KR102059248B1 - 세포의 배양 방법 및 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포의 배양 방법 및 키트에 관한 것이다. 상세하게는, 공기에 노출된 담체를 이용한 세포의 배양 방법 및 키트에 관한 것이다. 또한, 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법에 관한 것이다.

Description

세포의 배양 방법 및 키트
본 발명은 세포의 배양 방법 및 키트에 관한 것이다. 상세하게는, 공기에 노출된 담체를 이용한 세포의 배양 방법 및 키트에 관한 것이다. 또한, 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법에 관한 것이다.
세포 배양
세포는 생체 내에서는 일반적으로 삼차원적인 집단으로서 존재하지만, 고전적인 평면 배양에서는, 세포가 용기에 달라붙는 형태로 단층형으로 배양된다. 배양 환경의 차이에 따라, 세포의 성질도 크게 상이한 것이 수많이 보고되어 있다. 또한, 액체 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 부유 배양에 대해서는, 부유 배양에 적합한 세포가 있는 한편, 적합하지 않은 세포도 있다.
최근, 배양 세포를 이용하는 백신, 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등 생체 내 단백질 등의 산생(産生)이나 혹은 재생 의료에 있어서의 세포 이식 등이 주목을 모음에 따라, 대량의 세포를 효율적이고 또한 간편하게 배양하는 방법론이 주목을 모으고 있다. 세포 배양에 있어서는, 세포 배양용 담체를 이용하는지, 이용하지 않는지에 관계없이, 또한, 부유 세포인지 부착성 세포인지에 관계없이, 혐기성 세균을 제외하면, 산소 공급은 세포의 건전한 육성을 위해서 중요한 과제이다. 예컨대, 부착성 세포를 샬레나 플레이트 혹은 챔버를 이용하여 평면 배양하는 경우, 배양 용기의 면적에 대해 배지량의 적정 범위에 제한이 있다. 그 때문에, 불필요하게 다량의 배지를 사용한 경우에는, 세포에 충분한 산소가 공급되지 않아, 저산소에 의한 장해가 발생하는 케이스나 세포가 죽음에 이르는 케이스도 발생할 수 있다. 또한, 세포군이 스페로이드를 형성하는 경우, 그 사이즈가 지나치게 커지면, 내부의 세포는 산소 부족에 빠지는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1). 이러한 산소 공급 과제에 대해, 마이크로 버블의 이용에 의한 산소 농도의 향상(특허문헌 1)이나 마이크로 캐리어 배양에 있어서의 균일한 산소 공급 방법(특허문헌 2) 등의 시도가 이루어지고 있다.
세포 배양용 담체를 기상(氣相)에 노출하여 배양하는 방법의 시도도 이루어지고 있다. 예컨대, 중공사 배양에 있어서의 액상/기상 노출 바이오리액터(특허문헌 3)에 대해서는, 세포가 생식하는 중공사가 회전하여 기상과 액상에 교대로 노출되는 시스템이 소개되어 있다. 또한, 세포 배양을 실시하는 데 있어서, 핸들링 등이 우수한 시트형 담체에 대해, 전체가 기상에 노출되는 시스템도 소개되어 있으나(특허문헌 4), 구체적인 실시형태는 특정되어 있지 않다.
담체의 기상 노출이 세포 배양 시에 가능해지면, 세포 배양에 있어서의 산소 공급의 과제가 크게 개선되기 때문에, 효율적 배양 방법의 확립을 위해서는, 매우 매력적인 방법론이 될 수 있다. 그러나, 기지의 세포 배양 담체인 섬유성 소재에서는 건조 등을 피할 수 없기 때문에, 소재를 포함한 신규의 "기상에 담체가 노출될 수 있는 배양 방법"의 확립이 희구(希求)되고 있다.
세포는 그 생존 형태의 특징에 따라, 크게는, 부유 세포와 부착성 세포의 2종으로 크게 나뉜다. 부착성 세포의 배양에 있어서는, 세포가 분열·증식하는 과정에 있어서, 그 세포가 성육(成育)하고 있는 기반에 유한한 범위가 존재하기 때문에, 증식이 진행되면 자연히 그 기반에서의 증식 한계에 이르는 것은 피할 수 없다. 이것은, 표준적인 샬레 등의 평면에서의 배양의 경우에서도, 매체를 이용하는 3차원적인 배양에서도, 공통된 진실이다.
세포의 증식을 추진하기 위해서는, 계대(繼代)는 필요 불가결하며, 어떤 용도·방법에서도 중요한 작업인데, 트립신이나 콜라게나아제 등으로 세포를 처리하여 기반으로부터 분리하고, 세포 현탁액을 거쳐 재차 파종하는 작업은, 컨태미네이션(contamination) 등의 리스크를 수반하는 작업인 데다가 큰 수고가 들고, 세포에 대한 스트레스도 간과할 수 없다고 하는 사고 방식도 있다.
매체를 이용하는 배양 방법으로서 대표적이라고 할 수 있는 마이크로 캐리어 배양에 있어서는, 캐리어 사이에서의 세포의 교환이 달성되고 있으나, 어디까지나 마이크로 캐리어 배양 중에서의 취급이며, 마이크로 캐리어가 갖는 형상이나 사이즈의 규정성으로부터 벗어날 수 있는 방법이 아니고, 마이크로 캐리어의 형태에 한정되고 있다.
최근, 이 마이크로 캐리어 배양에 있어서 쿄토 대학·닛산 화학·니프로 등의 발명에 의해, 젤란검을 이용하는 ES 및 iPS 세포의 대량 배양법이 발명되어, 세포 현탁액을 거치지 않고 세포를 계대하는 방법이 발견되어 있다. 여기서는, 스페로이드라고 불리는 세포 덩어리의 형성을 액 중에서 부유시키면서 행하고, 이 스페로이드의 확대와 소괴화(小塊化)를 반복함으로써, 현탁액을 거치지 않고 세포 배양을 실현하고 있으나, 스페로이드를 형성하는 세포에 한정되고, 또한, 스페로이드의 집합화를 방지하기 위해서 상세한 타이밍 제어가 필요하다는 등, 많은 수고가 필요해지기 때문에, 효율적이라고는 말하기 어려운 데다가, 본질적으로, 마이크로 캐리어 배양이 갖는, 형상적 규정성에 대해서도 해결되어 있지 않다.
한편, 일반적인 배양 방법에 있어서는, 배양 세포의 배양면의 일부에 분리 가능한 고무형 재료를 이용하여 피복하고, 거기로 이동한 세포를 피복째 분리해서, 샬레 등으로 이송하여 배양하는 방법론이 알려져 있으나, 일시적으로 이송 가능하다고 하는 사실에 불과하며, 계속적이고 또한 대량의 세포 배양에의 전개라고 하는 시점에서는 과제는 다루어지고 있지 않고, 해결도 되어 있지 않다.
세포를 대량으로 배양·증식시켜, 용도에 맞춰 효율적으로 키우기 위해서는, 세포 현탁액을 거치지 않는 형태로, 간편하고 또한 자동화에 적합하며, 또한 형상이나 크기에 구애되지 않는 적응성이 높은 시스템에 의해 세포를 계대시킬 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 그 방법론을 정상적인 세포 배양과 직결시킬 수 있는 신규의 시스템의 구축이 희구되고 있다.
폴리이미드 다공질막
폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭이다. 방향족 폴리이미드는, 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 고분자를 의미한다. 방향족 폴리이미드는 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공역 구조를 갖기 때문에, 강직하고 강고한 분자 구조를 가지며, 또한, 이미드 결합이 강한 분자간력을 갖기 때문에 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.
폴리이미드 다공질막은, 본 발명 전부터 필터, 저유전율 필름, 연료 전지용 전해질막 등, 특히 전지 관계를 중심으로 하는 용도를 위해서 이용되어 왔다. 특허문헌 8∼10은, 특히, 기체 등의 물질 투과성이 우수하고, 공공률(空孔率)이 높은, 양 표면의 평활성이 우수하고, 상대적으로 강도가 높으며, 높은 공공률임에도 불구하고, 막 두께 방향으로의 압축 응력에 대한 내력이 우수한 매크로 보이드를 다수 갖는 폴리이미드 다공질막을 기재하고 있다. 이들은 모두, 아믹산을 경유하여 작성된 폴리이미드 다공질막이다.
일본 특허 제5549209호 일본 특허 제5460241호 WO2005/121311 일본 특허 공개 제2001-190270 일본 특허 공개 평성 제7-313151 일본 특허 공개 평성 제5-335368 일본 특허 공개 제2003-180337 WO2010/038873 일본 특허 공개 제2011-219585 일본 특허 공개 제2011-219586
쿠로사와 히로시, 생물 공학 제91권, 2013년 제11호 646-653 Otsuji et al., Stem Cell Reports, Vol.2, 734-745, May 6, 2014
본 발명은 세포의 배양 방법 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 상세하게는, 공기에 노출된 담체 상에서 세포를 배양하는 방법 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 폴리이미드 다공질막과 같은 시트형 세포 배양 담체가 세포의 접착, 배양에 적합한 것을 발견하고, 본 발명에 상도하였다. 본 발명자들은, 폴리이미드 다공질막과 같은 시트형 세포 배양 담체에 세포를 배양하고, 기상에 직접 접촉시킴으로써, 매우 작은 체적에서 많은 세포를 배양할 수 있는 가능성을 발견하고, 적용 범위를 검증하였다. 담체를 기상에 직접 접촉시킴으로써, 산소 공급의 효율이 크게 개선되는 것이 기대되지만, 배지의 고갈에 의한 세포사도 상정되기 때문에, 각종 조건 하에서 그 가능성을 검증하여, 본 발명을 완성하였다. 또한, 담체가 기상에 폭로됨으로써, 막끼리의 밀착성이 향상되고, 세포가 시트 사이를 자유롭게 이동할 가능성도 발견되며, 세포에 있어서 바람직한 큰 입체 공간이 발생하는 것도 기대된다.
또한, 본 발명자들은, 세포 현탁액을 거치지 않는 형태로, 적응성이 높은 시스템에 의해 세포를 계대시키는 방법을 제공한다고 하는 과제의 해결을 위해서, 예의 연구를 수행한 결과, 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양을 이용함으로써, 바람직한 결과가 얻어지는 것을 발견하고, 본 발명을 상도하였다. 구체적으로는, 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양에서는, 막이 갖는 세포가 통과 가능한 대구경 연결 구멍을 활용하여 이 공간에서 세포가 안정적으로 생식하기 때문에, 막끼리가 밀착되어 있는 한, 세포는 어느 정도 자유롭게 막 내뿐만이 아니라 막 사이도 이동할 수 있다. 이 특성을 활용하여, 세포가 성육하고 있는 매체(샬레, 디쉬, 컬쳐 플레이트, 마이크로 캐리어, 실리카 다공체, 셀룰로오스 스펀지, 폴리이미드 다공질막 및 그 외 세포 배양 매체)에, 세포가 성육하고 있지 않은 폴리이미드 다공질막을 밀착시킴으로써 세포의 이동을 야기하여, 계속적이고 또한 간편하게 세포 배양과 계대를 계속할 수 있다.
한정되는 것은 아니지만, 본 발명은 바람직하게는 이하의 양태를 포함한다.
[1]
세포의 배양 방법으로서,
(1) 1 또는 복수의 시트형 다공질 담체에 세포를 담지시키는 공정,
(2) 세포를 담지시킨 시트형 다공질 담체에 배지를 적용해서, 시트형 다공질 담체의 구멍의 일부 또는 전부에 배지가 포함된 상태로 하여, 시트형 다공질 담체를 배지로 습윤시키는 공정,
(3) 배지를 수용하는 배양 용기 중에, 배지로 습윤시킨 시트형 다공질 담체 표면의 일부 또는 전체가 기상에 폭로되도록 시트형 다공질 담체를 배치하는 공정, 및
(4) 배양 용기를 인큐베이터 내에 설치하여, 세포를 배양하는 공정
을 포함하고, 여기서 배양을 통해 시트형 다공질 담체 표면 및 내부의 습윤 상태가 유지되는 것인 배양 방법.
[2]
공정 (4)에 있어서, 배양 용기 내에 연속적 또는 간헐적으로 배지가 공급되고, 여기서 배양을 통해 배지로 습윤시킨 시트형 다공질 담체의 일부 또는 전체가 기상에 폭로되어 있는 [1]에 기재된 배양 방법.
[3]
공정 (4)에 있어서, 세포를 배양하는 공정이, 산소를 공급하는 수단으로 산소를 공급하면서 배양하는 공정인 [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4]
공정 (3)에 있어서, 시트형 다공질 담체를 강체(剛體) 위에 배치하는 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5]
강체가 금속 메시인 [4]에 기재된 방법.
[6]
공정 (3)에 있어서, 1 또는 복수의 시트형 다공질 담체의 상면의 일부 또는 전부를 피복하도록, 시트형 다공질 담체보다 평균 공경이 큰 다공질 시트를 배치하는 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[7]
시트형 다공질 담체보다 평균 공경이 큰 다공질 시트가 부직포, 거즈, 및 스펀지로 이루어지는 군에서 선택되는 [6]에 기재된 방법.
[8]
배양 용기가 개방 용기인 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[9]
배양 용기가 폐쇄 용기인 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[10]
공정 (3)에 있어서, 2 이상의 시트형 다공질 담체를 상하로 적층하여 배치하는 [1]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[11]
공정 (3)에 있어서, 1 또는 복수의 시트형 다공질 담체를 접어 배치하는 [1]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[12]
1 또는 복수의 시트형 다공질 담체가 폴리이미드 다공질막인 [1]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[13]
폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 [12]에 기재된 방법.
[14]
폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 [13]에 기재된 방법.
[15]
상기 폴리이미드 다공질막이, 2개의 상이한 표층면과 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조의 폴리이미드 다공질막인 [13] 또는 [14]에 기재된 방법.
[16]
세포가, 물질을 발현하도록 유전자 공학 기술에 의해 형질전환되어 있는 [1]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[17]
세포가 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 [1]∼[16] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[18]
동물 세포가, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인 [17]에 기재된 방법.
[19]
세포가 CHO 세포, CHO-K1 세포, 베로(Vero) 세포, 및 MDCK 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 [18]에 기재된 방법.
[20]
폴리이미드 다공질막을 포함하는, [1]∼[19] 중 어느 하나에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트.
