CN102575216A

CN102575216A - 浸泡式灌注生物反应器

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Publication number: CN102575216A
Application number: CN2010800340592A
Authority: CN
Inventors: D·Q·S·勒; J·V·奈加特; M·福斯; F·贝森巴切尔; C·布恩格尔
Original assignee: Aarhus Universitet
Current assignee: Aarhus Universitet
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2010-06-03
Publication date: 2012-07-11
Also published as: US20120171718A1; US8741631B2; AU2010256120B2; AU2010256120A1; EP2438153A1; WO2010139337A1; CA2763928A1; JP2012528576A

Abstract

本发明公开了一种用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，它包括：具有第一表面和第二表面的主体，所述主体由边框界定；位于主体的中心的孔，所述孔在该第一和第二表面处被第一和第二板覆盖，其中该第一和/或第二板包括允许液体基质进入孔中的进料口；用于旋转的装置，所述用于旋转的装置布置在第一和第二板之间的孔中；所述边框包括至少一个凹部，所述凹部是该主体的边框中的空洞，该空洞包括允许液体基质流出主体的第一出料口；连接该圆形孔与该凹部的至少一个出料通道。本发明还公开了一种方法，其中将液体泵送入设备的孔中，并被泵送经过至少一个出料通道。

Description

浸泡式灌注生物反应器

技术领域

本发明涉及用于获得灌注流的设备，例如用于细胞培养，尤其是在三维结构中的细胞培养。此外，还提供了用于培养细胞，特别是在三维结构中培养细胞的方法。本发明还涉及出于组织工程和人造器官的目的使用设备培养细胞的用途。

背景技术

细胞培养是高度复杂的事件，因为为了获得最佳的细胞生长，不同的细胞类型需要不同类型的液体基质以及不同的生长条件。生长条件包括基质的化学组成和流速、机械刺激和电磁刺激。

细胞可以在2D(二维)层中培养，传统上是在组织培养瓶和培养板中培养的。以该方式，细胞呈单层生长，液体基质添加在细胞上方。为了使温度和CO₂水平最优化，将培养瓶和培养皿放置在温箱中。然而，由于单层培养物没有经历与其天然环境相似的条件，因此，对于细胞不是最佳的。为了获得对细胞更天然的环境，可以随着例如氧水平的改变，诱导生长条件的改变。

已通过大量实验显示，在大多数情况下，3D细胞培养比2D细胞培养更近似地模拟了体内状态，尤其是涉及原代细胞时。主要原因是天然环境通常都是3D的。因此，3D细胞培养代表了构建/控制体外复杂生物方法的重要领域。平层细胞和复杂的3D组织之间存在巨大差异(Abbott A，″Biology′s new dimension″，Nature 21：870-872，(2003))。例如，在2D培养中，正常的和恶性的哺乳动物表皮细胞都具有相似的、高水平的柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)。但在3D培养中，仅恶性细胞具有CAR的上调(Anders M等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 100，1943-1948，(2003))。

此外，胚胎干细胞(ES)增殖的细胞培养实验和在3D支架中的分化也显示出比2D培养中更大的细胞增殖和分化(Willerth SM等人，“Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonicstem cells into neural lineage cells”，Biomaterials，27：5990-6003，(2006))。

对于成体干细胞，例如人间充质干细胞(hMSC)，已证实3D培养对于干细胞在体外的成骨潜力比2D常规培养更优秀(Machado CB等人，“3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenicdifferentiation of mesenchymal stem cells”，Biomed.Mater.2：124-131，(2007)；Grayson WL等人，“Human mesenchymal stem cells tissuedevelopment in 3D PET matrices”，Biotechnol Prog.，20(3)：905-12，(2004)；3D Culturing is Superior to 2D Conventional Culturing in Examining TheOsteogenic Potential of Stem Cells In Vitro，3D Biotek，LLC，NorthBrunswick，NJ，675US Highway 1，North Brunswick，NJ 08902，http：//3dbiotek.com/Documents/3DScaffold Osteogenesis.pdf)。

即使在2D中分化是成功的，但在临床应用中的用途是受限的，因为所形成的胞外基质结构有别于天然的组织形态。

为了获得可用于组织工程目的的正确分化的细胞，已开发了使用多孔支架的不同的3D培养方法。

3D培养需要增加流向细胞的营养物和氧气流的手段，和从位于支架中心的细胞去除废物的手段，而简单灌注不足以运输超过约200μm的距离(Ko HCH等人，“Engineering thick tissues-the vascularisationproblem”，European Cells and Materials，14：1-19，(2007))。

可以通过使瓶-所谓的旋转瓶-中的细胞旋转来实现向支架中心充分的运输，例如EP 1736536A2中描述的。细胞附着在支架上，然后被安置在装有液体基质的旋转瓶中。用磁力搅拌棒或带柄叶轮使基质相对于支架运动，提供增强营养物/废物与固定支架交换的对流手段。该液体移动效应增加了对附着细胞的剪切力，已知剪切力是影响细胞分化的。

这一培养方法的主要缺陷是没有充分或均匀的灌注支架。此外，由于每个支架周围的粘性流体场依赖于支架在瓶中实际的空间位置，故当在一个瓶中培养8个以上的样品时，就难以获得一致的结果。这是该方法的一个缺点，因为增加了灌注设施的整体占位面积。

由于对流而增加的质量运输限于靠近支架表面的体积。支架内部仍然依赖于灌注。而增加的剪切压力对细胞分化的作用，也局限于分布在支架表面上的细胞。

其他方法包括对可以位于培养架底部的小支架灌注流，液体基质穿过支架从而以连续的方式供应营养物(Cartmell SH等人，“Effects of MediumPerfusion Rate on Cell-Seeded Three-Dimensional Bone Constructs inVitro”，Tissue Engineering，9(6)：1197-1203，(2003)；Bancroft GN等人，“Technical Note：Design of a Flow Perfusion Bioreactor System for BoneTissue-Engineering Applications”，Tissue Engineering，9(3)：549-554，(2003))。然而，这些方法具有极大的缺陷。对于灌注流，设备本身是不理想的，因为为了维持液体基质的恒定流动，需要大量的管子。此外，在温箱内安排了大量的设备，如泵和瓶子，因而占据了大量宝贵的温箱支架空间。

灌注支架的另一种方法是将支架置于微控的线性驱动活塞上，然后使它在含基质的容器中往复上下移动(Timmins NE等人，“Three-Dimensional Cell Culture and Tissue En-gineering in a T-CUP(Tissue Culture Under Perfusion)”，Tissue Engineering，13(8)：2021-2028，(2007).))。该系统不能消除对设置管的需求，并且包括了大量的装配部件。此外，虽然可以计算经过支架的平均液流，但在每个支架之间的不均一性导致了不均一的灌注。

发明内容

本发明的目标是创造减少上述问题的细胞培养方法。因而，本发明的目的是创造一种紧凑的设备，该设备设置(建立，放置)简单，而不需要用以获得灌注系统的外部泵送机构(机制)。

本发明通过提供一种用于生物学目的的设备解决这些问题，所述生物学目的例如为细胞培养、酶促反应或流体过滤，其中，该设备包括：

-主体，该主体具有第一和第二表面，所述第一和第二表面之间限定主体的厚度，其中所述主体由边框界定；

-位于主体的中心的孔，所述孔在第一和第二表面处被第一板和第二板覆盖，其中第一和/或第二板包括允许液体基质进入孔中的进料口；

-用于旋转的装置，该装置在第一和第二板之间布置在该孔中；

-所述边框包括至少一个用于细胞培养的凹部，所述凹部是主体的边框中的孔洞，它包括允许液体基质流出主体的第一出料口，所述边框包括第一壁，该第一壁沿着所述孔洞限定所述凹部；

-至少一个出料通道，该出料通道连接该圆形孔与该用于细胞培养的凹部。

根据本发明的主体和主体的孔优选为圆形形状。然而，如果需要横跨凹部的不均匀的液体流，则其他形状也是有利的。

在整个文本中，细胞是所有微观和细观生物学单位的公共名称：原核细胞、真核细胞、原生动物、幼虫、蠕虫及其卵。此外，同一术语也用于经历封装、聚集等的细胞。

一个设备可含有一个或多个凹部。凹部通过出料通道与主体中的孔连接。液体基质在被允许通过第一出料口流出主体之前，通过位于第一和/或第二板的进料口进入主体的孔中，并流经出料通道和凹部。

出料口存在于布置在孔的一侧的第一板上，而第二板布置在孔的另一侧以阻止液体基质流过该孔。任选的，为了获得最佳流动，进料口的横截面积可以显著小于孔的横截面积，但大于出料通道与孔连接处的横截面积。

该设备可以由聚砜、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或其他通常用于所述目的的相似材料制成。其他可用于设备的材料是注射可塑性陶瓷或复合材料。设备的不同部分可以由不同类型的材料制成，例如，主体可以由聚砜制成，而用于旋转的装置可由

