CN109477069B - 抑制易脱分化的细胞的脱分化的方法、所述细胞的调制方法、及物质的产生方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制易脱分化的细胞的脱分化的方法，包括(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及(2)培养上述细胞，使增殖的工序，其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通。

Description

抑制易脱分化的细胞的脱分化的方法、所述细胞的调制方法、 及物质的产生方法

【技术领域】

本发明涉及抑制易脱分化的细胞的脱分化的方法、所述细胞的调制方法、及物质的产生方法。

【背景技术】

【细胞的脱分化】

再生医疗的重要度加速增加之中，使用有特异的功能的末梢细胞的移植疗法变得广泛实施，高的治疗效果集合了关注。软骨细胞是此移植疗法中关注的细胞的例。能从患者摘出且在生物体外培养健康的软骨细胞，向关节软骨的损伤部移植－包埋－取代的软骨再生术已经作为临床应用被推进。作为活用自身移植的优点的方法论的同时，在患部大的情况等中，在需要大量的细胞时，进行塑料培养皿等中的传代增殖变得不可或缺。

但是，软骨细胞当传代次数增加时已知称为“脱分化”的细胞特性的丧失现象，失去了产生蛋白聚糖等的细胞外基质的软骨细胞原本的功能，并且，已知变异为强烈显示增殖能力的成纤维细胞样细胞(专利文献1)。

报告了为了抑制含软骨细胞的易脱分化的细胞的脱分化，向培养容器表面包被人或动物来源的生物体物质(糖蛋白质、蛋白质等)的尝试(专利文献2)，或在高分子凝胶中培养的尝试(专利文献3)。

另外报告了，通过将易脱分化的乳腺上皮细胞在有多个微容器的细胞培养容器的微容器内使细胞重层化的状态下培养，抑制脱分化的方法(专利文献4)。

【聚酰亚胺多孔质膜】

聚酰亚胺多孔质膜在本申请前就用于滤器、低介电常数膜、燃料电池用电解质膜等，特别是以电池关系作为中心的用途。专利文献5～7特别记载了尽管气体等的物质透过性优良，空孔率高的，两表面的平滑性优良，相对强度高，高空孔率，有多个对于向膜厚度方向的压缩应力的耐力优良的大空隙的聚酰亚胺多孔质膜。这些均是经由酰胺酸而制成的聚酰亚胺多孔质膜。

报告了包括将细胞应用于聚酰亚胺多孔质膜而进行培养的细胞的培养方法(专利文献8)。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：WO2006/082854

专利文献2：特开平8-317786号公报

专利文献3：WO03/006635

专利文献4：WO2009/099153

专利文献5：WO2010/038873

专利文献6：特开2011-219585号公报

专利文献7：特开2011-219586号公报

专利文献8：WO2015/012415

【发明的概要】

【发明要解决的课题】

本发明旨在提供使用与以往完全不同的手段而抑制易脱分化的细胞的脱分化，能大量地供给所述细胞的方法。

【用于解决课题的手段】

本发明人鉴于上述课题，锐意探讨的结果，通过在有具有多个孔的2个表面层和夹在所述2个表面层之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜上培养，令人惊讶地，发现可抑制易脱分化的细胞的自发的脱分化，从而完成本发明。

即本发明有以下的实施方式。

[1]抑制易脱分化的细胞的脱分化的方法，其包括：

(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通。

[2]上述细胞是软骨细胞、成骨细胞、成牙质细胞、成釉质细胞、乳腺上皮细胞、纤毛上皮细胞、肠上皮细胞、脂肪细胞、肝细胞、系膜细胞、肾小球上皮细胞、血窦内皮细胞、或者成肌细胞的，[1]中所述的方法。

[3][1]或[2]中所述的方法，其中实施上述工序(2)至少30天。

[4]在上述工序(2)中，使细胞增殖至每1平方厘米聚合物多孔质膜达1.0×10⁵个以上的，[1]～[3]之任一项所述的方法。

[5]将2个以上的聚合物多孔质膜上下或左右积层到细胞培养基中而使用的，[1]～[4]之任一项所述的方法。

[6]将上述聚合物多孔质膜

(i)折叠，

(ii)卷成卷状，

(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者，

(iv)连接成绳状

而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定而使用的，[1]～[5]之任一项所述的方法。

[7]在工序(2)中，聚酰亚胺多孔质膜的一部分或整体不与细胞培养基的液相接触的，[1]～[6]之任一项所述的方法。

[8]在工序(2)中，细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚酰亚胺多孔质膜体积的总和的10000倍或比其少的，[1]～[7]之任一项所述的方法。

[9]上述表面层A的平均孔径是0.01～50μm的，[1]～[8]之任一项所述的方法。

[10]上述表面层B的平均孔径是20～100μm的，[1]～[9]之任一项所述的方法。

[11]上述聚合物多孔质膜的膜厚是5～500μm的，[1]～[10]之任一项所述的方法。

[12]上述聚合物多孔质膜是聚酰亚胺多孔质膜的，[1]～[11]之任一项所述的方法。

[13]聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的，聚酰亚胺多孔质膜的，[12]中所述的方法。

[14]聚酰亚胺多孔质膜是通过使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜的，[12]或[13]中所述的方法。

[15]上述聚合物多孔质膜是聚醚砜多孔质膜的，[1]～[11]之任一项所述的方法。

[16]调制易脱分化的细胞的方法，其包括：

(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述细胞的脱分化被抑制。

[17]使用易脱分化的细胞而产生物质的方法，其包括：

(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、

(2)培养上述细胞，使增殖的工序、及

(3)回收上述细胞产生的物质的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述细胞的脱分化被抑制。

[18]上述细胞是软骨细胞，上述物质是选自蛋白聚糖、胶原及透明质酸的至少1个的，[17]中所述的方法。

【发明的效果】

根据本发明，可抑制易脱分化的细胞的脱分化，大量地供给所述细胞。另外，可大量地得到以往难以得到的所述细胞产生的物质。

【附图的简单的说明】

【图1】图1显示使用聚酰亚胺多孔质膜的细胞培养的模型图。

【图2】图2显示细胞培养装置的一例。

【图3】图3显示将人软骨细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数的经时变化。

【图4】图4显示将培养人软骨细胞的聚酰亚胺多孔质膜用上下各1个空的聚酰亚胺多孔质膜夹而使接触时的细胞的增殖结果。

【图5】图5显示将人软骨细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数的经时变化。

【图6】图6显示活体成像人软骨细胞培养中的聚酰亚胺多孔质膜的试样的光学显微镜图像及荧光显微镜图像。

【图7】图7显示将人软骨细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数的经时变化。

【图8】图8显示将人成骨细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数的经时变化。

【图9】图9显示将人成骨细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数的经时变化。

【图10】图10显示钙化诱导长期间部件培养的人成骨细胞之后的光学显微镜图像。

【图11】图11显示将人成骨细胞用聚酰亚胺多孔质膜培养时的细胞数的经时变化。

【图12】图12显示将人成骨细胞培养中的聚酰亚胺多孔质膜福尔马林固定的试样的电子显微镜图像。

【图13】图13显示将人成骨细胞培养中的聚酰亚胺多孔质膜福尔马林固定的试样的荧光显微镜图像。

【具体实施方式】

本发明的一实施方式涉及抑制易脱分化的细胞的脱分化的方法，其包括：

(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通。以下也称为“本发明的脱分化抑制方法”。

另外，本发明的别的实施方式涉及调制易脱分化的细胞的方法，其包括：

(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述细胞的脱分化被抑制。以下也称为“本发明的细胞调制方法”。