[21]
폴리이미드 다공질막의, [1]∼[19] 중 어느 하나에 기재된 방법을 위한 용도.
[22]
세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체에 폴리이미드 다공질막을 접촉시킴으로써 세포를 세포 배양 매체로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동시키고, 그리고, 폴리이미드 다공질막으로 이동한 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법.
[23]
세포 배양 매체가, 샬레, 디쉬, 배양 플레이트, 배양 플라스크, 마이크로 웰 플레이트 및 유리 바닥 디쉬(glass bottom dish)로 이루어지는 군에서 선택되고, 그리고, 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 매체의 상면에 접촉시키는 것을 포함하는 [22]에 기재된 방법.
[24]
세포 배양 매체가, 마이크로 캐리어, 실리카 다공체, 셀룰로오스 스펀지, 부직포 및 중공사로 이루어지는 군에서 선택되고, 그리고, 상기 세포 배양 매체의 상부, 하부 또는 그 양방으로부터, 단수 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 접촉시키는 것을 포함하는 [22]에 기재된 방법.
[25]
세포를 배양하고 있는 제1 폴리이미드 다공질막의 상면, 하면 혹은 그 양방으로부터, 세포를 배양하고 있지 않은 제2 폴리이미드 다공질막을 접촉시킴으로써, 세포를 제1 폴리이미드 다공질막으로부터 제2 다공질막으로 이동시키고, 그리고, 제2 폴리이미드 다공질막으로 이동한 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법.
[26]
제1 폴리이미드 다공질막과 제2 폴리이미드 다공질막이 접촉한 상태인 채로, 막 집합체를 기상 중으로 들어올리는 것을 포함하는 [25]에 기재된 방법.
[27]
세포를 배양하고 있지 않은 빈 제1 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하여, 제1 폴리이미드 다공질막에서 세포를 배양하는 공정을 더 포함하는 [25] 또는 [26]에 기재된 방법.
[28]
세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체에 빈 제1 폴리이미드 다공질막을 접촉시켜, 세포를 세포 배양 매체로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동시킴으로써, 제1 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하는 [27]에 기재된 방법.
[29]
세포를 포함하는 생체 시료를, 폴리이미드 다공질막의 상면, 하면 혹은 그 양방에 접촉시킴으로써, 세포를 생체 시료로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동시키고, 그리고, 폴리이미드 다공질막으로 이동한 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법.
[30]
상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 [22]∼[29] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[31]
상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 [30]에 기재된 방법.
[32]
상기 폴리이미드 다공질막이, 2개의 상이한 표층면과 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조의 폴리이미드 다공질막인 [30] 또는 [31]에 기재된 방법.
[33]
상기 폴리이미드 다공질막의 막 두께가 75 ㎛ 이하인 [32]에 기재된 방법.
[34]
세포가 이동한 2 이상의 폴리이미드 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 세포를 배양하는 [22]∼[33] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[35]
세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체, 세포를 포함하는 생체 시료, 혹은, 세포를 배양하고 있는 폴리이미드 다공질막으로부터 세포를 배양하고 있지 않은 폴리이미드 다공질막으로의 세포의 이동을, 2회 이상 반복하는 것을 포함하는 [22]∼[34] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[36]
폴리이미드 다공질막을 포함하는, [22]∼[35] 중 어느 하나에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트.
[37]
폴리이미드 다공질막의, [22]∼[35] 중 어느 하나에 기재된 방법을 위한 용도.
본 발명은 폴리이미드 다공질막과 같은 시트형 다공질 담체를 이용하여 세포를 배양하고, 그 때, 시트형 다공질 담체 내부 및 표면의 습윤 환경을 유지한 채로, 시트형 다공질 담체 표면의 일부 또는 전체를 기상에 노출함으로써, 세포에의 효율적인 공기의 공급을 가능하게 한다. 본 발명에 의하면, 큰 스케일의 세포 배양계여도, 산소 공급을 위한 특별한 장치를 필요로 하지 않는다. 또한, 본 발명에서는, 배지 내에 시트형 다공질 담체가 깊이 가라앉아 있지 않기 때문에, 배지 교환에 있어서, 반드시 시트형 다공질 담체를 이동시킬 필요가 없다. 예컨대, 시트형 다공질 담체의 상부 또는 하부에 연속적 또는 간헐적인 배지의 흐름을 만듦으로써, 배지 교환을 행하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명을 이용한 세포 배양 시스템에는 교반 등의 가동부를 필요로 하지 않기 때문에, 견고성이 우수하고, 안정도가 높은 세포 배양계도 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 폴리이미드 다공질막을 이용함으로써, 세포 현탁액을 거치지 않는 형태로, 간편하고 또한 효율적으로 세포를 계대시키는 것이 가능해졌다.
또한 본 발명에 의하면, 종래 부착 세포에서 계대가 필요한 컨플루언트(confluent)한 상태가 된 경우라도, 세포가 파종되어 있지 않거나, 및/또는, 세포가 생착하는 스페이스를 가진 폴리이미드 다공질막을, 컨플루언트 또는 서브컨플루언트하게 된 세포 배양 담체에 밀착(예컨대, 협지하거나, 적층하는 등)시킴으로써, 종래 이용되는 트립신 등을 사용하지 않고, 확대 배양이 가능해진다.
도 1은 실시예 3에 있어서, 세포를 배양하고 있는 폴리이미드 다공질막을, 상하 1장씩 빈 폴리이미드 다공질막 사이에 끼워 접촉시키고, 이들의 집합체를 기상에 노출시킴으로써 밀착시킨 경우의, 세포의 이동을 조사한 결과를 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 양태인 「폴리이미드 다공질막으로부터 빈 폴리이미드 다공질막으로의 세포의 이동」을 도시한 모식도이다. 세포를 배양한 폴리이미드 다공질막(제1 폴리이미드 다공질막)을 빈 폴리이미드 다공질막(제2 폴리이미드 다공질막) 몇 장으로 상하 혹은 어느 한쪽으로부터 끼워 넣어, 적층한 집합체를 준비한다. 준비한 적층 집합체를, 예컨대, 스테인리스 메시와 유리 큐브를 추로 하여 샬레 바닥부에 가라앉히고, 양방을 접촉시킴으로써, 세포가 생육하고 있는 폴리이미드 다공질막으로부터 빈 상기 막으로 세포를 이동시킨다. 이 경우, 세포는, 물리적 압박력에 의해 강제적으로 떼내어지는 것이 아니라, 세포의 자발 운동에 의해, 능동적으로 이동이 발생한다.
도 3은 실시예 4에 있어서, 인간 피부 섬유아세포를 배양하고 있는 폴리이미드 다공질을, 상하 1장씩 빈 폴리이미드 다공질막 사이에 끼워 배지 중에 가라앉히고, 추를 이용하여 접촉시킨 경우의, 세포의 이동을 조사한 결과를 도시한다.
도 4는 극소 배지를 이용한 세포 배양의 예를 도시한다. 샬레 내에서 세포 배양을 실시하고 있는 폴리이미드 다공질막으로부터 배지를 제거한다. 샬레 내에서 실질적으로 배지가 없어진 상태로, 인큐베이터로 복귀시켜, 배양을 계속한다.
도 5는 실시예 6에 있어서, CHO 세포를 배양하고 있는 폴리이미드 다공질을, 상하 1장씩 빈 폴리이미드 다공질막 사이에 끼워 접촉시킨 "3단 겹침"의 경우, 및 상하 2장씩 빈 폴리이미드 다공질막 사이에 끼워 접촉시킨 "5단 겹침"의 경우의, 실험의 개관 사진을 나타낸다.
도 6은 실시예 6에 있어서, CHO 세포를 배양하고 있는 폴리이미드 다공질을, 상하 1장씩 빈 폴리이미드 다공질막 사이에 끼워 접촉시킨 "3단 겹침"의 경우의 세포의 증식 결과에 대해 도시한다.
도 7은 실시예 6에 있어서, CHO 세포를 배양하고 있는 폴리이미드 다공질을, 상하 2장씩 빈 폴리이미드 다공질막 사이에 끼워 접촉시킨 "5단 겹침"의 경우의 세포의 증식 결과에 대해 도시한다.
도 8은 실시예 7에 있어서, 세포를 배양하고 있는 폴리이미드 다공질을, 여러 가지 형태로 다중으로 적층시켜, 세포를 계대·증식시킨 경우의, 실험 개념도를 도시한다.
도 9는 배지 공급 장치를 이용한 담체만의 배양의 예를 도시한다. 금속 메시 위에 세포를 파종한 폴리이미드 다공질막을 적층하여 배치하고, 그 위로부터 배지를 연속적 또는 간헐적으로 첨가함으로써 세포를 계속적으로 배양할 수 있다. 배지의 고임이 없는 상태에서 세포가 배양되기 때문에, 간편한 장치임에도 불구하고, 작은 공간에서도 매우 대량의 세포를 배양할 수 있다. 실제의 운용에는, 세포 배양의 장해가 되는 거품을 제거하기 위한 탈포 유닛이나, 표면에서의 편류 방지를 위한 부직포, 케이싱 등을 구비한 구체도도 병기한다.
도 10은 도 9에서 개념도로 나타낸 연속 배양 장치에서의 배양의 경우에 대해, 각각의 시트마다의 세포 육성 상황을, 배양 5일 후의 결과로서 도시한다. 횡축의 번호는, 위로부터 센 적층 시트의 번호를 의미한다. 실시예 8에 관한 것이다.
도 11은 본 발명의 세포 배양 장치를 이용한 CHO-K1 세포의 배양 결과를 형광 현미경 사진으로서 나타낸다.
도 12는 본 발명의 세포 배양 장치를 이용한 순화 CHO-K1 세포의 배양 결과를 형광 현미경 사진으로서 나타낸다.
도 13은 본 발명의 세포 배양 장치를 이용한 CHO-K1 세포의 배양 결과를 도시한 도면이다.
도 14는 본 발명의 방법을 이용한, MDCK 세포의 배양 결과를 도시한 도면이다.
도 15는 본 발명의 방법을 이용한, 인간 피부 섬유아세포의 배양 결과를 도시한 도면이다.
I. 세포의 배양 방법
본 발명은 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 한편, 국제 출원 번호 PCT/JP2014/070407의 모든 내용을, 참조에 의해 본 명세서에 원용한다.
본 발명의 세포의 배양 방법은, 세포를 폴리이미드 다공질막과 같은 시트형 다공질 담체에 담지시켜, 배양하는 것을 포함한다. 본 발명자들은, 시트형 다공질 담체가 세포의 접착, 배양에 적합한 것을 발견하고, 본 발명에 상도하였다. 본 발명의 방법은, 시트형 다공질 담체에 세포를 적용하여, 폴리이미드막의 표면 또는 내부에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
1. 시트형 다공질 담체
본 발명에 이용하는 시트형 다공질 담체는, 세포를 유지할 수 있는 구멍을 갖는 시트형의 담체이면 어느 것을 이용해도 좋으나, 예컨대 부직포, 폴리머성 다공질 필름, 폴리이미드 다공질막 등을 예시할 수 있다. 특히 폴리이미드 다공질막을 적합하게 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서 세포를 담지시키기 위한 폴리이미드 다공질막과 같은 시트형 다공질 담체는, 당연히, 장전하는 것 이외의 세포를 포함하지 않는 상태, 즉, 멸균되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법은, 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막과 같은 시트형 다공질 담체를 미리 멸균하는 공정을 포함한다. 폴리이미드 다공질막은, 내열성이 매우 우수하고, 경량이며, 형태·크기도 자유롭게 선택 가능하고, 멸균 처리가 용이하다. 건열 멸균, 증기 멸균, 에탄올 등 소독제에 의한 멸균, 자외선이나 감마선 등의 전자파 멸균 등 임의의 멸균 처리가 가능하다.
폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭이며, 통상은, 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 방향족 폴리이미드를 의미한다. 방향족 폴리이미드는 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공역 구조를 갖기 때문에, 강직하고 강고한 분자 구조를 가지며, 또한, 이미드 결합이 강한 분자간력을 갖기 때문에 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.
본 발명에 있어서 이용하는 폴리이미드 다공질막은, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 (주된 성분으로서) 포함하는 폴리이미드 다공질막이며, 보다 바람직하게는 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막이다. 「주된 성분으로서 포함한다」란, 폴리이미드 다공질막의 구성 성분으로서, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드 이외의 성분은, 본질적으로 포함하지 않거나, 혹은 포함되어 있어도 좋으나, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드의 성질에 영향을 주지 않는 부가적인 성분인 것을 의미한다.
테트라카르복실산 성분과 디아민 성분으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막도 포함된다.
폴리아믹산
폴리아믹산은, 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분을 중합하여 얻어진다. 폴리아믹산은, 열 이미드화 또는 화학 이미드화함으로써 폐환(閉環)되어 폴리이미드로 할 수 있는 폴리이미드 전구체이다.
폴리아믹산은, 아믹산의 일부가 이미드화되어 있어도, 본 발명에 영향을 미치지 않는 범위이면 그것을 이용할 수 있다. 즉, 폴리아믹산은, 부분적으로 열 이미드화 또는 화학 이미드화되어 있어도 좋다.
폴리아믹산을 열 이미드화하는 경우에는, 필요에 따라, 이미드화 촉매, 유기 인 함유 화합물, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 또한, 폴리아믹산을 화학 이미드화하는 경우에는, 필요에 따라, 화학 이미드화제, 탈수제, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 폴리아믹산 용액에 상기 성분을 배합해도, 착색 전구체가 석출되지 않는 조건에서 행하는 것이 바람직하다.
착색 전구체
본 발명에 있어서 착색 전구체란, 250℃ 이상의 열처리에 의해 일부 또는 전부가 탄화하여 착색화물을 생성하는 전구체를 의미한다.
본 발명에서 이용되는 착색 전구체로서는, 폴리아믹산 용액 또는 폴리이미드 용액에 균일하게 용해 또는 분산되고, 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리, 바람직하게는 공기 등의 산소 존재 하에서의 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리에 의해 열분해하며, 탄화하여 착색화물을 생성하는 것이 바람직하고, 흑색계의 착색화물을 생성하는 것이 보다 바람직하며, 탄소계 착색 전구체가 보다 바람직하다.
