KR101828720B1 - 세포의 배양 방법, 세포 배양 장치 및 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 세포의 배양 방법, 및 상기 배양 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치 및 키트에 관한 것이다.
본 발명의 세포의 배양 방법은, 세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하여, 배양하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 일양태에 있어서, 세포를 상기 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함한다. 혹은, 일양태에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 올리고, 상기 폴리이미드 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동하여 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고, 세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는 공정을 포함한다. 혹은, 일양태에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막의 한면 또는 양면을, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고, 상기 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전하고, 그리고, 세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는 공정을 포함한다.

Description

세포의 배양 방법, 세포 배양 장치 및 키트{CELL CULTURING METHOD, CELL CULTURING APPARATUS AND KIT}
본 출원은, 2013년 7월 26일에 제출된 일본 출원 제2013-155550호에 기초하는 우선권을 주장하고, 그 전체 내용은 본 명세서 중에 도입된다.
본 발명은, 세포의 배양 방법, 세포 배양 장치 및 키트에 관한 것이다.
세포 배양
세포는 생체 내에서는 일반적으로 3차원적인 집단으로서 존재하지만, 고전적인 평면 배양에서는, 세포가 용기에 달라붙는 형태로 단층형으로 배양된다. 배양 환경의 차이에 따라, 세포의 성질도 크게 상이한 경우가 수많이 보고되어 있다. 또한, 액체 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 부유 배양에 관해서는, 부유 배양에 적합한 세포가 있는 한편, 적합하지 않은 세포도 있다.
SCIVAX Corporation이 개발한 NanoCulture(등록 상표) Plate(NCP)는, 나노임프린트 기술에 의해, 보텀면에 세포외 매트릭스를 모방한 패터닝(마이크로 스퀘어와 마이크로 허니컴)을 실시한 접착형의 3차원 배양 멀티플레이트이다. 마이크로 스퀘어는 사각 형상의, 마이크로 허니컴은 육각 형상의 규칙적인 반복 구조를 취한다. 세포는 이 마이크로 패턴을 부착면으로서 이용함으로써, 능동적으로 스페로이드(세포가 다수 응집하여 3차원 상태가 된 것)를 형성한다.
또한, 균일한 극세포 돌기(나노필라)를 규칙적으로 다수 배열한 세포 배양 시트(「나노필라 세포 배양 시트」)를 이용하여, 구조가 생체 간장 조직에 가까운 3차원의 간세포 조직체(스페로이드)의 배양을 행한 사례가 보고되어 있다(Takahashi et al., Tissue Engineering Part A. June 2012, Vol.16, No.6, p.1983-1995).
일본 특허 공개 제2009-213421호는, 허니컴형 다공질 필름(허니컴 필름)을 이용한 스페로이드의 제조방법 및 스페로이드 제조 장치를 기재하고 있다.
이들 세포 배양 방법은, 규칙적인 반복 패턴을 갖는 시트(필름)를 이용하는 것인 점, 세포는 시트의 표면형으로 접착하여 증식하는 점, 세포 배양에 의해 형성되는 것은, 동일한 형상의 세포가 다수 응집하여 3차원 상태가 된 스페로이드인 점에 있어서 공통되고, 그 의미에 있어서 한정적이었다. 세포를 보다 간편히, 효율적으로, 또한 안정적으로 배양하기 위한 방법의 개발이 요구되고 있었다.
폴리이미드 다공질막
폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭으로, 통상은, 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 방향족 폴리이미드를 의미한다. 방향족 폴리이미드는 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공역 구조를 갖기 때문에, 강직하고 강고한 분자 구조를 가지며, 또한, 이미드 결합이 강한 분자간력을 갖기 때문에 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.
폴리이미드 다공질막은, 본 발명 전부터 필터, 저유전율 필름, 연료 전지용 전해질막 등, 특히 전지 관계를 중심으로 하는 용도로 이용되어 왔다. 국제 공개 WO2010/038873호, 일본 특허 공개 제2011-219585호, 및 일본 특허 공개 제2011-219586호는, 특히, 기체 등의 물질 투과성이 우수하고, 공공률이 높은, 양표면의 평활성이 우수하고, 상대적으로 강도가 높고, 높은 공공률에도 불구하고, 막두께 방향으로의 압축 응력에 대한 내력이 우수한 매크로 보이드를 다수 갖는 폴리이미드 다공질막을 기재하고 있다.
일본 특허 공개 제2009-213421호 WO2010/038873호 일본 특허 공개 제2011-219585호 일본 특허 공개 제2011-219586호
Takahashi et al., Tissue Engineering Part A. June 2012, Vol.16, No.6, p.1983-1995
본 발명은, 세포의 배양 방법, 및 상기 배양 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치 및 키트에 관한 것이다.
한정되는 것은 아니지만, 본 발명은 바람직하게는 이하의 양태를 포함한다.
[양태 1]
세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하여, 배양하는 것을 포함하는, 세포의 배양 방법.
[양태 2]
세포를 상기 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는, 양태 1에 기재된 방법.
[양태 3]
상기 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 올리고,
상기 폴리이미드 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동하여 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는, 양태 1에 기재된 방법.
[양태 4]
상기 폴리이미드 다공질막의 한면 또는 양면을, 세포 배양 배지 또는 멸균된 액체로 습윤하고,
상기 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전하고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는, 양태 1에 기재된 방법.
[양태 5]
생세포가 상기 폴리이미드 다공질막 내에 머물고, 사세포는 수분과 함께 유출되는, 양태 4에 기재된 방법.
[양태 6]
상기 멸균된 액체가, 멸균수 혹은 멸균된 완충액인, 양태 4 또는 5에 기재된 방법.
[양태 7]
세포 배양 용기 중에, 세포 배양 배지, 세포 및 1 또는 그 이상의 상기 폴리이미드 다공질막을 넣는, 여기서, 폴리이미드 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태인 것을 포함하는, 양태 1-6 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 8]
2 이상의 상기 폴리이미드 다공질막의 소편을 이용하는 것을 특징으로 하는, 양태 7에 기재된 방법.
[양태 9]
세포가 상기 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착하는, 양태 7 또는 8에 기재된 방법.
[양태 10]
상기 폴리이미드 다공질막을
i) 절첩하여,
ii) 롤형으로 감아,
iii) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은,
iv) 새끼줄형으로 묶어
세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시키는, 양태 1-6 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 11]
세포가 상기 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착하는, 양태 10에 기재된 방법.
[양태 12]
2 이상의 폴리이미드 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용하는 것을 포함하는, 양태 1에 기재된 방법.
[양태 13]
양태 2-12 중 어느 한 항에 기재된 방법 중 2종류 이상의 방법을 조합하여 이용하는, 양태 1에 기재된 방법.
[양태 14]
세포가 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부에 생육하고 증식하는, 양태 1-13 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 15]
세포가, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 양태 1-14 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 16]
동물 세포가, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인, 양태 15에 기재된 방법.
[양태 17]
세균이, 유산균, 대장균, 고초균 및 시아노박테리아로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 양태 15에 기재된 방법.
[양태 18]
세포가, 다능성 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포 및 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는,
양태 1-14 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 19]
세포가, 육종 세포, 주화 세포 및 형질 전환 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 양태 1-13 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 20]
폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는, 폴리이미드 다공질막인, 양태 1-19 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 21]
폴리이미드 다공질막을 포함하는, 양태 1-20 중 어느 한 항에 기재된 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치.
[양태 22]
2 이상의 폴리이미드 다공질막이, 상하 또는 좌우로 적층되어 있는, 양태 21에 기재된 세포 배양 장치.
[양태 23]
폴리이미드 다공질막을 포함하는, 양태 1-20 중 어느 한 항에 기재된 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 키트.