另外，本发明的别的实施方式涉及使用易脱分化的细胞产生物质的方法，其包括：

(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、

(2)培养上述细胞，使增殖的工序、及

(3)回收上述细胞产生的物质的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述细胞的脱分化被抑制。以下也称为“本发明的产生物质的方法”。

以下将“本发明的脱分化抑制方法”、“本发明的细胞调制方法”及“本发明的产生物质的方法”也称为“本发明的方法”。

本说明书中，“脱分化”是指回到未分化性更高的状态，换言之，是指与分化相反的过程。

作为在本发明的方法中使用的“易脱分化的细胞”，不特别限定，例如是在以往的平板培养中处于脱分化的倾向的细胞，优选为软骨细胞、成骨细胞、成牙质细胞、成釉质细胞、乳腺上皮细胞、纤毛上皮细胞、肠上皮细胞、脂肪细胞、肝细胞、系膜细胞、肾小球上皮细胞、血窦内皮细胞、或者成肌细胞。更优选为软骨细胞或成骨细胞。在本说明书中，以下将“易脱分化的细胞”也简称为“本发明中使用的细胞”。

可在本发明中利用的易脱分化的细胞的种类不特别限定，优选为哺乳动物的细胞，更优选为灵长类(人、猴等)、啮齿类(小鼠、大鼠、豚鼠等)、猫、狗、兔、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊或雪貂的细胞，特别优选为人的细胞。

1.对于向聚合物多孔质膜应用在本发明中使用的细胞的工序

向本发明中使用的细胞的聚合物多孔质膜的应用的具体性的工序不特别限定。能采用本说明书中记载的工序、或者，适宜于将细胞应用于膜状的载体的任意的方法。虽不限定，但在本发明的方法中，向细胞的聚合物多孔质膜的应用例如，含如下所述的实施方式。

(A)包括向上述聚合物多孔质膜的表面接种细胞的工序的，实施方式；

(B)包括如下工序的实施方式：

向上述聚合物多孔质膜的干燥的表面加载细胞悬浮液，

放置，或移动上述聚合物多孔质膜而促进液的流出，或刺激表面的一部分而向上述膜吸入细胞悬浮液，进而，

在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，使水分流出；以及

(C)包括如下工序的实施方式：

将上述聚合物多孔质膜的一面或两面用细胞培养液或灭菌的液体湿润，

向上述湿润的聚合物多孔质膜装填细胞悬浮液，进而，

在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，使水分流出。

(A)的实施方式含向聚合物多孔质膜的表面直接接种细胞、细胞块。或者，也包括向细胞悬浮液中放入聚合物多孔质膜，从膜的表面浸润细胞培养液的实施方式。

接种到聚合物多孔质膜的表面上的细胞接附在聚合物多孔质膜上，放入到多孔的内部。优选为即使不特别从外部加物理的或化学的力，细胞也自发接附在聚合物多孔质膜上。接种到聚合物多孔质膜的表面上的细胞能在膜的表面和/或内部稳定生长－增殖。细胞对应于生长－增殖的膜的位置，可取各种不同的形态。

在(B)的实施方式中，向聚合物多孔质膜的干燥的表面加载细胞悬浮液。通过放置聚合物多孔质膜，或移动上述聚合物多孔质膜而促进液的流出，或刺激表面的一部分而向上述膜吸入细胞悬浮液，细胞悬浮液渗透到膜中。不被理论束缚，这被认为是因来源于聚合物多孔质膜的各表面形状等的性质导致的。由本实施方式，向装填了膜的细胞悬浮液的位置吸入接种细胞。

或者，也可如(C)的实施方式一样，将上述聚合物多孔质膜的一面或两面的部分或整体用细胞培养液或灭菌的液体湿润后，向湿润的聚合物多孔质膜装填细胞悬浮液。此时，细胞悬浮液的通过速度大提升。

例如，可使用以膜的飞散防止作为主目的而湿润膜极一部分的方法(之后，将其记作“一分湿法”)。一分湿法大致接近实质上不使膜湿润的干法((B)的实施方式)。但是，认为对于湿润的小部分而细胞液的膜透过变得迅速。另外，也可使用向一面或两面的整体被充分地湿润的聚合物多孔质膜(之后，将其记作“湿膜”)装填细胞悬浮液的方法(之后，将其记作“湿膜法”)。此时，在聚合物多孔质膜的整体中，细胞悬浮液的通过速度大提升。

在(B)及(C)的实施方式中，在上述膜内蓄积细胞悬浮液中的细胞，使水分流出。由此，浓缩细胞悬浮液中的细胞的浓度的，使细胞以外的不要的成分与水分一同流出的，等的处理也变得可能。

(A)的实施方式有时称为“自然播种”(B)及(C)的实施方式有时称为“吸入播种”。

虽不限定，但优选在聚合物多孔质膜中活细胞选择性地停留。从而，在本发明的方法的优选的实施方式中，活细胞停留在上述聚合物多孔质膜内，死细胞优先与水分一同流出。

在实施方式(C)中使用的灭菌的液体不特别限定，是被灭菌的缓冲液或灭菌水。缓冲液是例如，(+)及(-)Dulbecco’s PBS、(+)及(-)Hank's Balanced Salt Solution等。缓冲液的例示于以下的表1。

【表1】

成分	浓度(mmol/L)	浓度(g/L)
			NaCl	137	8.00
KCl	2.7	0.20
			Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	10	1.44
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1.76	0.24
			pH(-)	7.4	7.4

再者，在本发明的方法中，也包括向细胞的聚合物多孔质膜的应用通过使处于悬浮状态的接附性细胞与聚合物多孔质膜悬浮地共存而将细胞附着在膜上的实施方式(涂抹)。例如，在本发明的方法中，也可为了将细胞应用于聚合物多孔质膜，向细胞培养容器中放入细胞培养基、细胞及1或其以上的上述聚合物多孔质膜。在细胞培养基是液体的情况中，聚合物多孔质膜处于悬浮于细胞培养基中的状态。从聚合物多孔质膜的性质，细胞可接附在聚合物多孔质膜上。从而，即使是不先天适宜于悬浮培养的细胞，也能在聚合物多孔质膜悬浮于细胞培养基中的状态下培养。细胞优选自发接附在聚合物多孔质膜上。“自发接附”是指即使不特别从外部加物理的或化学的力，细胞也停留在聚合物多孔质膜的表面或内部。

