JP6969614B2 - 細胞培養装置、及びそれを使用した細胞培養方法 - Google Patents
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Description
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルタ、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献2〜4は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。
前記培養容器に収容され、1以上の培地流出入口を有する回転式ポリマー多孔質膜収容部と;
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部に収容された、ポリマー多孔質膜と;
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、モジュール化ポリマー多孔質膜であり、
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が、前記培養容器とは独立して回転することを特徴とする、細胞培養装置。
[2] 前記回転式ポリマー多孔質膜収容部を回転させるための、回転駆動手段を備えた、[1]に記載の細胞培養装置。
[3] 前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が回転動力受信手段を備えた、[2]に記載の細胞培養装置。
[4] 前記回転動力受信手段が、磁石である、[3]に記載の細胞培養装置。
[5] 前記回転駆動手段が、マグネチックスターラーである、[4]に記載の細胞培養装置。
[6] 前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
(i)2以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
(ii)前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
(iii)前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び/又は、
(iv)前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものである、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
[7] 前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径0.01〜100μmの複数の細孔を有する、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
[8] 前記表面層Aの平均孔径が、0.01〜50μmである、[1]〜[7]のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
[9] 前記表面層Bの平均孔径が、20〜100μmである、[1]〜[8]のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
[10] 前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、5〜500μmである、[1]〜[9]のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
[11] 前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、[1]〜[10]のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
[12] 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、[11]に記載の細胞培養装置。
[13] 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、[11]又は[12]に記載の細胞培養装置。
[14] 前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン(PES)多孔質膜である、[1]〜[10]のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層A(以下で、「A面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ)に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、0.01μm以上200μm未満、0.01〜150μm、0.01〜100μm、0.01〜50μm、0.01μm〜40μm、0.01μm〜30μm、0.01μm〜25μm、0.01μm〜20μm、又は0.01μm〜15μmであり、好ましくは、0.01μm〜25μmである。
(1)多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真から、200点以上の開孔部について孔面積Sを測定し、該孔面積を真円と仮定して式Iからそれぞれの孔径dを求める。
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
1)1,4−ジアミノベンゼン(パラフェニレンジアミン)、1,3−ジアミノベンゼン、2,4−ジアミノトルエン、2,6−ジアミノトルエンなどのベンゼン核1つのべンゼンジアミン;
2)4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ビス(トリフルオロメチル)−4,4’−ジアミノビフェニル、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジカルボキシ−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’,5,5’−テトラメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、ビス(4−アミノフェニル)スルフィド、4,4’−ジアミノベンズアニリド、3,3’−ジクロロベンジジン、3,3’−ジメチルベンジジン、2,2’−ジメチルベンジジン、3,3’−ジメトキシベンジジン、2,2’−ジメトキシベンジジン、3,3’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,3’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、4,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,3’−ジアミノジフェニルスルホン、3,4’−ジアミノジフェニルスルホン、4,4’−ジアミノジフェニルスルホン、3,3’−ジアミノベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジクロロベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジメトキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノジフェニルメタン、3,4’−ジアミノジフェニルメタン、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、3,3’−ジアミノジフェニルスルホキシド、3,4’−ジアミノジフェニルスルホキシド、4,4’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核2つのジアミン;
3)1,3−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェノキシ)−4−トリフルオロメチルベンゼン、3,3’−ジアミノ−4−(4−フェニル)フェノキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジ(4−フェニルフェノキシ)ベンゾフェノン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(3−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核3つのジアミン;
4)3,3’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、3,3’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核4つのジアミン。
(i)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
(ii)テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び/又は、
(iii)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
本発明で使用され得るPES多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
