CN111630150A - 细胞培养装置和使用其的细胞培养方法 - Google Patents

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CN111630150A CN201980009861.7A CN201980009861A CN111630150A CN 111630150 A CN111630150 A CN 111630150A CN 201980009861 A CN201980009861 A CN 201980009861A CN 111630150 A CN111630150 A CN 111630150A
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萩原昌彦
原田崇司
松林昭博
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Abstract

本发明提供一种细胞培养装置，其特征在于，其具备：培养容器；收纳于前述培养容器且具有1个以上的培养基流出流入口的旋转式聚合物多孔膜收纳部；以及收纳于前述旋转式聚合物多孔膜收纳部的聚合物多孔膜，此处，前述聚合物多孔膜为模块化聚合物多孔膜，前述旋转式聚合物多孔膜收纳部以独立于前述培养容器的方式旋转。

Description

细胞培养装置和使用其的细胞培养方法
技术领域
本发明涉及具备聚合物多孔膜的细胞培养装置。此外，涉及使用了具备聚合物多孔膜的细胞培养装置的细胞培养方法。
背景技术
近年来，治疗、疫苗所使用的酶、激素、抗体、细胞因子、病毒(病毒蛋白质)等蛋白质使用培养细胞进行工业生产。但是，这种蛋白质的生产技术在效率方面存在课题，这会对必须持续且广泛供给的生物医药的及时且稳定的供给造成影响。因此，为了确立有效、稳定且迅速的蛋白质生产方法，寻求高密度地培养细胞的技术、高效率连续生产法等使蛋白质的产量增大那样的革命性且简便的技术。
作为产生蛋白质的细胞，有时使用粘附于培养基材的支架依赖性的粘附细胞。这种细胞以支架依赖性的方式进行增殖，因此，需要使其粘附于培养皿、板或腔室的表面来进行培养。以往，为了大量培养这种粘附细胞而需要增大用于粘附的表面积。然而，为了增大培养面积，必然需要增大空间，其成为在有效生产、制造量的改善中产生课题的主要因素。
作为减小培养空间且大量培养粘附细胞的方法，开发了使用具有微小多孔的载体、尤其是微载体的培养法(例如专利文献1)。使用了微载体的细胞培养体系为了使微载体不会相互聚集而需要充分搅拌/扩散。因此，需要能够使分散有微载体的培养液充分搅拌/扩散的容积，因此，能够培养的细胞的密度存在上限。此外，为了将微载体与培养液进行分离，需要利用能够筛分细微粒的过滤器使其分离，其也会成为使生物医药的生产率降低的原因。从这种状况出发，寻求稳定且简便地培养大量附着细胞的革命性的细胞培养方法论。
<聚酰亚胺多孔膜>
聚酰亚胺多孔膜在本申请之前被用于过滤器、低介电常数薄膜、燃料电池用电解质膜等尤其是以电池相关为主的用途。专利文献2～4特别记载了具有多个大孔隙的聚酰亚胺多孔膜，其气体等物质的透过性优异、空孔率高、两个表面的平滑性优异、强度相对较高，虽然空孔率高，但对膜厚度方向上的压缩应力的耐力仍然优异。它们均是利用酰胺酸而制作的聚酰亚胺多孔膜。
报告有一种细胞的培养方法，其包括将细胞应用于聚酰亚胺多孔膜来进行培养(专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003/054174号
专利文献2：国际公开第2010/038873号
专利文献3：日本特开2011-219585号公报
专利文献4：日本特开2011-219586号公报
专利文献5：国际公开第2015/012415号
发明内容
发明要解决的问题
为了培养大量的动物细胞，需要使培养基持续性地溶存有大量的氧。作为使氧溶存于培养基的方法，有搅拌培养基的方法、鼓泡的方法。然而，动物细胞大多存在不抗剪切力、细胞在搅拌培养方法中死亡的问题。此外，在通常的将磁力搅拌器与搅拌子加以组合的搅拌培养方法中，在培养容器与搅拌子的接触部分，细胞被碾碎，难以大量培养细胞。此外，在进行鼓泡的培养方法中，存在细胞因鼓泡时产生的泡沫而死亡的问题。
用于解决问题的方案
本发明人等发现：具有规定结构的聚合物多孔膜不仅提供能够大量培养细胞的最佳空间，而且在产生剪切力的搅拌条件、产生泡沫的培养条件下也能够大量培养细胞，由此完成了本发明。即，虽然不限定于此，但本发明包括以下的技术方案。
[1]一种细胞培养装置，其特征在于，其具备：
培养容器；
收纳于前述培养容器且具有1个以上培养基流出流入口的旋转式聚合物多孔膜收纳部；以及
收纳于前述旋转式聚合物多孔膜收纳部的聚合物多孔膜，
此处，前述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A和表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径小于存在于前述表面层B的孔的平均孔径，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述表面层A和B中的孔与前述大孔隙连通，
此处，前述聚合物多孔膜为模块化聚合物多孔膜，
前述旋转式聚合物多孔膜收纳部以独立于前述培养容器的方式旋转。
[2]根据[1]所述的细胞培养装置，其具备用于使前述旋转式聚合物多孔膜收纳部旋转的旋转驱动单元。
[3]根据[2]所述的细胞培养装置，其中，前述旋转式聚合物多孔膜收纳部具备旋转动力接收单元。
[4]根据[3]所述的细胞培养装置，其中，前述旋转动力接收单元为磁体。
[5]根据[4]所述的细胞培养装置，其中，前述旋转驱动单元为磁力搅拌器。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的细胞培养装置，其中，前述模块化聚合物多孔膜是具备壳体的模块化聚合物多孔膜，
此处，前述模块化聚合物多孔膜以如下方式收纳在所述壳体内，
(i)2个以上的独立的前述聚合物多孔膜被汇集，
(ii)前述聚合物多孔膜被折叠，
(iii)前述聚合物多孔膜被卷成卷状，和/或
(iv)前述聚合物多孔膜被连接成绳状。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的细胞培养装置，其中，前述聚合物多孔膜具有平均孔径为0.01～100μm的多个细孔。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的细胞培养装置，其中，前述表面层A的平均孔径为0.01～50μm。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的细胞培养装置，其中，前述表面层B的平均孔径为20～100μm。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的细胞培养装置，其中，前述聚合物多孔膜的总膜厚为5～500μm。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的细胞培养装置，其中，前述聚合物多孔膜为聚酰亚胺多孔膜。
[12]根据[11]所述的细胞培养装置，其中，前述聚酰亚胺多孔膜包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺。
[13]根据[11]或[12]所述的细胞培养装置，其中，前述聚酰亚胺多孔膜是通过将包含着色前体以及由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
[14]根据[1]～[10]中任一项所述的细胞培养装置，其中，前述聚合物多孔膜为聚醚砜(PES)多孔膜。
[15]一种细胞的培养方法，其使用[1]～[14]中任一项所述的细胞培养装置。
发明的效果
本发明提供即使在产生剪切力的搅拌条件下也能够培养、不发生细胞的碾碎、细胞也不因泡沫而死亡的新型细胞培养装置和使用了其的培养方法。
附图说明
图1是表示一个实施方式中的细胞培养装置的截面图。
图2是表示一个实施方式中的细胞培养装置的一部分的立体图。
图3是表示一个实施方式中的细胞培养装置的一部分的俯视图。
图4是表示一个实施方式中的细胞培养装置的一部分的截面图。其表示图3的(A)的A-A截面。
图5是表示一个实施方式中的应用于细胞培养装置的模块化聚酰亚胺多孔膜的俯视图。
图6是表示一个实施方式中的应用于细胞培养装置的模块化聚酰亚胺多孔膜的截面图。其表示图5的B-B截面。