向上述的细胞的聚合物多孔质膜的应用也可组合2种或比其多的方法而使用。例如，实施方式(A)～(C)之中，也可组合2个以上的方法而向聚合物多孔质膜应用细胞。

2.对于培养增殖在本发明中使用的细胞的工序

细胞培养，根据细胞培养中的存在形态，培养细胞可分类为接附培养系细胞和悬浮培养系细胞。接附培养系细胞是附着在培养容器上而增殖的培养细胞，在传代中进行培养基更换。悬浮培养系细胞是在培养基中在悬浮状态下增殖的培养细胞，在一般传代时，不进行培养基更换，进行稀释培养。悬浮培养由于能在悬浮状态、即在液体中的培养，能大量培养，当与仅在培养容器表面生长的附着细胞比较时，由于是立体的培养，有每单位空间的能培养细胞数多的益处。

在本发明的方法中，在将聚合物多孔质膜悬浮于细胞培养基中的状态下使用时，也可使用2个以上的上述聚合物多孔质膜的小片。由于聚合物多孔质膜是立体且柔性的薄膜，通过例如将该小片悬浮于培养液中而使用，带有能在一定容量的细胞培养基中多数培养的表面积的聚合物多孔质膜变得可能。在通常培养的情况中，容器底面积成为能细胞培养的面积的上限，在使用本发明的聚合物多孔质膜的细胞培养中，尖部的带的聚合物多孔质膜的大表面积的全部成为能细胞培养的面积。由于聚合物多孔质膜使细胞培养液通过，例如在被折叠的膜内也能供给营养或氧等。另外，聚合物多孔质膜与以往的平面培养完全不同，由于是有立体的并且柔性的结构的细胞培养基材，不选培养容器的形状，在各种各样的形状、材质、大小的培养容器内也能培养有接附性的细胞(例如，培养皿、瓶、箱、袋等)。

聚合物多孔质膜的小片的大小，形状不特别限定。形状可取圆、椭圆形、四角形、三角形、多角形、绳状等任意的形状。

本发明的聚合物多孔质膜由于有柔软性而可使形状改变而使用。也可将聚合物多孔质膜加工成不是平面状的立体状形状而使用。例如，也可将聚合物多孔质膜(i)折叠，(ii)卷成卷状，(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者(iv)连接成绳状，在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定。通过如(i)～(iv)一样加工形状，可与使用小片时同样地，向一定容量的细胞培养基中放入多的聚合物多孔质膜。再者，因为可以各小片作为集合体对待，使细胞体集合化而使移动变得可能，综合的应用性高。

作为与小片集合体同样的想法，也可将2个以上的聚合物多孔质膜上下或左右积层到细胞培养基中而使用。积层也包括聚合物多孔质膜一部分重叠的实施方式。由积层培养，在窄的空间将细胞培养至高密度变得可能。也能是在已经培育细胞的膜上还积层膜而设置而形成与别种细胞的多层系。积层的聚合物多孔质膜的数不特别限定。

在本发明的方法中，细胞优选在聚合物多孔质膜的表面及内部生长增殖。

在本发明的方法中，可不像以往一样进行胰蛋白酶处理等的传代操作，一边抑制脱分化，一边培养细胞经至少30天、至少60天、至少120天、至少200天、或者至少300天的长期。另外，可由本发明的方法，可用以往的平面培养进行培养的期间以上、例如，平面培养期间的1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上的期间、一边抑制脱分化，一边培养细胞。根据本发明，不发生用培养皿等的平面培养的长期间的细胞培养发生的细胞的剥离或杀灭等，可长期间维持不是休止状态的动态的生命。另外，根据本发明，即使是长期培养的细胞，细胞活力或细胞的性质(例如，细胞表面标志物的表达量等)与长期培养前的细胞比较而几乎不改变。另外，根据本发明，由于细胞在聚合物多孔质膜内三维地增殖，难发生如在以往的平面培养中见到的培养区域的限制及由平面环境发生的接触抑制，从而使长期间生长的培养变得可能。另外，根据本发明，通过使细胞所接附的聚合物多孔质膜接触别的聚合物多孔质膜而能任意地增加能培养细胞的空间，不进行伴随如以往一样的胰蛋白酶处理的传代操作，一边回避引起接触抑制的汇合状态，一边使长期间增殖的培养变得可能。另外，根据本发明，还可提供不对细胞进行冷冻等而活着长期间保存的新的保存方法。

3.对于在本发明中使用的聚合物多孔质膜

存在于本发明中使用的聚合物多孔质膜中的表面层A(以下也称为“A面”或“网面”)的孔的平均孔径不特别限定，例如是0.01μm以上且不足200μm、0.01～150μm、0.01～100μm、0.01～50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～20μm、或者0.01μm～15μm，优选为0.01μm～15μm。

存在于本发明中使用的聚合物多孔质膜中的表面层B(以下也称为“B面”或“大孔面”)的孔的平均孔径只要比存在于表面层A的孔的平均孔径大，就不特别限定，例如是5μm超200μm以下，20μm～100μm、30μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm、或者60μm～100μm，优选为20μm～100μm。

聚合物多孔质膜表面的平均孔径可由多孔质膜表面的扫描型电子显微镜照片，对于200分以上的开孔部而测定孔面积，从该孔面积的平均值，根据下式(1)而由计算求出孔的形状是正圆时的平均直径。

【数1】

(式中，Sa是指孔面积的平均值。)

表面层A及B的厚度不特别限定，例如是0.01～50μm，优选为0.01～20μm。

在聚合物多孔质膜中的大空隙层中的大空隙的膜平面方向的平均孔径不特别限定，例如是10～500μm，优选为10～100μm，更优选为10～80μm。另外，所述大空隙层中的隔壁的厚度不特别限定，例如是0.01～50μm，优选为0.01～20μm。在一实施方式中，所述大空隙层中的至少1个隔壁有连通邻接的大空隙彼此的平均孔径0.01～100μm的，优选为0.01～50μm的1个或多个孔。在别的实施方式中，所述大空隙层中的隔壁无孔。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜的膜厚不特别限定，可为5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，也可为500μm以下，300μm以下，100μm以下，75μm以下或50μm以下。优选为5～500μm，更优选为25～75μm。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜的膜厚的测定可用接触式的厚度计进行。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜的空孔率不特别限定，例如是40％以上且不足95％。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜的空孔率可对切成指定的大小的多孔质膜的膜厚及质量进行测定，从单位面积重量质量，根据下式(2)而求出。

【数2】

空孔率(％)＝(1-w/(S×d×D))×100 (2)

(式中各自，S是指多孔质膜的面积、d是指膜厚、w是指测定的质量、D是指聚合物的密度。当聚合物是聚酰亚胺时，密度设为1.34g/cm³。)

在本发明中使用的聚合物多孔质膜优选为有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径是0.01μm～15μm，存在于上述表面层B的孔的平均孔径是20μm～100μm，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，上述大空隙层的隔壁、以及上述表面层A及B的厚度是0.01～20μm，在上述表面层A及B中的孔与大空隙连通，总膜厚是5～500μm，空孔率是40％以上且不足95％的，聚合物多孔质膜。在一实施方式中，大空隙层中的至少1个隔壁有连通邻接的大空隙彼此的，平均孔径0.01～100μm的，优选为0.01～50μm的1个或多个孔。在别的实施方式中，隔壁无这样的孔。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜优选被灭菌。作为灭菌处理，不特别限定，可举出干热灭菌、蒸气灭菌、由乙醇等消毒剂的灭菌、紫外线或γ线等的电磁波灭菌等任意的灭菌处理等。