착색 전구체는, 가열해 가면 언뜻 보아 탄소화물로 보이는 것이 되지만, 조직적으로는 탄소 이외의 이원소(異元素)를 포함하며, 층 구조, 방향족 가교 구조, 사면체 탄소를 포함하는 무질서 구조의 것을 포함한다.
탄소계 착색 전구체는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 석유 타르, 석유 피치, 석탄 타르, 석탄 피치 등의 타르 또는 피치, 코크스, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체, 페로센 화합물(페로센 및 페로센 유도체) 등을 들 수 있다. 이들 중에서는, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체 및/또는 페로센 화합물이 바람직하고, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체로서는 폴리아크릴로니트릴이 바람직하다.
테트라카르복실산 이무수물은, 임의의 테트라카르복실산 이무수물을 이용할 수 있고, 원하는 특성 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 테트라카르복실산 이무수물의 구체예로서, 피로멜리트산 이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물(s-BPDA), 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물(a-BPDA) 등의 비페닐테트라카르복실산 이무수물, 옥시디프탈산 이무수물, 디페닐술폰-3,4,3',4'-테트라카르복실산 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술피드 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판 이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실산 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실산 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)메탄 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)프로판 이무수물, p-페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산 무수물), p-비페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산 무수물), m-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산 이무수물, p-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산 이무수물, 1,3-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠 이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠 이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)비페닐 이무수물, 2,2-비스〔(3,4-디카르복시페녹시)페닐〕프로판 이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실산 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실산 이무수물, 4,4'-(2,2-헥사플루오로이소프로필리덴)디프탈산 이무수물 등을 들 수 있다. 또한, 2,3,3',4'-디페닐술폰테트라카르복실산 등의 방향족 테트라카르복실산을 이용하는 것도 바람직하다. 이들은 단독으로도, 2종 이상을 조합하여 이용할 수도 있다.
이들 중에서도, 특히, 비페닐테트라카르복실산 이무수물 및 피로멜리트산 이무수물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 테트라카르복실산 이무수물이 바람직하다. 비페닐테트라카르복실산 이무수물로서는, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물을 적합하게 이용할 수 있다.
디아민은, 임의의 디아민을 이용할 수 있다. 디아민의 구체예로서, 이하의 것을 들 수 있다.
1) 1,4-디아미노벤젠(파라페닐렌디아민), 1,3-디아미노벤젠, 2,4-디아미노톨루엔, 2,6-디아미노톨루엔 등의 벤젠핵 1개의 벤젠디아민;
2) 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르 등의 디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-비스(트리플루오로메틸)-4,4'-디아미노비페닐, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디카르복시-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3',5,5'-테트라메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 비스(4-아미노페닐)술피드, 4,4'-디아미노벤즈아닐리드, 3,3'-디클로로벤지딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 2,2'-디메틸벤지딘, 3,3'-디메톡시벤지딘, 2,2'-디메톡시벤지딘, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,3'-디아미노디페닐술피드, 3,4'-디아미노디페닐술피드, 4,4'-디아미노디페닐술피드, 3,3'-디아미노디페닐술폰, 3,4'-디아미노디페닐술폰, 4,4'-디아미노디페닐술폰, 3,3'-디아미노벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디클로로벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디메톡시벤조페논, 3,3'-디아미노디페닐메탄, 3,4'-디아미노디페닐메탄, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 2,2-비스(3-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(3-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 3,3'-디아미노디페닐술폭시드, 3,4'-디아미노디페닐술폭시드, 4,4'-디아미노디페닐술폭시드 등의 벤젠핵 2개의 디아민;
3) 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페녹시)-4-트리플루오로메틸벤젠, 3,3'-디아미노-4-(4-페닐)페녹시벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디(4-페닐페녹시)벤조페논, 1,3-비스(3-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(3-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠 등의 벤젠핵 3개의 디아민;
4) 3,3'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 3,3'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판 등의 벤젠핵 4개의 디아민.
이들은 단독으로도, 2종 이상을 혼합하여 이용할 수도 있다. 이용하는 디아민은, 원하는 특성 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
이들 중에서도, 방향족 디아민 화합물이 바람직하고, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르 및 파라페닐렌디아민, 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠을 적합하게 이용할 수 있다. 특히, 벤젠디아민, 디아미노디페닐에테르 및 비스(아미노페녹시)페닐로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디아민이 바람직하다.
폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 유리 전이 온도가 240℃ 이상이거나, 또는 300℃ 이상에서 명확한 전이점이 없는 테트라카르복실산 이무수물과 디아민을 조합하여 얻어지는 폴리이미드로 형성되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 이하의 방향족 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막인 것이 바람직하다.
(ⅰ) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와, 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드,
(ⅱ) 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드,
및/또는,
(ⅲ) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드.
한정되는 것은 아니지만, 폴리이미드 다공질막으로서, 적어도, 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조의 폴리이미드 다공질막을, 본 발명의 방법에 사용하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막은, 상기 매크로 보이드층이, 상기 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인, 막 평면 방향의 평균 공경이 10∼500 ㎛인 복수의 매크로 보이드를 갖고, 상기한 매크로 보이드층의 격벽, 및 상기 표면층(A면 및 B면)은 각각, 두께가 0.01∼20 ㎛이며, 평균 공경 0.01∼100 ㎛의 복수의 구멍을 갖고, 상기 세공끼리가 연통되어도 좋으며, 또한 상기 매크로 보이드에 연통되어 부분적 혹은 전면적으로 다층 구조를 갖고 있고, 그리고, 총 막 두께가 5∼500 ㎛이며, 공공률이 40% 이상 95% 미만인 폴리이미드 다공질막이다.
본 발명에 있어서 이용되는 폴리이미드 다공질막의 총 막 두께는, 한정되는 것은 아니지만, 일 양태로서 20∼75 ㎛로 해도 좋다. 막 두께의 차이에 의해, 세포의 증식 속도, 세포의 형태, 면 내에 있어서의 세포의 포화도 등에 차이가 관찰될 수 있다.
본 발명에 있어서, 2개의 상이한 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 폴리이미드 다공질막이 사용되는 경우, A면에 존재하는 구멍의 평균 공경은, B면에 존재하는 구멍의 평균 공경과 차이가 있어도 좋다. 바람직하게는, A면에 존재하는 구멍의 평균 공경은, B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작다. 보다 바람직하게는, A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이 0.01 ㎛∼50 ㎛, 0.01 ㎛∼40 ㎛, 0.01 ㎛∼30 ㎛, 0.01 ㎛∼20 ㎛, 또는 0.01 ㎛∼15 ㎛이며, B면에 존재하는 구멍의 평균 공경이 20 ㎛∼100 ㎛, 30 ㎛∼100 ㎛, 40 ㎛∼100 ㎛, 50 ㎛∼100 ㎛, 또는 60 ㎛∼100 ㎛이다. 특히 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막의 A면이 평균 공경 15 ㎛ 이하의, 예컨대 0.01 ㎛∼15 ㎛의 작은 구멍을 갖는 메시 구조이고, B면이 평균 공경 20 ㎛ 이상의, 예컨대 20 ㎛∼100 ㎛의 큰 구멍 구조이다.
본 발명에 있어서 이용되는 폴리이미드 다공질막의 총 막 두께의 측정은, 접촉식의 두께계로 행할 수 있다.
폴리이미드 다공질막 표면의 평균 공경은, 다공질막 표면의 주사형 전자 현미경 사진으로부터, 200점 이상의 개공부에 대해 구멍 면적을 측정하고, 상기 구멍 면적의 평균값으로부터 하기 식 (1)에 따라 구멍의 형상이 둥근 원이라고 했을 때의 평균 직경을 계산으로부터 구할 수 있다.
Figure 112017071357409-pct00001
(식 중, Sa는 구멍 면적의 평균값을 의미한다.)
본 발명에 있어서 이용되는 폴리이미드 다공질막의 공공률은, 소정의 크기로 잘라낸 다공질 필름의 막 두께 및 질량을 측정하고, 단위 중량 질량으로부터 하기 식 (2)에 따라 구할 수 있다.
Figure 112017071357409-pct00002
(식 중, S는 다공질 필름의 면적, d는 총 막 두께, w는 측정한 질량, D는 폴리이미드의 밀도를 각각 의미한다. 폴리이미드의 밀도는 1.34 g/㎤로 한다.)
예컨대, 국제 공개 WO2010/038873, 일본 특허 공개 제2011-219585, 또는 일본 특허 공개 제2011-219586에 기재되어 있는 폴리이미드 다공질막도, 본 발명에 사용 가능하다.
폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에 있어서 안정적으로 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 막 중의 생육·증식하는 위치에 따라, 여러 가지 상이한 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 세포의 종류에 따라, 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부를 이동하면서, 형상을 변화시키면서 증식하는 경우도 있다.
2. 시트형 다공질 담체에 있어서의 세포의 담지
본 명세서에 있어서, 시트형 다공질 담체에 있어서의 세포의 담지란, 시트형 다공질 담체의 표면, 내부, 또는 표면 및 내부의 일부 또는 전부에 세포가 유지되는 것을 말한다. 세포를 시트형 다공질 담체에 담지시키기 위한 구체적인 공정은 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 공정, 혹은, 세포를 막 형상의 담체에 적용하기에 적합한 임의의 수법을 채용하는 것이 가능하다. 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에 있어서, 시트형 다공질 담체로서 폴리이미드 다공질막을 이용하는 경우, 세포의 폴리이미드 다공질막에의 적용은, 예컨대, 이하와 같은 양태를 포함한다.
(A) 세포를 상기 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는 양태;
(B) 상기 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 놓고,
방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하며, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태; 및
(C) 상기 폴리이미드 다공질막의 한쪽 면 또는 양면을, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤시키고,
상기 습윤된 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전하며, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태.
(A)의 양태는, 폴리이미드 다공질막의 표면에 세포, 세포 덩어리를 직접 파종하는 것을 포함한다. 혹은, 폴리이미드 다공질막을 세포 현탁액 중에 넣고, 막의 표면으로부터 세포 배양액을 침윤시키는 양태도 포함한다.
폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 폴리이미드 다공질막에 접착하여, 다공의 내부로 들어간다. 바람직하게는, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않아도, 세포는 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착한다. 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에 있어서 안정적으로 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 생육·증식하는 막의 위치에 따라, 여러 가지 상이한 형태를 취할 수 있다.
(B)의 양태에 있어서, 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 놓는다. 폴리이미드 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시킴으로써, 세포 현탁액이 막 중에 침투한다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이것은 폴리이미드 다공질막의 각 표면 형상 등에서 유래하는 성질에 의한 것이라고 생각된다. 본 양태에 의해, 막의 세포 현탁액이 장전된 부위에 세포가 흡입되어 파종된다.
혹은, (C)의 양태와 같이, 상기 폴리이미드 다공질막의 한쪽 면 또는 양면의 부분 또는 전체를, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤시키고 나서, 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전해도 좋다. 이 경우, 세포 현탁액의 통과 속도는 크게 향상된다.
예컨대, 막의 비산 방지를 주목적으로 하여 막 극히 일부를 습윤시키는 방법(이후, 이것을 「일점 웨트법」이라고 기재한다)을 이용할 수 있다. 일점 웨트법은, 실질적으로는 막을 습윤시키지 않는 드라이법((B)의 양태)에 거의 가까운 것이다. 단, 습윤시킨 작은 부분에 대해서는, 세포액의 막 투과가 신속해진다고 생각된다. 또한, 폴리이미드 다공질막의 한쪽 면 또는 양면의 전체를 충분히 습윤시킨 것(이후, 이것을 「웨트막」이라고 기재한다)에 세포 현탁액을 장전하는 방법도 이용할 수 있다(이후, 이것을 「웨트막법」이라고 기재한다). 이 경우, 폴리이미드 다공질막 전체에 있어서, 세포 현탁액의 통과 속도가 크게 향상된다.
(B) 및 (C)의 양태에 있어서, 세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시킨다. 이에 의해 세포 현탁액 중의 세포의 농도를 농축시키고, 세포 이외의 불필요한 성분을 수분과 함께 유출시키는 등의 처리도 가능해진다.
(A)의 양태를 「자연 파종」 (B) 및 (C)의 양태를 「흡입 파종」이라고 호칭하는 경우가 있다.
한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막에는 생세포가 선택적으로 머문다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 생세포가 상기 폴리이미드 다공질막 내에 머물고, 사세포는 우선적으로 수분과 함께 유출된다.
양태 (C)에 있어서 이용하는 멸균된 액체는 특별히 한정되지 않으나, 멸균된 완충액 또는 멸균수이다. 완충액은, 예컨대, (+) 및 (-) 둘베코 PBS(Dulbecco's PBS), (+) 및 (-) 행크 평형 염류 용액(Hank's Balanced Salt Solution) 등이다. 완충액의 예를 이하의 표 1에 나타낸다.
Figure 112017071357409-pct00003
또한, 본 발명의 방법에 있어서, 세포의 폴리이미드 다공질막에의 적용은, 부유 상태에 있는 접착성 세포를 폴리이미드 다공질막과 현탁적으로 공존시킴으로써 세포를 막에 부착시키는 양태(포박)도 포함한다. 예컨대, 본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하기 위해서, 세포 배양 용기 중에, 세포 배양 배지, 세포 및 1 또는 그 이상의 상기 폴리이미드 다공질막을 넣어도 좋다. 세포 배양 배지가 액체인 경우 폴리이미드 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태이다. 폴리이미드 다공질막의 성질로부터, 세포는 폴리이미드 다공질막에 접착할 수 있다. 따라서, 본디부터 부유 배양에 적합하지 않은 세포여도, 폴리이미드 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태로 배양하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 세포는, 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착한다. 「자발적으로 접착한다」란, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않아도, 세포가 폴리이미드 다공질막의 표면 또는 내부에 머무는 것을 의미한다.
예컨대 전술한 방법에 의해, 시트형 다공질 담체에 세포를 담지시킬 수 있다.
3. 시트형 다공질 담체의 배지에 의한 습윤
본 발명의 방법은, 세포를 담지시킨 시트형 다공질 담체에 배지를 적용해서, 시트형 다공질 담체의 구멍의 일부 또는 전부에 배지가 포함된 상태로 하여 시트형 다공질 담체를 배지로 습윤시키는 공정을 포함한다.
본 명세서에 있어서, 시트형 다공질 담체가 배지로 습윤된 상태란, 시트형 다공질 담체의 표면 및 내부에 존재하는 구멍의 일부 또는 전부에 배지가 포함된 상태를 말한다.