图7表示一个实施方式中的细胞培养装置的一部分。(A)侧面图、(B)立体图、(C)立体图(无顶部)。
图8表示一个实施方式中的细胞培养装置的一部分。其是将图7的(A)～(C)分别用通过旋转轴中心的面切割而得的图。
图9是表示一个实施方式中的细胞培养装置的使用方式的照片。(A)表示设置在培养箱内的细胞培养装置，(B)表示设置有模块化聚合物多孔膜的旋转式聚合物多孔膜收纳部(无顶部)，(C)表示设置有模块化聚合物多孔膜的旋转式聚合物多孔膜收纳部(有顶部)。
图10表示使用一个实施方式的细胞培养装置进行培养后的葡萄糖浓度(GLC)和乳酸浓度(LAC)。
具体实施方式
以下，针对本发明的实施方式，根据需要参照附图进行说明。实施方式的构成是例示，本发明的构成不限定于实施方式的具体构成。
1.聚合物多孔膜
本发明所使用的聚合物多孔膜中的表面层A(以下也称为“A面”或“筛网面”)中存在的孔的平均孔径没有特别限定，例如为0.01μm以上且小于200μm、0.01～150μm、0.01～100μm、0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～25μm、0.01μm～20μm或0.01μm～15μm，优选为0.01μm～25μm。
本发明所使用的聚合物多孔膜中的表面层B(以下也称为“B面”或“大孔面”)中存在的孔的平均孔径只要大于表面层A中存在的孔的平均孔径，就没有特别限定，例如超过5μm且为200μm以下、20μm～100μm、25μm～100μm、30μm～100μm、35μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm或60μm～100μm，优选为30μm～100μm。
本说明书中，聚合物多孔膜表面的平均孔径为面积平均孔径。面积平均孔径可按照以下的(1)和(2)来求出。需要说明的是，聚合物多孔膜表面之外的部位的平均孔径也可以同样求出。
(1)根据多孔膜表面的扫描型电子显微镜照片，针对200个以上的开孔部测定孔面积S，假设该孔面积为正圆，由式I求出各自的孔径d。
[数学式1]
Figure BDA0002598488470000061
(2)将通过上述式I求出的全部孔径应用于以下的式II，求出将孔的形状设为正圆时的面积平均孔径da。
[数学式2]
面积平均孔径da＝∑(d3)/∑(d2) 式II
表面层A和B的厚度没有特别限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。
聚合物多孔膜的大孔隙层中的大孔隙的膜平面方向的平均孔径没有特别限定，例如为10～500μm，优选为10～100μm，更优选为10～80μm。此外，该大孔隙层中的分隔壁的厚度没有特别限定，例如为0.01～50μm，优选为0.01～20μm。在一个实施方式中，该大孔隙层中的至少1个分隔壁具有将邻接的大孔隙彼此连通且平均孔径为0.01～100μm、优选为0.01～50μm的1个或多个孔。在另一实施方式中，该大孔隙层中的分隔壁不具有孔。
本发明所使用的聚合物多孔膜表面的总膜厚没有特别限定，可以为5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，也可以为500μm以下、300μm以下、100μm以下、75μm以下或50μm以下。优选为5～500μm，更优选为25～75μm。
本发明所使用的聚合物多孔膜的膜厚的测定可利用接触式的厚度计来进行。
本发明所使用的聚合物多孔膜的空孔率没有特别限定，例如为40％以上且小于95％。
本发明中使用的聚合物多孔膜的空孔率可通过对切成规定大小的多孔薄膜的膜厚和质量进行测定，并按照下式III由单位面积质量来求出。
[数学式3]
空孔率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100 式III
(式中，S是指多孔薄膜的面积、d是指总膜厚、w是指测得的质量、D是指聚合物的密度。聚合物为聚酰亚胺时，密度设为1.34g/cm3。)
本发明中使用的聚合物多孔膜优选具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径为0.01μm～25μm，存在于前述表面层B的孔的平均孔径为30μm～100μm，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述大孔隙层的分隔壁以及前述表面层A和B的厚度为0.01～20μm，前述表面层A和B中的孔与大孔隙连通，总膜厚为5～500μm，空孔率为40％以上且小于95％。在一个实施方式中，大孔隙层中的至少1个分隔壁具有将邻接的大孔隙彼此连通且平均孔径为0.01～100μm、优选为0.01～50μm的1个或多个孔。在另一实施方式中，分隔壁不具有这样的孔。
本发明中使用的聚合物多孔膜优选未灭菌。作为灭菌处理，没有特别限定，可列举出干热灭菌、蒸气灭菌、基于乙醇等消毒剂的灭菌、紫外线、伽马射线等的电磁波灭菌等任意灭菌处理等。
本发明所使用的聚合物多孔膜只要具备上述结构上的特征，就没有特别限定，优选为聚酰亚胺多孔膜或聚醚砜(PES)多孔膜。
1-1.聚酰亚胺多孔膜
聚酰亚胺是指重复单元中包含酰亚胺键的高分子的统称，通常是指芳香族化合物直接借助酰亚胺键连接而成的芳香族聚酰亚胺。芳香族聚酰亚胺由于芳香族与芳香族通过酰亚胺键而具有共轭结构，因此具有刚直且牢固的分子结构，并且，酰亚胺键具有强分子间力，因此具有非常高水平的热性质、机械性质、化学性质。
本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜优选为(作为主要成分而)包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的聚酰亚胺多孔膜，更优选由通过四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺形成的聚酰亚胺多孔膜。“作为主要成分而包含”是指：作为聚酰亚胺多孔膜的构成成分，本质上不含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺之外的成分，或者虽然可以包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺之外的成分，但其是不会对由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质造成影响的附加性成分。
在一个实施方式中，本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜还包括：通过将包含着色前体以及由四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
聚酰胺酸是将四羧酸成分与二胺成分进行聚合而得到的。聚酰胺酸是能够通过热酰亚胺化或化学酰亚胺化进行闭环而制成聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。
对于聚酰胺酸，即使一部分酰胺酸进行了酰亚胺化，只要是不对本发明造成影响的范围，则也可以使用该聚酰胺酸。即，聚酰胺酸可以部分地进行了热酰亚胺化或化学酰亚胺化。
将聚酰胺酸进行热酰亚胺化时，根据需要，可以向聚酰胺酸溶液中添加酰亚胺化催化剂、含有机磷的化合物、无机微粒、有机微粒等微粒等。此外，将聚酰胺酸进行化学酰亚胺化时，根据需要，可以向聚酰胺酸溶液中添加化学酰亚胺化剂、脱水剂、无机微粒、有机微粒等微粒等。优选在即使向聚酰胺酸溶液中配混前述成分也不会析出着色前体的条件下进行。
本说明书中，“着色前体”是指：通过250℃以上的热处理而一部分或全部碳化并生成着色物的前体。
作为在上述聚酰亚胺多孔膜的制造中可使用的着色前体，优选为均匀地溶解或分散于聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液，并通过250℃以上、优选260℃以上、进一步优选280℃以上、更优选300℃以上的热处理，优选通过在空气等氧气存在下的250℃以上、优选260℃以上、进一步优选280℃以上、更优选300℃以上的热处理而发生热分解、碳化并生成着色物的着色前体，更优选为生成黑色系着色物的着色前体，更优选为碳系着色前体。
着色前体在加热时，乍看像是碳化物，但在组织上包含除碳之外的不同种元素，且包含层结构、芳香族交联结构、含有四面体碳的无序结构的物质。