본 발명은, 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하면, 세포가 생육한다는 발견에 기초한다. 세포는, 폴리이미드 다공질막에 바람직하게는 자발적으로 접착하고, 막의 표면 및 내부에서 증식할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해, 세포를 간편히, 효율적으로, 또한 안정적으로 배양하는 것이 가능해졌다.
도 1은, 폴리이미드 다공질막에 대한 세포 현탁액의 파종 형태의 일양태로서 자연 파종을 나타낸 것이다.
도 2는, 폴리이미드 다공질막에 대한 세포 현탁액의 파종 형태의 일양태로서 흡입 파종을 나타낸 것이다.
도 3은, 인간 간엽계 줄기 세포의 자연 파종시의 파종면별 시간 경과적 변화를 나타낸 것이다.
도 4는, 인간 피부 선유아세포의 자연 파종의 파종면별 시간 경과적 변화를 나타낸 것이다.
도 5는, 인간 피부 선유아세포 B면 파종시의 관측 결과(24시간 후)(웨트막법)를 나타낸, 형광 현미경 사진 및 실체 현미경 사진을 나타낸다.
도 6은, 인간 간엽계 줄기 세포의 A면 흡입 파종시의 시간 경과적 변화를 나타낸 것이다(1점 웨트법).
도 7은, 인간 간엽계 줄기 세포의 B면 흡입 파종시의 시간 경과적 변화를 나타낸 것이다(1점 웨트법).
도 8은, 인간 간엽계 줄기 세포 구속 파종시의 관측면별 시간 경과적 변화를 나타낸 것이다.
도 9는, 인간 간엽계 줄기 세포 구속 파종시의 저배율 사진 및 실험의 개관에 관한 사진이다.
도 10은, PC12 세포 흡입 파종시의 시간 경과적 변화를 나타낸 것이다.
도 11은, 인간 피부 선유아세포를, 막두께 25 ㎛의 폴리이미드 다공질막을 이용하여 배양한 경우의 세포수를 나타낸다. 횡축은 배양 후의 일수를 나타내고, 종축은 막 1 평방센티미터당의 세포수를 나타낸다.
도 12는, 인간 피부 각화 세포를 폴리이미드 다공질막을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 13은, 인간 제대 정맥 내피 세포를 폴리이미드 다공질막을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 14a는, Vero 세포를 폴리이미드 다공질막(25 ㎛ 시트)을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 14b는, Vero 세포를 폴리이미드 다공질막(40 ㎛ 시트)을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 14c는, Vero 세포를 폴리이미드 다공질막(75 ㎛ 시트)을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 15a는, HeLa 세포를 폴리이미드 다공질막(25 ㎛ 시트)을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 15b는, HeLa 세포를 폴리이미드 다공질막(40 ㎛ 시트)을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 15c는, HeLa 세포를 폴리이미드 다공질막(75 ㎛ 시트)을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 16a는, CHO 세포를 폴리이미드 다공질막(25 ㎛ 시트)을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 16b는, CHO 세포를 폴리이미드 다공질막(40 ㎛ 시트)을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 16c는, CHO 세포를 폴리이미드 다공질막(75 ㎛ 시트)을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
I. 세포의 배양 방법
본 발명은 세포의 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명의 세포의 배양 방법은, 세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하여, 배양하는 것을 포함한다. 본 발명자들은, 폴리이미드 다공질막이 세포의 접착, 배양에 적합한 것을 발견하고, 본 발명을 상도했다. 본 발명의 방법은, 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하여, 폴리이미드막의 표면 또는 내부에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 적용
세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 적용의 구체적인 공정은 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 공정, 혹은, 세포를 막형의 담체에 적용하는 데에 적합한 임의의 수법을 채용하는 것이 가능하다. 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은, 예컨대, 이하와 같은 양태를 포함한다.
(A) 세포를 상기 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는 양태;
(B) 상기 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 올리고,
방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동하여 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태; 및,
(C) 상기 폴리이미드 다공질막의 한면 또는 양면을, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고,
상기 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전하고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태.
(A)의 양태는, 폴리이미드 다공질막의 표면에 세포, 세포 덩어리를 직접 파종하는 것을 포함한다. 혹은, 폴리이미드 다공질막을 세포 현탁액 중에 넣고, 막의 표면으로부터 세포 배양액을 침윤시키는 양태도 포함한다.
폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 폴리이미드 다공질막에 접착하고, 다공의 내부에 들어간다. 바람직하게는, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않아도, 세포는 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착한다. 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에서 안정적으로 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 생육·증식하는 막의 위치에 따라, 여러가지 상이한 형태를 취할 수 있다.
(B)의 양태에 있어서, 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 올린다. 폴리이미드 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동하여 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시킴으로써, 세포 현탁액이 막 중에 침투한다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이것은 폴리이미드 다공질막의 각 표면 형상 등에서 유래되는 성질에 의한 것으로 생각된다. 본 양태에 의해, 막의 세포 현탁액이 장전된 개소에 세포가 흡입되어 파종된다.
혹은, (C)의 양태와 같이, 상기 폴리이미드 다공질막의 한면 또는 양면의 부분 또는 전체를, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고 나서, 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전해도 좋다. 이 경우, 세포 현탁액의 통과 속도는 크게 향상된다.
예컨대, 본 명세서의 실시예 4에 기재된 1점 웨트법은, 막의 비산 방지를 주목적으로 하여 막의 극히 일부를 습윤시키는 방법으로, 실질적으로는 막을 습윤시키지 않는 드라이법((B)의 양태)에 거의 가까운 것이다. 다만, 습윤시킨 작은 부분에 관해서는, 세포액의 막투과가 신속해지는 것으로 생각된다. 또한, 본 명세서의 실시예 3에 기재된 웨트막법은, 폴리이미드 다공질막의 한면 또는 양면의 전체를 충분히 습윤시킨 것(이후, 이것을 「웨트막」이라고 기재함)에 세포 현탁액을 장전하는 방법이다. 이 경우, 폴리이미드 다공질막의 전체에 있어서, 세포 현탁액의 통과 속도가 크게 향상된다.
(B) 및 (C)의 양태에 있어서, 세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시킨다. 이에 따라 세포 현탁액 중의 세포의 농도를 농축시키고, 세포 이외의 불필요한 성분을 수분과 함께 유출시키는 등의 처리도 가능해진다.
(A)의 양태를 「자연 파종」, (B) 및 (C)의 양태를 「흡입 파종」이라고 하는 경우가 있다.
한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막에는 생세포가 선택적으로 머문다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 생세포가 상기 폴리이미드 다공질막 내에 머물고, 사세포는 우선적으로 수분과 함께 유출된다. 본 발명의 실시예 3에 있어서, 본 발명의 상기 폴리이미드 다공질막에 적용하기 전의 세포 배양 배지(세포 현탁액) 중에서는 생세포율 90%였지만, 폴리이미드 다공질막에 적용하고, 유출시킨 액체 중에서는 생세포율 65%였다. 세포 생사로 비교하면, 생세포의 막에 대한 흡착률은 88%, 삼출률은 12%이고, 사세포의 막에 대한 흡착률은 40%, 삼출률은 60%였다. 본 발명의 상기 폴리이미드 다공질막에는 생세포가 선택적으로 흡착되는 것으로 이해할 수 있다.
양태(C)에 있어서 이용하는 멸균된 액체는 특별히 한정되지 않지만, 멸균된 완충액 혹은 멸균수이다. 완충액은, 예컨대, (+) 및 (-) Dulbecco's PBS, (+) 및 (-) Hank's Balanced Salt Solution 등이다. 완충액의 예를 이하의 표 1에 나타낸다.