制成。

此外，该设备可由可生物降解的材料制成。藉此，有或无支架的培养细胞可以以植入保持在该设备或该设备的一部分中。凹部留在人体或动物体内，但将经历受控的降解。

作为备选，可以更改将培养细胞的凹部表面。为了使细胞直接附着在凹部上，这可以如用于细胞培养瓶的常规方式或如文献中所报道的来实施。以该方式，能够在凹部和不同类型的支架中直接生长细胞。此外，可以将表面处理成不仅诱导细胞的附着，而且影响细胞并促进细胞的增殖或分化。作为实例，生长因子和/或激素可以与表面直接的或通过包被而可逆地结合，并在使用或不用支架培养的过程中影响细胞。

在有利的实施方案中，用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备还包括用于使所述设备在含有液体基质的容器中可靠地居中和水平(变水平，处于水平状态)的装置。

为了获得均匀的液流，设备需要相对于容器在静止的位置居中和水平。这可以通过例如向设备添加小的紧固件来实施，所述紧固件能将设备定位在容器内并避免它相对于例如磁场移位。这或者可以通过在设备的主体和含液体基质的容器侧面之间彼此相对地安放至少两个紧固件来实施。或者，可以在设备的主体和含液体基质的容器底部之间布置一个或多个紧固件，即，保持主体相对于例如磁场就位，但仍然允许该主体自由旋转。

此外，如果用于旋转的装置由磁体构成-该磁体由布置在含液体基质的容器下方并因而在设备下方的磁搅拌器起动，则由磁搅拌器产生的磁场可具有能自动将磁体设置在孔的中心的强度。因此，保持该设备处于相对于磁场的同一位置，且不干扰不同通道中液流的均一性。

术语“含液体基质的容器”在此理解为任何烧杯、箱子、瓶子、板、罐等，它们与该设备相关联地使用以便使本发明正确行使功能。

在整个说明书中，术语“边框”理解为主体的外边缘。边框可以是在主体的第一出料口与第一和第二表面之间的固定边框，或者该边框可以是部分开放的。

表面可以是在使用中覆盖主体的顶部和底部的平面表面，或者表面可以至少部分的与部分出料通道和凹部形成一体。第一和第二壁至少部分地与至少一个凹部的所述第一壁的一部分以及所述出料通道的一部分形成一体导致沿着凹部形状的出料通道的形状是表面的部分形状，因而导致表面的形状不是平面的。

在有利的实施方案中，所述第一和第二表面是基本平行的，这使得设备的主体具有沿着该主体的均匀的厚度。

在有利的实施方案中，第一和/或第二板是设备的一体部分。

设备的孔两侧都被板覆盖。一个板含有使液体基质进入设备的进料口。这些板可以是细胞设备的一体部分。由此消除了污染细胞培养设备的风险，因为多个部件会产生多个沟槽而增加例如真菌或细菌的生长可能。

在另一个有利的实施方案中，用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备是容器的一体部分。这进一步减少了要处理和组合的部件数，因为设备不再在添加液体基质前放入容器内。在其他有利的实施方案中，在已经将支架或细胞布置到设备中并将液体基质倒入容器中之后，在容器的开口处为容器安装盖子。减少待组合的部件数以及进一步在容器开口安装盖子减少了污染的风险。

术语“容器”理解为任何容器、器皿、Petri皿、烧杯、瓶子等，它能容纳液体基质，并覆盖低于液体基质的设备以使液体基质能被泵送入设备的液体入口中。

在其他有利的实施方案中，用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备沿着与所述第一或第二板基本平行的平面分为两个部件：顶部部件和底部部件，其中所述平面还划分了所述至少一个凹部和所述至少一个出料通道。

本发明还描述了这样一种用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，该设备包括两个部件，即底部部件和顶部部件，其中所述底部部件和所述顶部部件可以装配到主体中，所述顶部部件包括：

-第一表面，位于该第一表面中的第一孔，所述第一孔被第一板覆盖，其中该第一板包括允许液体基质进入该孔中的进料口；

-构成凹部的一部分的隧道形截面的上部部分，其中所述隧道形截面布置成从所述顶部部件的边缘向内延伸；

-连接第一孔与所述至少一个凹部的至少一个出料通道的上部部分；

所述底部部件包括：

-第二表面，位于该第二表面中的第二孔，所述第二孔被第二板覆盖；

-与所述上部部分中的所述凹部的尺寸和形状对应的、至少一个凹部的下部部分；

-连接第二孔与所述至少一个凹部的至少一个出料通道的下部部分；

其中所述顶部部件和所述底部部件包括用于装配的装置，

-由此所述至少一个凹部的下部部分叠放在所述至少一个凹部的上部部分上，而所述至少一个出料通道的所述下部部分叠放在所述至少一个出料通道的所述上部部分上，其中所述第一和第二孔叠放形成一个孔，用于旋转的装置布置在该孔中。

在其他有利的实施方案中，底部部件一体形成在容器中。

在该实施方案中，设备包括两个部件-底部部件和顶部部件。可以通过沿着位于设备主体的第一和第二表面之间的平面-即穿过主体的边框的平面-分隔该设备来形成这两个部件。优选的，在第一出料口处将主体、即第一和第二表面之间的厚度分成两半。然而，只要细胞和/或支架被方便的安放在凹部的下部部分中，也可以进行其它分隔。

底部部件包括使用中的凹部的下部部分，使用中的第二板、第二表面和出料通道的下部部分或部分下部部分，以及使用中的孔的下部部分，所述孔中可以任选的安放用于旋转的装置。作为有利的实施方案，设备的底部部件一体形成到容器的底板中，因而如前所述与容器一体形成。

顶部部件包括使用中的凹部的上部部分，使用中的进料口、第一板、第一表面、出料通道的上部部分或部分上部部分，以及使用中的孔的上部部分。

凹部的上部部分是从所述顶部部件的边缘向内延伸的隧道形截面。此外，凹部的下部部分是从所述底部部件的边缘向内延伸的隧道形截面。该顶部部件的隧道形截面与底部部件的下部部分的大小和形状对应，从而通过叠放隧道形截面的上部部分和下部部分形成凹部。所形成的凹部形成了由顶部部件和底部部件的边缘限定和/或在所述边缘之间的主体边框处的第一出料口。

因而隧道形截面的大小和形状定义了凹部的大小和形状。隐含理解为凹部的大小和形状仅以这样的方式对应，所述方式使得顶部部件和底部部件的装配形成了凹部的上部部分与下部部分的平滑交叉(跨越)。

底部部件和顶部部件的装配因而获得具有第一和第二表面的主体，所述表面包含由第一孔和第二孔叠放形成的孔，其中所述孔被第一板和第二板覆盖。通过存在于第一板中的进料口泵入液体，使之通过旋转装置进入孔中。主体还包括至少一个出料通道，所述出料通道通过叠放分别来自顶部部件和底部部件的上部部分和下部部分形成。此外，主体包括至少一个凹部，所述凹部通过叠放形成凹部的上部部分的上隧道形截面和形成凹部的下部部分的下隧道形截面形成。所形成的出料通道使该孔与凹部流体连接，液体可以通过由隧道状截面形成的第一出料口离开主体。

第一板和/或第二板可以是主体的一体部分，或者它们可以与所述部分连接。在有利的实施方案中，进料口可以是小管，通过该小管液体被泵入孔中。向顶部部件添加小管减轻了在装配过程中对顶部部件的操作。

在有利的实施方案中，底部部件和顶部部件包括用于将这些部件相互装配的装置，所装配的方式使这两个部件即使在旋转过程中也是稳固的。这类装置可以是：弹簧锁、磁性锁、螺钉和螺纹、压配合和/或在装配这两个部件时接合到开口中的突起。每个设备上存在的装置的数量足以保持两个部件在旋转过程中在一起。因而，如果转速高且接合只是表面的，则存在多种装置，而在每种装置都紧密配合的情况下才只存在少数装置或一个装置。作为备选，这两个部件也可以通过其他方法组合，例如使用胶粘或焊接使两个部件连在一起。

有利地，所述装置可以多次打开和关闭，以便允许在实验过程中接近细胞和/或支架以及能够多次重复使用该设备。

该两部件式-即包括顶部部件和底部部件-设备按下列方式使用。将支架和/或细胞安放在底部部件的凹部中，将旋转装置安放在孔的下部部分中。之后，将设备的顶部部件与底部部件相装配。然后，如果底部部件不是容器的一体部分或者如果在安放支架之前底部部件没有安放在容器中，则将装配好的设备安放在容器中。将液体基质倒入容器中，直到超过覆盖容器，之后开始旋转，液体可以通过进料口并通过细胞和/或支架。