碳系着色前体没有特别限定，可列举出例如石油焦油、石油沥青、煤焦油、煤沥青等焦油或沥青；焦炭、由包含丙烯腈的单体得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁和二茂铁衍生物)等。这些之中，优选为由包含丙烯腈的单体得到的聚合物和/或二茂铁化合物，作为由包含丙烯腈的单体得到的聚合物，优选为聚丙烯腈。
此外，在其它实施方式中，本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜还包括：不使用上述着色前体，而是通过将由四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液成形后，进行热处理而得到的聚酰亚胺多孔膜。
不使用着色前体地制造的聚酰亚胺多孔膜也可如下制造：例如，将包含特性粘度数值为1.0～3.0的聚酰胺酸3～60质量％和有机极性溶剂40～97质量％的聚酰胺酸溶液流延成膜状，使其浸渍于以水作为必须成分的凝固溶剂或与该凝固溶剂接触，制作聚酰胺酸的多孔膜，其后对该聚酰胺酸的多孔膜进行热处理而进行酰亚胺化。在该方法中，以水为必须成分的凝固溶剂可以是水，或者为5质量％以上且小于100质量％的水与超过0质量％且为95质量％以下的有机极性溶剂的混合液。此外，在上述酰亚胺化后，也可以对所得多孔聚酰亚胺膜的至少单面实施等离子体处理。
在上述聚酰亚胺多孔膜的制造中可使用的四羧酸二酐可以使用任意的四羧酸二酐，可根据期望的特性等来适当选择。作为四羧酸二酐的具体例，可列举出均苯四甲酸二酐、3,3’,4,4’-联苯四甲酸二酐(s-BPDA)、2,3,3’,4’-联苯四甲酸二酐(a-BPDA)等联苯四甲酸二酐；氧基二邻苯二甲酸二酐、二苯基砜-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)硫醚二酐、2,2-双(3,4-二羧基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二酐、2,3,3’,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’,4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)甲烷二酐、2,2-双(3,4-二羧基苯基)丙烷二酐、对亚苯基双(偏苯三甲酸单酯酸酐)、对亚联苯基双(偏苯三甲酸单酯酸酐)、间三联苯-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、对三联苯-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二酐、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)联苯二酐、2,2-双〔(3,4-二羧基苯氧基)苯基〕丙烷二酐、2,3,6,7-萘四甲酸二酐、1,4,5,8-萘四甲酸二酐、4,4’-(2,2-六氟异丙叉基)二邻苯二甲酸二酐等。此外，还优选使用2,3,3’,4’-二苯基砜四羧酸等芳香族四羧酸。它们可以单独使用，也可以组合使用2种以上。
这些之中，特别优选为选自由联苯四甲酸二酐和均苯四甲酸二酐组成的组中的至少一种芳香族四羧酸二酐。作为联苯四甲酸二酐，可适当地使用3,3’,4,4’-联苯四甲酸二酐。
在上述聚酰亚胺多孔膜的制造中可使用的二胺可以使用任意的二胺。作为二胺的具体例，可列举出以下的二胺。
1)1,4-二氨基苯(对苯二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯等1个苯核的苯二胺；
2)4,4’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚等二氨基二苯基醚；4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基联苯、2,2’-二甲基-4,4’-二氨基联苯、2,2’-双(三氟甲基)-4,4’-二氨基联苯、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’,5,5’-四甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫醚、4,4’-二氨基苯甲酰苯胺、3,3’-二氯联苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、2,2’-二甲基联苯胺、3,3’-二甲氧基联苯胺、2,2’-二甲氧基联苯胺、3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚、3,3’-二氨基二苯硫醚、3,4’-二氨基二苯硫醚、4,4’-二氨基二苯硫醚、3,3’-二氨基二苯基砜、3,4’-二氨基二苯基砜、4,4’-二氨基二苯基砜、3,3’-二氨基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基二苯基甲烷、3,4’-二氨基二苯基甲烷、4,4’-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二氨基二苯基亚砜、3,4’-二氨基二苯基亚砜、4,4’-二氨基二苯基亚砜等2个苯核的二胺；
3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3’-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯硫醚)苯、1,3-双(4-氨基苯硫醚)苯、1,4-双(4-氨基苯硫醚)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(3-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯等3个苯核的二胺；
4)3,3’-双(3-氨基苯氧基)联苯、3,3’-双(4-氨基苯氧基)联苯、4,4’-双(3-氨基苯氧基)联苯、4,4’-双(4-氨基苯氧基)联苯、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫醚、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫醚、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫醚、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫醚、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等4个苯核的二胺。
它们可以单独使用，也可以混合使用2种以上。所用的二胺可根据期望的特性等来适当选择。
这些之中，优选为芳香族二胺化合物，可适当地使用3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚和对苯二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯。特别优选为选自由苯二胺、二氨基二苯基醚和双(氨基苯氧基)苯组成的组中的至少一种二胺。
从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点出发，本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜优选由玻璃化转变温度为240℃以上或在300℃以上没有明确的转变点的、将四羧酸二酐和二胺组合得到的聚酰亚胺来形成。
从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点出发，本发明可使用的聚酰亚胺多孔膜优选为由以下的芳香族聚酰亚胺形成的聚酰亚胺多孔膜。
(i)由选自由联苯四甲酸单元和均苯四甲酸单元组成的组中的至少一种四羧酸单元与芳香族二胺单元形成的芳香族聚酰亚胺；
(ii)由四羧酸单元与选自由苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯单元组成的组中的至少一种芳香族二胺单元形成的芳香族聚酰亚胺；和/或
(iii)由选自由联苯四甲酸单元和均苯四甲酸单元组成的组中的至少一种四羧酸单元与选自由苯二胺单元、二氨基二苯基醚单元和双(氨基苯氧基)苯基单元组成的组中的至少一种芳香族二胺单元形成的芳香族聚酰亚胺。