Figure 112016006466812-pct00001
본 발명은 또한, 부유 상태에 있는 접착성 세포를 폴리이미드 다공질막과 현탁적으로 공존시킴으로써 세포를 막에 부착시키는 양태(구속)도 포함한다. 예컨대, 본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하기 위해, 세포 배양 용기 중에, 세포 배양 배지, 세포 및 1 또는 그 이상의 상기 폴리이미드 다공질막을 넣어도 좋다. 세포 배양 배지가 액체인 경우 폴리이미드 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태이다. 폴리이미드 다공질막의 성질로부터, 세포는 폴리이미드 다공질막에 접착할 수 있다. 따라서, 생래적으로 부유 배양에 적합하지 않은 세포라도, 폴리이미드 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태로 배양하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 세포는, 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착한다. 「자발적으로 접착한다」란, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않아도, 세포가 폴리이미드 다공질막의 표면 또는 내부에 머무는 것을 의미한다.
세포 배양은, 세포 배양에서의 존재 형태에 따라 배양 세포는 접착 배양계 세포와 부유 배양계 세포로 분류할 수 있다. 접착 배양계 세포는 배양 용기에 부착되어 증식하는 배양 세포이고, 계대에는 배지 교환을 행한다. 부유 배양계 세포는 배지 중에서 부유 상태로 증식하는 배양 세포이고, 일반적으로는 계대시에는 배지 교환은 행하지 않고, 희석 배양을 행한다. 부유 배양은, 부유 상태, 즉 액체 중에서의 배양이 가능하기 때문에, 대량 배양이 가능하고, 배양 용기 표면에만 생육하는 부착 세포와 비교하면, 입체적인 배양이기 때문에, 단위 공간당의 배양 가능 세포수는 많다는 이점이 있다.
본 발명에 의해, 개념적으로는, 세포의 종류에 한정되지 않고 부유 배양과 유사한 형태로 세포를 육성하는 것이 가능해진 것에 의해, 대량의 세포를 간편히 배양하는 방법이 제공되었다. 본 발명의 세포 배양 방법에 있어서, 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지 중에 부유한 상태로 이용하는 경우, 2 이상의 상기 폴리이미드 다공질막의 소편을 이용해도 좋다. 폴리이미드 다공질막은 플렉시블한 박막이기 때문에, 예컨대 그 소편을 배양액 중에 부유시켜 이용함으로써, 일정 용량의 세포 배양 배지 중에 많은 표면적을 갖는 폴리이미드 다공질막을 도입하는 것이 가능해진다. 통상 배양의 경우, 용기 바닥 면적이 세포 배양 가능한 면적의 상한이 되지만, 본 발명의 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양에서는, 앞서 도입된 폴리이미드 다공질막의 큰 표면적의 전체가 세포 배양 가능한 면적이 된다. 폴리이미드 다공질막은 세포 배양액을 통과시키기 때문에, 예컨대 절첩된 막 내에도 영양이나 산소 등의 공급이 가능해진다.
폴리이미드 다공질막의 소편의 크기, 형상은, 특별히 한정되지 않는다. 형상은, 원, 타원형, 사각, 삼각, 다각형, 끈형 등 임의의 형태를 취할 수 있다. 예컨대, 한변의 길이가 약 0.1 mm∼약 20 mm, 바람직하게는 약 0.2 mm∼약 10 mm인, 보다 바람직하게는, 약 1mm∼약 5 mm인 사각형(정사각형, 직사각형 등), 삼각형 등이 포함된다. 혹은, 예컨대, 바람직하게는, 직경이 약 0.1 mm∼약 20 mm, 보다 바람직하게는 약 0.5 mm∼약 10 mm인 원형이어도 좋다. 이들 소편을 액 중에 분산시킴으로써, 부유 배양과 근사한 형태가 형성되게 된다.
본 발명의 폴리이미드 다공질막은 유연성이 있기 때문에 형상을 변화시켜 이용할 수 있다. 폴리이미드 다공질막을 평면형이 아니라 입체형으로 형상을 가공하여 이용해도 좋다. 예컨대, 폴리이미드 다공질막을, i) 절첩하여, ii) 롤형으로 감아, iii) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은, iv) 새끼줄형으로 묶어, 세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시켜도 좋다. i)-iv)와 같이 형상을 가공함으로써, 소편을 이용하는 경우와 마찬가지로, 일정 용량의 세포 배양 배지 중에 많은 폴리이미드 다공질막을 넣을 수 있다. 또한, 각 소편을 집합체로서 취급할 수 있기 때문에, 세포체를 집합화하여 이동시키는 것이 가능해지고, 종합적인 응용성이 높다.
소편 집합체와 동일한 사고 방식으로서, 2 이상의 폴리이미드 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용해도 좋다. 적층이란, 폴리이미드 다공질막이 일부 겹쳐지는 양태도 포함한다. 적층 배양에 의해, 좁은 스페이스에서 고밀도로 세포를 배양하는 것이 가능해진다. 이미 세포가 육성되고 있는 막 상에 더욱 막을 적층시켜 설치하여 별종 세포와의 다층계를 형성하는 것도 가능하다. 또한, 입체 환경하에서의 세포간 상호작용 검증이나, 스트레스가 없는 세포 배양 방법 등, 창약(創藥)에 대한 이용도 가능하다. 적층하는 폴리이미드 다공질막의 수는 특별히 한정되지 않는다.
전술한 본 발명의 세포의 배양 방법을, 2종류 이상의 방법을 조합하여 이용해도 좋다. 예컨대, 양태(A)-(C) 중 어느 방법을 이용하여 우선 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하고, 계속해서, 세포가 접착한 폴리이미드 다공질막을 부유 배양해도 좋다. 혹은, 폴리이미드 다공질막에 적용하는 공정으로서, 상기 양태(A)-(C) 중 어느 방법을 2종류 또는 그보다 많이 조합하여 이용해도 좋다.
본 발명의 방법에 있어서, 바람직하게는, 세포는 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부에 생육하고 증식한다. 세포가 입체 구조체의 내부에 생육하고 증식하는 것을 나타낸 보고예는 없다. 본 발명에 있어서 폴리이미드 다공질막의 이용에 의해, 세포의 계속적인 3차원 배양이 가능해졌다. 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에 의해, 세포는 2일 이상, 보다 바람직하게는 4일 이상, 더욱 바람직하게는 6일 이상 계속해서 증식한다. 본 명세서에 기재된 실시예 1 및 4에서는, 21일간 세포가 증가하는 것이 관찰되었다.
2. 세포
본 발명의 방법에 이용할 수 있는 세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 임의의 세포의 증식에 이용 가능하다.
예컨대, 세포는, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 동물 세포는, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포와 무척추 동물(척추 동물문에 속하는 동물 이외의 동물) 유래의 세포로 대별된다. 본 명세서에 있어서의 동물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포를 의미한다. 척추 동물문은, 무악상강과 악구상강을 포함하고, 악구상강은, 포유강, 조강, 양서강, 파충강 등을 포함한다. 바람직하게는, 일반적으로 포유 동물이라고 말하는 포유강에 속하는 동물 유래의 세포이다. 포유 동물은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 돼지, 개, 양, 염소 등을 포함한다.
본 명세서에 있어서의 식물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 이끼 식물, 양치 식물, 종자 식물을 포함하는 식물의 세포가 대상이 된다.
종자 식물 세포가 유래하는 식물은, 단자엽 식물, 쌍자엽 식물의 어느 것이나 포함된다. 한정되는 것은 아니지만, 단자엽 식물에는, 난과 식물, 벼과 식물(벼, 옥수수, 대맥, 소맥, 수수 등), 금방동사니과 식물 등이 포함된다. 쌍자엽 식물에는, 국화아강, 목련아앙, 장미아강 등 많은 아강에 속하는 식물이 포함된다.