在本发明中使用的聚合物多孔质膜只要是具备上述的结构的特征，就不特别限定，优选为聚酰亚胺、或者聚醚砜(PES)的多孔质膜。

聚酰亚胺是指重复单位含酰亚胺键的高分子的总称，通常是指芳香族化合物直接经酰亚胺键连接的芳香族聚酰亚胺。芳香族聚酰亚胺由于芳香族和芳香族经酰亚胺键而具有共轭结构，具有刚直且强固的分子结构，并且，由于酰亚胺键具有强的分子间力而有非常高的水平的热的、机械的、化学性质。

在一实施方式中，可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺(作为主要的成分)的聚酰亚胺多孔质膜，更优选为由从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。“作为主要的成分含”是指作为聚酰亚胺多孔质膜的构成成分，从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺以外的成分则实质上不含，或者即使含也不影响从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质的附加的成分。

可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜也含通过使包含从四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

聚酰胺酸通过聚合四羧酸成分和二胺成分而得到。聚酰胺酸是可通过热亚胺化或化学亚胺化闭环而作为聚酰亚胺的聚酰亚胺前体。

聚酰胺酸只要是即使酰胺酸的一部分被亚胺化也不影响本发明的范围，就可使用。即，聚酰胺酸也可被部分热亚胺化或化学亚胺化。

当使聚酰胺酸热亚胺化时，可根据需要，将亚胺化催化剂、含有有机磷的化合物、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等添加到聚酰胺酸溶液中。另外，当使聚酰胺酸化学亚胺化时，可根据需要，将化学亚胺化剂、脱水剂、无机微粒子、有机微粒子等的微粒子等添加到聚酰胺酸溶液中。即使向聚酰胺酸溶液配合上述成分，也优选在着色前体不析出的条件下进行。

在本说明书中，“着色前体”是指由250℃以上的热处理碳化一部分或全部而生成着色化物的前体。

作为可在上述聚酰亚胺多孔质膜的制造中使用的着色前体，均一地溶解或分散于聚酰胺酸溶液或聚酰亚胺溶液，由250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理、优选为空气等的氧存在下的250℃以上、优选为260℃以上、再优选为280℃以上、更优选为300℃以上的热处理热分解，优选碳化而生成着色化物，更优选生成黑色系的着色化物，更优选碳系着色前体。

着色前体经加热则成为看似碳化物的物质，但含组织上含碳以外的异元素，层结构、芳香族交联结构、含四面体碳的无秩序结构。

碳系着色前体不特别限制，例如，可举出石油焦油、石油间距、煤焦油、煤间距等的焦油或间距、焦炭、从含丙烯腈的单体得到的聚合物、二茂铁化合物(二茂铁及二茂铁衍生物)等。在这些之中，优选从含丙烯腈的单体得到的聚合物和/或二茂铁化合物，作为从含丙烯腈的单体得到的聚合物，优选聚丙烯酸类树脂腈。

另外，在别的实施方式中，可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜也含不使用上述的着色前体而通过使从四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液成形之后，热处理而得到的聚酰亚胺多孔质膜。

不使用着色前体而制造的聚酰亚胺多孔质膜也可例如，通过以膜状流延由极限粘度数是1.0～3.0的聚酰胺酸3～60质量％和有机极性溶剂40～97质量％构成的聚酰胺酸溶液，浸渍或接触于以水作为必须成分的凝固溶剂，制作聚酰胺酸的多孔质膜，其后，热处理所述聚酰胺酸的多孔质膜而亚胺化而制造。在此方法中，以水作为必须成分的凝固溶剂是水，或者也可为5质量％以上且不足100质量％的水和超0质量％且95质量％以下的有机极性溶剂的混合液。另外，上述亚胺化之后，也可在得到的多孔质聚酰亚胺膜的至少一面实施等离子体处理。

可在上述聚酰亚胺多孔质膜的制造中使用的四羧酸二酐可使用任意的四羧酸二酐，可对应于期望的特性等而适宜选择。作为四羧酸二酐的具体例，可举苯均四酸二酐、3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)、2,3,3’，4’-联苯基四羧酸二酐(a-BPDA)等的联苯基四羧酸二酐、氧基二酞酸二酐、二苯基砜-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)硫化物二无水物、2,2-双(3,4-二羧基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二无水物、2,3,3’，4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’，4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3,4-二羧基苯基)甲烷二无水物、2,2-双(3,4-二羧基苯基)丙烷二无水物、p-亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、p-双亚苯基双(偏苯三酸单酯酸酐)、m-三联苯基-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、p-三联苯基-3,4,3’，4’-四羧酸二酐、1,3-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)苯二无水物、1,4-双(3,4-二羧基苯氧基)联苯基二无水物、2,2-双〔(3,4-二羧基苯氧基)苯基〕丙烷二无水物、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4’-(2,2-六氟异亚丙基)二酞酸二酐等。另外，也优选使用2,3,3’,4’-二苯基砜四羧酸等的芳香族四羧酸。这些可单独使用，也可组合2种以上而使用。

在这些之中，也特别优选选自联苯基四羧酸二酐及苯均四酸二酐的至少一种芳香族四羧酸二酐。作为联苯基四羧酸二酐，可适宜地使用3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐。

可在上述聚酰亚胺多孔质膜的制造中使用的二胺可使用任意的二胺。作为二胺的具体例，可举以下的。

(1)1,4-二氨基苯(对亚苯基二胺)、1,3-二氨基苯、2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯等的苯核1个苯二胺；

(2)4,4’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚等的二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-二甲基-4,4’-二氨基联苯基、2,2’-双(三氟甲基)-4,4’-二氨基联苯基、3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、3,3’，5,5’-四甲基-4,4’-二氨基二苯基甲烷、双(4-氨基苯基)硫化物、4,4’-二氨基苯甲酰苯胺、3,3’-二氯联苯胺、3,3’-二甲基联苯胺、2,2’-二甲基联苯胺、3,3’-二甲氧基联苯胺、2,2’-二甲氧基联苯胺、3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚、3,3’-二氨基二苯基硫化物、3,4’-二氨基二苯基硫化物、4,4’-二氨基二苯基硫化物、3,3’-二氨基二苯基砜、3,4’-二氨基二苯基砜、4,4’-二氨基二苯基砜、3,3’-二氨基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基二苯基甲烷、3,4’-二氨基二苯基甲烷、4,4’-二氨基二苯基甲烷、2,2-双(3-氨基苯基)丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)丙烷、2,2-双(3-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双(4-氨基苯基)-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二氨基二苯基亚砜、3,4’-二氨基二苯基亚砜、4,4’-二氨基二苯基亚砜等的苯核2个二胺；

(3)1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯、1,4-双(4-氨基苯氧基)苯、1,3-双(3-氨基苯氧基)-4-三氟甲基苯、3,3’-二氨基-4-(4-苯基)苯氧基二苯甲酮、3,3’-二氨基-4,4’-二(4-苯基苯氧基)二苯甲酮、1,3-双(3-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,4-双(4-氨基苯基硫化物)苯、1,3-双(3-氨基苯基砜)苯、1,3-双(4-氨基苯基砜)苯、1,4-双(4-氨基苯基砜)苯、1,3-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(3-氨基苯基)异丙基〕苯、1,4-双〔2-(4-氨基苯基)异丙基〕苯等的苯核3个二胺；