本发明中使用的聚酰亚胺多孔膜优选具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A和表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径为0.01μm～25μm，存在于前述表面层B的孔的平均孔径为30μm～100μm，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述大孔隙层的分隔壁以及前述表面层A和B的厚度为0.01～20μm，前述表面层A和B中的孔与大孔隙连通，总膜厚为5～500μm，空孔率为40％以上且小于95％。此处，大孔隙层中的至少1个分隔壁具有将邻接的大孔隙彼此连通且平均孔径为0.01～100μm、优选为0.01～50μm的1个或多个孔。
例如，国际公开第2010/038873号、日本特开2011-219585号公报或日本特开2011-219586号公报中记载的聚酰亚胺多孔膜也可用于本发明。
1-2.聚醚砜(PES)多孔膜
本发明可使用的PES多孔膜包含聚醚砜，典型而言，实质上由聚醚砜组成。聚醚砜可以利用本领域技术人员公知的方法来合成，可通过例如下述方法等来制造：使二元酚、碱金属化合物和二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中发生缩聚反应的方法；预先合成二元酚的碱金属二盐，并使其与二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中发生缩聚反应的方法。
作为碱金属化合物，可列举出碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物、碱金属氢化物、碱金属醇盐等。特别优选为碳酸钠和碳酸钾。
作为二元酚化合物，可列举出对苯二酚、邻苯二酚、间苯二酚、4,4’-联苯酚、双(羟基苯基)烷烃类(例如2,2-双(羟基苯基)丙烷和2,2-双(羟基苯基)甲烷)、二羟基二苯基砜类、二羟基二苯基醚类、或者它们的苯环中的至少1个氢被甲基、乙基、丙基等低级烷基、或甲氧基、乙氧基等低级烷氧基取代而得的化合物。作为二元酚化合物，可以将两种以上的上述化合物混合使用。
聚醚砜可以为市售品。作为市售品的例子，可列举出Sumika Excel 7600P、SumikaExcel 5900P(以上为住友化学株式会社制)等。
关于聚醚砜的对数粘度，从良好地形成多孔聚醚砜膜的大孔隙的观点出发，优选为0.5以上、更优选为0.55以上，从多孔聚醚砜膜的制造容易性的观点出发，优选为1.0以下、更优选为0.9以下、进一步优选为0.8以下、特别优选为0.75以下。
此外，从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点出发，PES多孔膜或作为其原料的聚醚砜的玻璃化转变温度优选为200℃以上、或观察不到明确的玻璃化转变温度。
本发明可使用的PES多孔膜的制造方法没有特别限定，可以通过例如下述方法来制造，所述方法包括如下工序：
将包含对数粘度为0.5～1.0的聚醚砜0.3质量％～60质量％和有机极性溶剂40质量％～99.7质量％的聚醚砜溶液流延成膜状，并使其浸渍于以聚醚砜的不良溶剂或非溶剂作为必须成分的凝固溶剂或与该凝固溶剂接触，从而制作具有空孔的凝固膜的工序；以及
对通过前述工序得到的具有空孔的凝固膜进行热处理而使前述空孔粗大化，从而得到PES多孔膜的工序，
前述热处理包括使前述具有空孔的凝固膜升温至前述聚醚砜的玻璃化转变温度以上或240℃以上。
本发明可使用的PES多孔膜优选具有表面层A、表面层B、以及夹在前述表面层A与前述表面层B之间的大孔隙层，
前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围且膜平面方向的平均孔径为10μm～500μm的多个大孔隙，
前述大孔隙层的分隔壁的厚度为0.1μm～50μm，
前述表面层A和B各自的厚度为0.1μm～50μm，
前述表面层A和B之中，一者具有平均孔径超过5μm且为200μm以下的多个细孔，且另一者具有平均孔径为0.01μm以上且小于200μm的多个细孔，
表面层A和表面层B中的一者的表面开口率为15％以上，另一个表面层的表面开口率为10％以上，
前述表面层A和前述表面层B的前述细孔与前述大孔隙连通，
前述PES多孔膜的总膜厚为5μm～500μm，且空孔率为50％～95％。
本发明的细胞培养装置中使用的作为细胞培养载体的上述聚合物多孔膜具有微亲水性的多孔特性，因此，在聚合物多孔膜内稳定地保持液体，还保持强烈抗干燥的湿润环境。因此，与使用以往的细胞培养载体的细胞培养装置相比，即使是极少量的培养基也能够实现细胞的存活和增殖。此外，播种至聚合物多孔膜的细胞即使历经剪切力、泡沫也不发生细胞的死亡，能够进行培养，因此，能够对细胞有效地供给氧、营养，能够培养大量的细胞。
根据本发明，能够充分地对细胞进行供氧。
2.细胞培养装置
本发明涉及一种细胞培养装置，其特征在于，其具备：
培养容器；
收纳于前述培养容器且具有1个以上的培养基流出流入口的旋转式聚合物多孔膜收纳部；以及
收纳于前述旋转式聚合物多孔膜收纳部的聚合物多孔膜，
此处，前述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在前述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于前述表面层A的孔的平均孔径小于存在于前述表面层B的孔的平均孔径，前述大孔隙层具有与前述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及前述表面层A和B包围的多个大孔隙，前述表面层A和B中的孔与前述大孔隙连通，
此处，前述聚合物多孔膜为模块化聚合物多孔膜，
前述旋转式聚合物多孔膜收纳部以独立于前述培养容器的方式旋转。
以下，也将该细胞培养装置称为“本发明的细胞培养装置”。以下，针对本发明的细胞培养装置的实施方式，示出附图进行说明。
2-1.细胞培养装置
图1是示出一个实施方式中的本发明的细胞培养装置1的图。此外，图2～4是示出一个实施方式中的旋转式聚合物多孔膜收纳部3的图。
旋转式聚合物多孔膜收纳部3收纳于培养容器2内。在一个实施方式中，为了覆盖培养容器2的培养空间而进一步具备盖体20。为了对培养容器2的内部供给含氧气体，优选在盖体20的一部分具备过滤器21。由此，能够在培养容器2的内部与外部之间进行气体交换，且防止培养基被污染。
在旋转式聚合物多孔膜收纳部3收纳有模块化聚合物多孔膜90。旋转式聚合物多孔膜收纳部3具有1个以上的培养基流出流入口。在一个实施方式中，旋转式聚合物多孔膜收纳部3具有底部30、与底部30大致垂直地设置的侧部31和设置在侧部31上部的顶部32，外观上形成了圆柱形状的容器。在其它实施方式中，旋转式聚合物多孔膜收纳部3可以为例如三棱柱、四棱柱、五棱柱、多棱柱。底部30具有1个以上的第一培养基流出流入口300。侧部31具有1个以上的第二培养基流出流入口310。顶部32具有1个以上的第三培养基流出流入口320。第一培养基流出流入口300、第二培养基流出流入口310或第三培养基流出流入口320的形状可以为例如圆形、椭圆形、三角形、四边形、五边形、六边形、多边形等。第一培养基流出流入口300、第二培养基流出流入口310和第三培养基流出流入口320的大小只要是模块化聚合物多孔膜90不会从旋转式聚合物多孔膜收纳部3飞出的程度即可，可以适当变更设计。第一培养基流出流入口300、第二培养基流出流入口310或第三培养基流出流入口320的数量为例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、50个、100个等。
通过第一培养基流出流入口300、第二培养基流出流入口310和第三培养基流出流入口320，向旋转式聚合物多孔膜收纳部3的内部和外部供给/排出培养基。在其它实施方式中，例如旋转式聚合物多孔膜收纳部3可以为球形、圆锥形、棱锥形、圆台形、任意多边形的旋转体形状等。
在本实施方式中，顶部32能够向侧部31装卸，能够向旋转式聚合物多孔膜收纳部3的内部收纳和/或取出模块化聚合物多孔膜90。