시트형 다공질 담체를 배지로 습윤시키는 방법으로서는, 시트형 다공질 담체에 배지를 적용해서, 시트형 다공질 담체의 표면 및 내부에 존재하는 구멍의 일부 또는 전부에 배지가 포함되는 상태로 할 수 있는 방법이면 어떤 방법이어도 좋다. 예컨대, 전술한 방법으로 세포를 시트형 다공질 담체에 담지시킴과 동시에, 시트형 다공질 담체를 배지로 습윤시킬 수 있다. 또한, 배지를 포함하지 않는 용액을 통해 세포를 시트형 다공질 담체에 담지시킨 후, 시트형 다공질 담체에 배지를 적용해서, 시트형 다공질 담체에 포함되는 액체를 배지로 치환해도 좋다. 또한, 안개형의 배지를 시트형 다공질 담체에 분무함으로써 적용해도 좋다.
4. 시트형 다공질 담체의 기상에의 폭로(제1 양태)
본 발명의 방법은, 배지를 수용하는 배양 용기 중에, 배지로 습윤시킨 시트형 다공질 담체 표면의 일부 또는 전체가 기상에 폭로되도록 시트형 다공질 담체를 배치하는 공정을 포함한다. 종래, 고밀도로 세포를 배양하는 경우나, 산소 요구도가 높은 세포를 배양하는 경우에는, 산소 소비량이 세포수 의존적으로 증가하기 때문에, 그에 따라 배지 중의 용존 산소량이 감소해 버려, 세포 밀도가 증가한 환경에서의 배양은 곤란하였다. 그 때문에, 고밀도로 세포 배양을 행하는 경우에는, 배지 중의 산소를 증가시키기 위한 제어 장치가 별도로 필요하였다. 그러나, 본 발명의 방법을 이용하면, 시트형 다공질 담체에 기상 중의 산소를 직접 공급하는 것이 가능하기 때문에, 배지에 산소를 공급하기 위한 특별한 장치는 필수적이지 않게 되고, 배양 중의 세포에 산소를 거의 무한히 공급 가능해진다. 또한, 통상, 기상 폭로한 경우에 발생하기 쉬운 배양 매체의 건조를, 폴리이미드 다공질막이 갖는 다공성으로부터 발생하는 견고한 보습성에 의해 피할 수 있는 것도, 기상에 폭로한 배양을 가능하게 하고 있다. 본 발명은 선택에 의해, 배지에 산소를 공급하는 수단(예컨대, 버블링 등에 의한 산소 공급 수단, 배지 교반 수단 등)을 더 갖고 있어도 좋다. 또한, 배양 용기 내에 산소를 공급하는 수단을 더 갖고 있어도 좋다.
또한, 본 발명의, 시트형 다공질 담체 표면의 일부 또는 전체가 기상에 폭로되도록 시트형 다공질 담체를 배치하는 공정에 의해, 시트형 다공질 담체가 겹쳐진 부분에서는 시트형 다공질 담체끼리가 밀착하여, 세포 접착 가능한 공간은 시트형 다공질 담체의 면적(체적)에 비례하여 증대하는 한편, 상기 시트형 다공질 담체를 수용하여 배양하는 공간은 최소화하는 것이 가능해진다. 종래의 액체 배지에서의 배양에 있어서 담체, 예컨대 마이크로 캐리어 등의 담체를 이용하는 배양의 경우, 배양하는 세포수를 증대시키기 위해서는, 담체끼리의 충돌을 방지할 필요가 있어, 필연적으로 배지량을 증대시키지 않으면 안 되고, 결과로서 담체를 수용하여 배양하는 공간이 증대해 버린다. 그에 대해 본 발명에서는, 시트형 다공질 담체를 기상에 폭로하여 배치 가능하기 때문에, 시트형 다공질 담체끼리가 밀착하여, 배양 공간을 최소화할 수 있다고 하는, 종래에는 없는 유리한 점을 갖는다. 당연히, 적층 매수에는, 산소 및 영양의 공급성으로 인해 한계가 발생하지만, 시트 자체가 플렉시블하고 입체적인 극히 박막이라고 하는 특성을 갖기 때문에, 예컨대 30단 이상의 적층으로 장기 배양을 실시해도, 확산만으로 충분히 안정적으로 산소와 영양을 공급하여 안정된 장기 세포 배양을 달성할 수 있다. 동시에 폴리이미드 다공질막끼리의 밀착성은 기상 폭로로 매우 양호하게 향상되고, 세포는 시트 사이를 자유롭게 오가는 것이 가능해져, 시트의 추가라고 하는 간편한 방법만으로, 접촉한 빈 시트로 자유롭게 확산하여 증식함으로써, 실질적인 계대와 동일한 효과를 부여할 수 있다.
본 발명의 방법에 이용할 수 있는 세포 배양 배지(본 명세서에 있어서, 간단히 배지라고 기재하는 경우가 있다)는, 액체 배지, 반고형 배지, 고형 배지 등의 어느 형태여도 좋으나, 액체 배지를 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 안개형으로 한 액체 배지를 세포 배양 용기 중에 분무함으로써, 시트형 다공질 담체에 배지가 접촉하도록 해도 좋다.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 2 이상의 시트형 다공질 담체의 소편(小片)을 이용해도 좋다. 시트형 다공질 담체를 이용하지 않는 통상 배양의 경우, 용기 바닥 면적이 세포 배양 가능한 면적의 상한이 되지만, 시트형 다공질 담체를 이용한 세포 배양에서는, 앞서 반입된 시트형 다공질 담체의 대표면적 전체가 세포 배양 가능한 면적이 된다. 시트형 다공질 담체는 세포 배양액을 통과시키기 때문에, 예컨대 접혀진 막 내에도 영양이나 산소 등의 공급이 가능해진다.
시트형 다공질 담체의 소편의 크기, 형상은, 특별히 한정되지 않는다. 형상은, 원, 타원형, 사각, 삼각, 다각형, 끈형 등 임의의 형태를 취할 수 있다.
시트형 다공질 담체는 형상을 변화시켜 이용할 수 있다. 시트형 다공질 담체를 평면형이 아니라, 입체형으로 형상을 가공하여 이용해도 좋다. 예컨대, 시트형 다공질 담체를, ⅰ) 접어, ⅱ) 롤형으로 감아, ⅲ) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은, ⅳ) 새끼줄형으로 묶어, 세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시켜도 좋다. ⅰ)∼ⅳ)와 같이 형상을 가공함으로써, 소편을 이용하는 경우와 마찬가지로, 일정 용량의 세포 배양 배지 중에 많은 시트형 다공질 담체를 넣을 수 있다. 또한, 각 소편을 집합체로서 취급할 수 있기 때문에, 세포체를 집합화하여 이동시키는 것이 가능해지며, 종합적인 응용성이 높다.
소편 집합체와 동일한 사고 방식으로서, 2 이상의 시트형 다공질 담체를, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용해도 좋다. 적층이란, 시트형 다공질 담체가 일부 겹쳐지는 양태도 포함한다. 적층 배양에 의해, 좁은 스페이스에서 고밀도로 세포를 배양하는 것이 가능해진다. 이미 세포가 육성되고 있는 막 상에 추가로 막을 적층시켜 설치하여 별종 세포와의 다층계를 형성하는 것도 가능하다. 적층하는 시트형 다공질 담체의 수는 특별히 한정되지 않는다.
배지로 습윤시킨 시트형 다공질 담체 표면의 일부 또는 전체가 기상에 폭로되도록 시트형 다공질 담체를 배치하는 방법으로서는, 목적에 따라 임의의 방법을 이용해도 좋다.
예컨대, 세포 배양 용기 내에 있어서, 세포를 파종하거나, 또는 세포를 배양하고 있는 시트형 다공질 담체로부터 배지를 제거하여, 시트형 다공질 담체의 외부에 실질적으로 배지가 없어진 상태로 할 수 있다. 이 경우, 시트형 다공질 담체의 상면의 일부 또는 전부를 피복하도록, 시트형 다공질 담체보다 평균 공경이 큰 다공질 시트를 배치해도 좋다. 다공질 시트는 폴리이미드 다공질막보다 평균 공경이 큰 것이면 어떠한 것을 이용해도 좋으나, 예컨대 부직포, 거즈, 및 스펀지 등을 적합하게 이용할 수 있다. 폴리이미드 다공질막보다 평균 공경이 큰 다공질 시트를 폴리이미드 다공질막 상에 배치함으로써, 폴리이미드 다공질막 표면 상을 흐르는 배지, 특히 액체 배지의 편류를 억제하여, 폴리이미드 다공질막 표면 상에 균일하게 배지를 적용할 수 있기 때문에, 더욱 배양 효율을 높일 수 있다.
또한, 세포 배양 용기 내에 금속제 메시와 같은 강체를 설치하고, 그 위에 세포를 파종하거나, 또는 세포를 배양하고 있는 시트형 다공질 담체를 기상에 폭로하도록 배치할 수 있다. 이 경우에도, 시트형 다공질 담체의 상면의 일부 또는 전부를 피복하도록, 시트형 다공질 담체보다 평균 공경이 큰 다공질 시트를 배치해도 좋다.
또한, 세포를 파종하거나, 또는 세포를 배양하고 있는 시트형 다공질 담체 상에, 배지를 연속적 또는 간헐적으로 적용할 수 있는 세포 배양 장치를 이용하여, 시트형 다공질 담체의 일부 또는 전체가 기상에 노출되는 상태로 할 수 있다. 이 경우에도, 시트형 다공질 담체의 상면의 일부 또는 전부를 피복하도록, 시트형 다공질 담체보다 평균 공경이 큰 다공질 시트를 배치해도 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양에 이용하는 시스템의 형상, 규모 등은 특별히 한정되지 않는다. 배양 용기로서는, 개방 용기를 이용해도 좋고, 폐쇄 용기를 이용해도 좋다. 예컨대, 세포 배양용의 샬레, 플라스크, 플라스틱 백, 시험관으로부터 대형의 탱크까지 적절히 이용 가능하다. 예컨대, BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이언티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다.
본 발명의 방법에 있어서의 배양은, 폴리이미드 다공질막 상에 연속적으로 배지를 첨가하여 회수하는 것과 같은 연속 순환 혹은 개방형의 장치를 이용하여, 공기 중에 폴리이미드 다공질막 시트를 노출시키는 것과 같은 형식으로 실행하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 세포의 배양은, 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계에서 행해도 좋다. 그 때, 세포 배양 배지가 세포 배양 배지 공급 수단과 세포 배양 용기 사이를 순환하는 계일 수 있다.
세포의 배양을, 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계에서 행하는 경우, 그 계는, 세포 배양 용기인 배양 유닛과 세포 배양 배지 공급 수단인 배지 공급 유닛을 포함하는 세포 배양 장치여도 좋고, 여기서
배양 유닛은 세포를 담지하기 위한 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 수용하는 배양 유닛으로서, 배지 공급구 및 배지 배출구를 구비한 배양 유닛이며,
배지 공급 유닛은 배지 수납 용기와, 배지 공급 라인과, 배지 공급 라인을 통해 연속적 또는 간헐적으로 배지를 송액하는 송액 펌프를 구비하고, 여기서 배지 공급 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기 내의 배지에 접촉하며, 배지 공급 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 공급구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어 있는 배지 공급 유닛인
세포 배양 장치여도 좋다.
또한, 상기 세포 배양 장치에 있어서, 배양 유닛은 공기 공급구, 공기 배출구, 및 산소 교환막을 구비하지 않는 배양 유닛이어도 좋고, 또한, 공기 공급구 및 공기 배출구, 또는 산소 교환막을 구비한 배양 유닛이어도 좋다. 배양 유닛은 공기 공급구 및 공기 배출구, 및 산소 교환막을 구비하지 않는 것이어도, 세포의 배양에 필요한 산소 등이 배지를 통해 충분히 세포에 공급된다. 또한, 상기 세포 배양 장치에 있어서, 배양 유닛이 배지 배출 라인을 더 구비하고, 여기서 배지 배출 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기에 접속되며, 배지 배출 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 배출구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어, 배지가 배지 공급 유닛과 배양 유닛을 순환 가능해도 좋다.
5. 세포의 배양
본 발명의 방법에서는, 상기한 바와 같이 배지로 습윤시킨 시트형 다공질 담체 표면의 일부 또는 전체가 기상에 폭로되도록 시트형 다공질 담체를 배치한 배양 용기를 인큐베이터 내에 설치하여, 세포를 배양한다.
인큐베이터는, 세포의 배양에 적합한 온도를 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것을 이용해도 좋다. 온도에 더하여, 습도 및 CO2 농도를 조정할 수 있는 인큐베이터를 이용해도 좋다. 일반적인 동물 세포를 이용하는 경우, 5% CO2를 세포 배양 장치에 공급할 수 있는 인큐베이터를 이용해도 좋다.
본 발명의 방법에서는, 세포의 배양을 통해, 배지로 습윤시킨 시트형 다공질 담체 표면의 일부 또는 전체가 기상에 폭로된다. 또한, 세포의 배양을 통해, 시트형 다공질 담체 표면 및 내부의 습윤 상태가 유지된다.
배양을 통해 시트형 다공질 담체 표면 및 내부의 습윤 상태를 유지하는 방법으로서는, 임의의 방법을 적절히 이용할 수 있다. 예컨대, 배지로 습윤시킨 시트형 다공질 담체를 폐쇄 용기에 수용하여, 용기 내부의 습도를 높게 유지할 수 있다. 이 경우, 용기 내부의 습도는, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 99% 이상으로 하는 것이 바람직하다. 또한, 전술한 바와 같이, 세포를 파종하거나, 또는 세포를 배양하고 있는 시트형 다공질 담체 상에, 배지를 연속적 또는 간헐적으로 적용할 수 있는 세포 배양 장치를 이용함으로써, 배양을 통해 시트형 다공질 담체 표면 및 내부의 습윤 상태를 유지할 수 있다.
6. 세포
본 발명의 방법에 이용할 수 있는 세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 임의의 세포의 증식에 이용 가능하다.