或者，如果第一或第二板没有分别一体形成在顶部部件和底部部件中，则可以在装配底部部件和顶部部件后安放用于旋转的装置。

该两部件式设备使得易于接近凹部、用于放置和去除细胞/支架的孔以及用于旋转的装置。这使得对设备的操作更简单且快速，因而减少了污染的风险。此外，该实施方案使得操作过程更易于自动化。

作为其他有利的实施方案，该设备可以作为含三个部件的试剂盒提供：一体形成在容器中的底部部件、安放在底部部件上方的顶部部件和安放在容器顶部上的盖子。

此外，说明一种制造用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备的方法，其中所述设备是模制的，例如注射模制或吹塑模制。

设备可以用不同类型的塑料以及可注射模制的陶瓷或复合材料制成。模制是制造顶部部件和底部部件的经济上有益的方式，任选的还制造容器和盖子，尤其是如果部件是由单一一片材料形成的。此外，可以通过模制将底部部件一体形成到容器中。

在其他有利的实施方案中，用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备还包括外部装置，该外部装置与所述外部装置或出料通道所在的主体的凹部接合，并且包括进料口和第二出料口以及所述进料口和所述第二出料口之间的液体连接，所述外部装置是由第二壁限定的三维形状的元件，所述第二壁定义了所述外部装置的外表面。

将设备与外部装置组合是有利的。藉此，可以在与主体本身组合之前，将含有细胞的支架或细胞本身导入外部设备装置中。这尤其对于操作的目的是有利的，因为必须旋转主体，并使其呈一定角度而将支架或细胞接合到设备的不同凹部中。

此外，在实验过程中，可以通过去除一个外部装置和添加一个新外部装置来改变外部装置。这样，能够实施时间解析的实验，其中细胞受相似的细胞生长条件的影响。

外部装置可以通过压配合配合到凹部中。作为优选的实施方案，外部装置沿着外侧边框含有凸缘。藉此，外部装置可以插入到凹部中的特定位置。此外，借助于凸缘，更易于拆卸外部装置。作为其他实施方案，可以与外部装置一起提供用于松开外部装置的特定设备。此外，在另一个实施方案中，设备包括用于将外部装置固定到主体上的外部装置。

在其他有利的实施方案中，外部装置包括外螺纹，其中当外部装置与凹部啮合时，所述外螺纹与设置在内部装置的内螺纹啮合。

与外部装置和凹部之间的压配合连接相反，螺纹可以布置在凹部的内侧和外部装置的外侧。这样，外部装置和凹部组合。为了执行将外部装置与中心孔的出料通道接合，出料通道的螺纹可以是阳螺纹或阴螺纹，外部装置则反之。有利的是让所述螺纹具有

的形状。这在一些实验中是优选的，以便使外部装置和凹部彼此完全附接。此外，两个部件的分开和结合比压配合更可靠和更易于操作。

或者，可使用如http://www.tiresias.org/research/reports/clasps.html上所示的滑动锁扣(slide-lock clasp)设计或齿扣(tooth clasp)设计来固定外部装置以及两个平行的板。

在其他有利的实施方案中，为在支架上导入表层剪切压力，可将用于细胞培养的外部装置设计成允许沿所含支架的周边流动。用于细胞培养的外部装置的这种修改将极大减少支架体积内的灌注流速。这一布置将模拟离心瓶培养的效果，但具有更高的可重复性和小得多的装置占位面积。

在其他有利的实施方案中，出料通道是锥形的，其中锥形出料通道的最小横截面与孔相关联。在更有利的实施方案中，出料通道的锥形与至少部分的凹部和/或至少部分的外部装置相连续，所述部分的凹部和/或所述部分的外部装置接触出料通道。

通过将出料通道的形状由具有恒定横截面积的窄通道变为锥形通道，防止了大量紊流。出料通道以狭窄的开口始于孔，然后尺寸持续增加，直到在出料通道和细胞培养的凹部之间的边界处等于细胞培养的凹部的大小为止。液体基质的流动经历了横截面积的梯度增加，与使用窄通道的设备时的扰动增加相反。因而，防止了紊流。

紊流可以影响细胞培养物的生长模式，细胞培养物在3D培养的不同位置受到不同的影响。因此，可以产生不均匀的生长模式以及不均匀的细胞分化。用于例如组织工程目的的接种细胞的支架的整体质量下降。此外，更难以获得细胞培养研究的可重复性。

优选的，锥形形状延续的比凹部和出料通道之间的边界更远。该锥形形状可以以连续的方式延续至第一或第二出料口，或留下第一出料口之前的一部分凹部或第二出料口之前的一部分外部装置(无锥形形状)。留下没有锥形形状的部分适应于例如安排在所述凹部中的支架或外部装置的大小。因而，所有离开孔和流向支架的通路，液体基质经过的横截面都以锥形的方式增加。

可以基于液流和在装载支架或间断的表面重塑过程中降低截留气泡的风险来优化孔和通道的形状。可以实施计算机流体动力学(CFD)计算以确保锥形通道的最佳几何学。也可以针对其中非均匀液流是有利的特定应用来调整液流。

在有利的实施方案中，可以通过将进料口与一个或多个插入物接合来调节进料口的大小。

由旋转装置在中心产生的低压影响液体基质通过主体孔的流动。液体基质流动的一个决定性因子是进料口的尺寸。通过调节进料口的大小，调节了进入孔的流速，从而调节了通过出料通道和细胞培养物的流速。

可以以多种方式调节进料口，例如，通过向进料口中设置不同尺寸的插入物。或者，可以通过一体形成在进料口中的装置来连续地改变进料口。可以通过利用百叶窗式机构改变进料口以便逐渐减小或增大进料口来实施对进料口的改变。可以在实验过程中调节流速，因而可以实施更加动态的实验以便优化细胞的生长。

有利的，进料孔可以包括用于连接外部装置以便例如在线测量流量的装置、中央外部装置或者团注基质装载。所述在线流量测量仪器可以包括简单的倒置式超低液流转子流量计，该流量计具有比液体基质轻的浮子。

在有利的实施方案中，大的外部装置可以与设备主体的第一平行板的中心进料口接合。因而进料口成为低压沉箱(接收器)。这种布置对大型支架或对液体基质分布到支架前进行调试是有利的，其中所述支架位于细胞培养或凹部的外周。通过调试，可以想象一群降低基质氧张力或分泌信号分子的接种细胞被运送到外周支架上，诱导分化或增殖。

在其他有利的实施方案中，凹部和/或外部装置包括调节出料口大小的第一调节机构。

还可以通过改变第一和/或第二出料口的大小来调节细胞生长和分化。如果完全关闭第一和/或第二出料口，则没有基质能够流过细胞培养物。如果仅关闭第二出料口，则主体内的压力水平增加。因而向细胞提供了增加的流体静压。可以以该方式影响细胞增殖和刺激某些细胞培养(Angele，P等，“Cyclic hydrostatic pressure enhances the chondrogenic phenotype ofhuman mesenchymal pro-genitor cells differentiated in vitro”，Journal ofOrthopaedic Research 21(3)：451-7，(2003))。

可以通过使第一和/或第二出料口具备连续或逐步调节大小的能力来控制压力。这对于动态细胞培养是非常有利的。

可以通过例如具有不同大小直径的插入物-所述插入物可以与第一和/或第二出料口组合，或者通过自动调节-例如可以受如微处理器控制的百叶窗式件，来手动或自动控制出料口。作为其他实施方案，微处理器还可以实现对压力的测量。藉此，在自动开放第一和/或第二出料口以最终减小压力之后，或者直到经过一定时间之后，可以诱导出某些压力极限。然后，可以再次关闭或近乎关闭第一和/或第二出料口，并再次增加压力。藉此，可以向细胞提供随时间改变的流体静压。

还可以单独调节或部分地简单通过改变旋转装置的转速和/或形状来调节细胞的流动和流体静压。实施例2示出借助于计算机流体动力学如何通过旋转装置的形状来调节压力。

在其他有利的实施方案中，用于旋转的装置是磁性的。

作为用于旋转的装置的优选形式，可以使用磁体。磁体导入到主体的孔中。可以通过将设备放置在磁搅拌器上方来使磁体旋转。

磁体的大小和形状可以使它能在主体的孔中自由旋转，或受孔的内边框影响而影响转速。转速还可以受所选材料的类型的影响。

虽然自由旋转，但磁体的大小和形状可以对位于凹部或外部装置中的细胞所经历的液流产生影响。长度仅略小于中心孔直径的磁搅拌棒将产生以两倍于转速的频率通过出料通道的间歇性流动波。该脉冲将以不同于恒流的方式刺激细胞，而细胞在机械上应被视为是粘弹性的。因此，脉冲流能够激活导致分化的通路。另一方面，较小的快速旋转的磁体可以产生通过通道的相同流速，但具有更高的打击频率。此外，还可以以不同的方式改变磁体的形状以便产生脉动流。实施例2中示出这样一个实例。