在一个实施方式中，旋转式聚合物多孔膜收纳部3具有旋转部33。在一个实施方式中，旋转部33设置于旋转式聚合物多孔膜收纳部3的底部30的下表面，具备圆筒形的旋转侧部330、旋转底部331和固定于旋转底部331的旋转动力接收单元333。旋转动力接收单元333为例如磁体、旋转轴。在一个实施方式中，旋转动力接收单元333可以使用例如磁力搅拌子。在一个实施方式中，旋转动力接收单元333为磁体时，旋转驱动单元4可以使用例如磁力搅拌器，能够非接触性地使旋转式聚合物多孔膜收纳部3旋转。在其它实施方式中，旋转动力接收单元333为旋转轴时，旋转驱动单元4可以使用例如与旋转轴相连的旋转电机。旋转驱动单元4的旋转运动被传导至旋转动力接收单元333，其结果，旋转式聚合物多孔膜收纳部3发生旋转。图2～4的实施方式中的旋转式聚合物多孔膜收纳部3中，旋转底部331的底面与培养容器底部22接触而旋转。如果是本发明的细胞培养装置1，则通过使旋转式聚合物多孔膜收纳部3以独立于培养容器2的方式旋转，从而能够对细胞所应用的模块化聚合物多孔膜90充分地供给氧和营养，能够进行大量的细胞培养。
在一个实施方式中，收纳有模块化聚合物多孔膜90的旋转式聚合物多孔膜收纳部3通过与培养容器2组合而能够立刻用作细胞培养装置1。旋转式聚合物多孔膜收纳部3能够向填充有新鲜培养基的培养容器2转移，还能够简单地进行培养基的更换。此外，作为其它实施方式，也可以以包含培养容器2和收纳有模块化聚合物多孔膜90的旋转式聚合物多孔膜收纳部3的细胞培养试剂盒的形式来提供。
图7和图8是示出其它实施方式中的细胞培养装置1所应用的旋转式聚合物多孔膜收纳部3a的图，图9是示出其使用状态的照片。需要说明的是，图7和图8所示的旋转式聚合物多孔膜收纳部3a的基本构成、发明概念与旋转式聚合物多孔膜收纳部3的各构件相同。关于除了对各构件的符号编号加注“a”之外标注了与设置于旋转式聚合物多孔膜收纳部3的各构件相同的符号编号的旋转式聚合物多孔膜收纳部3a中设置的各构件的相关说明，可应用旋转式聚合物多孔膜收纳部3的各对应构件的上述相关说明。此处，仅针对不适用旋转式聚合物多孔膜收纳部3的各构件的说明的构件进行说明。
旋转式聚合物多孔膜收纳部3a设置有用于使旋转式聚合物多孔膜收纳部3a的旋转稳定的轴部35a。轴部35a贯穿设置于盖体20的贯穿孔(参照图9)。在其它方式中，轴部35a可以不贯穿盖体20，而是被设置于盖体20内侧的轴承所支承。
侧部31a可以设置有旋转叶片311a。在旋转式聚合物多孔膜收纳部3a旋转时，通过旋转叶片311a产生液流，能够向培养基中高效地混入气相中的氧。旋转叶片311a的形状和数量可根据目的来适当调整。
旋转部33a的下部设置有旋转轴构件334a。此外，培养容器2的底面(未图示)设置有用于承受旋转轴构件334a的轴承34a。由于旋转轴构件334a被轴承34a的凹部所支承，因此能够使旋转式聚合物多孔膜收纳部3a的旋转稳定。
图8是图7所示的旋转式聚合物多孔膜收纳部3a的截面图。旋转部33a具备旋转动力接收单元333a(例如棒状的磁力搅拌子)。旋转动力接收单元333a被包围其的固定构件335a所固定。
旋转式聚合物多孔膜收纳部3a的内部可以设置有间隔构件312a。例如，如图9的(B)那样地设置模块化聚合物多孔膜90并使旋转式聚合物多孔膜收纳部3a旋转时，利用间隔构件312a能够减轻模块化聚合物多孔膜90因液流而偏向的情况。间隔构件312a只要是能够减轻模块化聚合物多孔膜90的偏向、并产生液流这一程度的形状和数量即可，可以适当调整。
2-2.细胞培养装置中使用的聚合物多孔膜的实施方式
本发明的实施方式所使用的聚合物多孔膜可以使用模块化的聚合物多孔膜。在本说明书中，“模块化聚合物多孔膜”是指收纳至壳体900内的聚合物多孔膜9(例如参照图5和图6)。在本说明书中，“模块化聚合物多孔膜”这一记载可以简写为“模块”，是指即使相互变更也相同的含义。
本发明的实施方式所使用的模块化聚合物多孔膜90可以以如下方式收纳在该壳体900内：
(i)2个以上的独立的前述聚合物多孔膜9被汇集，
(ii)前述聚合物多孔膜9被折叠，
(iii)前述聚合物多孔膜9被卷成卷状，和/或
(iv)前述聚合物多孔膜9被连接成绳状，
可以将该模块化聚合物多孔膜90应用于旋转式聚合物多孔膜收纳部3。
在本说明书中，“2个以上的独立的该聚合物多孔膜被汇集收纳至壳体内”是指相互独立的2个以上的聚合物多孔膜9被汇集收纳至被壳体900包围的一定空间内的状态。本发明中，2个以上的独立的该聚合物多孔膜9可以利用任意的方法将该聚合物多孔膜9的至少1处与该壳体900内的至少1处加以固定，从而固定为该聚合物多孔膜9不会在壳体900内活动的状态。此外，2个以上的独立的聚合物多孔膜9可以为小片。小片的形状可以采用例如圆、椭圆形、四边形、三角形、多边形、绳状等任意形状，优选为绳状或四边形。在本发明中，小片的大小可以采用任意的大小，在绳状的情况下，长度可以为任意长度，宽度可以为80mm以下，可优选为30mm以下，可更优选为10mm以下。由此，可防止对在聚合物多孔膜9内生长的细胞施加应力。在本发明中，聚合物多孔膜9的小片为四边形时，更优选为大致正方形，关于其一边的长度，只要沿着壳体的内壁形成或形成为比内壁的一边长度短(例如短0.1mm～1mm左右)，使得聚合物多孔膜为不会在壳体900内活动的状态即可。此外，在本发明中，聚合物多孔膜9的小片为大致正方形时，长度可以为任意长度，例如可以为80mm以下，可优选为50mm以下，可更优选为30mm以下，可更进一步优选为20mm以下，可以为10mm以下。
在本说明书中，“被折叠的聚合物多孔膜”是指通过在该壳体900内进行折叠，从而借助聚合物多孔膜9的各面和/或与壳体900内的表面的摩擦力而呈现不在壳体900内活动的状态的聚合物多孔膜9。在本说明书中，“被折叠”可以是聚合物多孔膜9带有折痕的状态，也可以是不带折痕的状态。
在本说明书中，“被卷成卷状的聚合物多孔膜”是指聚合物多孔膜9被卷成卷状，从而借助聚合物多孔膜9的各面和/或与壳体900内的表面的摩擦力而呈现不在壳体900内活动的状态的聚合物多孔膜9。此外，在本发明中，编成绳状的聚合物多孔膜9是指通过例如任意方法将短条状的多个聚合物多孔膜9编成绳状，利用聚合物多孔膜9彼此的摩擦力而呈互不活动的状态的聚合物多孔膜9。也可以将(i)2个以上的独立的前述聚合物多孔膜9被汇集而得的聚合物多孔膜9、(ii)被折叠的聚合物多孔膜9、(iii)被卷成卷状的聚合物多孔膜9和(iv)被连接成绳状的聚合物多孔膜9加以组合，并收纳至壳体900内。
在本说明书中，“该聚合物多孔膜不在壳体内活动的状态”是指：在细胞培养培养基中培养该模块化聚合物多孔膜90时，以呈现该聚合物多孔膜9不会持续发生形态变化的状态的方式收纳在壳体900内的状态。换言之，是该聚合物多孔膜9自身被抑制为不会因流体而持续性地进行波动的状态。由于聚合物多孔膜9保持不在壳体900内活动的状态，因此防止对在聚合物多孔膜9内生长的细胞施加应力，能够稳定地培养细胞而不使细胞死亡。
图5和图6中示出一个实施方式中的模块化聚合物多孔膜90的结构。模块化聚合物多孔膜90中的多个聚合物多孔膜9的层叠体被收纳至壳体900内。所层叠的聚合物多孔膜9可以是小片，其形状例如可以为圆、椭圆形、四边形、三角形、多边形、绳状等任意形状。所层叠的聚合物多孔膜9的小片优选为大致正方形。小片的大小可以采取任意的大小。小片为大致正方形时，其长度没有特别限定，例如为80mm以下、50mm以下、30mm以下、20mm以下或10mm以下。
收纳至壳体900内的聚合物多孔膜9为多个聚合物多孔膜9的层叠体时，优选为2片以上、3片以上、4片以上或5片以上且100片以下、50片以下、40片以下、30片以下、20片以下、15片以下或10片以下的聚合物多孔膜的层叠体，更优选为3～100片的、更优选为5～50片的聚合物多孔膜的层叠体。
收纳至壳体900内的聚合物多孔膜9为多个聚合物多孔性膜的层叠体时，可以在聚合物多孔膜9与聚合物多孔膜9之间设置垫板901(参照图6)。通过设置垫板901，能够对所层叠的聚合物多孔膜9之间有效地供给培养基。垫板901只要具有在所层叠的聚合物多孔膜9之间形成任意的空间，并有效地供给培养基的功能，就没有特别限定，可以使用例如具有筛网结构的平面结构体。垫板901的材质可以使用例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不锈钢制的筛网，但不限定于此。具备具有筛网结构的垫板901时，只要具有能够对所层叠的聚合物多孔膜9之间供给培养基这一程度的网孔即可，可适当选择。
3.使用了细胞培养装置的细胞培养方法
在本说明书中，“培养基”是指用于培养细胞、尤其是动物细胞的细胞培养培养基。培养基被用作与细胞培养液相同的含义。因此，本发明中使用的培养基是指液体培养基。培养基的种类可使用通常使用的培养基，根据所培养的细胞的种类来适当决定。
<对聚合物多孔膜应用细胞的工序>
