胞材料的培养过程中的损害通过在构造物中灌注或输入培养基的诱导作用进行抵消。
通过这种载体结构的有效方法确保了细胞内的同源营养供应，并使得软骨细胞可以连续代谢排除。另外，动态培养法确保了一个高的气体通过性，并且机械的刺激受到选择培养基灌注流动从而具有μPa剪力的细胞层。(Raimondi，M.T.，F.Boschetti等：Mechanobiology ofengineered cartilage cultured under a quantified fluid-dynamicenvironment.Biomechan Model Mechanobiol.2002；1：69-82)
没有充分的消毒是在“细胞培养瓶”中进行细胞繁殖和移植的另一个缺点。由于对应的培养通道必须打开，并且在确保“世界卫生组织有关药品制造及其质量保证的基本规定”(优质生产规范-WHO指导)的工作环境下的层流工作台也不能够100％的消毒，因此甚至常规的操作例如培养基的更换，种入细胞以及甚至得到它的操作都会被污染。
此外，这种不利的系统不能够提供一个通过扩散渗透膜以及在培养介质和底部细胞层之间的最大气体交换。为了避免培养瓶的这些缺陷，最近这些年加快了用于替代组织结构物形成的自动自备生物反应器系统的发展。它们具有(Freed和Vunjak-Novakovic：Microgravitytissue engineering.In Vitro Cell Dev Biol Anim.1997；33：381-385)消毒，可控培养和三维移植刺激的优点。通过结合可由加工方法学和生物工程学得到的组织工程学，在生物反应器系统中能够提供所选培养参数例如二氧化碳和氧气单独的排气量的操控和控制，温度控制，培养介质的更换，样本的获取等。(Obradovic，Carrier，Vunjak-Novakovic和Freed：Gas exchange is essential for bioreactorcultivation of tissue engineered cartilage.BiotechnolBioeng.1999；63：197-205)。
当设计生物反应器时，总是要制造一个好的慎重考虑后的系统，其可以通过人工方法控制方法。当它用于培养特殊组织时，生物反应器系统必须能够复制生理机能且在体内尽可能准确的发生作用。所有作用于培养物的生物反应器系统具有至少一种机械刺激。
在具有培养介质的灌注刺激下，生命基质中的自体替代组织物质的受控生物反应器培养的积极特征的排列表示了用于培养活性软骨细胞例如具有增加的ECM-合成性能的可符合自动消毒或GMP规定的移植培养的合理结果。
由DE4306661A1和Sittinger M，Bujia J，Minuth WW，HammerC，Burmester GR：Engineering of cartilage tissue usingbioresorbable polymer carriers in perfusion culture.Biomaterials.1994；15(6)：451-456公开的灌注反应器，其中细胞包埋入聚合物层中并另外包入胶囊中。一种人造培养介质以0.016ml/min的流速流过圆柱形玻璃反应器。反应器本身位于具有标准条件的相应组织培养器中。位于培养介质贮存处的消毒过滤器可以允许气体与外界环境发生交换。使用Bujia J，Rotter N，Minuth W，Burmester G，Hammer C，Sittinger M：Cultivation of human cartilage tissue in a 3-dimensional perfusion culture chamber：characterization ofcollagen synthesis.Laryngorhinootologie.1995；74(9)：559-563和Kreklau B，Sittinger M，Mensing MB，Voigt C，Berger G，BurmesterGR，Rahmanzadeh R，Gross U：Tissue engineering of biphasic jointcartilage transplants.Biomaterials.1999；20(18)：1743-1749所述型号反应器进行的继续实验使用已被浸入聚-L-赖氨酸或II型胶原纤维中的vicryldiaxonon层和聚二恶烷(polydioxanon)层的共聚物组织。人体软骨细胞被埋入这些层中并且在灌注条件下培养两周。通过共聚物两相模型的使用，即把聚羟基乙酸和聚L乳酸(Ethicon)共聚物加到碳酸钙产物上，培养时间延长到70天。
Mizuno S，Allemann F，Glowacki J：Effects of medium perfusionon matrix production by bovine chondrocytes in three-dimensionalcollagen sponges.J Biomed Mater Res.2001；56(3)：368-375中构造了另外一个十分相似于上述的灌注生物反应器系统。与已经描述的反应器相反的，这个反应器具有一个用于人造培养介质的封闭空间。培养物质的主体位于一个1厘米宽10厘米长的圆柱形玻璃柱中。柱中填满了很多细胞/聚合物构架组织，每一个构架组织的尺寸是7×15mm，这些物质并不另外进行胶囊密封。从贮存室流出的人造培养介质以300μl/min的速度通过柱体和整个系统。这个系统用于测试胶原海绵中的牛软骨细胞结构在15天的培养期内对于灌注的反应。
根据美国专利5,928,945公开的生物反应器装置中，粘着软骨细胞被用于定义进行增后II型胶原合成测试的生长室中的流量或剪力。