조류도, 세포 유래 생물로서 간주할 수 있다. 진정 세균인 시아노박테리아(남조)로부터, 진핵 생물이고 단세포 생물인 것(규조, 황녹조, 와편모조 등) 및 다세포 생물인 해조류(홍조, 갈조, 녹조) 등의 상이한 그룹을 포함한다.
본 명세서에 있어서의 고세균 및 세균의 종류도 특별히 한정되지 않는다. 고세균은, 메탄균·고도 호염균·호열 호산균·초호열균 등으로 이루어지는 군으로 구성된다. 세균은, 예컨대, 유산균, 대장균, 고초균 및 시아노박테리아 등으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에 이용할 수 있는 동물 세포 또는 식물 세포의 종류는, 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 다능성 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포, 및 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명에 있어서 「다능성 줄기 세포」란, 모든 조직의 세포로 분화하는 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 총칭하는 것을 의도한다. 한정되는 것은 아니지만, 다능성 줄기 세포는, 배성 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배성 생식 줄기 세포(EG 세포), 생식 줄기 세포(GS 세포) 등을 포함한다. 바람직하게는, ES 세포 또는 iPS 세포이다. iPS 세포는 윤리적인 문제도 없는 등의 이유에 의해 특히 바람직하다. 다능성 줄기 세포로는 공지된 임의의 것을 사용 가능하지만, 예컨대, 국제 공개 WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)에 기재된 다능성 줄기 세포를 사용 가능하다.
「조직 줄기 세포」란, 분화 가능한 세포 계열이 특정한 조직에 한정되어 있지만, 다양한 세포종으로 분화 가능한 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 예컨대 골수 중의 조혈 줄기 세포는 혈구의 기초가 되고, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화한다. 그 외에도 간장을 만드는 간 줄기 세포, 피부 조직이 되는 피부 줄기 세포 등 여러가지 종류가 있다. 바람직하게는, 조직 줄기 세포는, 간엽계 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 세포로부터 선택된다.
「체세포」란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포를 말한다. 유성 생식에 있어서는 차세대에는 이어지지 않는다. 바람직하게는, 체세포는, 간세포, 췌세포, 근세포, 골세포, 골아세포, 파골 세포, 연골 세포, 지방 세포, 피부 세포, 섬유아세포, 췌세포, 신세포, 폐세포, 또는, 림프구, 적혈구, 백혈구, 단구, 매크로퍼지 혹은 거핵구의 혈구 세포로부터 선택된다.
「생식 세포」는, 생식에 있어서 유전 정보를 차세대에 전하는 역할을 갖는 세포를 의미한다. 예컨대, 유성 생식을 위한 배우자, 즉 난자, 난세포, 정자, 정세포, 무성 생식을 위한 포자 등을 포함한다.
세포는, 육종 세포, 주화 세포 및 형질 전환 세포로 이루어지는 군으로부터 선택해도 좋다. 「육종」이란, 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈액 등의 비상피성 세포 유래의 결합 조직 세포에 발생하는 암으로, 연부 육종, 악성 골종양 등을 포함한다. 육종 세포는, 육종에서 유래되는 세포이다. 「주화 세포」란, 장기간에 걸쳐 체외에서 유지되어, 일정한 안정적인 성질을 갖기에 이르고, 반영구적인 계대 배양이 가능해진 배양 세포를 의미한다. PC12 세포(래트 부신 수질 유래), CHO 세포(차이니스 햄스터 난소 유래), HEK293 세포(인간 태아 신장 유래), HL-60 세포(인간 백혈구 세포 유래), HeLa 세포(인간 자궁 경부암 유래) 등 인간을 포함하는 여러가지 생물종의 여러 조직에서 유래되는 세포주가 존재한다. 「형질 전환 세포」는, 세포 외부로부터 핵산(DNA 등)을 도입하고, 유전적 성질을 변화시킨 세포를 의미한다. 동물 세포, 식물 세포, 세균의 형질 전환에 관해서는, 각각 적합한 방법이 공지되어 있다.
3. 폴리이미드 다공질막
폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭으로, 통상은, 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 방향족 폴리이미드를 의미한다. 방향족 폴리이미드는 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공역 구조를 갖기 때문에, 강직하고 강고한 분자 구조를 가지며, 또한, 이미드 결합이 강한 분자간력을 갖기 때문에 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.
본 발명의 폴리이미드 다공질막은, 바람직하게는, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 (주된 성분으로서) 포함하는 폴리이미드 다공질막이고, 보다 바람직하게는 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막이다. 「주된 성분으로서 포함한다」란, 폴리이미드 다공질막의 구성 성분으로서, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드 이외의 성분은, 본질적으로 포함하지 않거나, 혹은 포함되어 있어도 좋지만, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드의 성질에 영향을 미치지 않는 부가적인 성분인 것을 의미한다.
테트라카르복실산 성분과 디아민 성분으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막도 포함된다.
폴리아믹산
폴리아믹산은, 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분을 중합하여 얻어진다. 폴리아믹산은, 열 이미드화 또는 화학 이미드화함으로써 폐환하여 폴리이미드로 할 수 있는 폴리이미드 전구체이다.
폴리아믹산은, 아믹산의 일부가 이미드화되어 있어도, 본 발명에 영향을 미치지 않는 범위이면 그것을 이용할 수 있다. 즉, 폴리아믹산은, 부분적으로 열 이미드화 또는 화학 이미드화되어 있어도 좋다.
폴리아믹산을 열 이미드화하는 경우에는, 필요에 따라, 이미드화 촉매, 유기 인 함유 화합물, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 또한, 폴리아믹산을 화학 이미드화하는 경우에는, 필요에 따라, 화학 이미드화제, 탈수제, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 폴리아믹산 용액에 상기 성분을 배합하더라도, 착색 전구체가 석출되지 않는 조건에서 행하는 것이 바람직하다.
착색 전구체
본 발명에 있어서 착색 전구체란, 250℃ 이상의 열처리에 의해 일부 또는 전부가 탄화되어 착색화물을 생성하는 전구체를 의미한다.
본 발명에서 이용되는 착색 전구체로는, 폴리아믹산 용액 또는 폴리이미드 용액에 균일하게 용해 또는 분산하고, 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리, 바람직하게는 공기 등의 산소 존재하에서의 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리에 의해 열분해하고, 탄화하여 착색화물을 생성하는 것이 바람직하고, 흑색계의 착색화물을 생성하는 것이 보다 바람직하고, 탄소계 착색 전구체가 보다 바람직하다.
착색 전구체는, 가열해 나가면 언뜻 탄소화물로 보이는 것이 되지만, 조직적으로는 탄소 이외의 이원소를 포함하고, 층 구조, 방향족 가교 구조, 사면체 탄소를 포함하는 무질서 구조의 것을 포함한다.
탄소계 착색 전구체는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 석유 타르, 석유 피치, 석탄 타르, 석탄 피치 등의 타르 또는 피치, 코크스, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체, 페로센 화합물(페로센 및 페로센 유도체) 등을 들 수 있다. 이들 중에서는, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체 및/또는 페로센 화합물이 바람직하고, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체로는 폴리아크릴니트릴이 바람직하다.
테트라카르복실산이무수물은, 임의의 테트라카르복실산이무수물을 이용할 수 있고, 원하는 특성 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 테트라카르복실산이무수물의 구체예로서, 피로멜리트산이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산이무수물(s-BPDA), 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실산이무수물(a-BPDA) 등의 비페닐테트라카르복실산이무수물, 옥시디프탈산이무수물, 디페닐술폰-3,4,3',4'-테트라카르복실산이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술피드이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실산이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실산이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)메탄이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)프로판이무수물, p-페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산무수물), p-비페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산무수물), m-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산이무수물, p-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산이무수물, 1,3-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)비페닐이무수물, 2,2-비스[(3,4-디카르복시페녹시)페닐]프로판이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실산이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실산이무수물, 4,4'-(2,2-헥사플루오로이소프로필리덴)디프탈산이무수물 등을 들 수 있다. 또한, 2,3,3',4'-디페닐술폰테트라카르복실산 등의 방향족 테트라카르복실산을 이용하는 것도 바람직하다. 이들은 단독으로도, 2종 이상을 조합하여 이용할 수도 있다.