예컨대, 세포는 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택된다. 동물 세포는, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포와 무척추 동물(척추 동물문에 속하는 동물 이외의 동물) 유래의 세포로 크게 나뉜다. 본 명세서에 있어서의, 동물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포를 의미한다. 척추 동물문은, 무악상강(無顎上綱)과 악구상강(顎口上綱)을 포함하고, 악구상강은, 포유강, 조강, 양서강, 파충강 등을 포함한다. 바람직하게는, 일반적으로, 포유 동물이라고 말해지는 포유강에 속하는 동물 유래의 세포이다. 포유 동물은, 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는, 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 돼지, 개, 양, 염소 등을 포함한다.
본 명세서에 있어서의 식물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 이끼 식물, 양치 식물, 종자 식물을 포함하는 식물의 세포가 대상이 된다.
종자 식물 세포가 유래하는 식물은, 단자엽 식물, 쌍자엽 식물의 어느 것이나 포함된다. 한정되는 것은 아니지만, 단자엽 식물에는, 난초과 식물, 벼과 식물(벼, 옥수수, 대맥, 소맥, 수수 등), 사초과 식물 등이 포함된다. 쌍자엽 식물에는, 국화아강, 목련아강, 장미아강 등 대부분의 아강에 속하는 식물이 포함된다.
조류(藻類)도, 세포 유래 생물로서 간주할 수 있다. 진정 세균인 시아노박테리아(남조(藍藻))로부터, 진핵 생물이고 단세포 생물인 것(규조, 황녹조, 와편모조(渦鞭毛藻) 등) 및 다세포 생물인 해조류(홍조, 갈조, 녹조) 등의 상이한 그룹을 포함한다.
본 명세서에 있어서의 고세균(古細菌) 및 세균의 종류도 특별히 한정되지 않는다. 고세균은, 메탄균·고도 호염균·호열 호산균·초호열균 등으로 이루어지는 군으로 구성된다. 세균은, 예컨대, 유산균, 대장균, 고초균 및 시아노박테리아 등으로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명의 방법에 이용할 수 있는 동물 세포 또는 식물 세포의 종류는, 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 다능성 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포, 및 생식 세포로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명에 있어서 「다능성 줄기 세포」란, 모든 조직의 세포로 분화하는 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 총칭하는 것을 의도한다. 한정되는 것은 아니지만, 다능성 줄기 세포는, 배아 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배아 생식 줄기 세포(EG 세포), 생식 줄기 세포(GS 세포) 등을 포함한다. 바람직하게는, ES 세포 또는 iPS 세포이다. iPS 세포는 윤리적인 문제도 없는 등의 이유에 의해 특히 바람직하다. 다능성 줄기 세포로서는 공지된 임의의 것을 사용 가능하지만, 예컨대, 국제 공개 WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)에 기재된 다능성 줄기 세포를 사용 가능하다.
「조직 줄기 세포」란, 분화 가능한 세포 계열이 특정한 조직에 한정되어 있으나, 다양한 세포종으로 분화 가능한 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 예컨대 골수 중의 조혈 줄기 세포는 혈구의 기초가 되고, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화한다. 그 외에도 간장을 만드는 간 줄기 세포, 피부 조직이 되는 피부 줄기 세포 등 여러 가지 종류가 있다. 바람직하게는, 조직 줄기 세포는, 간엽계 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 세포에서 선택된다.
「체세포」란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포를 말한다. 유성 생식에 있어서는 차세대에는 계승되지 않는다. 바람직하게는, 체세포는 간 세포, 췌장 세포, 근세포, 골세포, 골아 세포, 파골 세포, 연골 세포, 지방 세포, 피부 세포, 섬유아 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 또는, 림프구, 적혈구, 백혈구, 단구(單球), 매크로파지 또는 거핵구의 혈구 세포에서 선택된다.
「생식 세포」는, 생식에 있어서 유전 정보를 차세대에 전달하는 역할을 갖는 세포를 의미한다. 예컨대, 유성 생식을 위한 배우자, 즉 난자, 난세포, 정자, 정세포, 무성 생식을 위한 포자 등을 포함한다.
세포는, 육종(肉腫) 세포, 주화 세포 및 형질전환 세포로 이루어지는 군에서 선택해도 좋다. 「육종」이란, 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈액 등의 비상피성 세포 유래의 결합 조직 세포에 발생하는 암으로, 연부육종, 악성 골종양 등을 포함한다. 육종 세포는, 육종에서 유래하는 세포이다. 「주화 세포」란, 장기간에 걸쳐 체외에서 유지되고, 일정한 안정된 성질을 갖기에 이르며, 반영구적인 계대 배양이 가능해진 배양 세포를 의미한다. PC12 세포(래트 부신수질 유래), CHO 세포(차이니즈 햄스터 난소 유래), HEK293 세포(인간 태아 신장 유래), HL-60 세포(인간 백혈구 세포 유래), HeLa 세포(인간 자궁 경부암 유래), 베로(Vero) 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포 유래), MDCK 세포(개 신장 세뇨관 상피 세포 유래), HepG2 세포(인간 간암 유래 세포주) 등 인간을 포함하는 여러 가지 생물종의 여러 가지 조직에서 유래하는 세포주가 존재한다. 「형질전환 세포」는, 세포 외부로부터 핵산(DNA 등)을 도입하여, 유전적 성질을 변화시킨 세포를 의미한다. 동물 세포, 식물 세포, 세균의 형질전환에 대해서는, 각각 적합한 방법이 공지되어 있다.
II. 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 키트
본 발명은 시트형 다공질막, 특히 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 키트에도 관한 것이다.
본 발명의 키트는, 폴리이미드 다공질막 외에, 세포 배양에 필요한 구성 요소를 적절히 포함할 수 있다. 예컨대, 폴리이미드 다공질막에 적용하는 세포, 세포 배양 배지, 연속적 배지 공급 장치, 연속적 배지 순환 장치, 세포 시트를 지지하는 기반 혹은 모듈, 세포 배양 장치, 키트의 취급 설명서 등이 포함된다.
한정되는 것은 아니지만, 일 양태로서, 투명한 파우치 내에 멸균된 폴리이미드 다공질막이 단독으로 또는 복수 매 보존되고, 그대로 세포 배양에 사용 가능한 형태를 포함하는 패키지나, 혹은, 동 파우치 내에 폴리이미드 다공질막과 함께 멸균 액체가 봉입되어 있으며, 효율적 흡입 파종이 가능하게 되어 있는 막·액체의 일체형 형태의 키트를 포함한다.
III. 시트형 다공질막의 세포의 배양 방법을 위한 용도
본 발명은 시트형 다공질막, 특히 폴리이미드 다공질막의, 세포의 배양 방법을 위한 용도에도 관한 것이다.
본 발명은 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법, 키트, 용도에 관한 것이다. 본 발명의 세포의 계대 방법 및 배양 방법은, 매체(샬레, 디쉬, 컬쳐 플레이트, 마이크로 캐리어, 실리카 다공체, 셀룰로오스 스펀지, 폴리이미드 다공질막 및 그 외 세포 배양 매체) 상에 생식하는 세포에 대해 세포가 생육하고 있지 않은 신규의 폴리이미드 다공질막을 접촉시켜, 매체 상의 세포를 빈 폴리이미드 다공질막으로 이동시킴으로써, 세포를 계대하거나 배양하거나 하는 것을 포함한다. 본 발명자들은, 폴리이미드 다공질막이 세포의 접착, 배양에 적합한 것을 발견하고, 본 발명을 상도하였다. 본 발명의 방법은, 이미 세포가 생육하고 있는 각종 매체에 폴리이미드 다공질막을 접촉시킴으로써, 폴리이미드막으로 세포를 이동시키고, 그 표면 또는 내부에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다. 이 폴리이미드 다공질막에 의해, 증식 가능한 넓은 공간을 세포는 얻기 때문에, 실질적으로 세포의 이동은 세포의 계대와 동등한 의의가 있으며, 매우 효율적인 세포의 증식을, 트립신 등의 처리 없이 실시할 수 있기 때문에, 효율성에 더하여, 세포에 대한 손상이 적다. 또한, 생체 조직 등, 복수의 세포가 혼합되어 있는 상태로부터, 접착성 및 운동성이 우수한 세포를 우선적으로 취출할 수 있는 것도 기대된다.
IV. 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법(제2 양태)
본 발명은 일 양태에 있어서, 세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체에 폴리이미드 다공질막을 접촉시킴으로써 세포를 세포 배양 매체로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동시키고, 그리고, 폴리이미드 다공질막으로 이동한 세포를 배양하는 것을 포함한다. 세포가, 세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체로부터, 폴리이미드 다공질막으로 이동한다.
1. 세포
본 발명의 방법에 이용할 수 있는 세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 임의의 세포, 예컨대, 전술한 세포의 증식에 이용 가능하다.
2. 세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체
세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체는, 세포를 생육(증식, 분화)할 수 있는 매체이면 특별히 한정되지 않는다. 한정되는 것은 아니지만, 샬레, 디쉬, 배양 플레이트, 배양 플라스크, 마이크로 웰 플레이트 및 유리 바닥 디쉬로 이루어지는 군에서 선택되어도 좋다. 이 경우 세포의 배양면은 통상은 평면이며, 본 발명에 있어서 폴리이미드 다공질막은 세포 배양 매체의 상면에 접촉시킨다. 혹은, 마이크로 캐리어, 실리카 다공체, 셀룰로오스 스펀지, 부직포 및 중공사로 이루어지는 군에서 선택되어도 좋다. 이 경우, 세포 배양 매체의 상부, 하부 또는 그 양방으로부터, 단수 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 접촉시키는 것이 가능하다.
한편, 후술하는 제3 양태에서는, 세포를 배양하고 있는 제1 폴리이미드 다공질막 자체가 「세포 배양 매체」에 상당한다.
세포의 매체에서의 배양에 관한 구체적인 공정은 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 공정, 혹은, 세포를 막 형상의 매체에 적용하기에 적합한 임의의 수법을 채용하는 것이 가능하다.
3. 폴리이미드 다공질막
본 발명에 이용되는 폴리이미드 다공질막은, 전술한 폴리이미드 다공질막이다.
비한정적으로, 본 발명에 있어서, 세포 배양 매체 또는 세포를 포함하는 시료를, 폴리이미드 다공질막의 평균 공경 15 ㎛ 이하의 작은 구멍을 갖는 메시 구조를 갖는 면(A면)에 접촉시킨다.
본 발명에 있어서 세포를 장전하는 폴리이미드 다공질막은, 당연히, 장전하는 것 이외의 세포를 포함하지 않는 상태, 즉, 멸균되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법은, 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막을 미리 멸균하는 공정을 포함한다. 폴리이미드 다공질막은, 내열성이 매우 우수하고, 경량이며, 형태·크기도 자유롭게 선택 가능하고, 멸균 처리가 용이하다. 건열 멸균, 증기 멸균, 에탄올 등 소독제에 의한 멸균, 자외선이나 감마선 등의 전자파 멸균 등 임의의 멸균 처리가 가능하다.
폴리이미드 다공질막의 표면에 적용된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에 있어서 안정적으로 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 막 중의 생육·증식하는 위치에 따라, 여러 가지 상이한 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 세포의 종류에 따라, 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부를 이동하면서, 형상을 변화시키면서 증식하는 경우도 있다.
4. 세포의 세포 배양 매체로부터 폴리이미드 다공질막으로의 이동
샬레, 디쉬, 컬쳐 플레이트, 마이크로 캐리어, 실리카 다공체, 셀룰로오스 스펀지 및 폴리이미드 다공질막 그 자체를 포함하는 각종 매체 상 혹은 내부에 생육한 세포는, 신규의 (세포가 생육하고 있지 않기 때문에, 큰 생육 가능 공간을 갖는다) 폴리이미드 다공질막과 접촉함으로써, 종래의 거처인 매체로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동을 개시하고, 수시간∼수일의 접촉으로, 빈 폴리이미드 다공질막측으로 이주하여 거기에 생착한다. 이 이동은, 면끼리의 접촉 상황에 크게 좌우되기 때문에, 유효한 (실질적으로 공간이 배제되어 있다) 접촉 면적을 크게 함으로써, 보다 효율적인 이동이 실현된다. 이동과 함께 증식도 일어날 수 있기 때문에, 본 현상은, 세포의 계대와 동등하다고 생각된다.
접촉을 보다 효율적으로 실현하기 위해서, 폴리이미드 다공질막을 고정하기 위한 추나 고정구를 이용할 수 있다. 또한, 폴리이미드 다공질막을 기상으로 밀어올림으로써 접촉면을 확대하는 방법도 채용할 수 있다. 접촉시킨 폴리이미드 다공질막을 분리하여 배양하는 방법도 가능하지만, 접촉시킨 상태를 유지한 채로 배양을 진행시키는 것도 가능하다.
세포의 배양면이 평면인 경우, 세포 배양 매체가, 예컨대, 샬레, 디쉬, 배양 플레이트, 배양 플라스크, 마이크로 웰 플레이트, 유리 바닥 디쉬 등인 경우, 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 매체의 상면에 접촉시키는 것이 가능하다. 세포의 배양면이 삼차원(입체)인 경우, 세포 배양 매체가, 예컨대, 마이크로 캐리어, 실리카 다공체, 셀룰로오스 스펀지, 부직포, 중공사 등인 경우, 세포 배양 매체의 상부, 하부 또는 그 양방으로부터, 단수 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 접촉시키는 것이 가능하다.
5. 세포의 배양
본 발명의 방법은, 폴리이미드 다공질막으로 세포를 이동시킨 후에, 세포를 배양하는 것을 포함한다.
폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하여 배양하는 것에 대해서는, PCT/JP2014/070407에 기재되어 있다. 동물 세포, 식물 세포, 및 세균의 각 세포에 적합한 배양 방법이 공지이며, 당업자는 임의의 공지된 방법을 이용하여 폴리이미드 다공질막에 세포를 배양할 수 있다. 세포 배양 배지도 세포의 종류에 따라 적절히 조제할 수 있다.
동물 세포의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, 론자사의 세포 배양 배지 카탈로그에 기재되어 있다. 식물 세포의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, WAKO사의 식물 조직 배지 시리즈 등에 기재되어 있다. 세균의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, BD사의 일반 세균용 배지 카탈로그에 기재되어 있다.
폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 배양에 대해, 마이크로 캐리어나 셀룰로오스 스펀지 등, 다른 부유형 배양 담체와 공존시킬 수 있다.