相比灌注生物反应器的发展，研究者开始关注在移植体，细胞样品或细胞/聚合物结构中进行不同机械施压方法的生物反应器的设计。当构造用于软骨细胞刺激的反应器时，它们的设计使反应器本身适应于机械塞的使用，等，如这些机械塞把单轴压力施加到软骨移植体上以模仿填充入人体软骨组织的最重要形态。大多数这类压力系统具有很大的设计相似性。
Steinmeyer J，Torzilli PA，Burton-Wurster N，Lust G：A newpressure chamber to study the biosynthetic response of articularcartilage to mechanical loading.Res Exp Med(Berl).1993，193(3)：137-142中进一步公开的系统的压力腔包括一个内侧涂覆有聚乙烯涂层的钛外壳。最大直径10mm的实验样品被放置在腔的基底上，并且周围覆盖有7ml的人造培养介质。由于模型没有一个人造培养介质灌注系统，因此只可能产生短培养时间的相内压力。把相应压力施加到实验样品上的载负系统包括一个位于通过腔锁前部并且也可以依靠样品质量移动的多孔压力坩锅，或者包括一个安装在腔体上具有压力柱的气体柱缸。
Lee DA，Bader DL：Compressive strains at physiologicalfrequencies influence the metabolism of chondrocytes seeded inagarose.J Orthop Res.1997；15(2)：181-188公开的系统通过促动器进行发动，这个促动器能够在24个测试样品上同时施加压力。这个促动器被安装在框架上，此框架围绕在培养器四周并且把压力向下传递到消毒盒中的载荷板上。此钢质载荷板具有24颗直径11mm位于有机玻璃锯齿缺口上的钢螺栓。促动器依靠变形度提供不同的载荷。这个系统用于在两天时间内对牛软骨细胞/琼脂糖结构进行培养。产生了具有最大张力幅度的静态和附加循环载荷(0.3-3Hz)。
多数压力刺激反应器的缺点在于在压力载荷期间带有培养介质的细胞培养物无法灌注，所以也就不能测试复合细胞刺激的效果。此外，最佳代谢交换和例如在软骨细胞内的胞外基质的最大合成也阻碍了这种培养供给的缺乏。
例如那些在美国专利6,060,306和德国专利19808055中公开的压力和灌注系统具有包括例如灌注量，结果诱导剪切力和单轴压力载荷等参数的同时多重刺激。
能够发生压力刺激的反应器的首要缺点是它们需要借助压力传递器，主活塞和活塞等进入的优先包含自体移植的生物反应器空间，这些压力传递器和活塞通过伺服马达或类似机器驱动，然后把已定义的压力载荷施加到细胞构造物上。消毒系统中这些压力施加装置的加入表明了整套独立的压力应用发生器设计的十分困难，所以这些系统日益复杂。因此这些(可能非消毒)系统仅仅用于基础研究，这些设备和方法应用于现有医用制备技术方向的医学部抵触部。
因此所有用于替代自体组织结构的培养和刺激的生物反应器装置都符合WHO优质生产规范指导(“世界卫生组织有关药品制造及其质量保证的基本规定”)和德国药品管理条例(Arzneimittelgesetz)(AMG)，“药物检验协定”和GMP-Directive 91/356/EEC。由于感染的危险或者不可能完全确保系统的消毒，因此根据AMG第13节对于制造许可是无法通过的。
本发明的任务在于发明一种用于制造具有三维形状、活性和机械抗力细胞培养物的方法和生物反应器，使得这些培养物可以在彼此很短的时间内或者同时被培养和刺激。所述生物反应器在确保无菌的条件下应允许进行符合GMP的移植培养。
本发明通过如权利要求1描述的方法和如权利要求13描述的生物反应器实现所述任务。在权利要求2-12中描述了所述方法的优选方式；在权利要求14-57中描述了其它形式的生物反应器。
发明的所述方法和发明的所述生物反应器将符合GMP制造的三维形状、活性和机械抗力的细胞培养物，优选为软骨细胞构造物，的培养和刺激结合到一个单独的反应器中。由此，刺激和培养可以同时地、连续地或者依照一个受时间控制的方法进行。以这种方式培养出的移植物可作为用于连接和支持组织损伤例如直接关节损伤、风湿病以及变性关节疾病治疗的替代组织材料。
发明的方法和发明的生物反应器的基本特征在于移植发生于一个整套独立的反应室内，在很多情况下此反应室可以接受体内适应性刺激。这包括使用有条件培养介质构造的立体培养物的灌注，所述培养介质可以引起作用于细胞膜上的器官型剪切力并且还允许发生增长的代谢交换。作为细胞培养物载荷施加装置的磁性类活塞式压力冲压机位于整套独立的生物反应器内的移植物上。冲压机以无接触形式受到生物反应室的控制，组织移植物受到定向单轴压力刺激。微型促动器的无接触控制通过外置的控制磁体进行实施，这些磁体产生磁场导致了生物反应器内冲压机位置的改变，从而分别产生器官型动态或静态压力刺激。
已进行描述的方法和生物反应器的优点在于在培养过程中也可以对细胞培养物进行刺激。连接和支持组织结构以及功能组织系统(例如软骨、骨等)的培养或再生变得尤其可能。
当在无菌方法中使用时，所述设备能够使细胞移植物进行培养，其特征在于，它们同时进行灌注和压力加载，这样就使基质组分(例如软骨细胞培养物)的产物增加。鉴于其自动化程度，所述装置使得步骤的数目减至最少，由此降低了细胞培养物受到污染的危险。移植物的自动化培养和刺激同样保证了已确定和可再生的方法循环。由于发明的生物反应器的设计特征，确保了整套独立的生物反应器的循环，并且因此能够在确保GMP指令下得到严格自体培养或替代组织结构的刺激。
所述生物反应器的另一应用领域是用于特征化移植物上的增殖和分化相关成分或成分组合的药学活性成分测试。