이들 중에서도, 특히, 비페닐테트라카르복실산이무수물 및 피로멜리트산이무수물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 방향족 테트라카르복실산이무수물이 바람직하다. 비페닐테트라카르복실산이무수물로는, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산이무수물을 적합하게 이용할 수 있다.
디아민은, 임의의 디아민을 이용할 수 있다. 디아민의 구체예로서 이하의 것을 들 수 있다.
1) 1,4-디아미노벤젠(파라페닐렌디아민), 1,3-디아미노벤젠, 2,4-디아미노톨루엔, 2,6-디아미노톨루엔 등의 벤젠핵 1개의 벤젠디아민;
2) 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르 등의 디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-비스(트리플루오로메틸)-4,4'-디아미노비페닐, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디카르복시-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3',5,5'-테트라메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 비스(4-아미노페닐)술피드, 4,4'-디아미노벤즈아닐리드, 3,3'-디클로로벤지딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 2,2'-디메틸벤지딘, 3,3'-디메톡시벤지딘, 2,2'-디메톡시벤지딘, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,3'-디아미노디페닐술피드, 3,4'-디아미노디페닐술피드, 4,4'-디아미노디페닐술피드, 3,3'-디아미노디페닐술폰, 3,4'-디아미노디페닐술폰, 4,4'-디아미노디페닐술폰, 3,3'-디아미노벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디클로로벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디메톡시벤조페논, 3,3'-디아미노디페닐메탄, 3,4'-디아미노디페닐메탄, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 2,2-비스(3-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(3-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 3,3'-디아미노디페닐술폭시드, 3,4'-디아미노디페닐술폭시드, 4,4'-디아미노디페닐술폭시드 등의 벤젠핵 2개의 디아민;
3) 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페녹시)-4-트리플루오로메틸벤젠, 3,3'-디아미노-4-(4-페닐)페녹시벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디(4-페닐페녹시)벤조페논, 1,3-비스(3-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스[2-(4-아미노페닐)이소프로필]벤젠, 1,4-비스[2-(3-아미노페닐)이소프로필]벤젠, 1,4-비스[2-(4-아미노페닐)이소프로필]벤젠 등의 벤젠핵 3개의 디아민;
4) 3,3'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 3,3'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 비스[3-(3-아미노페녹시)페닐]에테르, 비스[3-(4-아미노페녹시)페닐]에테르, 비스[4-(3-아미노페녹시)페닐]에테르, 비스[4-(4-아미노페녹시)페닐]에테르, 비스[3-(3-아미노페녹시)페닐]케톤, 비스[3-(4-아미노페녹시)페닐]케톤, 비스[4-(3-아미노페녹시)페닐]케톤, 비스[4-(4-아미노페녹시)페닐]케톤, 비스[3-(3-아미노페녹시)페닐]술피드, 비스[3-(4-아미노페녹시)페닐]술피드, 비스[4-(3-아미노페녹시)페닐]술피드, 비스[4-(4-아미노페녹시)페닐]술피드, 비스[3-(3-아미노페녹시)페닐]술폰, 비스[3-(4-아미노페녹시)페닐]술폰, 비스[4-(3-아미노페녹시)페닐]술폰, 비스[4-(4-아미노페녹시)페닐]술폰, 비스[3-(3-아미노페녹시)페닐]메탄, 비스[3-(4-아미노페녹시)페닐]메탄, 비스[4-(3-아미노페녹시)페닐]메탄, 비스[4-(4-아미노페녹시)페닐]메탄, 2,2-비스[3-(3-아미노페녹시)페닐]프로판, 2,2-비스[3-(4-아미노페녹시)페닐]프로판, 2,2-비스[4-(3-아미노페녹시)페닐]프로판, 2,2-비스[4-(4-아미노페녹시)페닐]프로판, 2,2-비스[3-(3-아미노페녹시)페닐]-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스[3-(4-아미노페녹시)페닐]-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스[4-(3-아미노페녹시)페닐]-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스[4-(4-아미노페녹시)페닐]-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판 등의 벤젠핵 4개의 디아민.
이들은 단독으로도, 2종 이상을 혼합하여 이용할 수도 있다. 이용하는 디아민은, 원하는 특성 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
이들 중에서도, 방향족 디아민 화합물이 바람직하고, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르 및 파라페닐렌디아민, 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠을 적합하게 이용할 수 있다. 특히, 벤젠디아민, 디아미노디페닐에테르 및 비스(아미노페녹시)페닐로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 디아민이 바람직하다.
폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온하에서의 치수 안정성의 관점에서, 유리 전이 온도가 240℃ 이상이거나, 또는 300℃ 이상에서 명확한 전이점이 없는 테트라카르복실산이무수물과 디아민을 조합하여 얻어지는 폴리이미드로 형성되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온하에서의 치수 안정성의 관점에서, 이하의 방향족 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막인 것이 바람직하다.
(i) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와, 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드,
(ii) 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드,
및/또는,
(iii) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드.
한정되는 것은 아니지만, 폴리이미드 다공질막으로서, 적어도, 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조의 폴리이미드 다공질막을, 본 발명의 방법에 사용하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막은, 상기 매크로 보이드층이, 상기 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인, 막 평면 방향의 평균 구멍 직경이 10∼500 ㎛인 복수의 매크로 보이드를 갖고, 상기한 매크로 보이드층의 격벽, 및 상기 표면층(A면 및 B면)은 각각, 두께가 0.01∼20 ㎛이고, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의 복수의 구멍을 갖고, 상기 세공끼리가 연통해도 좋고, 또한 상기 매크로 보이드에 연통하여 부분적 혹은 전면적으로 다층 구조를 갖고 있으며, 또한, 총막두께가 5∼500 ㎛이고, 공공률이 40% 이상 95% 미만인, 폴리이미드 다공질막이다.
총막두께는, 한정되는 것은 아니지만, 일양태로서 25∼75 ㎛로 해도 좋다. 막두께 차이에 의해, 세포의 증식 속도, 세포의 형태, 면 내에서의 세포의 포화도 등에 차이가 관찰될 수 있다.
일양태에 있어서, 폴리이미드 다공질막의 A면이 평균 구멍 직경 15 ㎛ 이하의 작은 구멍을 갖는 메시 구조이고, B면이 평균 구멍 직경 20 ㎛ 이상의 큰 구멍 구조이다.
예컨대, 국제 공개 WO2010/038873호, 일본 특허 공개 제2011-219585호, 또는 일본 특허 공개 제2011-219586호에 기재되어 있는 폴리이미드 다공질막도, 본 발명의 방법에 사용 가능하다.
폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에서 안정적으로 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 막 중의 생육·증식하는 위치에 따라, 여러가지 상이한 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 일양태에 있어서, 세포의 종류에 따라, 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부를 이동하면서, 형상을 변화시키면서 증식하는 경우도 있다.
4. 세포의 배양 방법, 세포 배양 배지
본 발명의 방법에 있어서, 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용한 후, 세포를 임의의 공지된 방법을 이용하여 배양할 수 있다. 동물 세포, 식물 세포, 및 세균의 각 세포에 적합한 배양 방법이 공지되어 있고, 당업자는 임의의 공지된 방법을 이용하여 폴리이미드 다공질막에 세포를 배양할 수 있다. 세포 배양 배지도 세포의 종류에 따라 적절히 조제할 수 있다.