本发明所使用的对聚合物多孔膜应用细胞的具体工序没有特别限定。可以采用本说明书中记载的工序、或者适合于将细胞应用于膜状载体的任意方法。虽然没有限定，但本发明的方法中，对聚合物多孔膜应用细胞包括例如以下那样的方式。
(A)包括将细胞播种至前述聚合物多孔膜表面的工序的方式；
(B)包括在前述聚合物多孔膜的经干燥的表面承载、放置细胞悬浮液、或者移动前述聚合物多孔膜来促进液体的流出、或者刺激表面的一部分而使细胞悬浮液被前述膜吸收，然后，使细胞悬浮液中的细胞留存在前述膜内，使水分流出的工序的方式；以及
(C)包括将前述聚合物多孔膜的单面或两面用细胞培养液或经灭菌的液体湿润，
向前述湿润的聚合物多孔膜装填细胞悬浮液，然后
使细胞悬浮液中的细胞留存在前述膜内，使水分流出的工序的方式。
方式(A)包括对聚合物多孔膜的表面直接播种细胞、细胞块。或者，还包括将聚合物多孔膜投入至细胞悬浮液中，使细胞培养液自膜的表面浸润的方式。
向聚合物多孔膜的表面播种的细胞粘附于聚合物多孔膜，并逐渐进入多孔的内部。优选的是：即使不特意从外部施加物理力或化学力，细胞也粘附于聚合物多孔膜。向聚合物多孔膜的表面播种的细胞能够在膜的表面和/或内部稳定地生长/增殖。细胞根据进行生长/增殖的膜的位置而能够呈现各种不同的形态。
在方式(B)中，在聚合物多孔膜的经干燥的表面承载细胞悬浮液。通过放置聚合物多孔膜、或者移动前述聚合物多孔膜来促进液体的流出、或者刺激表面的一部分而使细胞悬浮液被前述膜吸收，从而细胞悬浮液浸透至膜中。虽然不受理论束缚，但可以认为其是由源于聚合物多孔膜的各表面形状等的性质造成的。通过本方式，细胞被吸收到膜的装填有细胞悬浮液的部位而进行播种。
或者，可以如方式(C)那样地，将前述聚合物多孔膜的单面或两面的局部或整体用细胞培养液或经灭菌的液体润湿后，对润湿的聚合物多孔膜装填细胞悬浮液。此时，细胞悬浮液的通过速度大幅提高。
例如，以防止膜飞散作为主要目的，可以使用使膜的极小一部分润湿的方法(以后将其记作“一点湿润法”)。一点湿润法实质上大致近似不使膜润湿的干法(方式(B))。其中，针对润湿的小部分，可以认为细胞液的膜透过变得迅速。此外，也可以使用在使聚合物多孔膜的整个单面或两面充分润湿后的膜(以下将其记作“湿润膜”)中装填细胞悬浮液的方法(以下将其记作“湿润膜法”)。此时，在聚合物多孔膜的整体中，细胞悬浮液的通过速度大幅提高。
在方式(B)和(C)中，将细胞悬浮液中的细胞留置在前述膜内，使水分流出。由此，还能够进行浓缩细胞悬浮液中的细胞浓度、使细胞之外的无用成分与水分一同流出等处理。
有时将方式(A)称为“自然播种”，将方式(B)和(C)称为“吸收播种”。
虽然没有限定，但优选活细胞选择性地留置于聚合物多孔膜。由此，在本发明方法的优选实施方式中，活细胞留置在前述聚合物多孔膜内，死细胞优先与水分一同流出。
方式(C)中使用的经灭菌的液体没有特别限定，是已灭菌的缓冲液或灭菌水。缓冲液为例如(+)和(-)Dulbecco’s PBS、(+)和(-)Hank's Balanced Salt Solution等。将缓冲液的例子示于下述表1。
[表1]
Figure BDA0002598488470000231
进而，在本发明的方法中，对聚合物多孔膜应用细胞还包括：通过使处于浮游状态的粘附性细胞与聚合物多孔膜以悬浮方式共存而使细胞附着于膜的方式(缠结)。例如，在本发明的方法中，为了将细胞应用于聚合物多孔膜，可以在细胞培养容器中放入细胞培养培养基、细胞、以及1个或1个以上的前述聚合物多孔膜。细胞培养培养基为液体时，聚合物多孔膜以浮游在细胞培养培养基中的状态下存在。由于聚合物多孔膜的性质，细胞可以粘附于聚合物多孔膜。由此，即使是原本不适合浮游培养的粘附性细胞，通过使用聚合物多孔膜，也能够在吸附至聚合物多孔膜的状态下一边浮游一边培养。细胞优选粘附至聚合物多孔膜。“自发性地粘附”是指：即使不特别从外部施加物理力或化学力，细胞也会留置在聚合物多孔膜的表面或内部。
上述对聚合物多孔膜应用细胞可以组合使用2种或更多的方法。例如，可以将方式(A)～(C)中的2个以上的方法组合来对聚合物多孔膜应用细胞。能够将担载有细胞的聚合物多孔膜应用于上述细胞培养装置中的聚合物多孔膜载置部，并进行培养。
另外，也可以对收纳有模块化聚合物多孔膜的聚合物多孔膜收纳部滴加包含悬浮细胞的培养基来进行播种。
或者，通过将培养容器2用包含细胞的细胞悬浮液进行填充(例如填充细胞悬浮液至细胞悬浮液面L为止)，能够对模块化聚合物多孔膜均质地播种细胞。由此，能够防止对聚合物多孔膜播种的细胞在局部发生融合，从而高效地增殖。
本说明书中，“悬浮细胞”是指例如包括：利用胰蛋白酶等蛋白质分解酶，使粘附细胞强制性地浮游并悬浮在培养基中得到的细胞；通过公知的驯化工序而能够在培养基中浮游培养的粘附细胞等。
本发明中可利用的细胞种类选自由例如动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌组成的组。动物细胞大致分为来源于属于脊椎动物门的动物的细胞和来源于无脊椎动物(属于脊椎动物门的动物之外的动物)的细胞。本说明书中的动物细胞的来源没有特别限定。优选指的是来源于属于脊椎动物门的动物的细胞。脊椎动物门包括无颌类和有颌类，有颌类包括哺乳纲、鸟纲、两栖纲、爬行纲等。优选为来源于通常被称为哺乳动物的属于哺乳纲的动物的细胞。哺乳动物没有特别限定，优选包括小鼠、大鼠、人、猴、猪、狗、绵羊、山羊等。
本发明中可利用的动物细胞的种类没有限定，优选选自由多能干细胞、组织干细胞、体细胞和生殖细胞组成的组。
本说明书中，“多能干细胞”是指具有分化成所有组织的细胞这一能力(分化多能性)的干细胞的统称。虽然没有限定，但多能干细胞包括胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)、生殖干细胞(GS细胞)等。优选为ES细胞或iPS细胞。iPS细胞因没有伦理问题等理由而特别优选。作为多能干细胞，可以使用公知的任意干细胞，可以使用例如国际公开第2009/123349号(PCT/JP2009/057041)中记载的多能干细胞。
“组织干细胞”是指能够分化的细胞系列限定于特定的组织，但具有能够分化成多个细胞种类的能力(分化多能性)的干细胞。例如，骨髄中的造血干细胞成为血球的来源，神经干细胞分化成神经细胞。除此之外，有制造肝脏的肝脏干细胞、形成皮肤组织的皮肤干细胞等多个种类。组织干细胞优选选自间充质干细胞、肝脏干细胞、胰脏干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞或造血干细胞。
“体细胞”是指构成多细胞生物的细胞之中除生殖细胞之外的细胞。在有性生殖中不会传继至下一代。体细胞优选选自肝细胞、胰腺细胞、肌细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、成纤维细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞、或者淋巴细胞、红细胞、白细胞、单核细胞、巨噬细胞或巨核细胞的血细胞。
“生殖细胞”是指在生殖中具有将遗传信息传递至下一代这一作用的细胞。例如，包括用于有性生殖的配子、即卵子、卵细胞、精子、精细胞；用于无性生殖的孢子等。
细胞可以选自由肉瘤细胞、株化细胞和转化细胞组成的组。“肉瘤”是指在骨、软骨、脂肪、肌肉、血液等非上皮性细胞来源的结缔组织细胞中发生的癌，包括软组织肉瘤、恶性骨肿瘤等。肉瘤细胞是来源于肉瘤的细胞。“株化细胞”是指长期保持在体外且具有一定的稳定性质，能够半永久性地继代培养的培养细胞。存在PC12细胞(源自大鼠肾上腺髓质)、CHO细胞(源自中国仓鼠卵巢)、HEK293细胞(源自人胚胎肾)、HL-60细胞(源自人白细胞)、HeLa细胞(源自人宫颈癌)、Vero细胞(源自非洲绿猴肾上皮细胞)、MDCK细胞(源自犬肾小管上皮细胞)、HepG2细胞(源自人肝癌的细胞株)、BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)、NIH3T3细胞(源自小鼠胚胎成纤维细胞)等来自包括人的各种物种的各种组织的细胞株。“转化细胞”是指从细胞外部导入核酸(DNA等)并改变了遗传性质的细胞。
本说明书中，“粘附细胞”是指通常为了增殖而需要使自身粘附于适当的表面的细胞，也被称为附着细胞或支架依赖性细胞。在本发明的若干实施方式中，所使用的细胞为粘附细胞。本发明所使用的细胞为粘附细胞，更优选为即使在悬浮在培养基中的状态下也能够进行培养的细胞。能够悬浮培养的粘附细胞是指能够通过公知的方法将粘附细胞驯化至适于悬浮培养的状态而得到，可列举出例如CHO细胞、HEK293细胞、Vero细胞、NIH3T3细胞等、由这些细胞派生得到的细胞株。