下面，通过以下实施例对本发明的方法和本发明的生物反应器进行说明，其中：
图1示出了用于制备移植物的方法；
图2是GMP-生物反应器系统的示意图；
图3是单室生物反应器的示意图；
图4是双室生物反应器的示意图；
图5示出了微型促动器执行机构的设计和造型；
图6示出了在生物反应器内进行构造物制备和构造物接种(seeding)的示意图；
图7为用于在单室反应器内进行构造物灌注和培养基混合的技术设备的示意图；
图8为用于在双室反应器内进行构造物灌注和培养基混合的技术设备的示意图；
图9为示出了移植物在生物反应器内的固定情况的示意图；
图10示出了用于控制微型促动器的磁体系统；和
图11为示出了在双室反应器内进行刺激的示意图。
实例1
用于制备移植物的方法
图1使用软骨组织移植作为实例，示出了使用生物反应器用于对三维形状的细胞移植物同步进行培养和刺激。
为此，首先(I)采用微创手段从患者身上获得健康细胞材料(如关节软骨)和血液。对获得的这些细胞在酶消化的条件下进行分离和计数，然后采用标准组织工程学方法或者把它们播种到单层烧瓶(II)中，在所述单层烧瓶中它们以严格相似的方式进行繁殖，或者把它们立刻用于构造物(III)的制备中。由此，细胞被加到生物相容或可吸收的载体材料(例如水凝胶、琼脂糖、胶原、羟磷灰石、聚合物配合物等)的三维形状移植物结构的上面。悬浮细胞(例如软骨细胞)与生物支持(biogenic support)结构(例如琼脂糖)相混合，放置在接种活塞中并硬化成为例如圆柱形移植体(如软骨-琼脂糖-基质)。这种体内适应的三维形状结构特别是会产生在连接和支持组织细胞(如软骨细胞)中组织型物质和基质组分(如胶原，蛋白多糖)的(再)分化和结果合成。
把内部带有立体细胞移植物的接种活塞插入生物反应器(IV)中，随后移植物被压出并且被定位在生物反应器内。在最新研发出的符合GMP规定的生物反应器装置(V)中同时、连续或受时间控制地进行细胞构造物的符合GMP的培养和刺激。在这一阶段，细胞移植物可通过这种多重体内类似的刺激获得器官型标记(例如剪切力、灌注、形变、机械载荷等刺激)的增长分化和表达。
在较短的时间之后，在生物反应器内再生出高活性、富含基质的细胞培养构造物。这种自体移植物被去掉(VI)，如果需要则适合于组织受损处的几何形状，并且随后移植进入受损的连接或支持组织内。
实例2
生物反应器系统示意图
图2示出了用于在整套独立的反应器结构中使用符合GMP规定的工艺方法对细胞移植物进行自体培养和多重刺激的生物反应器系统(带有双室的生物反应器)的实施方式。
在这个实施例中，用于确保最佳温度、空气湿度和组成的整套设备被放入一个受温控和受气体调节的培养器(incubator)中。分开的设计也是有可能的，在其中生物反应器1和培养基位于培养器内，其它技术组成位于培养器外部。
生物反应器1自身以及其中使用的部件是生物惰性和化学惰性的，并且可以通过高压釜进行处理。此外，生物反应器构架和外壳上螺钉是非磁性材料(如合成物质)或是弱磁性材料(如钒-4-钢)。
培养介质从培养基贮器2中取出并且借助循环泵5经过带有三通阀6和四通阀7的软管系统4之后，进入到生物反应器1中。所述培养介质中可能会富集从添加物贮器3中由患者血液中获得的自体添加因子(生长因子，传递质介体等)。培养基被加入到生物反应器1中并且因此在批量、流加或连续方法中被加入到移植物11中。
当循环关闭时，培养基经由软管系统4进入培养基贮器2中，贮器中装有用以控制物理化学参数，例如pH、pCO2和pO2的测量探针。如果培养基已被使用，它会经由软管系统4排入外部的锁定的废料容器中而被排干。在两种情况下，使得用于进行进一步分析的无菌培养基样品经过阀装置7从反应器循环到样品采集段8发生偏离都是有可能的。
要进行培养和刺激的移植物11位于反应器底部上面的中间位置处。较小的第二室可被设置在移植物11的下面。培养基经过软管系统4提供的流动空间可以被强多孔薄层烧结材料16所填满。这个更低的室可以被一张透明玻璃薄片17封住，并且作为倒置显微镜的显微镜开口。
除了插入生物反应器外壳的生物传感器9以外，生物反应器1的上部室还包括微型促动器14。这种设计作为磁性冲压机的微型促动器14作为一种无接触压力施加装置，并且受到控制磁体或线圈15的控制。
实例3
单室生物反应器示意图
图3示出了包括一个培养室的生物反应器1的一种可能的实施方式，所述培养室用于执行无接触可控微型促动器14。
设计成单室生物反应器的生物反应器1包括构架和通过夹紧环20另外密封的生物反应器锁定装置21。生物传感器9被整合到用于在线测量其中的葡萄糖和乳酸盐浓度的罩盖(cover)结构中。一个精确装配整合的微型促动器14位于反应室中移植物11的上方，移植物和一个插入的透明玻璃板17被搁在专门的反应器底板上。
为了供给带有培养基的移植物11，最少有一个进料和一个排料通道经由路厄连接器19穿透生物反应器1。样品取得段8通过三通阀6整合至少一个排料通道19。
实例4
双室反应器示意图
图4示出了包括两个室的生物反应器1的另一种实施方式，其中上部包括压力冲压机14，下部用作在移植物11下面的相对流动。这种实施方式中的部件1，6，8，9，14，19-21的功能、特征和要求与实例3中描述的生物反应器1中的那些部件没有什么不同。
至少一个进料和排料通道19被整合到上部和下部反应室中，以便实现相对于各个室和移植物11的受阀门控制的流动。
下部室的直径尺寸要小于移植物11的直径尺寸。这个室包括一块多孔烧结材料16的精确匹配的平板，所述平板使得能够通过平板玻璃17和膜18对移植物11实施无损的倒置显微检查。下部反应室中的烧结材料平板16在所述设备中具有另外一个重要功能。当移植物11经受压力冲压机14的机械载荷时，它可以避免所不希望的将胶状细胞构造物11压入室空间。依据使用者的支持基质和其粘度，计划在烧结材料16和移植物11之间使用流体可渗膜18，以避免载体材料和烧结材料16相互混合。