동물 세포의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, 론자사의 세포 배양 배지 카탈로그에 기재되어 있다. 식물 세포의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, WAKO사의 식물 조직 배지 시리즈 등에 기재되어 있다. 세균의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, BD사의 일반 세균용 배지 카탈로그에 기재되어 있다.
II. 세포 배양 장치
본 발명은 또한, 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 본 발명의 배양 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 장치에 있어서, 폴리이미드 다공질막은 고정되어 이용되어도 좋고, 혹은 세포 배양 배지 중에 부유하여 이용되어도 좋다. 세포 배양 장치에 있어서, 2 이상의 폴리이미드 다공질막이, 상하 또는 좌우로 적층되어도 좋다.
본 발명의 세포 배양 장치는, 폴리이미드 다공질막을 포함한다는 요건을 만족하면 공지된 세포 배양 장치를 이용하는 것이 가능하다. 배양 장치의 형상, 규모 등은 특별히 한정되지 않고, 샬레, 시험관부터 대형의 탱크까지 적절히 이용 가능하다. 예컨대, BD Falcon사 제조의 셀컬처 디시나 서모 사이언티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다. 또, 본 발명에 있어서 폴리이미드 다공질막을 이용함으로써, 생래적으로 부유 배양이 가능하지 않았던 세포에 관해서도 부유 배양용 장치로, 부유 배양 유사 상태에서의 배양을 행할 수 있게 되었다. 부유 배양용의 장치로는, 예컨대, 코닝사 제조의 스피너 플라스크가 사용 가능하다.
III. 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 키트
본 발명은 또한, 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는, 폴리이미드 다공질막 외에, 세포 배양에 필요한 구성 요소를 적절히 포함할 수 있다. 예컨대, 폴리이미드 다공질막에 적용하는 세포, 세포 배양 배지, 세포 배양 장치, 키트의 취급 설명서 등이 포함된다.
한정되는 것은 아니지만, 일양태로서, 투명한 파우치 내에 멸균된 폴리이미드 다공질막이 단독으로 또는 복수장 보존되고, 그대로 세포 배양에 사용 가능한 형태를 포함하는 패키지나, 혹은, 동파우치 내에 폴리이미드 다공질막과 함께 멸균 액체가 봉입되어 있고, 효율적 흡입 파종이 가능하게 되어 있는 막·액체의 일체형 형태의 키트를 포함한다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 가할 수 있고, 이들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 이후, 특별히 기술하지 않는 경우에는, 「폴리이미드 다공질막」은 막두께 25 ㎛의 폴리이미드 다공질막을 말하는 것으로 한다.
실시예 1 인간 간엽계 줄기 세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 자연 파종
본 실시예에서는, 인간 간엽계 줄기 세포를 이용하여, 폴리이미드 다공질막에 대한 파종을 행했다.
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 0.5 ml를 가하고, 멸균한 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면 혹은 큰 구멍 구조의 B면을 위로 하여 침지시킨다. 별도로, 배지 1 ml당 3.6×105개의 인간 간엽계 줄기 세포(그 중, 생세포는 3.4×105개, 사세포는 2.0×104개, 생세포율 94%)를 현탁한, 인간 간엽계 줄기 세포 현탁액을 준비했다. 세포 현탁액을 60 ㎕씩, 상기 정사각형 용기 중의 세포 배양 배지에 첨가했다.
세포 배양 장치로 배양하고, 1시간, 5시간, 24시간, 48시간, 4일간, 7일간, 14일간, 21일간 후에 고정·염색(DAPI, 또는 액틴(actin)+DAPI)하여, 세포의 생육과 증식을 확인했다. 액틴의 염색은 팔로이딘으로 행했다. 시간 경과적인 세포의 증식과 파종면 특이적인 형태를 관측했다. 결과를 도 3에 나타낸다. 이 결과로부터, 대표적인 줄기 세포의 하나인 인간 간엽계 줄기 세포도, 본원발명의 방법에 의해 배양할 수 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 2 인간 피부 선유아세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 자연 파종
본 실시예에서는, 인간 피부 선유아세포를 이용하여, 자연 파종에 의해 세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 적용을 행했다.
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 0.5 ml를 가하고, 멸균한 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면 혹은 큰 구멍 구조의 B면을 위로 하여 침지시킨다. 별도로, 배지 1 ml당 8.3×105개의 인간 피부 선유아세포(그 중, 생세포는 8.1×105개, 사세포는 2.0×104개, 생세포율 98%)를 현탁한, 인간 피부 선유아세포 현탁액을 준비했다. 세포 현탁액을 50 ㎕씩, 상기 정사각형 용기 중의 세포 배양 배지에 첨가했다.
세포 배양 장치로 배양하고, 1시간, 5시간, 24시간, 48시간, 4일간, 7일간, 14일간, 21일간 후에 고정·염색(DAPI, 또는 액틴+DAPI)하여, 세포의 생육과 증식을 확인했다. 시간 경과적인 세포의 증식과 파종면 및 관찰면 특이적인 형태를 관측했다. 결과를 도 4에 나타낸다. 이 결과에 의해, 대표적인 선유아세포의 하나인 인간 피부 선유아세포도, 본원발명의 방법에 의해 배양할 수 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 3 인간 피부 선유아세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 흡입 파종(웨트막법)
본 실시예에서는, 인간 피부 선유아세포를 이용하여, 웨트막(충분히 습윤한 막; 상세한 것은 이하에 설명)에 대한 흡입 파종에 의해 세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 적용을 행했다.
배지 1 ml당 1.0×106개의 세포(그 중, 생세포는 9.1×105개, 사세포는 1.0×105개, 생세포율 90%)를 현탁한, 인간 피부 선유아세포 현탁액을 준비했다. 10 cm×14 cm의 각형 플레이트 상에, 미리 세포 배양 배지 1 ml로 습윤시킨 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막 25장을 겹쳐지지 않도록 늘어놓고, 각 폴리이미드 다공질막 B면에 20 ㎕씩 세포 현탁액을 첨가했다. 삼출한 액을 쓸어내고, 폴리이미드 다공질막을 75 cm2 샬레에 옮겨 배지 12 ml를 첨가한다. 그대로, 통상 배양 조건하에서 배양을 행하고, 다음날 시료를 고정했다. 도 5에, 24시간 후에 고정·형광 염색(DAPI, 또는 액틴+DAPI)한 시료의 형광 현미경 사진 및 실체 형광 현미경 사진을 나타낸다.
또, 파종 공정시, 삼출한 액을 회수하고 또한 상기 각형 플레이트를 배지 2 ml로 세정하고 플레이트 상에 잔류한 세포를 카운트한 바, 총세포수는 6.0×104개이고, 그 중 생세포는 5.5×104개, 사세포는 3.0×104개, 생세포율 65%였다. 세포 생사로 비교하면, 생세포의 막에 대한 흡착률은 88%, 삼출률은 12%이고, 사세포의 막에 대한 흡착률은 40%, 삼출률은 60%가 되었다.
실시예 4 인간 간엽계 줄기 세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 흡입 파종(1점 웨트법)
본 실시예에서는, 인간 간엽계 줄기 세포를 이용하여, 1점 웨트막(중앙의 1점만 액적에 습윤하여 간단히 고정한 막; 상세한 것은 이하에 설명)에 대한 흡입 파종에 의해 세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 적용을 행했다.
본 실시예에서는, 인간 간엽계 줄기 세포를 이용하여, 막재료의 중앙부 1점만을 습윤한 막에 대한 흡입 파종에 의해 세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 적용을 행한 예를 나타낸다.
막을 놓을 예정인 중앙부에, 10 ㎕ 정도의 액적을 형성시키고, 그 위에 폴리이미드 다공질막을 놓음으로써, 막의 부위를 고정시켜 파종하기 쉬운 장소를 만듦과 동시에, 또한 습윤을 이용하여, 세포액 막투과의 신속화를 도모했다.