세포 배양은, 세포 배양에 있어서의 존재 형태에 따라 배양 세포는 접착 배양계 세포와 부유 배양계 세포로 분류할 수 있다. 접착 배양계 세포는 배양 용기에 부착되어 증식하는 배양 세포이며, 계대에는 배지 교환을 행한다. 부유 배양계 세포는 배지 중에 있어서 부유 상태로 증식하는 배양 세포이며, 일반적으로는 계대 시에는 배지 교환은 행하지 않고, 희석 배양을 행한다. 부유 배양은, 부유 상태, 즉 액체 중에서의 배양이 가능하기 때문에, 대량 배양이 가능하고, 배양 용기 표면에만 생육하는 부착 세포와 비교하면, 입체적인 배양이기 때문에, 단위 공간당의 배양 가능 세포수는 많다고 하는 이점이 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지 중에 부유한 상태로 이용하는 경우, 2 이상의 상기 폴리이미드 다공질막의 소편을 이용해도 좋다. 폴리이미드 다공질막은 플렉시블한 박막이기 때문에, 예컨대 그 소편을 배양액 중에 부유시켜 이용함으로써, 일정 용량의 세포 배양 배지 중에 많은 표면적을 갖는 폴리이미드 다공질막을 반입하는 것이 가능해진다. 통상 배양의 경우, 용기 바닥 면적이 세포 배양 가능한 면적의 상한이 되지만, 본 발명의 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양에서는, 앞서 반입된 폴리이미드 다공질막의 대표면적 전체가 세포 배양 가능한 면적이 된다. 폴리이미드 다공질막은 세포 배양액을 통과시키기 때문에, 예컨대 접혀진 막 내에도 영양이나 산소 등의 공급이 가능해진다.
본 발명의 방법에 있어서, 바람직하게는, 세포는 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부에 생육하여 증식한다. 본 발명의 방법에 의해, 세포는 5일 이상, 보다 바람직하게는 10일 이상, 더욱 바람직하게는 30일 이상 계속 증식할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 일 양태로서, 배양 세포수가 많은 경우에는, 배지의 연속 첨가를 행하는 연속 배양 장치를 사용하는 것도 가능해진다. 연속적으로 배지가 첨가되기 때문에, 습윤 환경을 계속하면서, 상호의 밀착성을 유지하는 것이 가능해져, 빈 폴리이미드 다공질막으로의 이동도나 증식도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 일 양태로서, 세포를 배양하고 있는 샬레에, 폴리이미드 다공질막을 배양면 상부로부터 접촉시키고, 스테인리스 메시 등을 놓으며, 일정 기간 그대로 배양을 계속한다. 일정 기간 후, 폴리이미드 다공질막을 접촉면으로부터 분리하고, 상기 막 내로 이동한 세포를 계속해서 배양한다.
V. 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법(제3 양태)
본 발명은 일 양태에 있어서, 세포를 배양하고 있는 제1 폴리이미드 다공질막의 상면, 하면 혹은 그 양방으로부터, 세포를 배양하고 있지 않은 제2 폴리이미드 다공질막을 접촉시킴으로써, 세포를 제1 폴리이미드 다공질막으로부터 제2 폴리이미드 다공질막으로 이동시키고, 그리고, 제2 폴리이미드 다공질막으로 이동한 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법이다. 세포가, 세포를 배양하고 있는 제1 폴리이미드 다공질막으로부터, 세포를 배양하고 있지 않은 제2 폴리이미드 다공질막으로 이동한다.
「세포」, 「폴리이미드 다공질막」의 정의에 대해서는 제1 및 제2 양태에 대해 기재한 것과 동일하다.
제1 폴리이미드 다공질막과 제2 폴리이미드 다공질막을 접촉시키는 양태에 대해서도, 특별히 한정되지 않는다. 제1 폴리이미드 다공질막의 상면, 하면 혹은 그 양방으로부터 막을 접촉시켜도 좋다. 제1 폴리이미드 다공질막은, 세포가 유지된 상태로 동결 보존된 폴리이미드 다공질막이어도 좋고, 이 경우, 세포가 생존하는 임의의 방법으로 융해한 폴리이미드 다공질막을 사용할 수 있다. 이에 의해, 동결·융해를 행해도 생존 상태를 유지한 세포를, 제2 폴리이미드 다공질막으로 취출하는 것이 가능해져, 그대로 계속해서 배양하는 것이 가능해진다.
예컨대, 도 2에 도시된 바와 같이, 세포가 생육한 폴리이미드 다공질막과 빈 폴리이미드 다공질막의 복합체 전체를 배지 중에 가라앉히고, 금속 메시나 유리 큐브 등을 추로서 이용하여 접촉시키는 방법도 사용 가능하다. 제1 폴리이미드 다공질막과 제2 폴리이미드 다공질막이 접촉한 상태인 채로, 막 집합체 전체를 기상 중으로 들어올려도 좋다. 예컨대, 도 5에 도시된 바와 같이, 금속 메시 등을 적층하여 가대(架臺)를 만들고, 그 위에 세포가 생육한 폴리이미드 다공질막과 빈 폴리이미드 다공질막의 막 집합체 전체를 설치함으로써 상호의 시트 밀착성을 높여, 세포의 시트 간 이동과 증식을 진행시키는 방법도 사용 가능하다.
이들 각 양태에 있어서, 빈 폴리이미드 다공질막도, 혹은, 세포가 생육한 폴리이미드 다공질막도 2 이상의 복수 매수를 사용해도 좋다. 예컨대, 각 30장씩의 집합체끼리를 적층하는 것도 가능하고, 또한, 1장씩을 교대로 다수 적층하는 것도 가능하다. 또한, 일단 복합체로서 배양한 시트를 1장씩으로 분리하여 배양하는 형태도 취할 수 있다.
이들의 적층에 있어서, 폴리이미드 다공질막 그 자체가 세포 육성의 매체가 되기 때문에, 사용되는 폴리이미드 다공질막은, 미리 충분히 습윤되고, 공기를 포함하지 않는 상태를 형성하고 있는 것이 중요해진다.
제3 양태에 있어서, 제2 폴리이미드 다공질막을 제1 폴리이미드 다공질막에 접촉시키기 전에, 세포를 배양하고 있는 제1 폴리이미드 다공질막을 준비하는 공정, 구체적으로는, 세포를 배양하고 있지 않은 빈 제1 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하여, 제1 폴리이미드 다공질막에서 세포를 배양하는 공정을 더 포함해도 좋다.
세포를 배양하고 있지 않은 빈 제1 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하는 구체적인 공정은 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 공정, 혹은, 세포를 막 형상의 담체에 적용하기에 적합한 임의의 수법을 채용하는 것이 가능하다.
한정되는 것은 아니지만, 상기 제2 양태에서 폴리이미드 다공질막으로 세포를 이동시키는 방법을 이용해도 좋다. 구체적으로는, 세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체에 빈 제1 폴리이미드 다공질막을 접촉시키고, 세포를 세포 배양 매체로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동시킴으로써, 제1 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용한다.
혹은, 세포의 폴리이미드 다공질막에의 적용은, 예컨대, PCT/JP2014/070407에 기재되어 있는 바와 같은, 이하와 같은 양태 중 어느 하나를 적절히 이용해도 좋다.
(A) 세포를 상기 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는 양태;
(B) 상기 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 놓고,
방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하며, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태; 및,
(C) 상기 폴리이미드 다공질막의 한쪽 면 또는 양면을, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤시키고,
상기 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전하며, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태.
VI. 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법(제4 양태)
본 발명은 일 양태에 있어서, 세포를 포함하는 생체 시료를, 폴리이미드 다공질막의 상면, 하면 혹은 그 양방에 접촉시킴으로써, 세포를 생체 시료로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동시키고, 그리고, 폴리이미드 다공질막으로 이동한 세포를 배양하는 것을 포함한다. 세포가, 생체 시료로부터 직접 폴리이미드 다공질막으로 이동한다.
「세포」, 「폴리이미드 다공질막」의 정의에 대해서는 제1 양태∼제3 양태에 대해 기재한 것과 동일하다.
「세포를 포함하는 생체 시료」란 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 생체로부터 단리된 기관, 조직 등의 전체 또는 일부를 포함한다. 비한정적으로, 폐, 피부, 간장 등에서 유래하는 세포를 포함하는 생체 시료가 포함된다.
본 양태는, 다종 다수의 세포가 집적하여 생육하고 있는 생체 시료로부터, 이동성이 높은 세포 집단을 폴리이미드 다공질막으로 단숨에 이동시켜 배양하는 방법으로, 예컨대 각 생체 기관의 환경 재현 등, 곤란한 작업을 간편하게 달성할 수 있는 것이 기대된다.
본 양태에 있어서도, 폴리이미드 다공질막의 생체 시료에의 접촉 시에는, 상면 및 하면 혹은 그 양방으로부터 접촉시키는 방법을 취할 수 있다. 또한, 폴리이미드 다공질막에 시료를 접촉시키기 위해서, 배지에 시료·폴리이미드 다공질막 복합체를 가라앉히고 금속 메시나 유리 큐브 등을 추로서 사용하는 방법이나 기상으로 들어올려 시료와 폴리이미드 다공질막을 접촉시키는 방법의 어느 것이나 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 제1 양태∼제4 양태의 어느 양태라도, 본 발명에 있어서, 세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체, 세포를 포함하는 생체 시료, 혹은, 세포를 배양하고 있는 폴리이미드 다공질막으로부터 세포를 배양하고 있지 않은 폴리이미드 다공질막으로의 세포의 이동을, 2회 이상 반복하는 것도 가능하다. 본 발명의 방법에 의해, 종래 이용되는 것과 같은 트립신 등을 이용하지 않고, 간편한 방법으로 세포를 이동시켜 계대하는 것을 가능하게 한다. 계대의 횟수는 특별히 한정되지 않는다.
VII. 세포 배양 장치
본 발명은 또한, 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 장치에 있어서, 폴리이미드 다공질막은 고정되어 이용되어도 좋고, 혹은 세포 배양 배지 중에 부유하여 이용되어도 좋으며, 배지 중에 놓여져도, 배지로부터 노출되어도 좋다. 세포 배양 장치에 있어서, 2 이상의 폴리이미드 다공질막이, 상하 또는 좌우로 적층되어도 좋다. 적층된 집합체나 집적체는, 배지 중에 놓여져도 배지로부터 노출되어 있어도 상관없다.
본 발명의 세포 배양에 의한 세포 배양 장치로서는, 폴리이미드 다공질막을 포함하는 것이면 임의의 형태를 취해도 좋고, 공지된 세포 배양 장치를 이용하는 것이 가능하다. 배양 장치의 형상, 규모 등은 특별히 한정되지 않고, 샬레, 시험관으로부터 대형의 탱크까지 적절히 이용 가능하다. 예컨대, BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이언티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다. 한편, 본 발명에 있어서 폴리이미드 다공질막을 이용함으로써, 본디부터 부유 배양이 가능하지 않았던 세포에 대해서도 부유 배양용 장치로, 부유 배양 유사 상태에서의 배양을 행하는 것이 가능해졌다. 부유 배양용의 장치로서는, 예컨대, 코닝사 제조의 스피너 플라스크나 회전 배양 등이 사용 가능하다. 또한, 동일한 기능을 실현할 수 있는 환경으로서, VERITAS사의 FiberCell(등록 상표) System과 같은 중공사 배양도 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 배양 세포에 의한 세포 배양 장치는, 메시 상의 막에 연속적으로 배지를 첨가하여 회수하는 것과 같은, 연속 순환 혹은 개방형의 장치로, 공기 중에 폴리이미드 다공질막을 노출시키는 것과 같은 형식으로 실행하는 것도 가능하다.
VIII. 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법에 사용하기 위한 키트
본 발명은 또한, 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 본 발명의 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는, 폴리이미드 다공질막 외에, 세포 배양에 필요한 구성 요소를 적절히 포함할 수 있다. 예컨대, 폴리이미드 다공질막에 적용하는 세포, 세포 배양 배지, 연속적 배지 공급 장치, 연속적 배지 순환 장치, 폴리이미드 다공질막을 지지하는 기반 혹은 모듈, 세포 배양 장치, 작업용의 멸균된 샬레 혹은 각형(角型) 플레이트, 세포 현탁액 취급용의 셀 스크레이퍼, 키트의 취급 설명서 등이 포함된다.
한정되는 것은 아니지만, 일 양태로서, 투명한 파우치 내에 멸균된 폴리이미드 다공질막이 단독으로 또는 복수 매 보존되고, 그대로 세포 배양에 사용 가능한 형태를 포함하는 패키지나, 혹은, 동 파우치 내에 폴리이미드 다공질막과 함께 멸균 액체가 봉입되어 있으며, 효율적 흡입 파종이 가능하게 되어 있는 막·액체의 일체형 형태의 키트를 포함한다.
IX. 용도
본 발명은 또한, 폴리이미드 다공질막의 전술한 본 발명의 방법을 위한 용도를 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여, 보다 구체적으로 설명한다. 한편 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 가할 수 있고, 이들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 이후, 특별히 기술하지 않는 경우에는, 「폴리이미드 다공질막」은 총 막 두께 25 ㎛, 공공률 73%의 폴리이미드 다공질막을 말하는 것으로 한다. 상기 폴리이미드 다공질막은, 2개의 상이한 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 가졌다. A면에 존재하는 구멍의 평균 공경은 6 ㎛이고, B면에 존재하는 구멍의 평균 공경은 46 ㎛였다.
한편, 이하의 실시예에서 사용된 폴리이미드 다공질막은, 테트라카르복실산 성분인 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물(s-BPDA)과 디아민 성분인 4,4'-디아미노디페닐에테르(ODA)로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과, 착색 전구체인 폴리아크릴아미드를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써, 조제되었다.