实例5
微型促动器14的设计和实施方式
图5示出了十分适宜放入反应室形成良好配合的微型促动器14的设计、几何形状和不同形式(图中示出以双室模型作为实例)，它给出了施加在放置于反应器底板上的移植物11上的轴向压力。
磁性压力施加装置14借助根据本发明所述的外部安装的控制磁体15被无接触控制(参见图5a)在生物反应器1中的垂直位置上。一方面可通过将移植物11定位生物反应器1的中间位置从而确保完全垂直压缩。另一方面，还必须使得压力冲压机直径D2与内部生物反应器D2的尺寸精确匹配。这样就使得微型促动器14能够在无冲压阻塞或倾斜的情况下插入生物反应器1中。在所有的生物反应器模型中，直径D2的尺寸要大于移植物11的外径D1。
图5b示出了所述压力单元14的特征设计。所述压力单元具有一块在最弱磁场和电磁场存在的条件下沿对应场的方向进行移动时磁性很强的永久磁体2，优选为钕-铁-硼化合物。所述永久磁体22是涂漆或电镀形式，并且被封入生物惰性合成材料-包封体23中。这种具有完全配合外径的优选呈圆柱形的包封体23以低摩擦方式且完全垂直地滑入生物反应器圆筒中。另外，这个塑料包封体23的底面是水平面，并且在其上有作为冲压表面24的其它器官型负方式(organotypicalnegative forms)，从而复制体内适应的正方式(包括曲形、弓形等)。
这里提到的在包封体23中没有任何流槽33的新型促动器几何形状同样提供了由循环磁性场产生而出现的泵功能。由于生物反应器1中存在的压力和阀配给，微型促动器14的向上移动能够使得培养基被吸入反应室中。移植体11的向下移动或者压力压缩导致培养基被压出生物反应器1。
图5c示出了同样包括强磁性的永久磁体22和具有独立冲压表面24的包封体23的微型促动器14的另一种实施方式。这个模型在其包封体23的边缘具有用于优化流动性的所谓的流槽33。这使得能够在生物反应室中实施微型促动器14的培养基流动，从而使得只需要更小的定位力以克服培养基阻力。包封体23必须具有至少三个具有精确匹配的外径D2的引导凸出部，以确保整个微型促动器14在移植体11上的平面定位。
图5d示出了基于附图5b但是具有延伸旋座34’的一种改进型压力冲压机14，被设计用以在永久磁体22和细胞培养物结构11之间形成一定的空间距离。在上部圆筒头中的永久磁体22与移植物11之间拉开距离的原因在于使得作用于细胞培养物11的任何场的影响最小化。
图5e示出了基于附图5d且具有至少三个流槽33和具有外径D2的三个引导凸出部的微型促动器14。
实例6
示意性地示出了生物反应器1内构造物的制备和构造物的接种。
图6示出了用于制备和接种三维形状，优选圆柱形细胞基质构造物的方法和设备。
在图6a中(细胞基质接种)，繁殖(见附图1，II)或新鲜隔离(见附图1，III)和制备出的细胞12与生源体载体结构13相混合，均匀悬浮混合并且被注射进入接种活塞25。精确配合的接种活塞25具有对应于移植物11未来外径的内径D1，以及对应于生物反应器1内径的外径D2。
图6b(冲压插入物)示出了接种活塞25中的冲压插入物。在反应活塞25中的对应细胞基质进行硬化或聚合的同时，具有外径D1的精确配合平面的冲压物26被插入到水平滑动平板27上的中空活塞圆筒中。
这种冲压物26的底面可以压印具有与微型促动器14的冲压表面24相类似的器官型结构。
图6c(冲压应用)示出了施加到接种活塞25中移植物11上的冲压物26的应用。冲压物26被放置在细胞结构上且施加较轻的压力，以防止移植物11基质上部侧面形成半月形或弯曲，从而获得圆柱形的移植物形式等。
如果移植物11上压入了一个体内适应表面，这种冲压物应用26必须在硬化或聚合过程中分别进行。
在图6d中(移走滑动平板)，在移植物11成型以及优选为疏水性的位于接种活塞底部的滑动平板27被移走之后，所施加的冲压物抬升。为了防止凝胶型细胞构造物11粘附到滑动平板27和接种活塞上，例如把惰性箔片或惰性聚合物绒头织物用于覆盖表面。
图6e(在生物反应器中构造物进行接种)以双室生物反应器为例示出了圆柱形构造物的接种。因此，精确配合的接种活塞25在生物反应器1中运行，然后细胞构造物借助压力冲压物26被定位在制备反应器的中间位置，然后将接种装置从生物反应器1中移走。如果需要，这种制备生物反应器1包括有多孔烧结材料16和扩散可渗透膜18。
实例7
示意性地示出了用于在单室生物反应器中进行构造物灌注和培养基混合的技术设备。
图7示出了单室反应器构架的设计和结构，以及其对于移植物11的扩散和灌注的影响作用。
在图7a示出的实施方式中，带有整合在一起的路厄连接器19的四个进料口和出料口被连入生物反应器1中。它们的定位和位置可以不同以优化流动性，因此这意味着它们也可以切入生物反应器构架中。最少两个进料口和出料口分别进入生物反应器1中。样品采集段8可借助例如三通阀6而被安装到每一个排出式路厄连接器19上。
特别是生物反应器中的静态培养法产生了例如上部培养基以及圆柱形组织移植物11侧边部分的扩散，并且为细胞培养物提供了营养素，另外同时从载体基质中输运出代谢结束产物。
图7b示出了在后部带有可选补充贮器3(未示出)的培养基贮器2中培养基的连续供给。培养基借助具有分配作用的循环泵5在通过软管系统4以后经过最少一个进料口19进入到生物反应器1中。
培养基通过最少一个出料口19进行排料，其中培养基进入能够通过三通阀6整合到至少一个位置的独立样品采集部8的软管系统4中。
如图中所示，所使用的培养基能够保留在所述循环中，这是因为它进入培养基贮器2中后，被提取出来用于进行移植物11的重复连续灌注。它也可以从循环中被完全移除。然后移植物11分别采用分批或批量加料方法进行培养。