(4)3,3’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、3,3’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(3-氨基苯氧基)联苯基、4,4’-双(4-氨基苯氧基)联苯基、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕醚、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕酮、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕硫化物、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕砜、双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕甲烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕丙烷、2,2-双〔3-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔3-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(3-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-双〔4-(4-氨基苯氧基)苯基〕-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等的苯核4个二胺。

这些可单独使用，也可混合2种以上而使用。使用的二胺可对应于期望的特性等而适宜选择。

在这些之中，也优选芳香族二胺化合物，可适宜地使用3,3’-二氨基二苯基醚、3,4’-二氨基二苯基醚、4,4’-二氨基二苯基醚及对亚苯基二胺、1,3-双(3-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯基)苯、1,4-双(3-氨基苯基)苯、1,4-双(4-氨基苯基)苯、1,3-双(4-氨基苯氧基)苯、1,4-双(3-氨基苯氧基)苯。特别优选选自苯二胺、二氨基二苯基醚及双(氨基苯氧基)苯基的至少一种二胺。

可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选由将玻璃转移温度是240℃以上、或者在300℃以上无明确的转移点的四羧酸二酐和二胺组合而得到的聚酰亚胺形成。

可在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选为由以下的芳香族聚酰亚胺构成的聚酰亚胺多孔质膜。

(i)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺、

(ii)由四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺、

和/或，

(iii)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和选自苯二胺单位、二氨基二苯基醚单位及双(氨基苯氧基)苯基单位的至少一种芳香族二胺单位构成的芳香族聚酰亚胺。

在本发明中使用的聚酰亚胺多孔质膜优选为有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚酰亚胺多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径是0.01μm～15μm，存在于上述表面层B的孔的平均孔径是20μm～100μm，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，上述大空隙层的隔壁、以及上述表面层A及B的厚度是0.01～20μm，在上述表面层A及B中的孔与大空隙连通，总膜厚是5～500μm，空孔率是40％以上且不足95％。其中，大空隙层中的至少1个隔壁有连通邻接的大空隙彼此的平均孔径0.01～100μm的，优选为0.01～50μm的1个或多个孔。

例如，国际公开WO2010/038873、特开2011-219585、或者特开2011-219586中记载的聚酰亚胺多孔质膜也能在本发明中使用。

可在本发明中使用的PES多孔质膜含聚醚砜，典型而言实质上由聚醚砜构成。聚醚砜可由本领域技术人员公知的方法合成，例如，可由使二价苯酚、碱金属化合物及二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中进行缩聚反应的方法、预先合成二价苯酚的碱金属二盐而与二卤代二苯基化合物在有机极性溶剂中缩聚反应的方法等制造。

作为碱金属化合物，可举出碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物、碱金属氢化物、碱金属醇盐等。特别优选碳酸钠及碳酸钾。

作为二价苯酚化合物，举氢醌、儿茶酚、间苯二酚、4,4’-联苯二酚、双(羟基苯基)链烷类(例如2,2-双(羟基苯基)丙烷、及2,2-双(羟基苯基)甲烷)、二羟基二苯基砜类、二羟基二苯基醚类、或者它们的苯环的氢的至少1个被甲基、乙基、丙基等的低级烷基、或者甲氧基、乙氧基等的低级烷氧基取代的。作为二价苯酚化合物，可将上述的化合物两种类以上混合而使用。

聚醚砜也可为市售品。作为市售品的例，可举出SUMIKAEXCEL7600P、SUMIKAEXCEL5900P(以上、住友化学(株)制)等。

聚醚砜的对数粘度从良好地形成PES多孔质膜的大空隙的观点来看，优选为0.5以上、更优选为0.55以上，从多孔质聚醚砜膜的制造容易性的观点来看，优选为1.0以下，更优选为0.9以下，再优选为0.8以下，特别优选为0.75以下。

另外，PES多孔质膜、或作为其原料的聚醚砜从耐热性、高温下的尺寸稳定性的观点来看，优选玻璃转移温度是200℃以上，或者观察不到明确的玻璃转移温度。

可在本发明中使用的PES多孔质膜的制造方法不特别限定，例如，也可由包括下列工序的方法制造：

以膜状流延含对数粘度0.5～1.0的聚醚砜的0.3质量％～60质量％和有机极性溶剂40质量％～99.7质量％的聚醚砜溶液，浸渍或接触于以聚醚砜的贫溶剂或非溶剂作为必须成分的凝固溶剂，制作有空孔的凝固膜的工序、及

热处理在上述工序中得到的有空孔的凝固膜而使上述空孔粗大化，得到PES多孔质膜的工序，

上述热处理含使有上述空孔的凝固膜升温至上述聚醚砜的玻璃转移温度以上、或者240℃以上。

可在本发明中使用的PES多孔质膜优选为有表面层A、表面层B、及夹在上述表面层A和上述表面层B之间的大空隙层的PES多孔质膜，

上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的膜平面方向的平均孔径是10μm～500μm的多个大空隙，

上述大空隙层的隔壁的厚度是0.1μm～50μm，

上述表面层A及B各自的厚度是0.1μm～50μm，

上述表面层A及B之中，一方有平均孔径5μm超200μm以下的多个细孔，并且另一方有平均孔径0.01μm以上且不足200μm的多个细孔，

表面层A及表面层B的，一方面的表面开口率是15％以上，另一方面的表面层的表面开口率是10％以上，

上述表面层A及上述表面层B的上述细孔与上述大空隙连通，

上述PES多孔质膜的总膜厚是5μm～500μm，并且空孔率是50％～95％。

4.细胞培养和培养体积

使用聚合物多孔质膜的细胞培养的模型图示于图1。图1是用于辅助理解的图，各要素不是实际尺寸。在本发明的方法中，通过向聚合物多孔质膜应用细胞，培养，由于大量的细胞在聚合物多孔质膜所具有的内部的多面的连接多孔部分或表面生长，简便地培养大量的细胞变得可能。另外，在本发明的方法中，比以往的方法大幅地减少在细胞培养中使用的培养基的量的同时，培养大量的细胞变得可能。例如，即使聚合物多孔质膜的一部分或整体处于不与细胞培养基的液相接触的状态，也可经长期培养大量的细胞。另外，相对于含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和，显著地减少细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积也变得可能。

在本说明书中，将不含细胞的聚合物多孔质膜还包括其内部间隙的体积而在空间中所占的体积称为“表观聚合物多孔质膜体积”(参照图1)。进而，向聚合物多孔质膜应用细胞，在向聚合物多孔质膜的表面及内部负载细胞的状态下，将聚合物多孔质膜、细胞、及向聚合物多孔质膜内部浸润的培养基作为整体在空间中所占的体积称为“含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积”(参照图1)。在膜厚25μm的聚合物多孔质膜的情况中，含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积成为最大比表观聚合物多孔质膜体积大50％左右的值。在本发明的方法中，可在1个细胞培养容器中收容多个聚合物多孔质膜而进行培养，但此时，有时将含对于负载细胞的多个聚合物多孔质膜各自的细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和简记载为“含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和”。