· 인간 간엽계 줄기 세포(LONZA사 product code PT-2501)
· HepG2(CET(Cellular ENGINEERING TECHNOLOGIES, INC.)사, HEPG2-500)
· 인간 섬유아세포(LONZA사 product code CC-2511)
· CHO-K1(퍼블릭 헬스 잉글랜드 cat. 85051005)
· CHO DP-12(ATCC CRL-12445)
· MDCK(퍼블릭 헬스 잉글랜드 cat. 85011435)
· 인간 간엽계 줄기 세포용 배지(LONZA사 product code Pt-3238)
· HepG2용 배지(CET(Cellular ENGINEERING TECHNOLOGIES, INC.)사 cat. HEPG2.E. Media-450)
· 인간 섬유아세포용 배지(LONZA사 product code CC-3132)
· CHO-K1용 배지(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤 Ham's F-12 087-08335)
· CHO DP-12용 배지(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤 IMDM 098-06465)
· MDCK용 배지(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤 E-MEM 051-07615)
· 3.5 cm 샬레(Falcon사 cat. 353001)
· Cell Counting Kit 8(가부시키가이샤 도진 가가쿠 겐큐쇼 CK04)
· 스테인리스 메시(큐호 긴조쿠 가부시키가이샤 60메시 E9117)
· 2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기(Thermo Fisher Scientific사 cat. 103)
· 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 서스펜션(Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Suspension)(X100)(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤 161-23181)
· 현미경명, 사용한 화상 소프트웨어명
Carl Zeiss사 제조 LSM 700 사용 소프트웨어 ZEN
실시예 1
세포가 생식한 폴리이미드 다공질의 기상 폭로(1)
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막 5장을 메시 구조의 A면을 위로 하여 각각 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 인간 간엽계 줄기 세포를 각각 첨가하고, 주 2회의 비율로 배지를 교환하며, 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 58일간 세포 배양을 실시하고, CCK8을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
흡광도 측정 종료 후, 세포가 생육하고 있는 폴리이미드 다공질막으로부터 배지를 제거하고, 24시간, 인큐베이터 내에서 보존하였다. 그 후, 재차 CCK8을 이용하여 흡광도를 측정한 결과, 평균값으로서 1.0배의 흡광도를 확인하였다.
실시예 2
세포가 생식한 폴리이미드 다공질의 기상 폭로(2)
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막 5장을 메시 구조의 A면을 위로 하여 각각 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 HepG2 세포를 각각 첨가하고, 31일간 세포 배양을 실시하며, CCK8을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
흡광도 측정 종료 후, 세포가 생육하고 있는 폴리이미드 다공질막으로부터 배지를 제거하고, 24시간, 인큐베이터 내에서 보존하였다. 그 후, 재차 CCK8을 이용하여 흡광도를 측정한 결과, 평균값으로서 1.1배의 흡광도를 확인하였다.
실시예 3
폴리이미드 다공질로부터 빈 폴리이미드 다공질막으로의 이동(1) 기상 계대 ; 그 1
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 각각 침지시켰다. 1장의 시트당 5.2×104개의 인간 피부 섬유아세포를 각각 첨가하고, 6일간 세포 배양을 실시하며, CCK8을 이용하여 6일 시점에서의 세포수를 측정하였다.
이 세포가 생육하고 있는 기반 시트를 상하 각 1장의 빈 폴리이미드 다공질막 사이에 끼웠다. 이 때, 상하의 폴리이미드 다공질막의 A면이 기반 시트에 접착하도록 적층하였다. 스테인리스 메시를 샬레 바닥부에 가라앉히고, 공중에 시트의 집합체가 노출되는 상태를 24시간 계속하였다. 그 후, 각 시트를 단체(單體)로 나누고, 2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하여 배양을 계속하였다. 분리 개시 시와 5일간 후에 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하고, 증식 거동을 관찰하였다. 각 시트에 세포의 생착과 증식을 확인하였다.(도 1)
실시예 4
폴리이미드 다공질로부터 빈 폴리이미드 다공질막으로의 이동(2) 액 중 접촉법
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 침지시켰다. 1장의 막당 5.2×104개의 인간 피부 섬유아세포를 첨가하고, 28일간 세포 배양을 실시하며, CCK8을 이용하여 경시적으로 세포수를 측정하였다.
이 세포가 생육하고 있는 막을 상하 각 1장의 폴리이미드 다공질막 사이에 메시 구조의 A면의 빈 시트측이 접촉면이 되도록 하여 끼우고, 2 cm×2 cm의 스테인리스 메시와 가로 세로 2밀리미터의 유리 입방체 4개를 추로 한 상태로, 14일간 배양하였다.(도 2)
그 후, 추를 떼어낸 후에 각 막을 단체마다 나누고, 각각 2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가한 환경하에서 배양을 계속하였다. 14일간, 21일간, 28일간, 35일간 후에 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하고, 증식 거동을 관찰하였다. 원래의 상부막 및 하부 설치막 모두, 배양 상한에 가까운 세포수로까지 증식하고 있는 것이 확인되었다.(도 3)
상기와 동일한 양태에 의해 배양을 행한 사례에 있어서, 세포의 거동을 형광화에 의한 가시화로 검증한 결과, 세포는, 적층된 빈 막에 대해, 시간 경과에 따라 능동적으로 이동하고 있는 것을 확인하였다. 적어도, 물리적인 떼어냄 현상이 아닌 형태로 세포의 이동이 발생하고 있는 것이 검증되었다.
실시예 5
샬레면에 생육한 세포로부터 폴리이미드 다공질막으로의 이동
3.5 cm 직경 샬레에 2.0×105개의 HepG2 세포를 파종하고, CO2 인큐베이터 내에서, 주 2회 배지 교환하면서 33일간 배양하였다.
상기 샬레 내에, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 밑으로 하여 배지 중에 부유시켰다. 서서히 배지를 제거하여, 폴리이미드 다공질막이 아슬아슬하게 바닥면에 접촉할 때에 배지의 제거를 정지하였다.(도 4) 그대로의 상태를 유지해서, 인큐베이터 내로 샬레를 이동시켜, 24시간 배양하였다. 24시간 후, 서서히 배지를 추가하고, 그 후, 폴리이미드 다공질막을 이동시켜 CCK8을 이용하여, 세포수를 계측하면, 시트 전체에서, 1.2×106개의 세포가 생식하고 있었다.
실시예 6
폴리이미드 다공질로부터 빈 폴리이미드 다공질막으로의 이동(3) 기상 계대법
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막 9장을 메시 구조의 A면을 위로 하여 배지에 각각 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 CHO-K1 세포를 각각 첨가하고, 8일간 CO2 인큐베이터 내에서 세포 배양을 실시하여, 최대 생육량 근처의 상태가 되었다. 8일째의 각 시트당 생존 세포수는, 평균값으로 1.2×107이었다. 이 시트 중 5장을 취출하고, 각각의 시트에 대해, 신규의 동일 사이즈의 폴리이미드 다공질막으로 상하를 각 1장씩의 시트 사이에 끼워, 3단 겹침의 폴리이미드 다공질막 적층체를 5세트 준비하였다. 마찬가지로, 세포가 생육한 시트 4장을 취출하고, 각각의 시트에 대해, 신규의 동일 사이즈의 폴리이미드 다공질막으로 상하를 각 2장씩의 시트 사이에 끼워, 5단 겹침의 폴리이미드 다공질막 적층체를 4세트 준비하였다(도 5). 이들 합계 9세트의 3단 겹침 및 5단 겹침의 적층체를, 배지 중에 놓은 메시 위에 기상에 접하도록 놓고, 배양을 계속하였다. 4일간 이 배양을 계속한 후, 각각의 적층체를 전부 1장마다 독립시키고, 각 폴리이미드 다공질막의 세포수에 대해 CCK8을 이용하여 측정하였다. 3중 적층(도 6) 및 5중 적층(도 7)의 양방에서, 적층체 내부에서의 세포의 이동과 증식이 확인되었다. 기상에 접하는 환경에서의 세포의 적합한 증식·이동이 확인되었다.
실시예 7
폴리이미드 다공질로부터 빈 폴리이미드 다공질막으로의 이동(4) 다단 계대
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막 5장을 메시 구조의 A면을 위로 하여 배지에 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 CHO 세포를 첨가하고, 8일간 CO2 인큐베이터 내에서 세포 배양을 실시하며, 추가로 2일간, 배지 중에서 5장을 겹쳐서 배양을 계속하였다. 배지 교환은, 배양 기간 전체를 통해, 주 2회 페이스로 실시하였다. 10일째에, 세포가 생식하고 있지 않은 신규의 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막 6장을 준비하고, 그 사이에, 지금까지 CHO 세포를 배양해 온 5장의 시트를 교대로 겹쳐, 합계 11단의 폴리이미드 다공질막 적층체를 준비하였다. 준비한 적층체를, 배지 중에 놓은 메시 위에 기상에 접하도록 놓고, 4일간 그 상태를 유지하였다. 그 후, 얻어진 11장의 세포가 육성되는 시트를 1장씩 독립시키고 나서, 각각의 시트에 대해, 신규의 동일 사이즈의 폴리이미드 다공질막으로 상하를 각 1장씩의 시트 사이에 끼워, 3단 겹침의 폴리이미드 다공질막 적층체를 11세트 준비하였다.(도 8)
이들 11세트의 3단 겹침의 적층체를, 배지 중에 놓은 메시 위에 기상에 접하도록 놓고, 배양을 계속하였다. 배지 교환은, 주 2회의 빈도로 적절히 실시하였다. 상기와 동일한 기상에 접하는 형태에서의 3단 겹침의 상태로 2주간 배양을 계속하였다. 최종의 3단 적층에 있어서, 중간 시트 및 하부 시트는 이 2주간의 배양으로 거의 포화에 가까운 상태가 되고, 평균 세포수는 각각, 중간 시트에서는 9.5×106개의, 또한 하단 시트에서는 9.1×106개의 세포가 생식하고 있었다. 또한, 상층 시트에서는, 1.5×106개의 세포가 생식하고 있었다. 다중의 적층에 있어서도, 폴리이미드 다공질막의 표면에서의 접촉은, 세포를 충분히 이동시켜, 계대·증식을 진행시키는 것이 확인되었다.
실시예 8
대량 기상 폭로 배양(1)
본 실시예에서는, CHO-K1 세포를 이용하여, 폴리이미드 다공질막에의 파종을 행한 후, 연속 배양 장치를 이용하여 대량 연속 배양을 실시하였다.
4 cm×10 cm의 멸균된 폴리이미드 다공질막 10장을 건열 멸균하고, 멸균된 각형 샬레 내에 배열한다. 배지 5 ㎖당 1.1×107개의 CHO-K1 세포(그 중, 생세포는 1.1×107개, 사세포는 5.0×105개, 생세포율 96%)를 포함하는 현탁액을 준비하고, 앞서 준비한 폴리이미드 다공질막 상에 각각 0.5 ㎖씩 파종한다. 시트 상에 놓은 현탁액은, 셀 스크레이퍼로 균일화하고, 시트를 조금 움직임으로써, 액을 통과시켜 세포를 폴리이미드 다공질막에 파종하였다. 이 시트 10장을 동일 사이즈의 스테인리스제 금속 메시 상에 놓고, 또한 상부에 PE/PP 혼합 부직포를 놓으며, 이 세포를 포함하는 집합체를 플라스틱 케이스 내에 접지하였다.(도 9) 이 때, 세포를 포함하는 폴리이미드 다공질막 적층체를, 약 20° 경사시켰다. 경사 상부로부터 연속적으로 배지(페니실린·스트렙토마이신·암포테리신 B를 첨가한 Ham's F-12에 10% FBS를 첨가한 것)를 첨가하고, 매분 3 ㎖의 유속으로 150 ㎖량의 배지 저장부로부터 순환시켰다. 폴리이미드 다공질막은 상호 밀착하여 집합체로서 존재하고 있었다.
3일 후, 배지 저장부의 액을 폐기 후, 신규의 100 ㎖의 배지액을 배지 저장부에 첨가하고, 추가로 2일간 배지 순환을 계속하였다. 파종 완료로부터 5일 후에 배지 순환을 정지하고, CCK8에 의한 정색 반응을 이용하여 생육 세포수를 조사하였다. 폴리이미드 다공질막 각 시트에 생식하는 세포의 총합은, 8.9×108개였다. 부직포에의 세포 증식은 1.5×107개이고, 생식 세포 밀도는 1 ㎖당 3.8×106개였다. 시트마다의 세포 생육수를 나타낸다.(도 10; 도면 중의 숫자는 시트를 위로부터 세고 있다) 세포가 육성된 폴리이미드 다공질막을 일부 잘라내어 포르말린 고정하고, 핵(DAPI), 세포막(셀 마스크), 및 액틴(팔로이딘) 염색을 행한 후의 형광 현미경 사진을 도 11에 나타낸다.
실시예 9
대량 기상 폭로 배양(2)
순화된 CHO-K1 세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 대량 연속 배양
가로 세로 4 cm×10 cm의 직사각형의 폴리이미드 다공질막 10장을 180℃ 30분으로 건열 멸균하고, 메시 구조의 A면을 위로 하여 멸균 플레이트 상에 놓았다. 별도로, 배지 1 ㎖당 2.4×106개의 0.5% FBS에 순화한 CHO-K1 세포(그 중, 생세포는 2.3×106개, 사세포는 9.0×104개, 생세포율 96%)를 현탁한, CHO-K1 세포 현탁액 5 ㎖를 준비하였다. 세포 현탁액을 0.5 ㎖씩, 상기한 멸균한 폴리이미드 다공질막 10장에 각각 첨가하고, 셀 스크레이퍼로 평준화하였다. 수분간 방치한 후, 시트를 조금 움직여 현탁액을 통과시키고, 그 후에, 시트와 동형의 금속 메시 상에 세포 파종을 완료한 시트 10장을 적층하였다. 그 후, 적층한 시트 상에 부직포를 놓고, 배양 장치 내부에 설치하며, 그 위에 배지 공급 라인을 설치하고, 37℃로 설정한 다이테크사 제조 강제 통기식 CO2 인큐베이터로 배양 장치 전체를 옮겨, 배양 준비를 완료하였다.
0.5% FBS를 포함하는 Ham 배지 150 ㎖를 매분 1 ㎖의 페이스로 순환시켜, 연속 배양을 개시하였다. 3일 후에 배지를 분리하여 프레시한 배지 100 ㎖와 교환하고, 동일한 페이스로 배지 교환을 계속하면서 추가로 9일간 배양을 계속하였다.
배양 개시로부터 12일째에 배지 순환을 종료하고, 폴리이미드 다공질막 및 부직포를 분리하였다. 분리한 폴리이미드 다공질막을 집합체인 채로, CCK8로 셀 카운트를 실시한 결과, 합계로, 2.6×108개의 세포를 확인하였다. 개산(槪算)의 세포 배양 밀도로서는, 1.7×108개/㎖였다. 세포가 육성된 폴리이미드 다공질막을 일부 잘라내어 포르말린 고정하고, 핵(DAPI), 세포막(셀 마스크), 및 액틴(팔로이딘) 염색을 행한 후의 형광 현미경 사진을 도 12에 나타낸다. 순화 세포를 이용해도, 양호한 세포의 증식이 확인되었다.