与图7a所示的静态示意图相比较，进入反应室的培养基目标连续加料可以清楚地接近和流过移植物11。这种诱导灌注可以使培养基充分浸渍更深处的结构物区域。这样就最优化了材料交换，进而增强的细胞分化。这种形式的构造物接触流动使埋入细胞得到了剪切力刺激。
实例8
示意性地示出了用于在双室反应器内进行构造物灌注和培养基混合的技术设备。
图8示出了一种双室生物反应器，所述双室生物反应器允许移植物的优化流动、扩散和灌注，由此帮助改进替代组织的质量。
图8a中示出了一种形式的静态培养和扩散。通入生物反应器1中分别的进料口或出料口19最小数目为2，由此它们其中至少一个必须通入下部和上部反应室中。在此所示出的每一个室的两个进料口或出料口19的位置、部位或密度都可以不同以便实现流动性优化。
样品采集部8可以通过三通阀6或类似物连接到两个室中的任意一个排出式路厄连接器上。
除了上部和侧部移植物区域的培养介质扩散以外，首次这样设计的室造成培养基在靠近载体结构底板的区域中从多孔烧结材料中进行扩散，在静态培养过程中这种扩散发生在移植物下面，因此使移植物整体的代谢得到改进。
图8b示出了后部带有可选补充贮器3(未示出)的培养基贮器2中培养基的连续加料。培养基借助具有分配作用的循环泵5在通过软管系统4以后经过最少一个进料口19进入到生物反应器1的上部室和下部室中。培养基通过每个室最少一个出料口19进行排料，其中培养基进入能够通过三通阀6整合到至少一个位置的独立样品采集部8的软管系统4中。
如图中所示，所使用的培养基能够保留在所述循环中，这是因为它进入培养基贮器2中后，被提取出来用于进行移植物11的重复连续灌注。它也可以从循环中被完全移除。然后移植物11分别采用分批或批量加料方法进行培养。
在此所示的位于移植物11下方的本发明中第二室的整合，特别显示出其在生物构造物目标接近流动中的积极特性。如果从培养基贮器2中流出的培养基通过三通阀6转向流到下部室中，那么会产生移植物11的诱导向上的灌注，同时由于培养基只能通过上部出料口离开反应室，下部出料口将被关闭。
与此示意图相类似，三通阀6的切换导致移植物11的通流从上部室经过移植物到达下部室。这里所述的布置不仅导致完全灌注，而且存在于通过施加在细胞上的诱导剪切力并且可以经过循环泵5的大量流动进行调节的其它细胞刺激中。三通阀6还有可能部分或完全开启，从而在生物反应器1中实现更快培养基交换的目的。
实例9
示意性地示出了生物反应器1中移植物11的固定情况。
图9为示出了移植物11在生物反应器1内的固定情况的示意图，而与单室或双室生物反应器无关。
图9a示出了要进行刺激的移植物11被固定在单室生物反应器1中的透明玻璃17上的中间位置。具有最少三个固定壁28的移植物11避免了由于培养基进料流动产生的其在反应器底板上的水平移动，从而能够进行优化灌注和压力刺激。插入反应器1中的生物相容性固定壁28的高度必须低于要施加到移植物11上的压力幅度。
图9b示出了在双室生物反应器中使用至少三个固定壁28，以实现不同流动位置的移植物11的水平固定，因此能够进行理想的垂直灌注和机械压力应用。
实例10
控制微型促动器14的磁体系统
图10示出了用于对在移植物11上的微型促动器14进行无接触可控刺激的特征装置和设备布置(在单室生物反应器中示出)。
图10(磁性控制作用-磁体吸引力)示出了用于移植物11压力形变的生物反应器11中磁性微型促动器14的无接触控制的特征布置和原理。微型促动器14中永久磁体的排列与通过外部安装的控制磁体15所产生的主磁场方向相一致。这些作为至少一个永久磁体或至少一个线圈的控制磁体15产生一个磁场线伸入到整个生物反应室1中的确定的(电)磁场，并且引发了微型促动器14压力冲压机在磁场相关方向的移动。在图10a所示的实例中，控制磁体15使用上述的装置作为例子示出了磁体引力原理。在图10b所示的实施方式中(磁性控制作用-磁体的去除)，磁体的排斥(pushing off)表明了在磁性控制系统15和微型促动器14之间的第二磁性控制作用。控制磁体15磁场方向的改变导致了对移植物11向上导向的微型促动器14移动方向的改变。通过增加出自控制磁体15的性能或磁通量密度，施加到移植物11上的压力载荷会一直增加直到达到体内适应性刺激的目标值。
图10c-10e示出了具有高频率并且能够以循环方式在整套独立的生物反应器1中用于引导微型促动器14的控制元件的布置。
图10c(借助控制磁体导向板控制微型促动器14)示出了永久磁性控制系统的一种实施方式。在这种磁场形式中，不同尺寸和不同极性并因此具有不同磁场强度和方向的多个永久磁体32的布置在一个线性控制导向板31上进行工作，这里把基于上述反应器原型的描述作为一个实例。
由此，线性马达29通过位于磁体保持器31内的永久磁体32驱动导轨30。这种磁体系统的移动方式使得生物反应器1的移动是不必要的。
图10d中的控制系统(借助旋转永久磁体控制微型促动器14)也是基于借助在旋转盘上永久磁体的布置而对磁性压力冲压机14的控制。
因此，伺服马达29驱动包含有交替极性的适应永久磁体32的磁体保持器31。该旋转磁体保持器可包括四个交替极性的磁体32，而且因此为移植物11带来两个完全压力应用的充分旋转。带有磁体的旋转盘的使用结合伺服马达的旋转速率产生了具有更高频率的磁场交变，并且因此在移植物11上产生更强的动态刺激方式。以两个生物反应器1为例，从正视图中清楚地看出了旋转系统上两块磁体的作用。这种装置的实施方式适用于大多数那些只要能够精确的位于控制磁体中央的上方或下方的生物反应器1。
图10e(借助铁芯线圈35控制微型促动器14)示出了基于线圈布置的磁体装置。