通过使用本发明的方法，即使在细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和的10000倍或比其少的条件下，也经长期良好地培养细胞变得可能。另外，细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积在含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和的1000倍或比其少的条件下，也可经长期良好地培养细胞。再者，在细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和的100倍或比其少的条件下，也可经长期良好地培养细胞。进而，在细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚合物多孔质膜体积的总和的10倍或比其少的条件下，也可经长期良好地培养细胞。

即，根据本发明，能使细胞培养的空间(容器)变得与进行以往的二维培养的细胞培养装置比而至极限小型化。另外，在想要增加培养的细胞的数的情况中，由增加积层的聚合物多孔质膜的枚数等的简便的操作柔软地增加细胞培养的体积变得可能。只要是在本发明中使用的具备聚合物多孔质膜的细胞培养装置，就分离培养细胞的空间(容器)和储藏细胞培养基的空间(容器)变得可能，对应于培养的细胞数，准备必要的量的细胞培养基变得可能。储藏细胞培养基的空间(容器)可对应于目的而大型化或小型化，或也可为能更换的容器，不特别限定。

在本发明的方法中，例如，在使用聚合物多孔质膜的培养后细胞培养容器中所含的细胞的数是指，作为细胞均一地分散于全部细胞培养容器中所含的细胞培养基的，培养至每1ml培养基达1.0×10⁵个以上、1.0×10⁶个以上、2.0×10⁶个以上、5.0×10⁶个以上、1.0×10⁷个以上、2.0×10⁷个以上、5.0×10⁷个以上、1.0×10⁸个以上、2.0×10⁸个以上、5.0×10⁸个以上、1.0×10⁹个以上、2.0×10⁹个以上、或者5.0×10⁹个以上。

再者，作为测量培养中或培养后的细胞数的方法，可使用各种公知的方法。例如，作为以使用聚合物多孔质膜的培养后细胞培养容器中所含的细胞的数作为细胞均一地分散于全部细胞培养容器中所含的细胞培养基的测量的方法，可适宜使用公知的方法。例如，可适宜地使用使用CCK8的细胞数测量法。具体而言，使用Cell Countinig Kit8；同仁化学研究所制溶液试剂(以下，记载为“CCK8”)而测量在不使用聚合物多孔质膜的通常的培养中的细胞数，求出吸光度和实际的细胞数的相关系数。其后，应用细胞，向含CCK8的培养基移培养的聚合物多孔质膜，在温育器内保存1～3小时，取上清而测定在480nm的波长处的吸光度，从首先求出的相关系数计算细胞数。

另外，从别的观点来看，细胞的大量培养是指例如，在使用聚合物多孔质膜的培养后培养至每1平方厘米聚合物多孔质膜含的细胞数达1.0×10⁵个以上、2.0×10⁵个以上、1.0×10⁶个以上、2.0×10⁶个以上、5.0×10⁶个以上、1.0×10⁷个以上、2.0×10⁷个以上、5.0×10⁷个以上、1.0×10⁸个以上、2.0×10⁸个以上、或者5.0×10⁸个以上。每1平方厘米聚合物多孔质膜中所含的细胞数能使用细胞计数器等的公知的方法而适宜测量。

5.细胞的培养系统及培养条件

在本发明的方法中，细胞的培养系统及培养条件可对应于细胞的种类等而适宜确定。适宜于易脱分化的细胞的培养方法是公知的，可由本领域技术人员使用任意的公知的方法而培养应用于聚合物多孔质膜的细胞。细胞培养基也可对应于细胞的种类而适宜调制。

易脱分化的细胞的细胞培养基例如，记载在LONZA公司或宝生物公司的细胞培养基产品目录中。在本发明的方法中使用的细胞培养基也可为液体培养基、半固体培养基、固体培养基等之任一者的形态。另外，也可通过将作为液滴状的液体培养基喷喷雾到细胞培养容器中，使培养基接触负载细胞的聚合物多孔质膜。

关于使用聚合物多孔质膜的细胞的培养，也可与微载体或纤维素海绵等其他悬浮型培养载体共存。

在本发明的方法中，在培养中使用的系统的形状、规模等不特别限定，能适宜利用于细胞培养用的培养皿、瓶、塑料袋、试管至大型的箱。例如，含BD Falcon公司制的细胞培养皿或Thermo Scientific公司制的Nunc细胞工厂等。再者，通过在本发明中使用聚合物多孔质膜，对于先天不能悬浮培养的细胞而也用悬浮培养用装置进行在悬浮培养类似状态下的培养变得可能。作为悬浮培养用的装置，例如，能使用康宁公司制的旋转瓶或旋转培养等。另外，作为可实现同样的功能的环境，也能使用VERITAS公司的如FiberCell(注册商标)System一样的中空丝培养系统。

在本发明的方法中的培养也能使用以向聚合物多孔质膜上连续添加培养基而回收的方式的连续循环或开放型的装置而以使聚合物多孔质膜片露出到空气中的型式执行。

在本发明中，细胞的培养也可用从设置在细胞培养容器外的细胞培养基供给手段向细胞培养容器中连续或间歇地供给细胞培养基的系统进行。此时，细胞培养基可为在细胞培养基供给手段和细胞培养容器之间循环的系统。

可为细胞培养装置，其将细胞的培养用从设置在细胞培养容器外的细胞培养基供给手段连续或间歇地向细胞培养容器中供给细胞培养基的系统进行时，该系统可为含作为细胞培养容器的培养单元和作为细胞培养基供给手段的培养基供给单元的细胞培养装置，其中

培养单元是收容用于负载细胞的1个或多个聚合物多孔质膜的培养单元，是具备培养基供给口及培养基排出口的培养单元，

培养基供给单元是具备培养基收纳容器、培养基供给线和经培养基供给线连续或间歇地输送培养基的送液泵，其中培养基供给线的第一端部与培养基收纳容器内的培养基接触，培养基供给线的第二端部经培养单元的培养基供给口而与培养单元内连通的培养基供给单元。

另外，在上述细胞培养装置中，培养单元可为不具备空气供给口、空气排出口、及氧交换膜的培养单元，另外，可为具备空气供给口及空气排出口、或者氧交换膜的培养单元。培养单元即使不具备空气供给口及空气排出口、以及氧交换膜，也通过培养基而充分地向细胞供给对于细胞的培养必要的氧等。再者，在上述细胞培养装置中，培养单元还可具备培养基排出线，其中培养基排出线的第一端部与培养基收纳容器连接，培养基排出线的第二端部经培养单元的培养基排出口而与培养单元内连通，培养基能在培养基供给单元和培养单元循环。