或者，可以提供不同的旋转装置。可以在设备的孔中插入带轴的叶轮。藉此，通过离心力产生通过出料通道的液体基质流动。

可以设计具体用途的叶轮，带轴的或者磁性的，以使液体基质从孔向每个出料通道的流动对于每个叶轮/搅拌棒的解析时间段而言是随时间变化的。因而，为出料通道创造了改变的压力和流动，并获得通过细胞培养物和/或支架的具有可控频率的周期性流动。这一效应对于培养例如进行成骨分化的MSC或培养内皮细胞是有利的。可使用CFD仿真来确定所述具体用途的磁搅拌棒或叶轮的形状以及用于产生理想脉冲形状的最佳转速。

此外，可以设置这样的装置，在该装置中不仅旋转液体基质以便产生低压，而且还旋转主体。

在其他有利的实施方案中，主体包括用于产生电场的装置。

电场以各种方式影响细胞(Robinson KR，“The response of cells toelectrical fields：A review”，The Journal of Cell Biology，101：2023，(1985))，例如提供促进细胞增殖或分化(Sauer H等，“Effects of electricalfields on cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells”，Journalof Cellular Biochemistry，75(4)：710，(1999))。因而，电场对于一些用于促进细胞例如胚胎干细胞的生长和分化的细胞研究是有利的。可以通过在凹部和/或外部装置的附近引入磁性颗粒或线圈来感生电磁场。附加地或替代地，在设备的某些区域中可以包括导电材料如碳颗粒或导电聚合物。

电场强度在0.2-4kV/m之间，优选在0.5-2kV/m之间，最优选约1kV/m。

在其他优选实施例中，凹部和/或外部装置包括用于保留支架的装置。

通过将细胞附着在3D支架上，更易于实施细胞培养和促进细胞在3D培养物中增殖和分化。支架可以是各种类型、各种材料，例如壳聚糖、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D；L-乳酸)(PDLLA)、聚(D，L-乳酸共聚乙醇酸)(PLGA)、聚(乳酸共聚己内酯)(PLCL)、聚(乙醇酸共聚己内酯)(PGCL)、聚(丁酸共聚戊酸)、纤维素、丝纤蛋白、玉米醇溶蛋白、Trabecular

(钽)、钛网、烧结的羟磷灰石、磷酸三钙、珊瑚或任何其他的天然材料。也可以使用任何上述材料的组合。支架可以具有不同的多孔性，从例如50％至99％，并根据培养的细胞类型以及将成为的组织类型具有各种弹性模量。

然而，对于所有不同类型的支架而言，关键是支架不会在培养的过程中例如由于流动的原因而移动。当液流通过支架时遇到阻力，可能推动支架随液流移动。最坏的情况是由于液流的推动，支架被推离设备。此外，支架不能被推动太远而进入凹部是有益的。

可能的装置可以是脊或小凸缘，它们使支架保持在给定的位置上。

支架的大小保持在1mm3-1000cm3之间，优选在4mm3-1000cm3之间。大小和形状取决于培养的细胞类型和待分化的组织类型。支架可以是任何几何形状，包括立方形、长方形、柱形、锥形、三棱镜形、金字塔形、正四面体形。

在整个文件中，术语“支架”理解为具有3D结构的任何材料或材料组合物。该结构能够支持细胞的增殖和分化，以及支持细胞、蛋白质例如酶、碳水化合物、RNA、DNA、脂质微囊、纳米颗粒的附着。支架可以进一步是生物药和非生物药二者的药物递送载体。

此外，可考虑多孔支架作为大于孔径的颗粒的过滤材料。

在其他有利的实施方案中，两个或多个设备可以用其基本平行的表面叠放，其中设备被间隔件分隔，所述间隔件附装在设备上。间隔将可以与设备形成一体，或者在设备外部，或者是设备的一部分(即，主体、平行的板、进料口适配器或用于细胞培养的外部装置)。

通过不同设备之间的间隔件可以有利地连接更多的设备。这样，使每个设备中用于旋转的装置旋转，并将液体基质运输通过设备，运至凹部或外部装置。藉此实现将多个支架保持在相似的条件下。液体基质是相同的，并且对获得可重复的实验高度优选的条件也是相同。此外，也保持该扩展设置的占位面积最小化，节省了宝贵的温箱支架空间和昂贵的液体生长基质。不同设备之间的间隔件可以是可拆卸地附接的，或者可以是一个设备的一体部件，之后与另一个设备连接。

在仍然有利的实施方案中，进料口包括连接装置，所述连接装置连接外部隔间与所述进料口，所述外部隔间包括具有给定浓度指示剂的指示剂溶液。

可以通过将一外部隔间连接到设备的进料口来计算通过进料口加入设备的孔中的液体基质的流速。外部隔间通过连接装置连接到主体上，所述连接装置理解为能够可逆地将隔间的开口与进料口的接合以避免泄漏的任何装置，例如隔间内的所有溶液进入设备的孔中。此外，外部隔间必须由本身不泄漏的材料制成。

作为连接装置的实例，第一板可以包括一个或多个凸缘，所述凸缘将与轴环(颈环，collar)一起插入外部隔间的开口内，它可以连接并紧固至外部隔间的外侧以便防止泄漏。在另一实施方案中，外部隔间通过橡胶塞密封，该橡胶塞可以在与进料口连接时被大孔针头刺穿。

外部隔间包括指示剂溶液，其中指示剂具有给定的浓度。指示剂优选是便于测量的溶质，该溶质不会导致基质粘度或密度的可察觉的变化。实例是荧光染料、吸附染料、盐、酸和碱、糖等。

由于各批次的支架的特征可能不同，为了能够获得正确的流体测量，重要的是使用与进行后续实验的支架相同批次的支架进行校准。

在另一有利的实施方案中，可以使用指示剂染料、光源和相机/摄像机校准流速。通过测量指示剂填满出料通道花费的时间，可以计算中心孔的流体输出。如果至少设备的上部部分是透明的，而出料通道是可见的，则是有利的。如果设备的下部部分具有使其更易于追踪指示剂运动的光学特性，则对该方法而言是更有利的。优选但并非必需的是，出料通道具有易于计算的简单几何学。

在仍然更有利的实施方案中，第一和/或第二壁是部分中断的。

凹部和/或外部装置的壁的中断导致除第一出料口或第二出料口外，凹部和/或外部装置的额外开口。优选的，该额外开口足够大，允许支架或类似物插入凹部和/或外部装置中。

有益的，额外的开口布置在主体的进料口的同侧。当设备置于液体基质中或恰好位于平面表面上时，将其安放成使进料口指离所述表面。然后可以从顶部以及侧面通过第一出料口以及第二出料口给设备装载支架。这使设备能够更快速地装载支架，以及更易于正确的放置在凹部和/或外部装置中。当通过第一出料口或第二出料口装载支架时，仅当设备经操作并转向每个待放置的支架时才可以。使得第一出料口和/或第二出料口能以更向上的位置定位的转向涉及对设备的大量操作。这增加了污染的风险以及使已放置在设备中的支架从正确的位置移开的风险。

此外，当出料通道向第一出料口开放时，凹部的额外的开口允许从顶部而非侧面将外部装置装载到主体中，这当使用小的培养容器工作时是有利的。此外，额外的开口可以不从第一出料口延伸至出料通道，而只延伸至离开第一出料口一定距离，在此情况下，可以从主体的顶部装载部分外部装置，然后将其余的外部装置推入凹部中。为了正确且快速的将外部装置插入凹部中，这是有益的。

在仍然进一步有利的实施方案中，用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备进一步包括用于递送药物的装置，例如用于将一分送系统连接到优选处于所述第二板中的至少一个小开口的装置，所述至少一个小开口与所述孔相连接。在仍然进一步有利的实施方案中，用于递送药物的装置包括包埋在浸出材料中的药物溶液，优选所述浸出材料附着在与所述孔相连接的第二板上。

术语“药物”在此理解为任何类型的化合物，所述化合物通常根据设备的使用添加。它可以是药物、生长因子如细胞因子、激素，或在基于纳米颗粒的药物递送系统中的药物。该化合物可以作为单一化合物或作为多个化合物的混合物添加。可以通过一个或多个伸入设备的孔中的入口添加化合物。这些入口可以布置在一个或多个下列位置：第一板、第二板、孔的侧面。入口可以连接到包含管的分送系统、包含目标化合物或最终化合物的混合物的容器以及用于通过管将化合物从容器移动到设备的孔以使化合物与液体基质混合的装置。用于移动化合物的装置可以是例如泵。