실시예 10
대량 기상 폭로 배양(3) 대량 계대
실시예 9로부터 계속해서, CHO-K1 세포가 부착된 가로 세로 4 cm×10 cm의 직사각형의 폴리이미드 다공질막 10장을 기반 시트로 하고, 멸균한 동일 사이즈의 폴리이미드 다공질막 10장의 메시 구조의 A면을 전부 위로 하여, 기반 시트 상면에 적층시켰다. 또한, 마찬가지로 폴리이미드 다공질막 10장의 메시 구조의 A면을 전부 위로 하여, 기반 시트 하면에 적층시켰다. 그 후, 적층한 30장의 시트 상에 부직포를 놓고, 실시예 9에서 사용한 배양 장치(도 9) 내부에 설치하며, 그 위에 배지 공급 라인을 설치하고, 37℃로 설정한 다이테크사 제조 강제 통기식 CO2 인큐베이터로 배양 장치 전체를 옮겨, 배양 준비를 완료하였다.
0.5% FBS를 포함하는 Ham 배지를 매분 2 ㎖의 페이스로 순환시켜 연속 배양을 개시하였다. 도 13 우측에 나타내는 페이스로 배지 교환을 계속하면서 추가로 76일간 이상 배양을 계속하였다. 도면은, 배양 일수와 사용 배지량을 나타낸다. 그 때의 글루코오스 소비량과 젖산 생성량을 LC/MS(Shimadzu LCMS-2020)로 측정하였다. 도 13에 그 결과를 도시한다.
실시예 11
폴리이미드 다공질로부터 빈 폴리이미드 다공질막으로의 이동(5) 기상 계대법
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 40장의 폴리이미드 다공질막의 메시 구조의 A면을 위로 하여 배지에 침지시켰다. 1장의 시트당 2×104개의 MDCK 세포 현탁액을 시트 상부에 첨가한 후, CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 경시적으로 세포의 생육 상황을 관측하면서, 61일간 세포 배양을 계속하였다. 세포수는 8일째에 최고치에 이르고, 그 후, 안정된 세포수를 유지하였다. 61일째의 각 시트당 생존 세포수는, 평균값으로 2.5×106이었다.
이 시트 중 1장을 취출하고, 신규의 동일 사이즈의 폴리이미드 다공질막으로 상하를 각 1장씩의 시트 사이에 끼워, 3단 겹침의 폴리이미드 다공질막 적층체를 1세트 준비하였다. 마찬가지로, 세포가 생육한 시트 1장을 취출하고, 신규의 동일 사이즈의 폴리이미드 다공질막으로 상하를 각 2장씩의 시트 사이에 끼워, 5단 겹침의 폴리이미드 다공질막 적층체를 1세트 준비하였다(도 5). 이들 합계 2세트의 3단 겹침 및 5단 겹침의 적층체를, 배지 중에 놓은 메시 위에 기상에 접하도록 놓고, CO2 인큐베이터 내에서 배양을 계속하였다. 3일간 후, 각각의 적층체를 전부 1장마다 독립시키고, 각 폴리이미드 다공질막의 세포수에 대해 CCK8을 이용하여 측정하였다. 3중 적층 및 5중 적층의 양방에서, 적층체 내부에서의 세포의 이동과 증식이 확인되고, 1주일 후에 최고치와 동등한 세포수가 되었다. 기상에서의 접촉에 의해, 효율적이고 또한 신속하게 세포가 계대된 것을 확인하였다.(도 14)
실시예 12
폴리이미드 다공질로부터 빈 폴리이미드 다공질막으로의 이동(6) 장기 배양 후의 기상 배양
인간 피부 섬유아세포 장기 배양 시의 기상 계대에 의한 증식 확인
직경 6 cm의 샬레에 2 ㎖의 배지를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막의 메시 구조의 A면에 1장의 시트당 4×104개의 인간 피부 섬유아세포를 파종하여, 1개월 배양하였다. 그 후, 시트를 4분의 1로 절단하고, 추가로 배양을 계속해서 합계 230일 배양하였다. 그 후, 3.5 cm 디쉬 중앙에, 가로 세로 1.4 cm의 스테인리스 메시를 3장 겹쳐서 설치하고, 그 위에, 상기 폴리이미드 다공질막을 놓으며, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 빈 폴리이미드 다공질막 2장 사이에 끼웠다. 그 상태에서 배지 1 ㎖를 첨가하면, 배지는, 시트와 동일한 높이가 되었다. 이 상태에서 CO2 인큐베이터 내로 이동시키고, 1주일에 2회의 비율로 배지 교환하여 세포 배양을 계속적으로 실시하였다.
배양 7일 후, 각 시트를 1장씩으로 나누고, 단일의 시트로서 배양을 계속하였다. 7일, 10일, 16일, 21일, 28일, 42일, 56일 후에 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하고, 원래의 시트와 나중에 접지시킨 빈 폴리이미드 다공질막에 대해, 세포의 증식 거동을 CCK8에서의 염색법을 이용하여 관찰하였다. 인간 피부 섬유아세포를 장기간 배양한 폴리이미드 다공질막으로부터, 효율적으로 세포가 빈 폴리이미드 다공질막으로 이동하여, 계속적으로 증식해 가는 거동이 관찰되었다. 결과를 도 15에 도시한다.
기상 계대를 거치지 않고 폴리이미드 다공질막 상에서 장기 배양을 294일간 계속한 인간 피부 섬유아세포 배양 시트 및 기상 계대를 230일째에 거쳐 동기간 배양한 기반 시트 및 기상 배양에 의해 계대 후 56일간 배양한 상하 2장의 시트에 대해, 생식하는 인간 피부 섬유아세포가 산생하는 피브로넥틴을, ELISA 측정으로, 시트를 배양한 배지 중에 24시간에 방출한 피브로넥틴의 양으로 비교하였다. 배양 기간 및 기상 계대에 영향을 받지 않고, 안정적인 피브로넥틴의 산생을 확인하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 비교 대상으로서, 폴리이미드 다공질막에서 13일간 배양한 시트 2장으로부터 산생된 피브로넥틴량을 병기하였다.
Figure 112017071357409-pct00004

Claims (37)

  1. 세포의 배양 방법으로서,
    (1) 1 또는 복수의 시트형 다공질 담체에 세포를 담지시키는 공정,
    (2) 세포를 담지시킨 시트형 다공질 담체에 배지를 적용해서, 시트형 다공질 담체의 구멍의 일부 또는 전부에 배지가 포함된 상태로 하여, 시트형 다공질 담체를 배지로 습윤시키는 공정,
    (3) 배지를 수용하는 배양 용기 중에, 배지로 습윤시킨 시트형 다공질 담체 표면의 일부 또는 전체가 기상에 폭로되도록 시트형 다공질 담체를 배치하는 공정, 및
    (4) 배양 용기를 인큐베이터 내에 설치하여, 세포를 배양하는 공정
    을 포함하고, 여기서 배양을 통해 시트형 다공질 담체 표면 및 내부의 습윤 상태가 유지되는 것인 세포의 배양 방법으로서,
    상기 시트형 다공질 담체는, 적어도 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층(A면 및 B면) 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조를 가지며, 상기 A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이, 상기 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, 상기 매크로 보이드층이, 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인 복수의 매크로 보이드를 갖는 폴리이미드 다공질막인, 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, 공정 (4)에 있어서, 배양 용기 내에 연속적 또는 간헐적으로 배지가 공급되고, 여기서 배양을 통해 배지로 습윤시킨 시트형 다공질 담체의 일부 또는 전체가 기상에 폭로되어 있는 것인 배양 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공정 (4)에 있어서, 세포를 배양하는 공정이, 산소를 공급하는 수단으로 산소를 공급하면서 배양하는 공정인 배양 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공정 (3)에 있어서, 시트형 다공질 담체를 강체(剛體) 위에 배치하는 것인 배양 방법.
  5. 제4항에 있어서, 강체가 금속 메시인 배양 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공정 (3)에 있어서, 1 또는 복수의 시트형 다공질 담체의 상면의 일부 또는 전부를 피복하도록, 시트형 다공질 담체보다 평균 공경이 큰 다공질 시트를 배치하는 것인 배양 방법.
  7. 제6항에 있어서, 시트형 다공질 담체보다 평균 공경이 큰 다공질 시트가 부직포, 거즈, 및 스펀지로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 배양 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양 용기가 개방 용기인 배양 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양 용기가 폐쇄 용기인 배양 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공정 (3)에 있어서, 2 이상의 시트형 다공질 담체를 상하로 적층하여 배치하는 것인 배양 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공정 (3)에 있어서, 1 또는 복수의 시트형 다공질 담체를 접어 배치하는 것인 배양 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1 또는 복수의 시트형 다공질 담체가 폴리이미드 다공질막인 배양 방법.
  13. 제12항에 있어서, 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 배양 방법.
  14. 제13항에 있어서, 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 막 형상으로 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 배양 방법.
  15. 삭제
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가, 물질을 발현하도록 유전자 공학 기술에 의해 형질전환되어 있는 것인 배양 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 배양 방법.
  18. 제17항에 있어서, 동물 세포가, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인 배양 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포가 CHO 세포, CHO-K1 세포, 베로(Vero) 세포, 및 MDCK 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 배양 방법.
  20. 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트로서,
    상기 폴리이미드 다공질막은, 적어도 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층(A면 및 B면) 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조를 가지며, 상기 A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이, 상기 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, 상기 매크로 보이드층이, 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인 복수의 매크로 보이드를 갖는 폴리이미드 다공질막인, 키트.
  21. 제1항 또는 제2항에 기재된 방법에 사용하기 위한 폴리이미드 다공질막으로서,
    상기 폴리이미드 다공질막은, 적어도 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층(A면 및 B면) 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조를 가지며, 상기 A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이, 상기 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, 상기 매크로 보이드층이, 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인 복수의 매크로 보이드를 갖는 폴리이미드 다공질막인, 폴리이미드 다공질막.
  22. 세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체에 폴리이미드 다공질막을 접촉시킴으로써 세포를 세포 배양 매체로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동시키고, 그리고, 폴리이미드 다공질막으로 이동한 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법으로서,
    상기 폴리이미드 다공질막은, 적어도 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층(A면 및 B면) 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조를 가지며, 상기 A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이, 상기 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, 상기 매크로 보이드층이, 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인 복수의 매크로 보이드를 갖는 폴리이미드 다공질막인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 세포 배양 매체가, 샬레, 디쉬, 배양 플레이트, 배양 플라스크, 마이크로 웰 플레이트 및 유리 바닥 디쉬(glass bottom dish)로 이루어지는 군에서 선택되고, 그리고, 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 매체의 상면에 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 세포 배양 매체가, 마이크로 캐리어, 실리카 다공체, 셀룰로오스 스펀지, 부직포 및 중공사로 이루어지는 군에서 선택되고, 그리고, 상기 세포 배양 매체의 상부, 하부 또는 그 양방으로부터, 단수 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  25. 세포를 배양하고 있는 제1 폴리이미드 다공질막의 상면, 하면 혹은 그 양방으로부터, 세포를 배양하고 있지 않은 제2 폴리이미드 다공질막을 접촉시킴으로써, 세포를 제1 폴리이미드 다공질막으로부터 제2 폴리이미드 다공질막으로 이동시키고, 그리고, 제2 폴리이미드 다공질막으로 이동한 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법으로서,
    상기 폴리이미드 다공질막은, 적어도 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층(A면 및 B면) 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조를 가지며, 상기 A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이, 상기 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, 상기 매크로 보이드층이, 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인 복수의 매크로 보이드를 갖는 폴리이미드 다공질막인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 제1 폴리이미드 다공질막과 제2 폴리이미드 다공질막이 접촉한 상태인 채로, 막 집합체를 기상 중으로 들어올리는 것을 포함하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 세포를 배양하고 있지 않은 빈 제1 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하고 배양하여, 상기 세포를 배양하고 있는 제1 폴리이미드 다공질막을 얻는 공정을 더 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체에 빈 제1 폴리이미드 다공질막을 접촉시켜, 세포를 세포 배양 매체로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동시킴으로써, 제1 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하는 것인 방법.
  29. 세포를 포함하는 생체 시료를, 폴리이미드 다공질막의 상면, 하면 혹은 그 양방에 접촉시킴으로써, 세포를 생체 시료로부터 폴리이미드 다공질막으로 이동시키고, 그리고, 폴리이미드 다공질막으로 이동한 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포를 폴리이미드 다공질막 상으로 이동시켜 배양하는 방법으로서,
    상기 폴리이미드 다공질막은, 적어도 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층(A면 및 B면) 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조를 가지며, 상기 A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이, 상기 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, 상기 매크로 보이드층이, 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인 복수의 매크로 보이드를 갖는 폴리이미드 다공질막인, 방법.
  30. 제22항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 막 형상으로 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 방법.
  32. 삭제
  33. 제30항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막의 막 두께가 75 ㎛ 이하인 방법.
  34. 제22항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 이동한 2 이상의 폴리이미드 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 세포를 배양하는 것인 방법.
  35. 제22항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 배양하고 있는 세포 배양 매체, 세포를 포함하는 생체 시료, 혹은, 세포를 배양하고 있는 폴리이미드 다공질막으로부터 세포를 배양하고 있지 않은 폴리이미드 다공질막으로의 세포의 이동을, 2회 이상 반복하는 것을 포함하는 방법.
  36. 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 제22항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트로서,
    상기 폴리이미드 다공질막은, 적어도 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층(A면 및 B면) 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조를 가지며, 상기 A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이, 상기 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, 상기 매크로 보이드층이, 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인 복수의 매크로 보이드를 갖는 폴리이미드 다공질막인, 키트.
  37. 제22항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 폴리이미드 다공질막으로서,
    상기 폴리이미드 다공질막은, 적어도 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층(A면 및 B면) 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조를 가지며, 상기 A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이, 상기 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, 상기 매크로 보이드층이, 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인 복수의 매크로 보이드를 갖는 폴리이미드 다공질막인, 폴리이미드 다공질막.
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