本发明的细胞的培养方法中，通过对聚合物多孔膜应用细胞并进行培养，从而在聚合物多孔膜所具有的内部的多面性的连接多孔部分、表面生长大量的细胞，因此能够简便地培养大量的细胞。此外，本发明中使用的播种至聚合物多孔膜的细胞即使在以往会死亡那样的搅拌条件下也可提供能够生长的环境，从而能够大量培养细胞。
本说明书中，将不含细胞的聚合物多孔膜包括其内部间隙的体积在内在空间中占据的体积称为“表观上的聚合物多孔膜体积”。并且，将细胞应用于聚合物多孔膜，在聚合物多孔膜的表面和内部担载有细胞的状态下，将聚合物多孔膜、细胞和浸润至聚合物多孔膜内部的培养基整体在空间中占据的体积称为“包含细胞生存区域在内的聚合物多孔膜体积”。在膜厚为25μm的聚合物多孔膜的情况下，包含细胞生存区域在内的聚合物多孔膜体积成为比表观上的聚合物多孔膜体积最大大出50％左右的值。本发明的方法中，能够在1个细胞培养容器中收纳多个聚合物多孔膜并进行培养，此时，有时将针对担载有细胞的多个聚合物多孔膜各自的包括细胞生存区域在内的聚合物多孔膜体积的总和简写为“包括细胞生存区域在内的聚合物多孔膜体积的总和”。
通过使用本发明的方法，即使在细胞培养容器中包含的细胞培养培养基的总体积为包括细胞生存区域在内的聚合物多孔膜体积的总和的10000倍或少于其的条件下，也能够长期良好地培养细胞。此外，即使在细胞培养容器中包含的细胞培养培养基的总体积为包括细胞生存区域在内的聚合物多孔膜体积的总和的1000倍或少于其的条件下，也能够长期良好地培养细胞。进而，即使在细胞培养容器中包含的细胞培养培养基的总体积为包括细胞生存区域在内的聚合物多孔膜体积的总和的100倍或少于其的条件下，也能够长期良好地培养细胞。并且，即使在细胞培养容器中包含的细胞培养培养基的总体积为包括细胞生存区域在内的聚合物多孔膜体积的总和的10倍或少于其的条件下，也能够长期良好地培养细胞。
换言之，根据本发明，与以往进行二维培养的细胞培养装置相比，能够将进行细胞培养的空间(容器)小型化至极限。此外，想要增加进行培养的细胞数量时，通过增加所层叠的聚合物多孔膜的片数等简便操作，能够灵活地增加进行细胞培养的体积。如果是本发明中使用的具备聚合物多孔膜的细胞培养装置，则能够将培养细胞的空间(容器)与贮藏细胞培养培养基的空间(容器)加以分离，能够根据所培养的细胞数来准备所需量的细胞培养培养基。贮藏细胞培养培养基的空间(容器)可以根据目的进行大型化或小型化，或者，也可以是能够更换的容器，没有特别限定。
本说明书中，细胞的大量培养是指：例如，对于使用聚合物多孔膜进行培养后细胞培养容器中包含的细胞数，以细胞全部均匀地分散至细胞培养容器中包含的细胞培养培养基中的情况计，培养至每1毫升培养基为1.0×105个以上、1.0×106个以上、2.0×106个以上、5.0×106个以上、1.0×107个以上、2.0×107个以上、5.0×107个以上、1.0×108个以上、2.0×108个以上、5.0×108个以上、1.0×109个以上、2.0×109个以上或5.0×109个以上为止。
需要说明的是，作为计测培养中或培养后的细胞数的方法，可以使用各种公知方法。例如，作为以细胞全部均匀地分散至细胞培养容器中包含的细胞培养培养基中的情况来计测使用聚合物多孔膜进行培养后在细胞培养容器中包含的细胞数的方法，可以适当使用公知的方法。例如，可适当地使用利用了CCK8(参照下文)的细胞数计测法。具体而言，使用Cell Countinig Kit8；同仁化学研究所制的溶液试剂(以下记作“CCK8”)，计测不使用聚合物多孔膜的通常培养中的细胞数，求出吸光度与实际细胞数的相关系数。其后，应用细胞，将所培养的聚合物多孔膜转移至包含CCK8的培养基中，在培养箱内保存1～3小时，取出上清并以460nm的波长测定吸光度，由事先求出的相关系数计算细胞数。
此外，从其它观点出发，细胞的大量培养是指：例如，培养至在使用聚合物多孔膜进行培养后每1平方厘米聚合物多孔膜中包含的细胞数为1.0×105个以上、2.0×105个以上、1.0×106个以上、2.0×106个以上、5.0×106个以上、1.0×107个以上、2.0×107个以上、5.0×107个以上、1.0×108个以上、2.0×108个以上或5.0×108个以上为止。每1平方厘米聚合物多孔膜中包含的细胞数可使用上述CCK8等公知方法来适当计测。
实施例
以下，基于实施例，更具体地说明本发明。需要说明的是，本发明不限定于这些实施例。本领域技术人员可基于本说明书的记载容易地对本发明施加修饰/变更，它们包括在本发明的技术范围内。
以下实施例中使用的聚酰亚胺多孔膜通过如下方法制备：将包含由作为四羧酸成分的3,3’,4,4’-联苯四甲酸二酐(s-BPDA)和作为二胺成分的4,4’-二氨基二苯基醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液、以及作为着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上进行热处理来制备。所得聚酰亚胺多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在该表面层A和表面层B之间的大孔隙层的三层结构，存在于表面层A的孔的平均孔径为19μm，存在于表面层B的孔的平均孔径为42μm，膜厚为25μm，空孔率为74％。
(实施例1)
使用培养基(BalanCD(商标)CHO Growth A)，对使抗人IL-8抗体产生CHO-DP12细胞(ATCC CRL-12445)驯化/浮游化而得的细胞进行浮游培养，继续培养至每1ml的活细胞数成为3.51×106cells/ml(总细胞数为3.83×106cells/ml、活细胞率为92％)为止。准备100个具有图5和6所示结构的模块，利用经稀释的MILTON(注册商标)(杏林制药公司、日本)、超纯水、含70％乙醇的水进行清洗后，灭菌性地干燥，完成准备。将经时变化示于表2。此外，模块中使用的聚酰亚胺多孔膜的尺寸为1.0×1.0cm，聚酰亚胺多孔膜总片数为1800片、总面积为1800cm2。准备利用3D打印机准备的旋转式聚合物多孔膜收纳部(图2～4)，将合计100个模块灭菌性地设置于上部空洞，放置在透明容器内部。将磁力搅拌器设置于生物反应器下部后，转移至CO2培养箱内，完成培养准备。需要说明的是，透明容器的上部的敞开部分用无纺布覆盖，形成可避免杂菌混入且可输入空气的状态。
向上述准备的旋转培养装置中添加KOHJIN-BIO公司制的CHO细胞单层培养培养基KBM270 200.0mL，以56rpm的转速使培养基在模块中浸渍10分钟。向其中添加CHO DP-12浮游细胞培养液(总细胞数为3.83×106cells/ml、活细胞数为3.51×106cells/ml、死细胞数为3.23×105cells/ml、活细胞率为92％)30.8mL与浮游细胞用培养基BalanCD(商标)CHOGrowth A)69.2mL的混合液，在CO2培养箱内缓慢搅拌/混合5分钟后，静置2.5小时来实施细胞吸附。在2.5小时后回收的培养基中几乎观察不到细胞，细胞吸附率为100％。该时刻下的预想平均细胞密度为6.00×104cells/cm2。
排出细胞吸附所使用的培养基，将KOHJIN-BIO公司制的CHO细胞单层培养培养基KBM270 200ml加注至旋转生物反应器容器中，以56rpm的转速使生物反应器旋转来持续培养。3天后，使转速上升至192rpm，继续培养。每天进行培养基的更换，使用ROCHE-DIAGNOSTICS公司制的Cedex Bio，对培养基中的每一天的葡萄糖消耗量、乳酸产生量、乳酸脱氢酶量和抗体产生量进行4天的测定。观察到葡萄糖的消耗和乳酸的产生经时性地提高，进行了稳定的细胞培养。将结果示于表2。
[表2]
Figure BDA0002598488470000291
(实施例2)
在培养基(BalanCD(商标)CHO Growth A)中浮游培养使抗人IL-8抗体产生CHO-DP12细胞(ATCC CRL-12445)驯化/浮游化的细胞，持续培养至每1ml的活细胞数成为2.29×106cells/ml、(总细胞数为2.62×106cells/ml、活细胞率为88％)为止。
将具有图5和图6所示结构的模块100个投入至灭菌用袋(Thermo FisherScientific公司制)中，进行最小为25kGy/最大为50kGy的伽马射线照射灭菌，完成模块准备。需要说明的是，模块中使用的聚酰亚胺多孔膜的尺寸为1.0cm×1.0cm，聚酰亚胺多孔膜的总片数为1800片、总面积为1800cm2。