可以以连续的方式或脉冲的方式将化合物添加到设备的孔中。可以通过例如向分送系统添加基于微处理器的功能或机械计时功能来实现化合物的脉冲递送。

或者，化合物可以包埋在安放在一个或多个位置的浸出材料中，所述位置例如为第一板、第二板或邻接设备的孔以将材料浸析到液体基质中的的侧部。作为备选，可以将包含液体流入开口的插入物置入主体的进料口中，具有包含一种或多种化合物的浸出材料靠近孔。作为进一步的备选，化合物和浸出材料可以是例如第一或第二板自身的一部分。

化合物从浸出材料的释放可以是缓慢的或快速的，取决于使用的浸出材料的类型。浸出材料的实例是例如聚二甲硅氧烷(PDMS)、可腐蚀的聚合物(例如，PLGA)、层状硅酸盐亦即粘土、凝胶和水凝胶。

由于体积差异，当添加到孔时，为了获得给定浓度所需的化合物的量小于添加到液体基质时的量，通过入口或通过浸出材料直接添加化合物是有益的。

在其他有利的实施方案中，凹部和/或所述外部装置是透明的。

至少一部分凹部或外部装置的材料可由无色、透明的材料制成，优选具有低的细胞附着性。当仅一部分凹部或外部装置由无色、透明的材料制成时，该放置支架的部分是主体中清楚的。这帮助研究人员在不明显干扰或终止计划的条件下目测检查支架和例如所培养支架的细胞克隆的进展。

在其他有利的实施方案中，第一和/或第二壁至少部分地包括多孔材料。在其他仍然有利的实施方案中，所述外部装置的进料口包括调节出料口大小的第二调节机构。

至少一部分的第一或第二壁，例如凹部的壁和外部装置的壁，由互连的多孔材料制成，所述材料有益的是惰性的和非吸附的，例如纤维或纳米纤维网、烧结的金属、玻璃、聚合物珠子或多孔膜例如ePTFE、聚砜、赛璐珞。这就增加允许基质通过支架和通过第一和/或第二壁外流的支架周围空间。例如，仅外部装置的壁由互连的多孔材料制成，而凹部的壁不是。在此情况下，液体基质的流动将终止于主体的边框处。这将帮助营养物更好的分布在培养支架中。

在其他有利的实施方案中，支架周围的空间不直接与培养基交界，而可通过设备主体上的一个或多个端口接近。这对于用支架培养上皮细胞例如肝细胞、分泌性哺乳动物细胞或肾小管细胞是有益的，所述上皮细胞的端部和基底部具有不同的胞吐和胞吞功能。由于与培养细胞的基底部更密切的关系，因此认为在细胞周围空间中的基质具有与灌注基质不同的组成。主体的端口使得能对支架周围空间中的基质进行采样和调节。

凹部的第一出料口和/或外部装置的第二出料口可以是开放的、部分开放的或关闭的，例如通过第一调节机构的调节。藉此，可以控制经过支架和壁的液体基质的流出量。当第一出料口或第二出料口完全关闭时，所有的液体基质都流过支架和壁。第一出料口和/或第二出料口开放越大，则越多的液体基质从第一出料口和/或第二出料口流出，而越少的液体基质流过支架和壁。

此外，可以通过具有与第一调节机构相似特征的第二调节机构来将外部装置的进料口调节为开放的、部分开放的或关闭的。作为备选，进料口可以以非调节方式部分或完全关闭，所述非调节方式为外部装置的设计，或者是通过将小的插入物例如塞子插入到进料口中以将它关闭。藉此，可以将液体基质流导入外部装置的第二壁中，之后进入支架中，从而产生基质向支架内的流入。此类构型可以提供支架内更好的营养物和细胞分布。

在其他有利的实施方案中，用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备包括用于自动化机械操作的装置，例如设备内或设备上的用于固定、定位和鉴别以使得能进行机械操作的标记。这些机械操作包括例如与气动或电动夹子的机械接合以用于将设备从一站移向另一站、自动检查细胞培养物、自动更换基质、自动接种支架和支架卸载。

此外，描述了这样的方法，其中将用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备置于液体基质中，所述设备包括：

-主体，该主体具有在它们之间限定的主体厚度的第一表面和第二表面，其中所述主体由边框界定；

-位于主体中心的孔，所述孔在第一和第二表面处被第一板和第二板覆盖，其中第一和/或第二板包括允许液体基质进入孔中的进料口；

-用于旋转的装置，所述用于旋转的装置在第一和第二板之间设置在所述孔中；

-所述边框包括至少一个凹部，所述凹部是主体的边框中的空洞，它包括允许液体基质流出主体的第一出料口，该边框还包括沿着所述空洞界定所述凹部的第一壁；

-至少一个连接圆形孔与凹部的出料通道；

-任选的，与凹部接合的外部装置，所述外部装置包括进料口和第二出料口以及所述进料口和所述第二出料口之间的流体连接，所述外部装置是由第二壁界定的三维形状的元件，所述第二壁限定了所述外部装置的外表面；

-凹部中或外部装置中的支架；

其中液体基质由于旋转装置的旋转而通过进料口被泵送入主体的圆形孔中，并被泵送经过至少一个出料通道、经过凹部和/或外部装置中的支架，并通过第一和/或第二出料口被泵出。

此外，提供了这样的方法，在该方法中在将支架放在凹部或外部装置中之前或之后，将细胞接种在支架内或支架上。

本发明描述的设备通过简单的装置运行。将包括细胞的不同类型的支架或没有支架支撑的细胞放入凹部或外部装置中。之后，降低设备到低于例如烧杯中的液体基质中。为了避免气泡与进料口和孔关联，小心地降低设备。气泡的形成将通过阻断液体基质通过进料口流入或阻断从孔流出并进入一个或多个出料通道，而阻碍液体基质连续流动。

然后，起动用于旋转的装置，产生主体的孔内的中心低压。将液体基质泵入孔中，经过出料通道并经过细胞。藉此向细胞连续提供新鲜的液体基质，并为即使三维培养物充分的供应营养物和氧。

当使用磁搅拌器驱动磁搅拌棒或叶轮时，重要的是使设备在磁搅拌器的基板上居中。否则磁搅拌棒或叶轮的旋转不一致，使流动打折扣。因此，在其他有利的实施方案中，设备将包括用于可逆地确保中心孔在含液体基质的容器中的理想位置的一体的或外部的装置。该装置可以是例如安装在主体周围的侧向间隔件或挡板的形式。借助于这些装置，可以确保容器之后牢固地定位在磁搅拌基座上。

所述设备的简单应用和构建使设备也能用在小的温箱中。因此，该温箱可以方便的用于低氧温箱中。在此，可以在更类似于生理条件的条件下培养细胞，所述条件中的氧张力低于环境条件的氧张力。

作为另一实例，因为由非机械力传递导致的叶轮磁搅拌棒的旋转，可以将小尺寸的设备方便地放在气密性密封的容器中。藉此，可以进行实验室规模例如超临界CO₂水平的催化进程以及用不同水平的压力进行细胞培养研究。

此外，该设备可以放在气密性密封的容器中，以便避免运输过程中的污染。

此外，描述了这样的方法，在所述方法中将蛋白质固定在支架上，所述蛋白质能与经过支架的液体基质的组分相互作用。在该方法中，蛋白质可以是酶，所述酶与底物分子相互作用，所述底物分子是经过包含酶的支架的液体基质的组分。额外的，在该方法中，蛋白质可以是抗体、抗原或配体，所述抗体、抗原或配体与细胞相互作用，所述细胞是作为经过包含抗体的支架的液体基质的组分。

由于用于旋转的装置，液体基质经过凹部和/或外部装置以及经过支架。因而，液体基质的任何组分都经过支架，以及与支架上固定的蛋白质接触，从而受影响。

此外，在无细胞应用中，在支架上固定螯合剂，所述螯合剂能与溶解在通过支架的液体基质中的离子或较大分子相互作用。

将酶固定在支架上使酶与液体基质流接触，因而与液体基质的组分接触。被固定在支架上的酶所催化的分子可以被例如酶切割而改变。液体基质循环增加了代谢的底物分子的百分比。

用于促进细胞附着的固定组分对从液体基质中纯化细胞而言是有利的。固定的组分可以是细胞表面蛋白-不论是或不是细胞特异性的，或其他细胞附着蛋白的配基，如钙粘着蛋白、含RGD或IKVAV的蛋白质，例如纤粘连蛋白、波连蛋白、层粘连蛋白、胶原、骨桥蛋白。

此外，描述了这样的方法，在所述方法中通过该用于旋转的装置使该主体旋转。

旋转用于旋转的装置在孔内产生了低压，并产生了连续的液体基质流动。然而，可以增加旋转以包括整个设备。藉此，将细胞也暴露在离心力下。细胞的效应对某些细胞类型的增殖和分化是有益的。