배지 1 ml당 1.0×106개의 세포(그 중, 생세포는 9.6×105개, 사세포는 4.0×104개, 생세포율 96%)를 현탁한, 인간 간엽계 줄기 세포 현탁액을 준비했다. 10 cm×14 cm의 각형 플레이트 상에, 멸균·건조한 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막 A면 및 B면 각 10장을 겹쳐지지 않도록 늘어놓고, 각 폴리이미드 다공질막 40 ㎕씩 세포 현탁액을 첨가했다. 삼출한 액을 쓸어내고, 폴리이미드 다공질막을 10 cm2 샬레에 파종면별로 옮기고, 배지 2 ml를 첨가한다. 그대로, 통상 배양 조건하에서 배양을 행하고, 0.5시간, 3일간, 7일간, 12일간 후에 고정·염색(DAPI, 액틴+DAPI, 또는 액틴)하여, 세포의 생육과 증식을 확인했다. 결과를 도 6 및 7에 나타낸다.
또한, 파종 공정시, 삼출한 액을 회수하고 또한 상기 각형 플레이트를 배지 4 ml로 세정하고 플레이트 상에 잔류한 세포를 카운트한 바, A면 파종의 경우, 총세포수는 6.5×104개이고, 그 중 생세포는 4.0×104개, 사세포는 2.5×104개, 생세포율 62%였다. 세포 생사로 비교하면, 생세포의 막에 대한 흡착률은 89%, 삼출률은 11%이고, 사세포는 거의 흡착되지 않고 유출된 것으로 생각된다. 또한, B면 파종의 경우, 회수 총세포수는 6.5×104개이고, 그 중 생세포는 8.0×104개, 사세포는 2.0×104개, 생세포율 80%였다. 세포 생사로 비교하면, 생세포의 막에 대한 흡착률은 79%, 삼출률은 21%이고, 사세포는 거의 흡착되지 않고 유출된 것으로 생각된다.
실시예 5 인간 간엽계 줄기 세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 구속 파종
본 실시예에서는, 인간 간엽계 줄기 세포를 이용하여, 세포 현탁액으로부터의 구속에 의해 세포의 폴리이미드 다공질막에 대한 적용을 행했다.
한변 10 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막을, 가위를 이용하여 대략 가로세로 2∼3 mm의 소편으로 세단하고, 160℃에서 10분간 멸균한 후에 방랭하고, 2 ml의 멸균한 배지로 습윤한다. 그 후, 폴리이미드 다공질막을 핀셋으로 꺼내어, 팔콘 튜브 중에 옮겼다. 팔콘 튜브 중의 막 상에, 배지 1 ml당 3.6×105개의 세포(그 중, 생세포는 3.4×105개, 사세포는 2.0×104개, 생세포율 94%)를 현탁한, 인간 간엽계 줄기 세포 현탁액 1.6 ml를 첨가했다(세포 총수 5.7×105개 중, 생세포는 5.4×105개, 사세포는 3.2×104개). 때때로 흔들어 섞으면서 배양 장치 내에 2시간 방치하고, 액부의 세포량을 측정하면, 2.0×105개의 세포(그 중, 생세포는 1.2×105개이고, 사세포는 8.0×104개, 생세포율 60%)가 관측되었다. 소편의 폴리이미드 다공질막을 꺼내고, 4 ml의 배지를 넣은 20 cm2 샬레에 옮겨, 배양 장치 중에서 배양을 계속했다. 소편을 48시간, 7일간, 14일간, 21일간, 28일간 후에 고정·염색(DAPI, 또는 액틴+DAPI)하여, 세포의 생육과 증식을 확인했다. 결과를 도 8 및 도 9에 나타낸다.
실시예 6 주화 세포의 폴리이미드 다공질막의 소편에 대한 흡입 파종
본 실시예에서는, 주화 세포의 PC12 세포를 이용하여, 흡입에 의해 세포의 폴리이미드 다공질막의 소편에 대한 적용을 행했다.
10 cm×14 cm의 각형 플레이트 상에, 미리 배지 5 ml로 습윤시키고, 여분의 액체를 제거한 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막 15장을 상하 좌우에 일부 중복되도록 랜덤으로 늘어놓았다. 배지 1 ml당 9.0×105개의 세포(그 중, 생세포는 7.4×105개이고, 사세포는 1.7×105개, 생세포율 82%)를 현탁한, 래트 부신 갈색 세포종 PC12의 세포 현탁액을 별도로 준비했다. 상기 세포 현탁액 2 ml를, 플레이트를 약간 기울여 삼출액을 아래쪽으로 이동시키도록 하면서, 천천히 순차적으로 막 상에 첨가했다. 5분 후에 폴리이미드 다공질막의 삼출액을 쓸어내고, 미리 준비한 20 cm2의 샬레에 배지 4 ml를 넣은 중에 이동시켜, 배양 장치 중에서 배양을 행했다.
48시간, 4일간, 6일간, 9일간 후에 폴리이미드 다공질막을 고정·염색하여, 세포의 증식을 확인했다. 염색은, 멤브레인 형광 염색제 셀마스크(CellMask(상표) Orange plasma membrane stain(라이프 테크놀로지즈사). 이후, 간단히 CellMask라고 기재함)+DAPI로 행했다. 결과를 도 10에 나타낸다. 본 세포에서도, 폴리이미드 다공질막 내에서 집단을 형성하면서 증식하는 모습이 관측되고, 적용의 가능성이 확인되었다. 이 결과로부터, 대표적인 주화 세포의 하나인 PC12 세포도, 본원발명의 방법에 의해 배양할 수 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 7 배양 세포수의 측정
본 실시예에서는, 인간 피부 선유아세포를 폴리이미드 다공질막을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 배양 세포수를 측정했다.
1, 통상 배양 세포의 CCK8을 이용한 세포수 계측
우선, 이하의 시약 및 방법을 이용하여, 통상 배양에 있어서의 세포수를 계측하고, 흡광도와 실제 세포수의 상관 계수를 구했다.
[시약] Cell Countinig Kit8; 도진 화학 연구소 제조의 용액 시약(이하, 「CCK8」이라고 기재함)
[방법] 일정 기간 5 cm2의 챔버형 샬레 상에서 배양한 인간 피부 선유아세포를 준비하여, 그 배양 상청을 제거하고, 2%의 CCK8을 첨가한 일정량의 배지로 치환하여, 2시간 인큐베이터 내에서 보존한다. 그 후, 착색한 상청을 추출하여 480 nm의 파장으로 흡광도를 측정한다(블랭크는, 배지만을 이용하여 측정한 조건을 사용). 그 후, 동상청을 제거한 후에 인산 버퍼로 2회 세포를 세정하고, 0.05% 트립신-EDTA 용액으로 처리하여 세포수를 카운트한다.
이 방법으로 배양 조건과 CCK8 농도 조건에 있어서의 흡광도와 실제 세포수의 상관 계수를 구했다.
2. 폴리이미드 다공질막 상에 증식한 세포수의 측정
1과 동일하게, 세포를 배양한 2 cm2(1.4 cm*1.4 cm)의 폴리이미드 다공질막을 5 cm2의 챔버형 샬레에 옮기고, 5%의 CCK8을 첨가한 배지를 일정량 첨가하여, 1∼3시간 인큐베이터 내에서 보존하고, 상청을 추출하여 480 nm의 파장으로 흡광도를 측정한다. 이 경우, 사용하는 CCK8을 2.5배 사용하고 있고, 한편으로, 면적적으로는 2.5배 적은 면적밖에 폴리이미드 다공질막의 면적이 없기 때문에, 1에서의 판독치와의 비교를 그대로 행할 수 있다(농도나 면적 등의 조건을 변화시킨 경우에는, 환산이 필요해짐). 1,에서 구한 환산 계수를 이용하여 부재 상에 생존하는 세포수의 계산을 행하고, 그 후, 배지로 2회 세정하고, 인큐베이터 내에 복귀시켜 배양을 계속한다. 이 작업을 반복하여, 시간 경과적으로 폴리이미드 다공질막 상의 세포가 증식하는 모습을 정량적으로 해석했다. 실험수를 거듭하여, 재현성의 검증도 행했다.