作为上述细胞的培养系统的一例的细胞培养装置的例示于图2，可为了本发明的目的使用的细胞的培养系统不限于此。

6.对于本发明的产生物质的方法

在本发明的产生物质的方法中，通过如上所述培养细胞，从细胞产生期望的物质。产生的物质可为停留在细胞内的物质，也可为从细胞分泌的物质。产生的物质能对应于物质的种类、性质而由公知的方法回收。在从细胞分泌的物质的情况中，可从细胞培养基回收物质。产生的物质停留在细胞内的物质时，通过由使用细胞溶解剂等的化学处理、超声波处理、使用均浆器、破碎用Dispo管等的物理的处理等的公知的方法破坏细胞，能将物质释放到细胞外而回收。破坏细胞的方法能对应于细胞的种类、物质的种类等而由本领域技术人员适宜应用。

在本发明的产生物质的方法的一实施方式中，使用的细胞是软骨细胞，上述物质是选自蛋白聚糖、胶原及透明质酸的至少1个。

以下，基于实施例而更具体性地说明本发明。再者本发明不限定于这些实施例。本领域技术人员可基于本说明书的记载而容易地向本发明加修饰－变更，它们包括在本发明的技术性范围内。

【实施例】

在以下的实施例中使用的聚酰亚胺多孔质膜通过使含从作为四羧酸成分的3,3’，4,4’-联苯基四羧酸二酐(s-BPDA)和作为二胺成分的4,4’-二氨基二苯基醚(ODA)得到的聚酰胺酸溶液和作为着色前体的聚丙烯酰胺的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上进行热处理来调制。得到的聚酰亚胺多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在所述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚酰亚胺多孔质膜，存在于表面层A的孔的平均孔径是6μm，存在于表面层B的孔的平均孔径是46μm，膜厚是25μm，空孔率是73％。

实施例1

在聚酰亚胺多孔质膜上的人软骨细胞的培养

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司cat.103)加软骨细胞增殖培养基(PromoCell公司制)1ml，使灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍到培养基中。每1个片接种4×10⁴个人软骨细胞，一边每周更换2次培养基(1ml)，一边在CO₂温育器内继续进行培养。以下将使用聚酰亚胺多孔质膜的上述培养称为“部件培养”，以下将得到的细胞样品称为“部件培养细胞样品”。培养开始后，使用Cell Counting Kit-8(同仁化学研究所制、以下称为“CCK8”)而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。结果示于图3。观察到经长期间的稳定的人软骨细胞的增殖及生长。

实施例2

从聚酰亚胺多孔质膜向空的聚酰亚胺多孔质膜的人软骨细胞的移动(气相传代法)

根据实施例1中记载的方法而在CO₂温育器内培养人软骨细胞59天。对于培养中的细胞的生长的聚酰亚胺多孔质膜片，用新的同尺寸的聚酰亚胺多孔质膜各1个上下夹，准备1组3段重复的聚酰亚胺多孔质膜积层体。将此3段重复的积层体以在置于培养基中的网上与气相接触的方式放置，在CO₂温育器内继续培养。7天后，使各自的积层体每1个独立，对于各聚酰亚胺多孔质膜的细胞数而使用CCK8进行测定。结果示于图4。

上部－下部的片均由接触植活充分量的细胞，即使在独立后也确认到细胞数的顺利升高。约4周而达生长细胞数上限附近。

实施例3

人软骨细胞的长期培养

在与实施例1相同的条件下还继续实施例1的人软骨细胞的培养。使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。结果示于图5。

将培养开始后第170天的部件培养中的聚酰亚胺多孔质膜向皿(口内径35mm)灭菌地移送。加培养基1ml，再者，加CellMask Orange Plasma Membrane Stain(1μL)及Hoechst33342(PromoKine公司制)(0.5μL)而在温育器内静置5分钟。其后，除去放入染色试剂的培养基，加新的培养基而结束染色。每个培养基，向2孔塑料室(SARSTEDT公司制)移动聚酰亚胺多孔质膜，由共聚焦激光显微镜使细胞在活着的状态下取得荧光显微镜图像。另外，得到同视野的光学显微镜图像。图像示于图6。以适合于聚酰亚胺多孔质膜A面的网结构的形状观察到软骨细胞。

实施例4

自人软骨细胞的物质产生

回收在实施例3中的培养开始后第120天及第365天的部件培养细胞样品、及培养所述细胞样品之后的培养基，由ELISA法测定II型胶原及蛋白聚糖的产生量。再者，对于部件培养细胞样品而由来自外部的超声波破碎破坏细胞壁来回收细胞内的II型胶原及蛋白聚糖。

另外，除了未使用聚酰亚胺多孔质膜之外，与实施例3在同样的条件下，在细胞培养用培养皿(住友Bakelite制)中将人软骨细胞传代1次后培养5天。以下将不使用聚酰亚胺多孔质膜的培养称为“通常培养”，将得到的细胞样品称为“通常培养细胞样品”。回收所述通常培养细胞样品、及培养所述细胞样品之后的培养基而由ELISA法测定II型胶原及蛋白聚糖的产生量。

接下来示回收的II型胶原及蛋白聚糖的量。确认到II型胶原及蛋白聚糖高的产生量维持。

【表2】

II型胶原及蛋白聚糖是人软骨细胞中特有的物质。证实即使在长期培养之后，作为易脱分化的细胞的人软骨细胞的特性被维持，从而能通过使用本发明的方法来抑制易脱分化的细胞的脱分化。

实施例5

人软骨细胞的长期培养及产生物质的(细胞的初期接种数的差异造成的影响)

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)加软骨细胞增殖培养基(PromoCell公司制)1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍到培养基中。每1个片各自接种4×10⁴或2×10⁴个软骨细胞，一边每周更换2次培养基(1ml)，一边在CO₂温育器内继续进行培养。使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。结果示于图7。可不大依赖细胞的初期接种数而稳定且长期培养人软骨细胞。

回收人软骨细胞的培养开始后第39天及第277天的部件培养细胞样品(初期接种细胞数4.0×10⁴个)、及培养所述细胞样品之后的培养基，由ELISA法测定II型胶原及蛋白聚糖的产生量。再者，对于部件培养细胞样品而由来自外部的超声波破碎破坏细胞壁来回收细胞内的II型胶原及蛋白聚糖。

接下来示回收的II型胶原及蛋白聚糖的量。即使在长期间的部件培养后，在人软骨细胞中确认到II型胶原及蛋白聚糖高的产生量维持。另外，与实施例4的结果比较也确认到物质产生量的再现性。

【表3】

实施例6

在聚酰亚胺多孔质膜上的人成骨细胞的培养

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)加成骨细胞增殖培养基(PromoCell公司制、C-27001)1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍到培养基中。每1个片接种4×10⁴个人成骨细胞(PromoCell公司制)，在CO₂温育器内继续进行培养。每周更换2次培养基(1ml)。培养开始后，使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。结果示于图8。观察到经长期间的稳定的细胞的增殖及生长。

实施例7

聚酰亚胺多孔质膜上的人成骨细胞的培养和钙化诱导

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)加成骨细胞增殖培养基(PromoCell公司制、C-27001)1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍到培养基中。每1个片接种4×10⁴或2×10⁴个人成骨细胞(PromoCell公司制)，一边每周更换2次培养基(1ml)，一边在CO₂温育器内继续进行培养。培养开始后，使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。结果示于图9。观察到不大依赖细胞的初期接种数而经长期间的稳定的人成骨细胞的增殖及生长。