此外，描述了这样的方法，所述方法中用于旋转的装置包括磁体，所述磁体放在圆形孔中，且其中磁体借助于外部旋转磁场旋转，例如由所述磁搅拌器形成的磁场。

作为用于旋转的装置的优选形式，可以使用磁体。该磁体插入到主体的孔中，所述孔可以优选为圆形。与主体相关联地，将磁搅拌器设置成使设备中的磁体能够旋转。大部分的磁搅拌器能够控制磁体的转速。为了实施稳定的、连续的流动，磁体的旋转优选高于120转/分。流量优选为0-0.8ml/min(毫升/分钟)，更优选为0.2-0.8ml/min。

此外，可以以时间依赖性的方式控制磁体。例如，可以控制它旋转两个小时，然后再停止旋转两个小时，之后再次旋转一个小时。因而，可以获得通过细胞的停止-运动流。还可以设置相对于时间行为更复杂流动的液流，例如，线性流动增加/减少。

此外，描述了这样的方法，在所述方法中通过以下步骤测量泵送经过所述进料口的基质的流速(流量)：

-连接包含含第一浓度C₁指示剂的指示剂溶液的外部不泄漏隔间与进料口处的连接装置；

-允许所述指示剂溶液泵送到所述孔中，并被泵送经过至少一个出料通道；

-在给定时间dt后，测量给定体积V的所述液体基质中的所述指示剂的第二浓度C₂；

-通过公式计算所述流速Q，所述公式是Q＝-(C₂＊V)/((C₂-C₁)＊dt)。

用于校准通过支架的流速的方法是基于指示剂稀释技术的，所述指示剂稀释技术是根据例如临床心输出测量已知的。对于该实例，包含给定浓度C₁的指示剂溶液的外部不泄漏隔间通过具有可忽略的流体动力学阻力的通道与进料口连通。叶轮的旋转将导致指示剂溶液的整体不依赖时间的流动Q₁，该溶液经过进料口、向下游经过支架并最终进入基质浸泡的Superfreac。以一定间隔对具有确定的起始体积V₂的浸泡基质取样，并确定指示剂的浓度。然后通过

Q＝-(C_2，dt V₂)/((C_2，dt-C₁)dt)

计算进料流速，其中dt是从流动开始到取样指示剂浓度C_2，dt的时间。

重要的是，含指示剂溶液的隔间不对指示剂溶液产生任何混淆性压力-既不由于重力，也不由于隔间壁两侧的静水压差异。出于这些原因，在整个校准程序中，容器壁优选是高度柔性和松弛的。

此外，描述了这样的方法，在所述方法中基质被泵送经过所述凹部和/或所述外部装置的壁。

支架是三维结构。液体基质从出料通道向第一出料口或第二出料口的流动导致以单向方式经过支架的流动。液体基质在整个支架的分布因而不是均匀的。在实例中，在支架内将培养细胞的条件下，均匀的液体基质流动对向每个细胞提供相似和最佳量的氧和营养物是关键性的。强迫液体基质向其他方向流动使液体基质能够到达支架的最远的角落，所述方向例如与从出料通道向第一出料口和/或第二出料口的直接流动或多或少垂直的方向。

为了获得上述液体基质的择一流动，凹部的互连的多孔壁与关闭或部分关闭的出料口一起将引导液体基质从出料通道向凹部壁的孔流出。相似的，外部装置的互连的多孔壁与关闭或部分关闭的第二出料口一起将引导液体基质从出料通道至少部分的向外部装置的壁流出。如果凹部的壁也由互连的多孔材料形成，则液体基质通过这些壁的流动也将是连续的。然而，如果凹部的壁不由多孔材料制成，则液体基质将沿着外部装置流动，并流出第一出料口，同时部分液体基质将通过外部装置的互连的多孔壁进入，经过支架并流出第二出料口，如果所述第二出料口是部分开放的。

液体基质经过支架的流动可以由上述的流出变为流入。这可以通过将包含互连的多孔壁的外部装置插入凹部中来产生，其中外部装置的进料口是关闭的或部分关闭的。藉此强迫液流进入外部装置和凹部支架的空间内。由于外部装置的互连的多孔壁，液体基质之后渗透到外部装置中，并在它通过第二出料口流出前经过支架。

本发明还涉及如前所述用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备的使用，其中所述设备用于获得灌流流动。此外，本发明涉及用于培养细胞或从液体中纯化细胞的设备的使用。此外，如前所述的设备的使用，该设备用于培养3D培养物。

该设备可用于获得可重复的细胞培养研究。流动使液体基质在烧杯内部循环，因而增加营养物和氧气的扩散速率，促进细胞在3D培养物中的增殖和分化。此外，液体基质的循环不必须使用泵，因为用于旋转的装置是该系统中的泵。

此外，用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备可用于从液体中纯化细胞，只要将恰当的支架放在凹部中。含有细胞的液体是通过进料口直接添加，或者该含有细胞的液体是放入了设备的液体基质。当液体基质经过出料通道并经过插入到凹部或外部装置中的支架时，细胞附着到支架的表面。附着到支架上的细胞可以是特定类型的细胞，或能够附着的所有细胞。特定类型的细胞可以通过例如在支架表面连接特定类型的抗体来附着。作为实例，可以将Stro-1或CD44抗体连接到支架上，并用于附着到来自骨髓的MSC。

待纯化的液体可以例如为血液，从该血液中可以纯化例如干细胞。在该情况下，支架是具有100-200μm的孔径的生物相容性聚合物，包含相互连通的多孔性。

总体上说，与含细胞的液体接触的设备表面不含有具有能充分结合细胞的特性的材料理所当然是必须的，因为否则细胞将粘附在暴露的表面而非支架上。因而，可以用例如疏水性聚氟乙烯丙烯或硅酮处理暴露的表面。

液体基质经过细胞的持续流动导致细胞可以在3D培养物中生长。藉此，可以生长用于组织工程的细胞，如用于肝、骨骼和软骨修复和/或替换的组织。

作为实例，可以以下列方式实施对骨的修复：用干细胞或骨前体细胞接种合适的支架。将支架置于外部装置内，并将所述外部装置放入凹部中，或者将支架直接放在凹部中。将磁体放在主体的孔内，然后将设备降低到含液体基质的烧杯中。将烧杯安放在CO₂温箱内的磁搅拌器上方，起动该磁搅拌器。液体基质经过支架流动，细胞随时间增殖并分化成矿物化培养物。在一定时间后，从设备中移出支架，并可以将所述支架转移到患者的骨骼/骨结构中。

此外，本发明涉及用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备用于整体处理支架的用途。

根据设备的材料，用于整体处理支架或其他具有多孔特征的组分的液体基质可以是酸、碱、有机溶剂、盐溶液等。在整体处理的过程中，支架内的任何组分例如在支架形成中剩余的都被冲出。

此外，本发明涉及设备用于酶促反应的用途，其中固定的酶作用于液体基质提供的蛋白质。

为了作用于经过支架的液体，可以将细胞或酶固定在支架上。可以通过共价连接、吸附、包埋在聚合凝胶中、与双官能试剂交联或如KlibanovAM，“Immobilized enzymes and cells as practical catalysts”，Science219：722-7，(1983)所述的封闭进行固定。酶或细胞的固定增强了方法的效率，例如蛋白质的切割。

在本申请中，术语“液体基质”用于描述实现通过设备的流动的液体。液体基质可以是适合给定状态的任何类型的液体。作为实例，当培养细胞时，液体基质优选是细胞培养基，一般考虑特定的细胞类型。

此外，本发明涉及设备的使用，其中通过流经支架来过滤用于术后自体灌注的失血。

藉此，失血被引导经过支架从而纯化了血液。优选的，使用具有约40、80和/或200μm的孔径的支架。

附图说明

图1示出主体的顶侧视图；

图2示出具有进料口的第一板；

图3示出主体的侧视图；

图4示出主体的顶视图；

图5示出温箱内的设备；

图6示出压力室内的设备的主体；

图7示出培养在静态条件下(7A)和本发明设备内(7B)的支架上的hMSC-tert细胞；

图8示出磁搅拌器的标准形状(8A)和磁搅拌器的第二形状(8B)；

图9示出标准磁搅拌器的压力变化(9A)、磁搅拌器的第二形状的压力变化(9B)和中心动脉压波形(9C)；

图10示出附装到主体上的外部的、不漏式隔间；

图11示出当外壁包括多孔材料时，液体基质的流动；

图12示出两部件形式的设备，它包括从顶部(A)和底部(B)看去的底部部件，从顶部(C)和底部(D)看去的顶部部件，以及已装配的设备(E)。

具体实施方式

图1示出设备的主体1的顶侧视图。在该具体实施例中，主体1中的孔3布置在降低的环形孔5中。该主体1的边框7中具有八个凹部，其中五个9可见于附图中。此外，在主体1中的孔3中可以看到出料通道11。在主体1的表面13上，设置有四个孔15。这些孔15能够与销啮合，所述销可以彼此上下地组合多个设备。