该磁体线圈系统使用感应线圈35进行工作，所述感应线圈被固定在生物反应器1上面，可以产生通过供应电源进行恒定调节的确定的电磁场，由此可以使得微型促动器14位于生物反应器构架上的任何位置。电流方向的极性反转导致现有磁场方向和电磁效应的反转。所使用的铁芯线圈35产生了垂直于线圈绕组的电场，并且对微型促动器14的静态永久磁体产生吸引或排斥作用。
该系统的自动站包括一个低发热量的大功率线圈35和通过万用表监控数值的连接可调节变压器。此外，使用微控制器触发一个根据所需方向转换电流的继电器，从而确保细胞构造物所需要的间歇压力应用的效果。
实例11
双室反应器内的刺激方式示意图
图11示出了在新型符合GMP的生物反应器1中的完全刺激方式。因此，在三维形状移植物内并行发生了机械压力刺激、灌注和剪切力诱导的流动。
在图11a中(无机械载荷的灌注刺激)，仅通过培养基的目标接近流动产生对细胞构造物11的刺激，从而产生构造物灌注，施加在μPa范围内的剪切力。所述方法实例示出了培养基通过两个进料口19的连续进料，以提供给每一个反应室并在移植物11中调整到浓度平衡，然后在构造物上产生有关选定体积流量的上部和下部灌注区。使用过的培养基通过两个另外的出料口19排出反应室。由于压力冲压机14通过磁体控制系统15被保持在生物反应器1中较高的位置，在此流动刺激过程中不施加压力。在附图11b中(灌注刺激和冲压应用)示出了包括在生物反应器1中对替代组织材料11进行多重刺激的第二步骤。如此实例所示，在最初调整了流动条件。经过三通阀6，培养基流只进入反应器的下部室，从那里经过移植物11进行灌注，发生材料交换，并且可以通过一个出料口离开反应器上部室。通过反转磁体控制系统的磁极，例如是具有低功率感应的铁芯线圈35，磁性微型促动器14被放置在圆柱形替代组织11上。具有0％构造物形变的冲压机布置表明了具有细胞基质11的动态高频形变量的微型促动器14的返回点。
在所述刺激方法的下一步中，图11c(灌注刺激和机械载荷)示出了由线圈35产生的磁场强度的增加。
磁流密度增大的结果是移植物11的压缩量增至优选类似于体内方法所要求的目标形变量。在已施加所述压力刺激以后，使得在细胞刺激和冲压应用之间产生一个间歇性的转变。同样有可能得到使用所述装置和上述方法的替代材料的静态压缩。在机械加载期间，可以进行通过载体基质的目标构造物灌注以把所需营养素提供给细胞，另外在例如增殖和分化(胞外基质合成)的特定交换期间移除代谢物。
在压力载荷完成后，例如冲压机装置回到起始位置，继续不断地灌注细胞培养物，并且例如如果胞外基质已经完全合成，则移走移植物11。
附图标记一览表
1.生物反应器
2.培养基贮器
3.附加贮器
4.软管系统
5.循环泵
6.三通阀
7.四通阀
8.样品采集部
9.Glu/Lac生物传感器
10.pH，pCO2，pO2测量头
11.移植物
12.细胞/组织
13.支持基质
14.微型促动器
15.控制磁体
16.多孔烧结材料
17.透明玻璃
18.可渗透膜
19.软管联接器/路厄连接器
20.夹紧环
21.反应器锁定装置
22.永久磁体
23.包封体
24.冲压表面
25.接种活塞
26.冲压机
27.滑动板
28.固定壁
29.伺服马达
30.导轨
31.磁体保持器
32.永久磁体
33.流槽
34.延伸旋座
35.线圈

Claims (57)

1、在符合产品生产质量管理规范要求的生物反应器中对具有三维形状、活性和机械抗力的细胞移植物进行培养和刺激的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从生物体中得到并且使用已公知的方法准备用于进行生物反应器培养的外植细胞(12)和包括商业上可获得的生物相容、可吸收或自体或同种材料的载体基质(13)在混合后成为细胞基质悬浮液，
b)将其放置在接种活塞(25)内，如果需要的话，所述接种活塞可以被贴箔且所述活塞具有适于随后在其中硬化或聚合的移植物的截面，
c)如果需要的话，通过一个精确配合的惰性冲压物(26)施加最小量的压力到活塞上，如果需要的话，所述冲压物被构造或贴箔，
d)带有移植物(11)的接种活塞被插入到生物反应器构架的室空间内，
e)来自接种活塞(25)中的移植物(11)被放置在生物反应器底板上的中间位置，并且在移走接种活塞后关闭生物反应器(1)，
f)通过向其中引入灌注流对移植物进行进一步的培养，并且
g)在培养完成后移除替代组织材料用于进一步的使用，
其特征在于，在培养期间，移植物在生物反应器底板的相对面上受到载荷。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述移植物被施加压力的冲压机加载。
3、根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于，均可以相对于与培养条件有关的时间和数量或密度对在生物反应室中由于灌注流引起的混合以及向移植物施加压力的冲压机进行控制。
4、根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述移植物具有每隔一段时间流过其中的有条件的培养基流，并且受到施加压力的冲压机的循环加载。
5、根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在灌注期间产生移植物的压力载荷。
6、根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，通过使用静态，优选类体内压力载荷或构造物形变或通过间歇或动态压力连续加载刺激移植物。
7、根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，施压机械载荷的频率高于0.1Hz。