向加钙化诱导培养基(PromoCell公司制、成骨细胞钙化培养基)的2cm×2cm的灭菌的正方形容器各自移送培养开始后第83天及第224天的部件培养中的聚酰亚胺多孔质膜(各自称为“样品1”及“样品2”)，实施钙化诱导。诱导期间经过后，用钙化染色试剂盒(CosmoBio制)进行染色，将钙化部分的赤变用光学显微镜进行观察。结果示于以下的表及图10。表中的钙化诱导前的生长细胞数使用CCK8进行测量。在图10的显微镜图像中观察到有特长的赤变部，得知成骨细胞特性在长期培养之中被继续维持。证实即使在长期间培养之后，作为易脱分化的细胞的成骨细胞的特性(钙化能)被维持，从而能通过使用本发明的方法来抑制易脱分化的细胞的脱分化。

【表4】

	培养期间(日)	钙化诱导期间(日)	钙化诱导前的生长细胞数(个细胞/cm<sup>2</sup>)
				样品1	83	21	5.6×10<sup>4</sup>
样品2	224	28	6.1×10<sup>4</sup>

实施例8

在聚酰亚胺多孔质膜上的人成骨细胞的培养和显微镜观察

向2cm×2cm的灭菌的正方形容器(Thermo Fisher Scientific公司、cat.103)加成骨细胞增殖培养基(Promo Cell公司制、C-27001)1ml，将灭菌的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面朝上浸渍到容器的培养基中。每1个聚酰亚胺多孔质膜各自接种4×10⁴或2×10⁴个人成骨细胞(PromoCell公司制)，一边每周更换2次培养基(1ml)，一边在CO₂温育器内继续进行培养。培养开始后，使用CCK8而测量细胞数，对细胞生长行为进行观察。结果示于图11。观察到不大依赖细胞的初期接种数而经长期间的稳定的人成骨细胞的增殖及生长。

培养开始后，将第160天的部件培养中的聚酰亚胺多孔质膜福尔马林固定，进行电子显微镜观察。具体而言，用2.5％戊二醛、2％甲醛混合固定液将聚酰亚胺多孔质膜固定后，进行四氧化锇后固定，用依次的乙醇取代法脱水后，用液氮温度进行冷冻割断。使用t-丁基醇的冷冻真空干燥后，由锇等离子体蒸镀进行带电防止处理，实施扫描型电子显微镜(SEM)观察。在观察中使用电场释放型SEM，在加速电压5kV、高真空下作为二次电子像进行观察。结果示于图12。观察到细胞的整列、细胞的多重积层结构的形成、及在膜表层部和膜附近(内部)层中的细胞的整列的相异性等，多的令人感兴趣的部件培养行为。

培养开始后，将第171天的部件培养中的聚酰亚胺多孔质膜福尔马林固定，进行荧光显微镜观察。具体而言，将聚酰亚胺多孔质膜用福尔马林固定后，用Alexa Fluor(注册商标)488鬼笔环肽、CellMask Orange Plasma Membrane Stain、及DAPI染色，由共聚焦激光显微镜取得荧光显微图像。结果示于图13。对A面表层和B面表层的2个不同的表层部进行测定，验证细胞的集合状况。在任何方的表层部中均明显见到强的取向性，成为与SEM解析良好一致的结果。另外，关于取向的形状，在A面侧，观察到对于观察到多个广泛的细胞的事实，在B面侧观察到细长的细胞组的整列。此事实也是与SEM解析良好一致的结果。聚酰亚胺多孔质膜的2个不同的表面也可在长期培养后还给细胞的集合状态大的影响这样的事实以多个分析手段作为一致的见解观察，可认为是非常令人感兴趣的结果。

【产业上的利用可能性】

本发明的方法可用于抑制易脱分化的细胞的脱分化，大量地供给所述细胞。另外，可用于大量地得到以往难以得到的所述细胞产生的物质。

Claims (16)

1.抑制易脱分化的细胞的脱分化的方法，其包括：

(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通；

其中，所述易脱分化的细胞为软骨细胞或成骨细胞；实施上述工序(2)至少30天。

2.权利要求1所述的方法，其中在上述工序(2)中，使细胞增殖至每1平方厘米聚合物多孔质膜达1.0×10⁵个以上。

3.权利要求1或2所述的方法，其中将2个以上的聚合物多孔质膜上下或左右积层到细胞培养基中而使用。

4.权利要求1或2所述的方法，其中将上述聚合物多孔质膜

(i)折叠，

(ii)卷成卷状，

(iii)将片或小片用丝状的结构体连接，或者，

(iv)连接成绳状

而在细胞培养容器中的细胞培养基中悬浮或固定而使用。

5.权利要求1或2所述的方法，其中在工序(2)中，聚酰亚胺多孔质膜的一部分或整体不与细胞培养基的液相接触。

6.权利要求1或2所述的方法，其中在工序(2)中，细胞培养容器中所含的细胞培养基的总体积是含细胞生存域的聚酰亚胺多孔质膜体积的总和的10000倍或比其少。

7.权利要求1或2所述的方法，其中上述表面层A的平均孔径是0.01～50μm。

8.权利要求1或2所述的方法，其中上述表面层B的平均孔径是20～100μm。

9.权利要求1或2所述的方法，其中上述聚合物多孔质膜的膜厚是5～500μm。

10.权利要求1或2所述的方法，其中上述聚合物多孔质膜是聚酰亚胺多孔质膜。

11.权利要求10所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰亚胺的，聚酰亚胺多孔质膜。

12.权利要求10所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是通过使包含从四羧酸二酐和二胺得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺酸溶液组合物成形之后，在250℃以上进行热处理而得到的着色的聚酰亚胺多孔质膜。

13.权利要求1或2所述的方法，其中上述聚合物多孔质膜是聚醚砜多孔质膜。

14.调制易脱分化的细胞的方法，其包括：

(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、及

(2)培养上述细胞，使增殖的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述细胞的脱分化被抑制；

其中，所述易脱分化的细胞为软骨细胞或成骨细胞；实施上述工序(2)至少30天。

15.使用易脱分化的细胞而产生物质的方法，其包括：

(1)将上述细胞应用于聚合物多孔质膜的工序、

(2)培养上述细胞，使增殖的工序、及

(3)回收上述细胞产生的物质的工序，

其中，上述聚合物多孔质膜是有具有多个孔的表面层A及表面层B和夹在上述表面层A及表面层B之间的大空隙层的三层结构的聚合物多孔质膜，其中存在于上述表面层A的孔的平均孔径比存在于上述表面层B的孔的平均孔径小，上述大空隙层有与上述表面层A及B结合的隔壁和被所述隔壁以及上述表面层A及B包围的多个大空隙，在上述表面层A及B中的孔与上述大空隙连通，

在上述工序(2)中上述细胞的脱分化被抑制；

其中，所述易脱分化的细胞为软骨细胞或成骨细胞；实施上述工序(2)至少30天。

16.权利要求15所述的方法，其中上述细胞是软骨细胞，上述物质是选自蛋白聚糖、胶原及透明质酸的至少1个。

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