在降低的孔5内侧可见四个开口17。这四个开口17确保与第一板21的开口19啮合。图2中可看到第一板21的一个实例，其中示出顶侧视图。第一板21可以通过例如螺钉附装到主体1上，该螺钉通过第一板21的开口19和主体1的开口17。图2进一步示出进料口23，液体基质可以通过进料口23进入主体1的孔3中。

图3示出主体1的侧视图。在主体1的边框7处可见凹部9。此外，孔3与出料通道17一起示出，所述出料通道使孔3与凹部9结合。此外，在主体1的两侧都可看到降低的孔5。第一和第二板21可以插入这些降低的孔5中。或者，第一和第二板21可以是主体1的一体部分。除进料口以外，第二板优选与第一板类似，进料口优选只存在于第一板21上。

图4示出主体1的顶视图。孔3可以在圆形主体1的中心看到。此外，在主体1的边框7处示出八个凹部9。还示出出料通道17。出料通道17集成在设备的主体1中，因而不与周围环境接触。为了获得正确的流动和避免被例如细菌和真菌污染，出料通道17的集成是关键的。

在图4中的主体1的下方，示出外部装置25。该具体实施例是外部装置25的压配合形式，此外，它包括沿着外部装置25的外边框29的凸缘27。支架可以插入该外部装置25中，并在存在凸缘27的部位朝向边框29布置。优选的，边框29上的第二出料口的形状设计成使支架装载到主体凹部的过程中截留气泡的风险最小化，同时仍然支持支架的放置并阻止该支架沿流31的方向移动。这对于高速流应用场合是特别重要的，在所述应用场合中施加到支架上的力变得显著。

在图4中，用于旋转的装置示出为磁体30，该磁体填充孔的开口，并具有两个转动叶片，所述转动叶片在旋转的过程中使出料通道17和孔3之间的通路被释放以用于液体基质的移动，或者使之关闭以便没有液体基质能够移入出料通道17中。因此，在磁体30的转动过程中产生随时间改变的液流。

图5示出该设备在CO₂温箱33内的构造。在CO₂温箱33中，磁搅拌器35布置在架子37上。在磁搅拌器的顶部放置有烧杯39。烧杯39中存在液体基质41以及三个设备43、45、47。第一设备47安放在烧杯39的底部。第一设备47与第二设备45通过间隔件49连接，第二设备45与第三设备43通过另一间隔件51连接。以此方式，可以叠放多个设备，并使之在单个烧杯39中旋转。设备43、45、47都在其孔中包括了磁体。该磁体受到由磁搅拌器35产生的磁场的影响，因此在每个设备中都产生液流。虽然磁场强度随距磁搅拌器的距离快速减小，但只要磁搅拌器棒的磁矩足以以期望的转速(RPM)驱动它们，则通过所有叠放设备的液流都将是相同的。为使系统发挥正确的功能，使液体基质覆盖所有的设备是关键的。

图6示出放在压力室53内的设备。设备的主体55放在压力室53内。磁搅拌器57位于压力室外侧，从而可以转动设备的中心孔中的转动装置，并产生通过出料通道的液体基质流。

图7A和7B示出在静态条件下培养的细胞的实例(7A)和使用本发明的设备培养的细胞的实例(7B)。通过融合纤维沉积建模(Syseng，Germany)，编织了具有

＝10mm、h＝6mm的尺寸和93％的多孔度的多孔聚已内酯(PCL)支架。突出的纤维表现出约170μm的厚度，并以0.8mm的间距放置。为了增加亲水性，用1.25M NaOH处理支架16h(小时)，之后用EtOH梯度处理。

将八个支架插入到外部装置中，并放在6孔板的孔中，每个孔放一个支架。在6孔板的孔中直接放4个支架(对照)，每个孔放一个支架。之后按每个支架2x10⁶细胞的浓度接种hMSC-tert细胞(Simonsen JL等人，“Telomerase expression extends the proliferative life-span and maintainsthe osteogenic potential of human bone marrow stromal cells”，NatBiotechnol.，20(6)：592-6，(2002))。

将细胞留在CO₂温箱中2小时，使细胞附着。之后，向支架中添加7.5mL的细胞培养基(DMEM中含10％胎牛血清)。

第二天，将对照支架移到新的6孔板中，而将放在外部装置中的支架放置在设备中。向对照中添加每孔15mL基质，每周更换一次基质。用细胞培养及处理所有12个支架，所述培养基是添加了10nM维生素D的含10％胎牛血清的DMEM。

在研究细胞生长前培养细胞2周。将支架切成薄片，并用苏木精和伊红染色，之后研究附着在支架上的细胞的形态学。静态培养的细胞表现出具有延长的细胞的成纤维细胞样形态，而在导入本发明设备的外部装置中的支架上培养的细胞具有更大的核和更加成骨细胞样的形态，如图7A和图7B分别所示。支架示出为白色部分。

在图8中研究旋转装置的形状，并使用计算机流体动力学研究它对在支架前构建压力的影响。数字化地生成两种凸轮式设计。一种模拟图8A所示的标准磁搅拌器(59)。第二种形状(61)是从描述中心动脉压波形的数据拟合的曲线生成的，如图8B所示。

流体室的3D几何学是在Comsol(COMSOL 3.5a，COMSOL Inc，Stockholm，Sweden)中通过2D几何学近似的。通过Chen等人以Circulation，95：1827-1836，(1997)测量的中心动脉压波形是通过

R2008b(The MathWorks Inc.，Natick，MA，USA)中的样条曲线分两段近似的。将该曲线从笛卡尔坐标向极坐标进行坐标转换以便生成接近的曲线，从而确定叶轮的一次转动等价于动脉压波形的两个时段。它的振幅换算为适合流体室空腔，而完整的几何结构是按Comsol装配并如所示离散的。

图8示出离散的2D空间，其中两种不同的旋转装置形状解决了Navier-Stokes难题。

然后，通过在两个关联坐标系、静态的参照系和包括旋转装置的旋转系统中使用Comsol的有限元方法数字地解决不可压缩的Navier-Stokes偏微分方程。叶轮的旋转设定为60rpm，而水的性质应用于流体区域。边界在入口/出口边缘模制开口，暗示在描述结构和流体之间的界面的所有其他边缘都没有滑动条件。而对于两种情况，位于支架前面的上边缘上的压力变化则与所测量的中心动脉压波形一起绘制在图9中。图9A示出标准磁搅拌器的压力变化，图9B示出磁搅拌器的第二形状的压力变化，而图9C示出中心动脉压波形。

藉此已证实，支架前的相对压力变化显示为可受旋转装置的形状控制。通过使形状最优化，可以诱导支架内的细胞上的压力场，相对模拟了在一个心动周期产生的压力波动。

图10示出用于校准设备63的流速的设置。设备63布置在烧杯65中并浸泡在具有给定体积的液体基质67中。设备63以主体示例，该主体包括出料通道69、凹部71和孔73，该孔73中安放有磁体75。外部隔间77连接在连接装置79、81上并与进料口83相连。在该具体实施方案中，连接装置79、81包括两个优选为环形的部件。第一部件81包括与主体71的第一表面87接合的扁平环85。该扁平环85还包括垂直于扁平环85的凸缘89，其中该凸缘89通过插入外部隔间77的开口内侧而与外部隔间77接合。外部隔间77的外侧固定有连接装置的第二部件79。第二部件79优选是环，它可以在固定到连接装置上后收紧。这保证外部隔间与进料口83的连接防止泄漏，从而防止外部隔间的溶液流到孔73以外的任何地方。

为进行流动校准，计算液体基质67的体积、外部隔间77内所含溶液中的指示剂的浓度以及给定时间后液体基质67中的指示剂的浓度。起动孔73中的磁体75，将溶液从外部隔间77泵送至孔73中，使之通过出料通道69、通过凹部71并进入液体基质67中，在该液体基质中溶液被稀释。有益的是，用于校准的设置与实验中的设置相似。

图11示出入流机构的一个示例，其中液体基质通过壁93穿透外部装置91。凹部95包括其中插入支架97的外部装置91。液体基质99(由箭头示出)通过出料通道101流入凹部95中，但未直接进入外部装置91，因为进料口103是关闭的。相反，液体基质99沿外部装置91流动，并通过外部装置91的互连的多孔壁93进入外部装置91和支架95中。液体基质99通过第二出料口105离开支架95和外部装置91。

图12示出两部件形式的设备，包括从上部(A)和下部(B)观察的底部部件，从上部(C)和下部(D)观察的顶部部件及已装配的设备(E)。

底部部件107在图12A中以顶视图示出，在图12B中以底视图示出。底部部件107是容器109的一体部分，它包括外边框111和盖子(图12E中示出)。设备的底部部件107包括被第二板114覆盖的底部孔113，该第二板与出料通道115和凹部117的下部部分流体连接。出料通道115和凹部117形成纵向分开的锥形，该锥形的最小直径最接近底部孔113。在凹部117之间的区域中存在开口119。