対数粘度0.5〜1.0のポリエーテルスルホンの0.3質量%〜60質量%と有機極性溶媒40質量%〜99.7質量%とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、PES多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは240℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が10μm〜500μmである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが0.1μm〜50μmであり、
前記表面層A及びBはそれぞれ、厚さが0.1μm〜50μmであり、
前記表面層A及びBのうち、一方が平均孔径5μm超200μm以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径0.01μm以上200μm未満の複数の細孔を有し、
表面層A及び表面層Bの、一方の表面開口率が15%以上であり、他方の表面層の表面開口率が10%以上であり、
前記表面層A及び前記表面層Bの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記PES多孔質膜は、総膜厚が5μm〜500μmであり、かつ空孔率が50%〜95%である、
PES多孔質膜である。
本発明は、
培養容器と;
前記培養容器に収容され、1以上の培地流出入口を有する回転式ポリマー多孔質膜収容部と;
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部に収容された、ポリマー多孔質膜と;
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、モジュール化ポリマー多孔質膜であり、
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が、前記培養容器とは独立して回転することを特徴とする、細胞培養装置に関する。
図1は、一実施態様における本発明の細胞培養装置1を示す図である。また、図2〜4は、一実施態様における、回転式ポリマー多孔質膜収容部3を示す図である。
(i)2以上の独立した前記ポリマー多孔質膜9が、集約されて、
(ii)前記ポリマー多孔質膜9が、折り畳まれて、
(iii)前記ポリマー多孔質膜9が、ロール状に巻き込まれて、及び/又は、
(iv)前記ポリマー多孔質膜9が、縄状に結ばれて、
該ケーシング900内に収容されたものであってもよく、該モジュール化ポリマー多孔質膜90を回転式ポリマー多孔質膜収容部3へ適用することが可能である。
本発明で使用される細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
(B)前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞懸濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様;並びに、
(C)前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に細胞懸濁液を装填し、そして、
細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
抗ヒトIL−8抗体産生CHO−DP12細胞(ATCC CRL−12445)を馴化・浮遊化した細胞を、培地(BalanCD(商標)CHO Growth A)を用いて浮遊培養し、1mlあたりの生細胞数が3.51×106cells/ml、(総細胞数3.83×106cells/ml、生細胞率92%)になるまで培養を継続した。図5及び6に示す構造を有するモジュールを100個用意し、希釈したミルトン(登録商標)(杏林製薬、日本)、超純水、70%エタノール含有水にて洗浄した後、滅菌的に乾燥し、準備を完了した。経時変化を表2に示す。尚、モジュールで使用したポリイミド多孔質膜のサイズは、1.0×1.0cmであり、ポリイミド多孔質膜総枚数は1800枚、総面積は1800cm2となる。3Dプリンターにて準備した回転式ポリマー多孔質膜収容部(図2〜4)を用意し、合計100個のモジュールを滅菌的に上部空洞に設置し、透明容器内部に据えた。マグネチックスターラーをバイオリアクター下部に設置してからCO2インキュベータ内に移送し、培養準備を完了した。尚、透明容器は、上部の開放部分を不織布で覆い、雑菌混入を避けながら空気を取り入れる事の出来る形態とした。
細胞吸着に用いた培地を排出し、コージンバイオ株式会社製CHO細胞単層培養培地KBM270 200mlを回転バイオリアクター容器に注加し、56rpmの回転速度でバイオリアクターを回転させて培養を継続した。3日後、回転速度を192rpmに上昇させ、培養を進めた。培地交換は毎日行い、培地中の一日当たりのグルコール消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量をロシュ・ダイアグノスティックス社製Cedex Bioを用いて4日間測定した。経時的にグルコース消費及び乳酸の産生が向上し、安定的な細胞培養が進展している事が観察された。結果を表2に示す。
抗ヒトIL−8抗体産生CHO−DP12細胞(ATCC CRL−12445)を馴化・浮遊化した細胞を、培地(BalanCD(商標)CHO Growth A)中で浮遊培養し、1mlあたりの生細胞数が2.29×106cells/ml、(総細胞数2.62×106cells/ml、生細胞率88%)になるまで培養を継続した。
ヒト皮膚線維芽細胞(Lonza CAT#CC−2511)を、アズワン社製150cm2シャーレ14枚を用いて、コージンバイオ株式会社製培地(KBM Fibro Assist)中で約6,500cells/cm2になるまで培養した。
2 培養容器
20 蓋体
21 フィルタ
22 培養容器底部
3、3a 回転式ポリマー多孔質膜収容部
30、30a 底部
300、300a 第1培地流出入口
31、31a 側部
310、310a 第2培地流出入口
311a 回転翼
312a 仕切部材
32、32a 頂部
320、320a 第3培地流出入口
33、33a 回転部
330、330a 回転側部
331、331a 回転底部
332、332a 第4培地流出入口
333、333a 回転動力受信手段
334a 回転軸部材
335a 固定部材
34a 軸受
35a 軸部
4 回転駆動手段
9 ポリマー多孔質膜
90 モジュール化ポリマー多孔質膜
900 ケーシング
L 細胞懸濁液面
Claims (12)
- 培養容器と;
前記培養容器に収容され、1以上の培地流出入口を有する回転式ポリマー多孔質膜収容部と;
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部に収容された、ポリマー多孔質膜と;
を備え、
ここで前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜であり、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、モジュール化ポリマー多孔質膜であり、
前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
(i)2以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
(ii)前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
(iii)前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び/又は、
(iv)前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に流体によって継続的に波打つ動きを行わない状態で収容されたものであり、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が前記回転式ポリマー多孔質膜収容部内に固定されていないものであり、
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が、前記培養容器とは独立して回転することを特徴とする、細胞培養装置。 - 前記回転式ポリマー多孔質膜収容部を回転させるための、回転駆動手段を備えた、請求項1に記載の細胞培養装置。
- 前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が回転動力受信手段を備えた、請求項2に記載の細胞培養装置。
- 前記回転動力受信手段が、磁石である、請求項3に記載の細胞培養装置。
- 前記回転駆動手段が、マグネチックスターラーである、請求項4に記載の細胞培養装置。
- 前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径0.01〜100μmの複数の細孔を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記表面層Aの平均孔径が、0.01〜50μmである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記表面層Bの平均孔径が、20〜100μmである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、5〜500μmである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。
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