此外，利用3D打印机制作用于收纳模块并旋转的旋转式聚合物多孔膜收纳部(图7～9)后，利用与模块相同的方法进行灭菌。
为了能够向容器内部液中通气，在设置上述旋转式聚合物多孔膜收纳部的透明容器的下部设置玻璃制的喷淋器。此外，使用粘接剂将轴承(参照图7～8)设置于透明容器中央部，充分设置直至固定为止。在该状态下，与模块同样地利用伽马射线法进行灭菌。
将合计100个模块灭菌性地设置于旋转培养装置的模块收纳部内(参照图9的(B))，将其设置在透明容器内部的中央轴承部上。在CO2培养箱内设置磁力搅拌器，在其上放置旋转培养装置。
向上述准备的生物反应器内添加CHO细胞单层培养用培养基KBM CHO HBM1(KOHJIN-BIO公司制)450ml，使模块以60rpm的转速在培养基中浸渍约30分钟。将CHO细胞单层培养用培养基KBM CHO HBM1(KOHJIN-BIO公司制)废弃50ml，添加包含CHO DP-12的悬浮液(总细胞数为2.62×106cells/ml、活细胞数为2.29×106cells/ml、死细胞数为3.23×105cells/ml、活细胞率为88％)50mL，静置约1.5小时，其后，在使生物反应器以60rpm的转速旋转的状态下培养约18.5小时，使细胞对模块吸附合计约20小时(每张片材的设想平均活细胞吸附数为6.36×104cells)。由回收的培养基算出的活细胞吸附率为94％。
其后，去除培养基，添加CHO细胞单层培养用培养基KBM CHO HBM1(KOHJIN-BIO公司制)450ml，一边以气泡不会从容器溢出这一程度的流量进行氧浓度为40％的通气一边培养。自培养开始起4天、10天后进行培养基的更换。每天进行少量的取样，使用Cedex Bio(ROCHE-DIAGNOSTICS公司制)测定培养基中的每一天的葡萄糖消耗量、乳酸产生量、乳酸脱氢酶量和抗体产生量。确认到经时性地消耗葡萄糖，并持续性地产生抗体和乳酸。
需要说明的是，将直至初次更换培养基为止的培养开始后4天内的葡萄糖消耗浓度和乳酸产生浓度示于表3。
[表3]
Figure BDA0002598488470000311
(实施例3)
使用AS-ONE公司制的150cm2培养皿14片，将人皮肤成纤维细胞(Lonza CAT#CC-2511)在KOHJIN-BIO公司制的培养基(KBM Fibro Assist)中培养至成为约6500cells/cm2。
将具有图5和图6所示结构的模块30个投入至灭菌用袋(Thermo FisherScientific公司制)中，进行伽马射线照射灭菌。此外，模块中使用的聚酰亚胺多孔膜的尺寸为1.0cm×1.0cm，聚酰亚胺多孔膜的总片数为540片、总面积为540cm2。准备利用3D打印机准备的形状与实施例2类似的旋转型反应器和带有用于放置反应器的轴承的透明容器。与实施例2不同，在本实施例中，未设置玻璃制喷淋器，采用了仅通过旋转来进行供氧的系统。将这些旋转培养容器和透明容器与模块同样地利用伽马射线法进行灭菌后，将合计30个模块灭菌性地设置于旋转型反应器的模块收纳部，将其放置在透明容器内部。
在CO2培养箱内设置磁力搅拌器，在其上方放置旋转培养装置。
向上述准备的生物反应器内添加KOHJIN-BIO公司制的培养基(KBM FibroAssist)270ml，使模块以约60rpm的转速在培养基中浸渍约30分钟。
添加包含人皮肤成纤维细胞的悬浮液(总细胞数为1.23×106cells/ml、活细胞数为1.00×106cells/ml、死细胞数为2.30×105cells/ml、活细胞率为81％)30mL，并静置约1小时，其后，在使生物反应器以约60rpm的转速旋转的状态下培养约23小时，使细胞对模块吸附合计约24小时(每1张片材的设想平均活细胞吸附数为5.56×104cells)。由吸附开始约5小时后的培养基算出的活细胞吸附率为95％。
其后，去除培养基，添加KOHJIN-BIO公司制的培养基(KBM Fibro Assist)300ml来进行培养。自培养开始起基本上以3天或4天的间隔进行培养基的更换，使用Cedex Bio(ROCHE-DIAGNOSTICS公司制)测定培养基中的葡萄糖消耗量、乳酸产生量、乳酸脱氢酶量。确认到经时性地消耗葡萄糖，且持续性地产生乳酸。
将培养开始后的葡萄糖浓度和乳酸浓度示于图10。
附图标记说明
1 细胞培养装置
2 培养容器
20 盖体
21 过滤器
22 培养容器底部
3、3a 旋转式聚合物多孔膜收纳部
30、30a 底部
300、300a 第一培养基流出流入口
31、31a 侧部
310、310a 第二培养基流出流入口
311a 旋转叶片
312a 间隔构件
32、32a 顶部
320、320a 第三培养基流出流入口
33、33a 旋转部
330、330a 旋转侧部
331、331a 旋转底部
332、332a 第四培养基流出流入口
333、333a 旋转动力接收单元
334a 旋转轴构件
335a 固定构件
34a 轴承
35a 轴部
4 旋转驱动单元
9 聚合物多孔膜
90 模块化聚合物多孔膜
900 壳体
L 细胞悬浮液面

Claims (15)

1.一种细胞培养装置，其特征在于，其具备：
培养容器；
收纳于所述培养容器且具有1个以上的培养基流出流入口的旋转式聚合物多孔膜收纳部；以及
收纳于所述旋转式聚合物多孔膜收纳部的聚合物多孔膜，
此处，所述聚合物多孔膜具备具有多个孔的表面层A和表面层B、以及夹在所述表面层A与表面层B之间的大孔隙层的三层结构，此处，存在于所述表面层A的孔的平均孔径小于存在于所述表面层B的孔的平均孔径，所述大孔隙层具有与所述表面层A和B结合的分隔壁、以及被该分隔壁及所述表面层A和B包围的多个大孔隙，所述表面层A和B中的孔与所述大孔隙连通，
此处，所述聚合物多孔膜为模块化聚合物多孔膜，
所述旋转式聚合物多孔膜收纳部以独立于所述培养容器的方式旋转。
2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其具备用于使所述旋转式聚合物多孔膜收纳部旋转的旋转驱动单元。
3.根据权利要求2所述的细胞培养装置，其中，所述旋转式聚合物多孔膜收纳部具备旋转动力接收单元。
4.根据权利要求3所述的细胞培养装置，其中，所述旋转动力接收单元为磁体。
5.根据权利要求4所述的细胞培养装置，其中，所述旋转驱动单元为磁力搅拌器。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述模块化聚合物多孔膜是具备壳体的模块化聚合物多孔膜，
此处，所述模块化聚合物多孔膜以如下方式收纳在所述壳体内，
(i)2个以上的独立的所述聚合物多孔膜被汇集，
(ii)所述聚合物多孔膜被折叠，
(iii)所述聚合物多孔膜被卷成卷状，和/或
(iv)所述聚合物多孔膜被连接成绳状。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔膜具有平均孔径为0.01～100μm的多个细孔。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述表面层A的平均孔径为0.01～50μm。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述表面层B的平均孔径为20～100μm。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔膜的总膜厚为5～500μm。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔膜为聚酰亚胺多孔膜。
12.根据权利要求11所述的细胞培养装置，其中，所述聚酰亚胺多孔膜包含由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺。
13.根据权利要求11或12所述的细胞培养装置，其中，所述聚酰亚胺多孔膜是通过将包含着色前体以及由四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液的聚酰胺酸溶液组合物成形后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔膜。
14.根据权利要求1～10中任一项所述的细胞培养装置，其中，所述聚合物多孔膜为聚醚砜(PES)多孔膜。
15.一种细胞的培养方法，其使用权利要求1～14中任一项所述的细胞培养装置。
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