与之互补的，设备的顶部部件121在图12C中以顶视图示例并在图12D中以底视图示例。顶部部件121包括出料通道123和凹部125的上部部分，这些部分与顶部孔127流体连接。出料通道123和凹部125形成纵向分开的锥形，该锥形的最小直径最接近顶部孔127。在凹部125之间的区域中存在突起129。此外，图12C中示出被第一板128覆盖的进料口131，该进料口131与顶部孔127流体连接。

暗示地理解，顶部部件121上可以存在开口119，而底部部件107上存在突起129。此外，可以理解，虽然开口119和突起129存在于凹部117、125之间的每个空间中，但它们也可以存在于例如每两个(每隔一个)或每三个(每隔两个)空间中，只要顶部部件121和底部部件107可以牢固连接以便在旋转过程中不分离即可。在该附图中，用于装配两个部件的装置是突起和开口，然而，可以理解，用于装配的装置也可采用其他形式。

图12E示出已装配的设备/主体135。装配底部部件107和顶部部件121，由此获得具有第一和第二表面的已装配设备135，所述表面包括由第一孔127和第二孔113叠加成的孔，其中所述孔被第一板128和第二板114覆盖。利用旋转装置通过存在于第一板128上的进料口131将液体泵送入该孔中。已装配的设备135还包括至少一个出料通道，所述出料通道由分别来自顶部部件121和底部部件107的上部部分125和下部部分115叠加而成。此外，主体135包括至少一个凹部，该凹部通过将形成凹部的上部部分123的上部隧道形区段和形成凹部的下部部分117的下部隧道形区段叠放而成，所述区段的尺寸和形状相互对应，从而形成第一出料口。所形成的出料通道使孔与凹部流体连接，液体可以通过由隧道形区段形成的第一出料口离开该主体。

在使用过程中，支架置于底部部件107的凹部117中，底部孔113中设置有磁体。然后，例如通过压配合使突起129进入开口119中以便布置设备的顶部部件121，并形成如图12E所示的已装配的设备135。将液体基质倒入容器109中，并将盖子133放在容器109的顶部。容器109的边框111显著高于设备135，即，组装顶部部件121和底部部件107以使基质明显高于已装配的设备135。

Claims

1.一种用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，该设备包括：

-主体，该主体具有第一表面和第二表面，所述第一和第二表面之间限定主体厚度，其中所述主体由边框界定；

-位于该主体的中心的孔，所述孔在第一和第二表面处被第一和第二板覆盖，其中该第一和/或第二板包括允许液体基质进入该孔中的进料口；

-用于旋转的装置，所述用于旋转的装置在第一和第二板之间布置在该孔中；

-所述边框包括至少一个凹部，所述凹部是主体的边框中的空洞，该空洞包括允许液体基质流出主体的第一出料口，第一壁沿着所述空洞界定所述凹部；

-连接该孔与该凹部的至少一个出料通道。

2.根据权利要求1的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述第一和第二表面是基本平行的。

3.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，该设备包括用于使该设备在含有液体基质的容器中居中和水平的装置。

4.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，第一板和/或第二板是设备的一体部分。

5.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述设备是容器的一体部分。

6.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述设备沿着与所述第一或第二板基本平行的平面分为两个部件，即顶部部件和底部部件，其中，所述平面还划分了所述至少一个凹部和所述至少一个出料通道。

7.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述设备还包括外部装置，该外部装置与所述外部装置所在的主体的凹部接合，该外部装置包括进料开口、第二出料开口以及所述进料开口和所述第二出料开口之间的流体连接，所述外部装置是由第二壁界定的三维形状的元件，该第二壁限定所述外部装置的外表面。

8.根据权利要求7的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，该外部装置包括外螺纹，其中当该外部装置与凹部接合时，所述外螺纹与设置在内部装置中的内螺纹接合。

9.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，出料通道是锥形的，其中锥形出料通道的最小的横截面区域与该孔相关联。

10.根据权利要求9的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，出料通道的锥形形状与凹部的至少一部分和/或外部装置的至少一部分相接续，所述凹部的部分和/或所述外部装置的部分与出料通道相接触。

11.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，进料口的尺寸可以通过将该进料口与一个或更多插入物接合来调节。

12.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，凹部和/或外部装置包括用以调节出料开口的尺寸的第一调节机构。

13.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，用于旋转的装置是磁性的。

14.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，该主体或该设备包括用于产生电场的装置。

15.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，凹部和/或外部装置包括用于保持支架的装置。

16.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，可以将两个或更多设备利用它们的基本平行的表面叠放，这些设备通过间隔件分隔，所述间隔件附装至该设备。

17.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述进料口包括连接装置，所述连接装置将外部隔间连接到所述进料口，所述外部隔间包括具有给定的指示剂浓度的指示剂溶液。

18.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述第一和/或第二壁是部分中断的。

19.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述设备还包括用于递送药物的装置，例如用于连接分送系统与至少一个小开口的装置，该小开口优选在第二板上，所述至少一个小开口与所述孔相关联。

20.根据权利要求1-19之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述用于递送药物的装置包括包埋在浸出材料中的药物溶液，优选所述浸出材料附着在与所述孔相关联的第二板上。

21.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述凹部和/或所述外部装置是透明的。

22.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述第一和/或第二壁至少部分地包括多孔材料。

23.根据权利要求7的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备，其特征在于，所述外部装置的所述进料开口包括用以调节该进料开口的尺寸的第二调节机构。

24.一种在液体基质中使用根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备的方法，所述设备包括：

-主体，该主体具有第一和第二表面，该第一和第二表面之间限定主体厚度，所述表面基本平行，其中，所述主体由边框界定；

-位于该主体的中心的孔，所述孔在第一和第二表面处被第一和第二板覆盖，其中该第一和/或第二板包括允许液体基质进入孔中的进料口；

-将该孔与所述至少一个凹部相连的至少一个出料通道；

-任选的，与凹部接合的外部装置，所述外部装置包括进料开口、第二出料开口以及所述进料开口和所述第二出料开口之间的流体连接，所述外部装置是由第二壁界定的三维形状的元件，该第二壁限定所述外部装置的外表面；

-在凹部中或在外部装置中布置支架，其中，液体基质由于旋转装置的旋转而通过进料口被泵送入主体的孔中，并被泵送经过至少一个出料通道、经过和/或围绕凹部和/或外部装置处的支架，并通过第一和/或第二出料口被泵送出。

25.根据权利要求24的方法，其特征在于，在将支架布置到凹部中或外部装置中之前或之后，将细胞接种在该支架中或该支架上。

26.根据权利要求24的方法，其特征在于，在支架上固定蛋白质，所述蛋白质能与通过支架的液体基质的组分相互作用。

27.根据权利要求26的方法，其特征在于，该蛋白质是酶，所述酶与底物分子相互作用，所述底物分子是通过和/或围绕包含酶的支架的液体基质的组分。

28.根据权利要求26的方法，其特征在于，该蛋白质是抗体，所述抗体与细胞相互作用，所述细胞是通过包含抗体的支架的液体基质的组分。

29.根据权利要求24-28之一的方法，其特征在于，用于旋转的装置包括磁体，所述磁体布置在孔中，其中，通过来自例如磁搅拌器的外部旋转磁场使该磁体旋转。

30.根据权利要求24-29之一的方法，其特征在于，通过以下步骤测量泵送经过所述进料口的基质的流速：

-在进料口处向连接装置附装外部隔间，该外部隔间包括指示剂溶液，该指示剂溶液包括具有第一浓度C1的指示剂；

-使所述指示剂溶液被泵送到所述孔中，并被泵送经过至少一个出料通道；

-在给定时间dt后，测量给定体积V的所述液体基质中的所述指示剂的第二浓度C2；

-通过公式计算所述流速Q，所述公式是Q＝-(C2＊V)/((C2-C1)＊dt)。

31.根据权利要求24-29之一的方法，其特征在于，将所述基质泵送经过所述凹部和/或所述外部装置的壁。

32.根据前述权利要求之一的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备的使用，其特征在于，该设备用于获得灌流流动。

33.根据权利要求32的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备的使用，其特征在于，该设备用于培养细胞或从液体中纯化细胞。

34.根据权利要求32的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备的使用，其特征在于，该设备用于培养三维培养物。

35.根据权利要求32的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备的使用，其特征在于，该设备用于整体处理支架。

36.根据权利要求32的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备的使用，其特征在于，该设备用于酶促反应，其中固定的酶作用于由液体基质提供的蛋白质。

37.根据权利要求32的用于生物学目的例如细胞培养、酶促反应或流体过滤的设备的使用，其特征在于，通过流经支架来过滤用于术后自体灌注的失血。