8、根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，机械压力刺激的形式为对称或不对称的半余弦或正弦波。
9、根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，由磁性材料构成的压力冲压机通过在生物反应器外部产生的(电)磁场纵向移动到生物反应器内的移植物表面上。
10、根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述磁场由至少一块永久磁体产生。
11、根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，至少两个具有交替极性的永久磁体位于生物反应器上的活动保持器上并且由伺服马达循环驱动，由此它们位置的改变导致压力冲压机交变地向移植物施加压力。
12、根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，电磁体线圈的转换改变了其电流和电压方向，并因此改变场的方向和经过生物反应器的高频磁流密度，从而交变地改变了压力冲压机向移植物施加的压力。
13、用于在符合产品生产质量管理规范要求的生物反应器中对具有三维形状、活性和机械抗力的细胞移植物进行培养和刺激的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器(1)的基架与反应器锁定装置(21)在耐压无菌条件下相连接，这样就形成至少一个反应室，其中设置有移植物(11)的贮存空间和微型促动器(14)，所述生物反应器(1)上装配有至少两个用于除充气外的培养基进料和出料的软管联接器(19)。
14、根据权利要求13所述的装置，其特征在于，所述细胞培养构造物(11)可以直接或间接地在单室生物反应器(1)的生物反应器底板上进行培养或刺激。
15、根据权利要求13所述的装置，其特征在于，所述细胞培养构造物(11)直接或间接地，至少部分地位于双室生物反应器的上部反应室的底板上用于进行培养和刺激，同时该移植物(11)位于第二反应室中。
16、根据权利要求14或15所述的装置，其特征在于，所述生物反应器(1)中装配有嵌入上部反应室底板的移植片，细胞构造物(11)可以被放置到移植片上。
17、根据权利要求13-16中任一项所述的装置，其特征在于，生物反应器(1)容器是一个圆柱形主体，所述主体通过反应器锁定装置(21)从上面关闭。
18、根据权利要求13-17中任一项所述的装置，其特征在于，反应器锁定装置单元(21)与生物反应器(1)通过一个螺纹接头和至少一个锥形螺纹接管(20)相连接，使得所述螺纹接头或是在反应器锁定装置(21)和容器(1)之间由容器(1)中的内螺纹和相配合的反应器锁定装置中的外螺纹形成，或是在反应器锁定装置(21)和容器(1)之间形成，其中容器(1)中的外螺纹与反应器锁定装置(21)中的内螺纹相配合。
19、根据权利要求13-18中任一项所述的装置，其特征在于，呈罩盖形式的反应器锁定装置(21)上装配有生物传感器(9)和/或测量头(10)。
20、根据权利要求13-19中任一项所述的装置，其特征在于，所述罩盖(21)上装配有样品采集部(10)。
21、根据权利要求13-20中任一项所述的装置，其特征在于，所述生物反应器(13)的基架具有用于单室生物反应器上软管联接器的供给的至少两个且每个都包括一个进料口和出料口的镗孔。
22、根据权利要求13-20中任一项所述的装置，其特征在于，所述生物反应器(1)的基架具有至少两个用于双室生物反应器上软管联接器(19)的供给的镗孔。
23、根据权利要求22所述的装置，其特征在于，至少一个软管联接器被整合在下部反应室中，且至少一个软管联接器被整合在上部反应室中。
24、根据权利要求21-23中任一项所述的装置，其特征在于，进入生物反应室的进料连接器(19)和出料连接器(19)上装配了带有回流功能的一个三通阀(6)或一个四通阀(7)。
25、根据权利要求24所述的装置，其特征在于，至少一个出料连接器(19)上设有样品采集段(10)。
26、根据权利要求13-25中任一项所述的装置，其特征在于，所述生物反应器(1)具有一块用于监控移植物制备的由完全或部分透明材料制成的反应器底板，优选为一块透明玻璃板(17)。
27、根据权利要求13-26中任一项所述的装置，其特征在于，由抗静电或惰性材料制成的贴箔；绒头织物或膜(18)位于生物反应器(1)的反应底板上以定位移植物(11)，这种材料优选为宽网眼并且对于光、流体和气体具有可渗透性。
28、根据权利要求13-27中任一项所述的装置，其特征在于，在双室反应器中，生物反应器(1)的上部反应室具有对应于移植物区域的区域，同时下部反应室的尺寸小于移植物(11)的尺寸，从而使得如果细胞培养物被放置在中间位置，那么该构造物主要位于下部室的下方，且部分位于上部室的反应底板上。
29、根据权利要求28所述的装置，其特征在于，反应室下面的空间中装填有一块具有生物惰性、透光性、由宽孔隙材料优选多孔烧结材料制成的平板(16)，从而使该平板(16)与上部反应室的底板齐平。
30、根据权利要求28和29所述的装置，其特征在于，由抗静电或惰性材料制成的贴箔、绒头织物或膜(18)位于下部反应室上，所述下部反应室中装填有一块双室生物反应器(1)的上部反应室的反应底板上的平板(16)，这种材料用于定位移植物(11)，优选为宽网眼且允许光、流体和气体透过的材料。
31、根据权利要求28-30中任一项所述的装置，其特征在于，位于双室生物反应器(1)中移植物(11)下方的部件，例如透明平板(17)，带有插入多孔材料(16)的下部反应室和宽网眼膜(18)，它们的总高度不超过商业上可买到的显微镜和照相机物镜的焦距。