자연 파종 및 흡입 파종을 각각 3회 행한 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11에 나타내는 바와 같이, 파종의 방법에 의존하여 세포의 증식 속도는 상이하지만, 1개월 정도의 배양으로 그 차는 해소되어 가고, 유사한 단위 면적당의 세포수에 도달한다. 도면 중의 점선은, 비교 실험으로서 실시한 샬레 등에서 통상의 부착 배양시의 배양 세포수 상한을 나타내고 있다. 면적 베이스로 세포수를 비교한 경우, 통상의 세포 배양보다는 많은 세포를 단위 면적 중에 배양하는 것이 가능해졌다.
실시예 8 인간 피부 각화 세포의 배양
본 실시예에서는, 인간 피부 각화 세포를 폴리이미드 다공질막을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰했다.
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지(KGM-Gold 케라티노사이트 증식 배지 BulletKit(론자사)) 0.5 ml를 가하고, 멸균한 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 침지시켰다. 4×104개의 인간 피부 각화 세포를, 상기 정사각형 용기 중의 세포 배양 배지에 첨가했다. 즉, 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막 1장당, 4×104개의 인간 피부 각화 세포를 자연 파종했다.
세포 배양 장치로 배양하고, 1일간, 3일간, 6일간 후에 고정·염색했다. 염색은, CellMask+DAPI, 또는 CellMask만으로 행했다. 그 후, 공초점 레이저 현미경(LSM700(칼 자이스사 제조)) 및 실체 형광 현미경(Leica M165 FC(라이카사 제조))을 이용하여, 시간 경과적인 세포의 증식과 형태를 관찰했다.
결과를 도 12에 나타낸다. 이 결과로부터, 인간의 초대 배양 세포(프라이머리 컬처셀)인 인간 피부 각화 세포도, 본원발명의 방법에 의해 배양할 수 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 9 인간 제대 정맥 내피 세포의 배양
본 실시예에서는, 인간 제대 정맥 내피 세포를 폴리이미드 다공질막을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰했다.
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지(EGM-2 BulletKit(론자사)) 0.5 ml를 가하고, 멸균한 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 침지시켰다. 4×104개의 인간 제대 정맥 내피 세포를, 상기 정사각형 용기 중의 세포 배양 배지에 첨가했다. 즉, 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막 1장당, 4×104개의 인간 제대 정맥 내피 세포를 자연 파종했다.
세포 배양 장치로 배양하고, 3일간, 6일간, 10일간 후에 고정·염색(CellMask+DAPI 및 CellMask)했다. 염색, 및 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경에 의한 관찰은, 실시예 8과 동일하게 행했다.
결과를 도 13에 나타낸다. 이 결과로부터, 인간의 초대 배양 세포(프라이머리 컬처셀)인 인간 제대 정맥 내피 세포도, 본원발명의 방법에 의해 배양할 수 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 10 Vero 세포의 배양
본 실시예에서는, Vero 세포를 폴리이미드 다공질막을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰했다. 폴리이미드 다공질막은, 25 ㎛, 40 ㎛, 75 ㎛의 3종류를 이용했다. 배양 기간은 1일∼15일이다.
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지(DMEM에 10% FBS 및 항생 물질을 첨가한 것) 0.5 ml를 가하고, 멸균한 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 침지시켰다. 4×104개의 Vero 세포를, 상기 정사각형 용기 중의 세포 배양 배지에 첨가했다. 즉, 가로세로 1.4 cm의 정사각형 폴리이미드 다공질막 1장당, 4×104개의 Vero 세포를 자연 파종했다.
세포 배양 장치로 배양하고, 1일간, 3일간, 7일간, 10일간, 15일간 후에 고정·염색했다. 염색은, 액틴+DAPI로 행하고, 액틴의 검출은 팔로이딘에 의해 행했다. 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경에 의한 관찰은, 실시예 8과 동일하게 행했다.
결과를 도 14a∼14c에 나타낸다. 이 결과로부터, 대표적인 주화 세포의 하나인 Vero 세포에 관해서도, 본원발명의 방법에 의해 배양할 수 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 11 HeLa 세포의 배양
본 실시예에서는, HeLa 세포를 폴리이미드 다공질막을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰했다. 폴리이미드 다공질막은, 25 ㎛, 40 ㎛, 75 ㎛의 3종류를 이용했다. 배양 기간, 이용한 현미경, 구체적 공정 등은 실시예 10에 기재한 바와 같다.
결과를 도 15a∼도 15c에 나타낸다. 이 결과로부터, 대표적인 주화 세포의 하나인 HeLa 세포에 관해서도, 본원발명의 방법에 의해 배양할 수 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 12 CHO 세포의 배양
본 실시예에서는, CHO 세포를 폴리이미드 다공질막을 이용한 본원발명의 방법에 의해 배양하고, 공초점 레이저 현미경 및 실체 형광 현미경으로 관찰했다. 폴리이미드 다공질막은, 25 ㎛, 40 ㎛, 75 ㎛의 3종류를 이용했다. 배양 기간 1일∼7일간이고, 이용한 현미경, 구체적 공정 등은 실시예 10에 기재한 바와 같다.
결과를 도 16a∼도 16c에 나타낸다. 이 결과로부터, 대표적인 주화 세포의 하나인 CHO 세포에 관해서도, 본원발명의 방법에 의해 배양할 수 있는 것이 밝혀졌다.

Claims (23)

  1. 세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하여 배양하는 것을 포함하고,
    여기서 상기 폴리이미드 다공질막은 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리이미드 다공질막이며,
    상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 직경은, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 직경보다 작고,
    상기 매크로 보이드층은, 상기 표면층 A 및 표면층 B에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 매크로 보이드를 갖는, 세포의 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포를 상기 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 올리고;
    상기 폴리이미드 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동하여 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극함으로써,
    세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고; 그리고,
    세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
    공정을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막의 한면 또는 양면을, 세포 배양 배지 또는 멸균된 액체로 습윤하고,
    상기 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전하고, 그리고,
    세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
    공정을 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 생세포는 상기 폴리이미드 다공질막 내에 머물고, 사세포는 수분과 함께 유출되는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 멸균된 액체는 멸균수 혹은 멸균된 완충액인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 세포 배양 용기 중에, 세포 배양 배지, 세포 및 1 또는 그 이상의 상기 폴리이미드 다공질막을 넣고, 여기서, 폴리이미드 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태인 것을 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 2 이상의 상기 폴리이미드 다공질막의 소편을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 세포는 상기 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막을
    i) 절첩하여,
    ii) 롤형으로 감아,
    iii) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은,
    iv) 새끼줄형으로 묶어
    세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시키는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 세포는 상기 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 2 이상의 폴리이미드 다공질막을 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 방법 중 2종류 이상의 방법을 조합하여 이용하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 세포는 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부에 생육하고 증식하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 세포는 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 동물 세포는 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 세균은 유산균, 대장균, 고초균 및 시아노박테리아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 세포는 다능성 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포 및 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 세포는 육종 세포, 주화 세포 및 형질 전환 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 폴리이미드 다공질막은 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 방법.
  21. 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 제1항에 기재된 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치.
  22. 제21항에 있어서, 2 이상의 폴리이미드 다공질막이 상하 또는 좌우로 적층되어 있는 것인 세포 배양 장치.
  23. 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 제1항에 기재된 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 키트.

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