32、根据权利要求13所述的装置，其特征在于，一个磁性的，优选活塞式的微型促动器(14)位于生物反应器(1)内，并且可以在一个或更多外部布置的控制和操控磁体(15)的作用下以受控方式移动通过生物反应器(1)。
33、根据权利要求13-32中任一项所述的装置，其特征在于，单室生物反应器(1)中的微型促动器(14)位于膜(18)和生物反应器空间内移植物(11)的上方。
34、根据权利要求13-32中任一项所述的装置，其特征在于，双室生物反应器(1)中的微型促动器(14)位于多孔材料(16)、膜(18)和移植物(11)上方的上部反应器空间内。
35、根据权利要求32-34中任一项所述的装置，其特征在于，要使用的磁性微型促动器(14)包括一个磁性核(22)，优选为一块包封在优选为塑料的生物惰性包封体(23)内的永久磁体。
36、根据权利要求32-35中任一项所述的装置，其特征在于，所述的磁性核(22)如此进行取向，使得磁极间产生的磁场垂直于移植物(11)，从而使整个微型促动器(14)的磁北极朝向向上的方向。
37、根据权利要求32-36中任一项所述的装置，其特征在于，包围磁性核(22)的生物相容性包封体(23)具有与生物反应器(1)的反应室形状相匹配的外形。
38、根据权利要求32-35中任一项所述的装置，其特征在于，选择包封体(23)的全高，使得反应器空间内微型促动器(14)的启用产生对微型促动器(14)的压力冲压机朝向移植物(11)的垂直引导。
39、根据权利要求32-38中任一项所述的装置，其特征在于，所述活塞型微型促动器(14)包括超过一个包封圆柱体，从而使得其中一个包封圆柱体，优选上面的那个包括包封的永久磁体且另一个圆柱体用作冲压机压模(24)，由此这些空间隔离的圆柱体通过一个桥接器(34)或具有相同功能的连接器进行连接。
40、根据权利要求32-39中任一项所述的装置，其特征在于，由所述包封体(23)形成的微型促动器底面上的冲压机平表面(24)沿垂直于生物反应器(1)的方向进行运动。
41、根据权利要求32和40所述的装置，其特征在于，器官型负形式例如凸形被压印在微型促动器(14)的冲压表面(24)上。
42、根据权利要求32和41所述的装置，其特征在于，所述平面或成形冲压表面(24)以网格结构进行压印，从而增大冲压表面，其优选具有小网眼结构。
43、根据权利要求32-42中任一项所述的装置，其特征在于，微型促动器(14)的包封体(24)上设有钻孔和/或流槽(33)，使得微型促动器(14)的连续精确垂直导向在3点处依然得到确保。
44、根据权利要求32-44中任一项所述的装置，其特征在于，微型促动器(14)的冲压表面(24)上装配有至少一个滑入生物反应器构架中与其精确配合的整合导轨内的旋座。
45、根据权利要求32-44中任一项所述的装置，其特征在于，安装在生物反应器(1)外部的控制和操控磁体(15)与定向朝上的永久磁体(22)的磁北极之间产生(电)磁场，使得执行微型促动器产生定向移动。
46、根据权利要求32-45中任一项所述的装置，其特征在于，所述控制和操控磁体(15)位于相对于压力冲压机(14)的垂直轴线上的中间位置，优选位于压力冲压机(14)上方并且由于微型促动器的极性改变而产生上下移动，从而使得施加到移植物(11)上的压力发生改变。
47、根据权利要求32所述的装置，其特征在于，所述控制和操控磁体(15)包括两个具有不同垂直磁极方向的永久磁体(32)，这些永久磁体被插入矩形磁体保持器(31)内，并且借助伺服马达(29)和导轨(30)循环移动到生物反应器上方的它们的水平位置。
48、根据权利要求32所述的装置，其特征在于，所述控制和操控磁体(15)包括最少两个具有不同垂直磁极方向的永久磁体(32)，这些永久磁体位于磁体保持器(31)内，并且由于伺服马达(29)的旋转驱动而循环移动到生物反应器(1)上。
49、根据权利要求32所述的装置，其特征在于，为了增强场的效应并且在移植物(11)上施加更高的压力，所述生物反应器借助步进马达经过磁体保持器(31)的垂直移动，被牢固固定在其水平位置处的生物反应器靠近永久磁体(32)。
50、根据权利要求49所述的装置，其特征在于，在一个站中布置至少两个生物反应器(11)，从而使得其微型促动器(14)被刚好一个永久磁性控制系统以无接触方式进行驱动。
51、根据权利要求32所述的装置，其特征在于，所述控制和操控磁体(15)为一个电磁体，所述电磁体具有至少一个使用已公知方法可以对场进行无级控制的感应线圈(35)。
52、根据权利要求32和51所述的装置，其特征在于，所述感应线圈(35)通过可以改变的频率进行高频触发，以便产生高动态磁场的转换和移植物(11)上微型促动器的移动。
53、根据权利要求13-53中任一项所述的装置，其特征在于，接种活塞(25)，其优选为圆柱形，并且为了注射细胞(12)和载体基质(13)而具有与在移动滑动板(27)上的移植物外径相对应的内径。
54、根据权利要求13-53中任一项所述的装置，其特征在于，所述移动滑动板(27)和接种活塞(25)的内部均覆盖有惰性膜、箔片或聚合物绒头织物。
55、根据权利要求53和54所述的装置，其特征在于，把接种活塞(25)内具有冲压平表面或器官型负形式的精确配合的冲压机(26)轻轻施加到细胞悬浮液上。
56、根据权利要求53-55中任一项所述的装置，其特征在于，所述接种活塞(25)的外径与所述生物反应器(1)的内径精确匹配。
57、根据权利要求13-56中任一项所述的装置，其特征在于，至少三个固定壁(28)被整合在生物反应器(1)的反应器底板中，这些固定壁的尺寸能够适应移植物插入并且不会损害压力压缩。
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